Le virus T lymphotropique humain HTLV-1 est l’agent étiologique de la leucémie-lymphome T de l’adulte (ATLL) et de nombreuses maladies inflammatoires. HTLV-1 est associée à de nombreuses modifications quantitatives de l’expression des gènes cellulaires. À ce jour, ces modifications ont été décrites essentiellement à l’échelle transcriptionnelle à travers notamment les effets de l’oncoprotéine virale Tax, et plus récemment HBZ. Outre leurs impacts sur les niveaux d’activité des promoteurs, certains facteurs apparaissent jouer également un rôle dans la régulation de l’épissage alternatif. Ce mécanisme essentiel à la diversité du transcriptome et du protéome cellulaire, apparait étroitement couplé à la transcription et ses dérégulations sont de plus en plus décrites dans les phénomènes cytotoxiques et pathogènes tels que les infections et les cancers. Dans ce contexte, mon travail s’est intéressé à caractériser les profils d’expression des exons des cellules T CD4+ infectées ou non, et transformée ou non par HTLV-1 in vivo. Dans une seconde étude, j’ai abordé les aspects mécanistiques des modifications d’épissage alternatif par HTLV-1. Mes données montrent que, outre ses effets sur la régulation quantitative de l’expression des gènes cellulaires, l’activation de la voie NF-kB par l’oncogène Tax est impliquée dans la reprogrammation de l’épissage alternatif de nombreux gènes. Ces données révèlent un nouveau degré de complexité dans les mécanismes de dérégulation de l’expression des gènes cellulaires par HTLV-1 et ouvre de nouvelles perspectives d’investigations dans la compréhension des processus leucémogènes associés à l’infection par le virus HTLV-1 / Reprogramming cellular gene transcription sustains HTLV-1 viral persistence that ultimately leads to the development of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL). We hypothesized that besides these quantitative transcriptional effects. HTLV-1 quantitatively modifies the pattern of cellular gene expression. Exon expression analysis shows that patients’ untransformed and malignant HTLV-1+ CD4+ T-cells exhibit multiple alternate exon usage (AEU) events. These affect either transcriptionally modified or unmodified genes, culminate in ATLL, and unveil new functional pathways involved in cancer and cell cycle. A total of 486 exon modifications occurred in untransformed infected CD4+ cells were detected in ATLL arguing for a role of AEUs in HTLV-1 leukemogenesis. Unsupervised hierarchical clustering of array data permitted to isolate exon expression patters of 3977 exons that discriminate uninfected, infected, and transformed CD4+ T-cells. Exposing cells to splicing inhibitors revealed that Sudemycin E reduces cell viability of HTLV-1 transformed cells without affecting primary control CD4+ cells and HTLV-1 negative cell lines, suggesting that the huge excess of AEU might provides news targets for treating ATLL. Taken together, these data reveal that HTLV-1 significantly modifies the structure of cellular transcripts and unmask new putative leukemogenic pathways and possible therapeutic targets

O splicing alternativo é um processo no qual moléculas idênticas de pré-mRNA são processadas de diferentes formas. Ele é fundamental em organismos complexos, pois é responsável por criar uma ampla diversidade de proteínas a partir de um número relativamente pequeno de genes. Contudo, poucas proteínas advindas do splicing alternativo já foram identificadas, visto que a maioria dos espectros de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) não encontra sequências correspondentes nos diversos bancos de dados de proteínas disponíveis. Entre diversos fatores, isso ocorre porque um número reduzido de eventos de splicing alternativo (ASEs) são conhecidos e devidamente estudados. Nesse trabalho, o espectro de eventos observáveis foi ampliado por meio da análise de eventos complexos de splicing alternativo (CASEs), que consideram múltiplos ASEs em um ou diferentes transcritos. Foi desenvolvido um novo método de análise utilizando expressões regulares (regexes) associada a uma sintaxe baseada em caracteres intuitivos. O método de análise e a sintaxe foram implementados em uma ferramenta web denominada de SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) que também apresenta ferramentas extras de análise. Adicionalmente, os subestimados eventos do tipo retenção de íntron (IR) foram explorados em busca de evidências funcionais por meio de análises de MS/MS. Como resultado, eventos bastante incomuns foram observados no proteoma humano, sugerindo que muito pouco ainda é conhecido sobre a complexidade transcriptômica e proteômica humana. Portanto, com base nesses dados, esse trabalho representa um grande avanço no estudo de fenômenos de splicing alternativo ainda pouco explorados. / Alternative splicing is defined, basically, as a process in which identical pre-mRNA molecules are processed in different ways in terms of usage of exon/introns borders. It is a fundamental process in complex organisms, and is responsible for creating a large diversity of proteins from a relatively small number of genes. However, just a few proteins resulted from alternative splicing were already identified, since only a small part of \\emph mass spectrometry (MS/MS) spetras match proteins in sequence databases. Among different factors, it occurs because a reduced number of alternative splicing events (ASEs) are known and properly studied. In this work, the landscape of observable events was amplified through the analysis of complex alternative splicing events (CASEs), which consider different ASEs within the same or different transcripts. A method of analysis was developed using regular expressions (regexes) associated with a syntax composed of intuitive characters. Those features were implemented in a web tool called SPLOOCE (http://www.bioinformatics-brazil.org/splooce) that also has extra analysis tools.Furthermore, the understudied events known as intron retention (IR) were explored using MS/MS analyses as a strategy to identify functional roles. As result, very uncommon events were observed in human proteome, suggesting that little is currently known about the complexity of the human proteome and transcriptome. Based on those data, it can be concluded that this work represents a significant advance in the study of uncommon and understudied alternative splicing events.

A proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), codificada pelo gene do Retardo Mental do X Frágil (do inglês, Fragile Mental Retardation 1, FMR1) tem expressão significativa no encéfalo, gônadas e células proliferativas. A FMRP é uma proteína ligante de RNA, repressora traducional, que transita entre o núcleo celular, grânulos citoplasmáticos e polissomos. Sua associação a RNA pode se dar pelos domínios Tudor N-terminais, dois domínios centrais, com homologia à heteronucleoproteína K (KH) ou motivos RGG, ricos em arginina (R) e glicina (G), C-terminais. A abolição da expressão da FMRP por mutações no gene FMR1 é a causa mais frequente de deficiência intelectual hereditária entre homens. Transcritos desse gene sofrem splicing alternativo de quatro éxons, podendo gerar até 20 isoformas não redundantes da FMRP. A tradução de RNAm do FMR1 contendo o éxon 12 causa uma extensão em fase, em 21 aminoácidos na alça variável do segundo domínio KH (KH-2) da FMRP, cujos padrão de expressão e função ainda são desconhecidos. Embora a FMRP tenha alta similaridade com duas proteínas parálogas, proteínas relacionadas à FMRP, FRX1P e FXR2P, ela apresenta algumas características de expressão e função que lhes são próprias. A longa alça variável do domínio KH-2, por exemplo, não é observada nas parálogas e é característica somente de ortólogas da FMRP em mamíferos. Assim, é possível que o estudo deste segmento da proteína traga informações funcionais específicas para o encéfalo de mamífero. Demonstramos anteriormente, por qRT-PCR, que, em transcritos do Fmr1 de rato, a expressão da sequência do éxon 12 é regulada ao longo do desenvolvimento pós-natal precoce, de forma diferencialmente positiva no córtex cerebral frontal e cerebelo, em relação ao hipocampo. No presente trabalho, aprofundamos esses estudos, tendo como objetivo a análise cuidadosa da expressão desse éxon em isoformas da FMRP (FMRP+12ISO), pelo uso de um anticorpo dirigido ao segmento codificado por ele, em encéfalos do décimo segundo dia pós-natal (P12, controle positivo) ou embrionários. Para tal, foram realizadas análises por imunoistoquímica e, em P12, ensaios de cromatografia de exclusão molecular de partículas ribonucleoproteicas. Análises de níveis de RNAm e proteicos em fase embrionária (E12 a E20) do encéfalo do rato foram também conduzidas in vivo e in vitro, em cultivo primário de neuroesferas em suspensão, a partir da dissociação de vesículas telencefálicas de ratos em E14. Os dados de imunoistoquímica de encéfalo de ratos em P12 indicaram que (i) as camadas granular externa e a camada piramidal externa do córtex cerebral e as células de Purkinje no cerebelo são mais ricas em FMRP+12ISO; (ii) o giro denteado e CA3 foram fontes de FMRP+12ISO no hipocampo, porém em mais baixa intensidade; e (iii) o conjunto das isoformas da FMRP, incluindo as FMRP+12ISO, foram expressas em região periventricular dos ventrículos laterais em período pós-natal, sugestivo de células-tronco neurais do adulto ou recém diferenciadas. No córtex cerebral, as FMRP+12ISO foram expressas em áreas motora (segmento rostrodorsal), sensorial (segmentos dorsolaterais a laterais), auditiva (segmentos dorsolaterais), olfatória (córtex piriforme) e visual (segmentos ventrolaterais), além da área do cingulado (segmentos mediais) de ambos os hemisférios cerebrais. Os dados também confirmaram que, em P12, as FMRP+12ISO têm expressão mais pronunciada no córtex cerebral e cerebelo do que no hipocampo. À cromatografia, as FMRP+12ISO tiveram o mesmo padrão de distribuição que o conjunto das isoformas da FMRP, fracionando em complexos ribonucleoproteicos maiores que 600 kDa. De modo geral, a expressão das FMRP+12ISO foi baixa em E12 e E14. Houve concordância entre as análises por qRT-PCR, Western blotting e imunoistoquímica, corroborando a baixa expressão do éxon 12 do FMR1 na vesículas telencefálicas em E14. Observamos por imunoistoquímica poucas células sugestivas de progenitoras, na base do neuroepitélio, que expressassem FMRP+12ISO ou outras isoformas da FMRP. O córtex cerebral em E20 foi raramente positivo para FMRP+12ISO ou o conjunto das isoformas da FMRP. Por outro lado, células da camada mais superficial da placa cortical, indicativa de ser a camada I, mostraram expressão de isoformas da FMRP sem o segmento codificado pelo éxon 12 do Fmr1, em E18 e da FMRP, incluindo as FMRP+12ISO, em E20, de forma contínua em várias regiões corticais. Em neuroesferas em suspensão, a expressão das FMRP+12ISO foi muito baixa enquanto isoformas da FMRP, supostamente com a alça variável de KH- 2 em sua conformação curta, tiveram alta expressão nessas células. Desde as primeiras 24 horas sob condições de diferenciação neuronal in vitro, células de neuroesferas aumentaram a expressão das FMRP+12ISO, que se mantiveram alta no período analisado (12 dias in vitro), colocalizando-se com outras isoformas da FMRP. Ensaios preliminares in vitro pela interferência do RNA, em células imortalizadas C6, indicaram um RNA em fita dupla, entre dois testados, com capacidade de inibição de mensagens do Fmr1 que especificamente contenham o éxon 12. A expressão do éxon 12 do FMR1 no córtex cerebral frontal, humano, em envelhecimento foi baixa pela análise de RNAm, enquanto o total de transcritos deste gene apresentou-se em níveis significativos. Nossos dados sugerem que a expressão do éxon 12 do Fmr1 é mais significativa para FMRP+12ISO em células neuronais, durante um período crítico de sinaptogênese, no primeiro mês pós-natal do rato. O tecido telencefálico, embrionário não se mostrou uma fonte rica dessas isoformas, principalmente em células indiferenciadas, que foram francamente negativas / Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP), codified by Fragile Mental Retardation 1 (FMR1) gene, is significantly expressed in the brain, gonads and proliferative cells. FMRP is an RNA-binding protein and acts as a translation repressor, which transits between cell nucleus, cytoplasmic granules and polysomes. Its association with RNA occurs via several domains, namely: Nterminal Tudor domains; two central domains with K-heteronucleoprotein (KH) homology; and C-terminal RGG motifs, that are rich in arginine (R) and glicine (G). The absence of FMRP expression triggered by mutations in the FMR1 gene is the most frequent cause of hereditary intellectual disability in human men. Four FMR1 exons may undergo alternative splicing, generating up to 20 non-redundant FMRP isoforms. The translation of the FMR1 mRNA containing exon 12 leads to an in-phase extension of 21 amino acids in the variable loop on FMRP the second KH domain (KH-2). The pattern of expression and function of this isoform are unknown. Although FMRP is highly similar to two paralogs proteins, FMRP-related proteins FRX1P and FRX2P, it presents some unique expression and function characteristics. The long variable loop of the KH-2 domain, for example, is not observed in these paralogs and is a hallmark of FMRP mammal orthologs. Therefore, the study of this protein segment can potentially bring information about its function specifically in the mammalian brain. Using qRT-PCR and Western blotting, we previously demonstrated that, for rat Fmr1 transcripts, the expression of sequences containing exon 12 is regulated during early postnatal development. In this period, expression of these segments in the frontal cerebral cortex and in the cerebellum is higher when compared to hippocampus expression. In the present work, we deepened these studies with the objective of carefully analysing the expression of FMRP isoforms containing FMRP exon 12 (FMRP+12ISO). For this purpose, we employed rat postnatal brains at the twelfth postnatal day (P12, used as a positive control) and rat embryo brain in immunohistochemistry assays with antibodies detecting peptides codified by exon 12. In this strategy, we also carried out molecular exclusion chromatography of ribonucleoproteins particles with lysates from rat P12 encephalon. Analysis of mRNA and protein levels in rat brain in the embryonic period [embryonic days 12 to 20 (E12 to E20)] were conducted in vivo and in vitro, in neurosphere suspension primary cultures, obtained by dissociation of telencephalic vesicles from E14 rats. Immunohistochemical data from P12 rat brain indicated that (i) the granular external layers and pyramidal external layer in the brain cortex and Purkinje cells in the cerebellum are richer in FMRP+12ISO; (ii) in the hippocampus, FMRP+12ISO can be found in dentate gyrus and CA3, although in lesser intensities; and (iii) FMRP isoforms, including FMRP+12ISO, are expressed in the periventricular regions from the lateral ventricles, suggesting their expression in adult neural stem cells or in differentiating cells. In the cerebral cortex, FMRP+12ISO are expressed in motor areas (rostrodorsal segment) and in sensorial areas (dorsolateral and lateral segments), specifically in auditory (dorsolateral segments), olfactory (piriform cortex) and visual (ventrolateral segments) areas, besides expression in the cingulate área (medial segment) in both hemispheres. Our data also confirmed that, in P12 brain, cerebral cortex and cerebellum have higher FMRP+12ISO expression when compared to the hippocampus. Chromatography data indicated that FMRP+12ISO have the same pattern of distribution than the FMRP isoform group, fractionating in ribonucleoproteics complexes heavier than 600kDa. Altogether, FMRP+12ISO expression is low in E12 and E14 rat brain. qRT-PCR, Western blotting and immunohistochemistry data were concordant, corroborating the low expression of exon 12 in E14 telencephalic vesicles. In immunohistochemistry images, we observed few cells with progenitor phenotype, at the basal neuroepithelium, expressing FMRP+12ISO or other FMRP isoforms. In E20, cerebral cortex was rarely positive for FMRP+12ISO or other FMRP isoforms. Still, cells in the superficial layer of the cortical plate, possibly layer 1, were positive for FMRP isoforms that do not contain the segment codified by exon 12 in E18, brains and positive for the ensemble of FMRP, isoforms, FMRP+12ISO included, in E20 brains, in continuous portions of several cortical regions. In suspension neurosphere cultures, FMRP+12ISO expression was very low, while the expression of FMRP isoforms, supposedly with the variable loop of KH-2 in its short conformation, was high in. After 24 hours under neuron differentiation conditions in vitro, neurosphere cells showed increasing expression of FMRP+12ISO, which remained high during the period analyzed (12 days in vitro), co-localizing with other FMRP isoforms. Preliminary assays using RNA interference in vitro in an immortalized glioma cell lineage (C6), disclosed a double-stranded RNA, among two tested samples, with the ability to suppress exon 12 containig Fmr1 mRNA. The expression of FMR1 transcripts containing exon 12 in aging human brain frontal cortex was low, while total FMR1 transcripts levels were significant. Our data suggest that the expression of exon 12 from Fmr1 is more significant in rat neuronal cells during a critical period of synaptogenesis in the first postnatal month. The embryonic telencephalic tissue is not rich in FMRP+12ISO, which were notably absent from undifferentiated cells

O relógio biológico é um mecanismo molecular autossustentado gerador de ritmos. Ele integra vias de percepção das condições ambientais com um oscilador central para gerar respostas fisiológicas rítmicas em escalas diária e sazonal. Nas plantas, o relógio biológico está associado a vias metabólicas e fisiológicas importantes, como fotossíntese. Na cana-de-açúcar, uma gramínea de grande interesse econômico, estudos realizados em condições circadianas mostraram que o relógio biológico tem uma influência superior àquela vista em outras plantas. Assim, este trabalho visa a compreender os mecanismos de funcionamento do oscilador central do relógio biológico da cana-de-açúcar crescida em campo. Para tanto, foram investigados o transcriptoma de diferentes órgãos da cana-de-açúcar; a expressão de isoformas alternativas e de múltiplos alelos dos genes do relógio biológico da cana; e o efeito do sombreamento mútuo das plantas em campo sobre o funcionamento do relógio biológico. Os resultados obtidos sugerem que o relógio biológico é funcional e sincronizado entre os diferentes órgãos da cana-de-açúcar analisados. Os transcritos regulados sinergicamente pelo relógio biológico e pelo ambiente flutuante pertencem a vias metabólicas, fisiológicas e de regulação gênica e epigenéticas todas essenciais à produtividade da cana-de-açúcar. O sombreamento mútuo observado em campo parece alterar a fase de expressão de genes do relógio biológico da cana-de-açúcar. Além disso, eventos de splicing alternativo foram observados nos genes do relógio biológico em condições de baixa temperatura e múltiplos alelos dos genes do relógio biológico são expressos e a regulação de sua expressão parece ser sazonal. / The circadian clock is a self-sustaining molecular mechanism that generates rhythms. It perceives the environmental conditions and connects this pathway with its central oscillator, generating daily and seasonal rhythms of physiological responses. In plants, the circadian clock is associated with major metabolic and physiological pathways. In sugarcane, an economically important grass, previous studies showed that the circadian clock has the largest influence on plants seen so far under circadian conditions. This work aims to understand how the central oscillator of the circadian clock works in field-grown sugarcane. Thus, the transcriptome from different sugarcane organs; the expression of alternative isoforms and multiple alleles of circadian clock genes; and the effect of mutual shading in the field on the circadian clock function were analyzed. The results suggest that there is a functional and synchronized circadian clock in the different sugarcane organs. The transcripts regulated synergistically by the circadian clock and the variable environment are related to metabolic, physiological, genetic or epigenetic pathways, all important to sugarcane productivity. Mutual shading observed in the field seems to change the phase of expression of the sugarcane circadian clock. Besides, alternative splicing events have been reported for circadian clock genes under low temperature conditions and multiple alleles of circadian clock genes are expressed and their expression is likely to be seasonally regulated.

O splicing alternativo do pré-mRNA de BCL-X produz duas isoformas de mRNAs com funções antagônicas, a pró-apoptótica BCL-XS e a anti-apoptótica BCL-XL, cujo balanço regula a homeostasia celular. Entretanto, o mecanismo que regula esse processamento ainda é desconhecido. Nesse trabalho, nós identificamos e caracterizamos um longo RNA não codificador de proteínas (lncRNA) nomeado INXS, que é transcrito a partir da fita oposta do locus genômico de BCL-X, sendo menos abundante em linhagens celulares tumorais e tecidos tumorais de pacientes quando comparados com os respectivos pares não tumorais. INXS é um RNA unspliced de 1903 nts, é transcrito pela RNA Polimerase II, possui cap 5\', está enriquecido na fração nuclear das células e se liga à proteína Sam68 do complexo modulador de splicing. O tratamento de células tumorais 786-O com cada um de três agentes indutores de apoptose aumentou a expressão endógena do INXS, levando ao aumento expressivo da proporção entre os mRNAs de BCL-XS / BCL-XL, e ativação das caspases 3, 7 e 9. Estes efeitos foram anulados na presença do knockdown do INXS. Da mesma forma, a superexpressão ectópica do INXS causou uma mudança no splicing favorecendo a isoforma BCL-XS e ativação das caspases, aumentando os níveis da proteína BCL-XS e conduzindo as células à apoptose. Utilizando um modelo in vivo, cinco injeções intra-tumorais do INXS durante 15 dias causaram uma regressão acentuada no volume dos xenotumores. Portanto, INXS é um lncRNA que induz a apoptose, sugerindo que essa molécula seja um possível alvo a ser explorado na terapia contra o câncer. / BCL-X mRNA alternative splicing generates pro-apoptotic BCL-XS or anti-apoptotic BCL-XL, whose balance regulates cell homeostasis. However, the mechanism that regulates the splice shifting is incompletely understood. Here, we identified and characterized a long noncoding RNA (lncRNA) named INXS, transcribed from the opposite genomic strand of BCL-X, that was less abundant in tumor cell lines and patient tumor tissues compared with non-tumors. INXS is an unspliced 1903 nt-long RNA, is transcribed by RNA Polymerase II, 5\'-capped, nuclear enriched and binds Sam68 splicing-modulator. The treatment of tumor cell line 786-O with each of three apoptosis-inducing agents increased endogenous INXS lncRNA, increased BCL-XS / BCL-XL mRNA ratio, and activated caspases 3, 7 and 9. These effects were abrogated in the presence of INXS knockdown. Similarly, ectopic INXS overexpression caused a shift in splicing towards BCL-XS and activation of caspases, increasing the levels of BCL-XS protein and then leading the cells to apoptosis. In a mouse xenograft model, five intra-tumor injections of INXS along 15 days caused a marked regression in tumor volume. INXS is an lncRNA that induces apoptosis, suggesting that INXS is a possible target to be explored in cancer therapies.

Submitted by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2015-09-23T19:19:26Z No. of bitstreams: 1 dissertacao-vitor.pdf: 1691206 bytes, checksum: fef620f128c4346f7ff506439cdffdfd (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2015-09-23T19:20:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertacao-vitor.pdf: 1691206 bytes, checksum: fef620f128c4346f7ff506439cdffdfd (MD5) / Made available in DSpace on 2015-09-23T19:20:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao-vitor.pdf: 1691206 bytes, checksum: fef620f128c4346f7ff506439cdffdfd (MD5) Previous issue date: 2015-03-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Splicing Alternativo (SA) é um mecanismo pós-transcricional que produz mais de um produto de gene, através da combinação de diferente éxons do lócus genômico, gerando grande parcela da variedade do proteoma dos eucariotos. Ao longo da última década, como seu papel regulatório tornou-se mais e mais evidente, SA tornou-se um fator chave para criação de complexidade de diferentes organismos dado um repertório constante de genes através das gerações. Através da inserção, exclusão ou substituição de partes da sequência do transcrito, SA pode obviamente também ter um impacto nos domínios funcionais de proteínas. Apesar de algumas tentativas que tem sido principalmente prejudicadas por questões técnicas causada pela redundância nas sequências transcritos alternativos, os efeitos em larga escala do SA em nível funcional tem sido pouco estudados até os dias de hoje. Este projeto descreve o desenvolvimento de uma ferramenta computacional chamada ASTAFUNK - Alternative Splicing Trancriptional Analyses with FUNctional Knowledge - um programa stand-alone automatizado e eficiente para estudar como a diversidade de determinado transcriptoma é traduzido em variação funcional, baseado em um padrão de anotação de transcriptomas (em GTF, Gene Transfer Format) e perfis de domínios (no formato do Pfam). Resumidamente, ASTAFUNK traduz as regiões que sofreram splicing alternativo de open read frames em sequências de aminoácidos, que subsequentemente são alinhadas com o profile Hidden Markov Model da base de dados do Pfam, empregando programação dinâmica padrão (algoritmo de Viterbi) com alguns refinamentos técnicos (isto é, abordagem branch-and-bound). Em contraste com ferramentas convencionais de predição de domínios (por exemplo, HMMER), o algoritmo de ASTAFUNK foi projetado para evitar escaneamentos redundantes de sequências em transcriptomas com alto grau de SA. Neste trabalho, aspectos teóricos e práticos da abordagem do ASTAFUNK são avaliados, e a eficiente implementação em JAVA é disponível livremente na internet sob BSD 3-clause open source license. / Alternative splicing (AS) is a mechanism that produces more than one gene product at the transcriptional level, by combining different exons of a gene, generating a major part of the proteome diversity in eukaryotes. Over the last decade, as the regulatory role of splicing has become more and more evident, AS turned a key factor in creating different organism complexity given a rather constant repertoire of genes across generations. By inserting, deleting or substituting part of the transcript sequence, AS can obviously also have an impact on functional protein domains. Despite some attempts that have mainly been hampered by technical issues caused by the redundancy in alternative transcript sequences, the large-scale effects of AS on the functional level has been poorly studied so far. This project describes the development of a computational tool called ASTAFUNK - Alternative Splicing Trancriptional Analyses with FUNctional Knowledge - an automated and efficient stand-alone program to study how diversity of a custom transcriptome translates into functional variation, based on standard transcriptome annotations (in GTF, Gene Transfer Format) and domain profiles (in Pfam format). In a nutshell, \afunk{} translates the alternatively spliced parts of open reading frames on the fly into amino acid sequences, which subsequently are aligned with the profile Hidden Markov Models from Pfam employing standard dynamic programming (Viterbi's algorithm) with some technical refinements (i.e., a branch-and-bound approach). In contrast to conventional domain prediction tools (e.g., the HMMER aligner), the ASTAFUNK algorithm has been designed to avoid redundant sequence scans in AS-enriched transcriptomes. In this work, theoretical and practical aspects of the ASTAFUNK approach are evaluated, and the efficient JAVA implementation is made freely available over the internet under the BSD 3-clause open source license.

Neste trabalho, nós mostramos estudos em larga-escala de RNAs não codificadores antisenso que são transcritos em regiões intrônicas de genes humanos. Alguns destes transcritos intrônicos possuem níveis de expressão correlacionados ao grau de diferenciação tumoral de câncer de próstata, apontando para uma relevância biológica destas mensagens em doenças complexas como o câncer. Nós também avaliamos a existência de um mecanismo comum de regulação de transcrição, compartilhado por mRNAs codificadores de proteína e RNAs intrônicos, através de análises de perfis de expressão de uma linhagem tumoral de próstata estimulada por andrógeno. A análise de ESTs e mRNAs depositados em bancos públicos de seqüências revelou mais de 55 mil RNAs Totalmente Intrônicos Não-codificadores (TIN), transcritos dos íntrons de 74% de todos os genes RefSeq únicos. Guiados por esta informação, nós desenhamos uma plataforma de oligonucleotídeos contendo sondas senso e antisenso para cada um de 7.520 transcritos TIN selecionados aleatoriamente, além de sondas para os genes codificadores de proteína correspondentes. Nós identificamos assinaturas intrônicas e exônicas de expressão tecido-específicas em fígado, próstata e rim. Os RNAs TIN antisenso mais altamente expressos eram transcritos de íntrons de genes codificadores de proteína enriquecidos na categoria ?Regulação da transcrição?. A inibição da RNA Polimerase II resultou num aumento de expressão de uma fração dos RNAs intrônicos em células em cultura, sugerindo que outras RNA Polimerases possam estar envolvidas em sua biossíntese. Um subconjunto das assinaturas intrônicas e exônicas localizadas nos mesmos loci genômicos possuíram padrões de expressão correlacionados, sugerindo que RNAs intrônicos regulem a abundância ou o padrão de uso de éxons de mensagens codificadoras de proteína. Nós identificamos diversos padrões de expressão de RNAs intrônicos, indicando que eles possam ter papéis regulatórios. Esta estratégia orientada pelo gene, que combina um microarray intrônico/exônico deve permitir análises comparativas futuras de transcrição intrônica sob várias condições fisiológicas e patológicas, avançando assim em nosso conhecimento sobre as funções biológicas destes RNAs não codificadores. / In this work, we show large-scale studies of antisense noncoding RNAs transcribed from intronic regions of human genes. The correlation of expression levels of some intronic transcripts to the degree of tumor differentiation in prostate cancer points to the biological relevance of these messages in complex diseases such as cancer. We also evaluated the existence of a common mechanism of regulation of transcription shared by protein-coding mRNAs and intronic RNAs by measuring the effect of androgen on the transcriptional profile of a prostate cancer cell line. Survey of mRNA and EST public databases revealed more than 55,000 Totally Intronic Noncoding (TIN) RNAs transcribed from the introns of 74% of all unique RefSeq genes. Guided by this information, we designed an oligoarray platform containing sense and antisense probes for each of 7,520 randomly-selected TIN transcripts plus probes for the corresponding protein-coding genes. We identified exonic and intronic tissue-specific expression signatures for human liver, prostate and kidney. The most highly expressed antisense TIN RNAs were transcribed from introns of proteincoding genes enriched in the \"Regulation of transcription\" class. RNA Polymerase II inhibition resulted in increased expression of a fraction of the intronic RNAs in cell cultures, suggesting that other RNA polymerases may be involved in their biosynthesis. A subset of intronic and protein-coding signatures transcribed from the same genomic loci has correlated expression patterns, suggesting that intronic RNAs regulate the abundance or the pattern of exon usage in protein-coding messages. We have identified diverse intronic RNA expression patterns, indicating that they may have regulatory roles. This gene-oriented approach, using a combined intronic/exonic microarray should permit further comparative analysis of intronic transcription under various physiological and pathological conditions, thus advancing current knowledge about the biological functions of these noncoding RNAs.

A pós-genômica surgiu como um próspero campo para que as infinidades de seqüências provenientes dos projetos genoma tenham os seus significados biológicos elucidados. Um dos mecanismos descritos na literatura capaz de gerar surpreendente diversidade protéica é o splicing alternativo (AS). Próximo de 22% das proteínas com estruturas tridimensionais resolvidas por difração de raios-X ou ressonância magnética nuclear (RMN) são humanas e pouco se sabe dos efeitos de eventos de splicing alternativo em suas funções. Uma vez que estas estruturas tridimensionais (3D) protéicas humanas são de alguma forma redundantes, o conjunto de genes humanos únicos que as correspondem é muito reduzido, em torno de 1%. Hoje em dia ainda são escassos os exemplos de duas isoformas de splicing alternativo de um mesmo gene com estruturas tridimensionais experimentais disponíveis. A variedade de proteínas que este evento pode potencialmente produzir é demasiado grande para que projetos de genômica estrutural em andamento consigam determinar suas estruturas. Isto tem inviabilizado, ainda que temporariamente, estudos sobre implicações funcionais de splicing alternativo no proteoma quando se utilizando dados estruturais experimentais. Entretanto, a bioinformática possibilita estudos deste porte com base nos dados de mapeamento no genoma, tanto de transcritos como de proteínas com estrutura tridimensional (3D) determinada. Torna-se possível, então, a prospecção de genes com isoformas de AS com estruturas 3D contendo informação adicional quando comparada à isoforma de AS. Produzimos para tal finalidade uma nova metodologia para detecção de eventos de AS no transcriptoma humano utilizando matrizes binárias para cada transcrito e estrutura de proteína 3D. Selecionadas as isoformas protéicas putativas, foram construídas 73 estruturas 3D utilizando conceitos de modelagem molecular por homologia. Foram escolhidas aleatoriamente 21 isoformas de AS para simulações por dinâmicas moleculares (SDM), e que cerca de 80% destes modelos se apresentaram estruturalmente estáveis. A anotação biológica relativa a cada fragmento não inserido na seqüência da proteína devido à sua remoção no mRNA resultante do evento de AS foi obtida e mostrou que mais de 80% delas possuem algum tipo de relevância funcional para a proteína. Concluímos que, para o nosso conjunto de dados, os eventos de splicing alternativo produzem isoformas que podem atuar como dominantes negativas, antagonistas ou atenuadoras da sua atividade biológica. / The post-genomic era has emerged as one prosper field to deal with the huge amount of sequences produced by genome projects and increase the understanding of its biological meaning. One of the most surprising mechanisms capable to generate a lot of protein diversity is alternative splicing in immature mRNAs. No more than 22% of the known protein structures elucidated by X-ray diffraction or nuclear magnetic resonance (NMR) were made using human proteins and the knowledge about alternative splicing functional implications is weak. Since those human protein three-dimensional structures (3D) are redundant, the unique number of human genes represented by them is estimated around 1%. Nowadays there are only a few cases describing two isoforms that have their own protein 3D structures done experimentally. The variety that alternative splicing can produce is large enough to structural genome projects undergoing could determinate its structures, fact that have negating, at least for a while, large-scale studies about functional implications of alternative splicing using experimental data. However, bioinformatics turn possible this kind of projects using the mapping onto the genome of transcripts and the sequence of the known protein 3D structures. Using this approach we searched for alternative splicing isoforms which have at least one known protein structure with additional biological information when compared against the isoform. We have produced a new methodology for detecting alternative splicing in the human transcriptoma using binary matrices for each transcript and known 3D protein structure. After the selection of putative isoforms, there were constructed 73 3D protein using concepts of molecular modelling by homology. There were randomly selected 21 of them to the submitted to molecular dynamics simulations and 80% of them showed that they were structurally stable. The biological annotation of each non-inserted fragment due to alternative splicing shows that 80% of them have in some degree functional importance. Then, we conclude that, for our dataset, the alternative splicing events produce isoforms that can act as negative dominants, antagonists or even regulators of their biological activity.

O gene, uma seqüência de nucleotídeos necessária para a síntese de moléculas funcionais, é transcrito e regulado por um conjunto de processos e fatores extremamente complexos. Entender o momento e o tecido em que os genes são expressos, as isoformas funcionais, as regiões controladoras e os fatores envolvidos na regulação da expressão de cada gene é um dos grandes desafios da biologia molecular moderna. Hoje, com a enorme quantidade de informações de seqüências genômicas e de transcriptomas, aliado ao desenvolvimento de métodos computacionais para agrupar e analisar estes dados em larga escala, o estudo dos fenômenos relacionados à transcrição e regulação gênica está passando por uma revolução. Por exemplo, é possível medir, concomitantemente, a expressão gênica de milhares de genes em diferentes tecidos, assim como identificar diversos fenômenos que atuam nestes genes. Neste trabalho nós desenvolvemos e aplicamos métodos computacionais no estudo de quatro temas envolvendo aspectos chave da transcrição e regulação gênica. No primeiro trabalho, nós abordamos a expressão gênica tecido-específica através do estudo dos genes expressos no cérebro e em dez regiões cerebrais de camundongo. No segundo trabalho, nós identificamos seqüências potencialmente envolvidas no controle da transcrição gênica através do estudo de motivos sobre representados na região promotora dos genes de receptores olfativos. No terceiro trabalho, analisamos o transcriptoma humano quanto a presença de eventos de retenção de intron, um tipo de splicing alternativo. No quarto trabalho, nós abordamos a complexidade do transcriptoma e a regulação da expressão gênica através do estudo de pares de genes senso-antisenso em humanos e camundongos. Em todos os trabalhos, obtivemos resultados que nos permitiram tirar conclusões específicas sobre cada fenômeno estudado e nos mostraram a importância de estudá-los através de uma abordagem em larga escala. Adicionalmente, verificamos que os nossos métodos computacionais foram eficientes e adequados para o estudo da transcrição e regulação gênica em Homo sapiens e Mus musculus. / Genes, nucleotide sequences necessary for the synthesis of functional molecules, are transcribed and regulated by extremely complex cellular and molecular processes. To understand when and in which tissues the genes are expressed, their functional isoforms, control regions and the factors involved in gene regulation is one of major challenges of modern molecular biology. Today, the availability of complete genome sequences and transcriptomes, together with the development of new computational methods allows the study of phenomena related to the transcription and gene regulation in a large scale. For example, it is possible to quantify, concomitantly, gene expression of thousands of genes in different tissues and analyze different aspects of their regulation. In this work we developed and applied computational methods to the study of four key aspects of gene transcription and regulation. In the first study, we addressed tissue specific gene expression through the study of genes that are preferentially expressed in the brain and ten different mouse brain regions. In the second study, we identified sequences that are potentially involved in the control of gene transcription through the study of motifs that are over represented in the promoter region of olfactory receptor genes. In the third study, we browsed the human for the presence of intron retention, a type of alternative splicing. In the fourth study, we addressed the transcriptoma complexity and gene expression regulation through the study of pair of sense-antisense genes in human and mouse. In all studies, our results allowed us to make specific conclusions about each phenomenon analyzed which showed us the importance of a large scale approach. In addition, we verified that our computational methods can be efficiently applied to the study of transcription and gene regulation in Homo sapiens and Mus musculus.

abstract: Multicellular organisms use precise gene regulation, executed throughout development, to build and sustain various cell and tissue types. Post-transcriptional gene regulation is essential for metazoan development and acts on mRNA to determine its localization, stability, and translation. MicroRNAs (miRNAs) and RNA binding proteins (RBPs) are the principal effectors of post-transcriptional gene regulation and act by targeting the 3'untranslated regions (3'UTRs) of mRNA. MiRNAs are small non-coding RNAs that have the potential to regulate hundreds to thousands of genes and are dysregulated in many prevalent human diseases such as diabetes, Alzheimer's disease, Duchenne muscular dystrophy, and cancer. However, the precise contribution of miRNAs to the pathology of these diseases is not known. MiRNA-based gene regulation occurs in a tissue-specific manner and is implemented by an interplay of poorly understood and complex mechanisms, which control both the presence of the miRNAs and their targets. As a consequence, the precise contributions of miRNAs to gene regulation are not well known. The research presented in this thesis systematically explores the targets and effects of miRNA-based gene regulation in cell lines and tissues. I hypothesize that miRNAs have distinct tissue-specific roles that contribute to the gene expression differences seen across tissues. To address this hypothesis and expand our understanding of miRNA-based gene regulation, 1) I developed the human 3'UTRome v1, a resource for studying post-transcriptional gene regulation. Using this resource, I explored the targets of two cancer-associated miRNAs miR-221 and let-7c. I identified novel targets of both these miRNAs, which present potential mechanisms by which they contribute to cancer. 2) Identified in vivo, tissue-specific targets in the intestine and body muscle of the model organism Caenorhabditis elegans. The results from this study revealed that miRNAs regulate tissue homeostasis, and that alternative polyadenylation and miRNA expression patterns modulate miRNA targeting at the tissue-specific level. 3) Explored the functional relevance of miRNA targeting to tissue-specific gene expression, where I found that miRNAs contribute to the biogenesis of mRNAs, through alternative splicing, by regulating tissue-specific expression of splicing factors. These results expand our understanding of the mechanisms that guide miRNA targeting and its effects on tissue-specific gene expression. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Molecular and Cellular Biology 2019