A indústria biotecnológica enzimática vem aumentando progressivamente nas últimas décadas com a utilização e produção de diversas enzimas microbianas. As amilases são enzimas que hidrolisam moléculas de amido liberando diversos produtos secundários, incluindo as dextrinas e progressivamente por unidades de glicose. Apresentam um amplo campo de aplicações na indústria de alimentos, em cervejarias e bebidas fermentadas, em cereais para alimentação infantil e ração animal, indústrias de papel e celulose, têxtil, de detergentes, química, farmacêutica e produtos de limpeza. Foram realizados ensaios de seleção em meio sólido para produção de amilase por 05 isolados de ambientes contaminados por petróleo em diferentes temperaturas (28 e 37 C), respectivamente. Os resultados obtidos evidenciaram que o isolado Bacillus licheniformis UCP 1009 apresentou a formação de halo característico de 55 mm para amilase, após 72 horas de incubação. Após a seleção do microrganismo, foram realizados fermentações para produção de amilase, substituindo o amido solúvel, pelo amido de milho e de batata, através de um planejamento fatorial 23 com quatro pontos centrais, tendo a variável de resposta a produção de amilase, durante 96 horas. Foram estabelecidos o perfil de crescimento microbiano, o pH, o consumo de glicose pelo método do DNS e a determinação da atividade específica da enzima. Os resultados obtidos evidenciaram que o amido de milho apresentou uma atividade específica de 0,756 U/mg, a um pH de 8,82 e uma atividade enzimática da amilase de 0,99 U/dL, demonstrando um potencial industrial / The enzymatic biotechnology industry is growing up progressively in the last decades with the utilization e production of diverse microbial enzymes. Amylases are enzymes which hydrolyze starch molecules to give diverse products including dextrin's and progressively glucose units. They play a wide field of applications. In food industries, in beer industry and others fermented drinks, in cereal for baby's food and animal feed, in paper and cellulose industry, textile industry, in detergent and cleaning products industry, in chemical and pharmaceutical industry. Screening was carrying out in solid media to amylase production in 5 strains isolated from contaminated ambient by petroleum in different temperatures (28 C and 37 C), respectively. The results obtained evidenced that the isolated Bacillus licheniformis UCP 1009 showed the halo formation characteristically of the 55 mm to amylase, after 72 hours of incubation. After the selection of the microorganism, fermentations was carrying out to amylase production, replacing the soluble starch, by corn starch and potato starch, trough of factorial planning 23 with 4 central's points, having a amylase's production as a answering variable, during 96 hours. The microbial growth profile was established, the pH, the glucose consumption by the DNS and determination of specific enzyme activity. The results obtained evidenced that the corn starch shown an specific activity of 0.756 U/mg, at a pH of 8.82 and a enzymatic activity of amylase 0.99 U/dL, showing a industrial potential

Orientador: Elias Basile Tambourgi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-07T08:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CurveloSantana_JoseCarlos_D.pdf: 2790492 bytes, checksum: 998c5d670d1553e55823381772bbddce (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Em atenção ao desenvolvimento de novas tecnologias é que neste trabalho foram feitos estudos de recuperação das enzimas a e b-amilases produzidas a partir das sementes de milho (Zea mays) em sistema de adsorção em leito expandido (ALE), para agregar valor a esta cultura, muito difundida em nosso país. Para tanto, foram feitas otimizações das etapas de produção do malte de milho, desde o processo de germinação (variando tempo) até a secagem (variando tempo e temperatura), para obter este produto com boa atividade enzimática. A caracterização hidrodinâmica da coluna de ALE foi feita para avaliar os efeitos dos: tampões fosfato (a 22°C) e Tris/HCl, com ou sem malte de milho, sobre a fluidização do leito contendo a resina de troca iônica Amberlite IRA 410. Durante a recuperação das enzimas usou-se como fatores a altura do leito fixo (4 cm) e expandido (8, 12, 16 cm), o pH (5, 6 e 7), e o tipo de tampão (fosfato ou Tris/HCl ambos a 0,05M), em condições constantes de eluição (NaCl 0,25M a 14mL/min). Os resultados mostraram que para se obter um malte com maior atividade enzimática deve-se parar a germinação das sementes no quarto dia e secá-las a 54°C por 5-6 h. A equação de Richardson-Zaki se ajustou à fluidização das resinas sobre o efeito dos fatores estudados, e o estudo de hidrodinâmica mostrou que altura do número de pratos teóricos (HETP), a dispersão axial (Daxial) e o número de Peclet (Pe) aumentaram com a elevação da altura e da porosidade do leito. O tampão fosfato aumentou a afinidade entre a resina e as enzimas, enquanto que o tampão Tris/HCl não promoveu adsorção das mesmas. A recuperação das amilases em leito expandido foi melhor que em leito fixo e aumentou usando 8 cm (grau de expansão dois) a pH 7. O fator de purificação foi de 500 vezes a atividade inicial, provavelmente por redução de impureza. Desta forma, este trabalho contribuiu para a obtenção de condições ótimas para se produzir as a e b-amilases a partir das sementes de milho (Zea mays), com alto potencial enzimático e boa aceitação comercial, e assim ele poderá agregar valor à cultura do milho / Abstract: Aiming to development of new technologies, in this work a and b-amylases recovery from maize (Zea mays) malt by expanded bed adsorption (EBA) was studied in order, to aggregate value to the maize culture which is diffused into our Country. Thus, the optimization of the manufacture steps of maize malt, since the germination (changing the time) until the drying process (changing of time and temperature) were make to obtain this product with good activity. The hydrodynamic characterization of EBA column was making to evaluation of effects of: phosphate (at 22°C) and Tris/HCl buffer, with or without maize malt, on the bed fluidization using the Amberlite IRA 410 ion-exchange resin. The effects of bed (4 cm) and expanded bed height (8, 12 and 16 cm), pH (5, 6 e 7) and buffer type (phosphate or Tris/HCl, both 0.05M) on enzyme recovery were observed under fixed conditions for elution (NaCl 0.25M at 14mL/min). The results showed that maize seeds germination must be stopped in the 4 days and drying process conducted at 54°C for 5-6 h, to obtain the maize malt with good enzymatic activity. Richardson-Zaki equation fitted to behavior of the resins fluidization on the effect of factors studied in this work, and the hydrodynamic study showed that height equivalent to the theoretical plates (HETP), axial dispersion (Daxial) and Peclet number (Pe) increased using higher bed height and voidage. The use of phosphate buffer increased to the affinity between resins and enzymes; while the Tris/HCl buffer was not promoted to enzymes adsorption on resins. Amylase recovery by expanded bed was more effective than fixed bed chromatography and increased using 8 cm (two expansion degrees) and pH 7. The purification factor was of 500 times, due to reduction of impurity. Thus, this work had contributed to found of optimal conditions of a e b-amylases production from maize (Zea mays) malt, at high enzymatic potential and good commercial acceptance, and in this way to aggregate value to the maize culture / Doutorado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Doutor em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:55:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cassiane Minelli.pdf: 1637307 bytes, checksum: b5227c9445b1a0b3f8dcc8fcef9bcfd3 (MD5) Previous issue date: 2013-06-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / One of the biggest successes of Brazilian agriculture is the Pro-Alcohol, whose base of support is the culture of sugar cane, which leaves a lapse of activity in the offseason. In view of this, several alchool industries have been investing in other cultures, where the starch is the primary source for the alcohol production. The pursuit of amylase in thermotolerant Bacillus sp. And rhizobia from Amazonian soils is a strategy to be used for the bio-industries to reduce or stop importing them. Mutation was made from two Bacillus sp. containing amylases by exposure to ultraviolet light. Also tested were 40 strains of rhizobia for the presence of thermophilic amylases. Enzyme assays were performed to check for amylase activity at different temperatures, times, pHs, thermal shock and thermal stability. The Bacillus sp. ITAAM 023M mutant showed higher amylolyse than mutant ITAAM 010M. The amylases of the two Bacillus sp mutants and rhizobias proved quite diverse as their characteristics, indicating they are different from each other. The temperature with higher amylase activity of the mutants ITAAM 010M and ITAAM 023M was 100 ˚C. Amylase from the mutant ITAAM 010M showed greater activity in pH 4.5, and from the ITAAM 023M at pH 7.5. Their amylases showed high sensitivity to thermal shock. Amylase from mutant ITAAM 010M showed high thermostability at temperature of 90 ˚C. The amylase from ITAAM 023M, at a temperature of 80˚C. The highest activity shown by ITAAM 010M amylase was 1.6 U / ml and the ITAAM 023M, 1.5 U / mL. From the 40 rhizobia, 17 grew well in culture medium containing starch, 19 produced amylolytic halo, and 11 proved to be thermophiles. Rhizobia INPA INPA R001 and INPA R020 showed the highest rates of amylolyse. Their amylase showed greater activity at 90˚C. Amylase of INPA R001 showed higher activity at 100˚C, and from INPA R020, 30˚C. Amylase from INPA R001 showed greater activity at pH 4.5 and from INPA R020, at pH 7.5. Their amylases showed high sensitivity to thermal shock. Amylase from INPA R020 showed higher thermostability at 90 °C and from INPA R001 at 100˚C. The higher activity shown by amylase of rhizobia INPA R001 was 1.6 U/mL, and from INPA R020, 7.5 U/mL / Um dos maiores sucessos da agricultura brasileira é o Pró-Álcool, cuja base de sustentação é a cultura da cana-de-açúcar, que deixa um lapso de atividade na entressafra. Em vista disso, diversas usinas vêm investindo em outras culturas, onde o amido é a fonte primária para a produção do álcool. A busca de amilases termotolerantes em Bacillus sp. e em rizóbios de solos da Amazônia é uma estratégia a ser usada para que as bioindústrias reduzam ou parem de importá-las. Foi feita a mutação de dois Bacillus sp. contendo amilases com exposição à luz ultravioleta. Foram testadas também, 40 estirpes de rizóbio quanto à presença de amilases termotolerantes. Foram feitos ensaios enzimáticos para a verificação de atividade amilolítica em diferentes temperaturas, tempos, pHs, choque térmico e termoestabilidade. O mutante de Bacillus sp. ITAAM 023M mostrou maior índice de amilolise do que o ITAAM 010M. As amilases dos dois mutantes de Bacillus sp e dos rizóbios mostraram-se bem diversificadas quanto às suas características, indicando serem diferentes umas das outras. A temperatura com maior atividade das amilases dos mutantes ITAAM 010M e ITAAM 023M foi 100˚C. A amilase do mutante ITAAM 010M mostrou maior atividade em 4,5, e a do ITAAM 023M em pH 7,5. Suas amilases mostraram alta sensibilidade ao choque térmico. A amilase do mutante ITAAM 010M mostrou maior termoestabilidade na temperatura de 90˚C. A do ITAAM 023M, na temperatura de 80˚C. A maior atividade mostrada pela amilase do ITAAM 010M foi de 1,6 U/mL e a do ITAAM 023M, 1,5 U/mL. Dos 40 rizóbios, 17 cresceram bem em meio de cultura contendo amido, 19 produziram halo amilolítico e 11 se mostraram termofílicos. Os rizóbios INPA R001 e INPA R020 mostraram os maiores índices de amilolise. Suas amilases mostraram maior atividade a 90˚C. A amilase do INPA R001 mostrou maior atividade a 100˚C, e a do INPA R020 a 30˚C. A amilase do INPA R001 mostrou maior atividade no pH 4,5 e a do INPA R020 no pH 7,5. Suas amilases mostraram alta sensibilidade ao choque térmico. A amilase do INPA R020 mostrou maior termoestabilidade a 90ºC e a do INPA R001 a 100˚C. A maior atividade amilolítica mostrada pela amilase do rizóbio INPA R001 foi de 1,6 U/mL e a do rizóbio INPA R020, 7,5 U/mL

Este trabalho objetivou coletar e isolar fungos filamentosos de diferentes regiões do estado de São Paulo com potenciais para produção de enzimas amilolíticas com características físico-químicas desejáveis para aplicação industrial. Foram coletados 19 fungos nas três coletas realizadas e estes juntamente com outros cinco fungos, isolados anteriormente durante o projeto Biota/FAPESP, foram submetidos a uma seleção para a escolha do melhor produtor de amilases. Aspergillus niveus foi o que melhor produziu amilases nas condições avaliadas e foi tomado para dar continuidade ao trabalho. A etapa seguinte consistiu em avaliar as melhores condições de cultivo para a produção das amilases. Os maiores níveis de atividade enzimática foram detectados em meio Khanna, em cultivos estáticos, pH inicial 6,0, a 40°C, com 72 horas de crescimento. Milho moído, farinha de aveia, palha de arroz, maisena, amido solúvel, casca de mandioca, maltose, farelo de trigo, penetrose, amilopectina e rafinose foram as fontes de carbono que melhor induziram a síntese de amilases. Extratos enzimáticos de A. niveus obtidos sob condições ótimas de cultivo, foram submetidos a eluição em diferentes colunas cromatográficas (DEAE-Fragtogel e Sephacryl S-200) e três amilases foram purificadas (uma glucoamilase e 2 a-glucosidases- I e II), cujas massas moleculares determinadas por SDS-PAGE corresponderam à 77, 59 e 55 kDa. Os pontos isoelétricos e o conteúdo de carboidrato corresponderam respectivamente a de 3,8 e 15% para glucoamilase, 6,6 e 4% para a-glucosidase I e 6,8 e 29% para a- glucosidase II. O pH ótimo para atividade de glucoamilase foi de 5,0-5,5 e pH 6,0 para a atividade de a-glucosidase I e II. A temperatura ótima para as três enzimas foi de 65°C e as mesmas apresentaram boa estabilidade a 60 e 65°C. A glucoamilase apresentou alta afinidade para o amido, já a a-glucosidase I apresentou alta afinidade para amido, glicogênio e maltose. A maior eficiência catalítica foi verificada na presença de VII glicogênio, seguido de amido e maltose. A a-glucosidase II apresentou atividade sobre vários substratos e os valores de Kcat/Km obtidos mostraram maior preferência dessa enzima pelo glicogênio, seguido de amido, amilopectina, maltose e -NPG. A análise de Dicroísmo Circular demonstrou que as três amilases são ricas em a-hélices nas suas estruturas secundárias e o sequenciamento de aminoácidos revelou similaridade da glucoamilase de A. niveus com glucoamilases de A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi e A. shirousami. O sequenciamento das a-glucosidases I e II revelaram homologia destas com a-glucosidase de A. fumigatus. Estudos do efeito de N-glicanas nas propriedades das enzimas foram avaliados mediante tratamento do meio de cultivo com tunicamicina. A glucoamilase e a a-glucosidase I perderam significativamente a especificidade pelo substrato, já a a-glucosidase II perdeu termoestabilidade com a remoção das N-glicanas. Glucoamilase e a-glucosidase II foram imobilizadas em suportes com interação iônica e por ligação covalente. Os suportes trocadores iônicos usados foram Glioxil-PEI, Glioxil-MANAE, DEAESephacel e Sepharose Q. Os suportes utilizados para interação covalente foram agarose ativada com brometo de cianogênio (BrCN) e Glioxil-Agarose, pH 10,5. A estabilidade apresentada com os derivados formados por ligações covalentes foi maior que aquela apresentada para os derivados formados a partir de ligações iônicas. O uso da trealose como aditivo aumentou significativamente a estabilidade de todos os derivados / This study aimed to collect and isolate filamentous fungi from different regions of São Paulo state with potential for amylases production with desirable physical and chemical characteristics for industrial application. It was collected 19 fungi during three different expeditions. These fungi with other five microorganisms previously isolated during the Biota project were submitted to screening tests to select a good amylases producer. Aspergillus niveus was one of the best amylase producers under experimental conditions and was chosen to continue this work. The next step was to determine the best growth conditions for the amylases production. The highest levels of enzymatic synthesis were detected in Khanna medium under static conditions, initial pH 6.0, at 40°C during 72 hours. Corn, oatmeal, rice straw, corn starch, soluble starch, cassava peel, maltose, wheat bran, penetrose, amylopectin and raffinose were the best carbon sources for amylase production. Enzymatic extracts from A. niveus obtained under the optimal culture conditions, were loaded in different chromatography columns (DEAE-Fragtogel and Sephacryl S200) where three amylases were purified (a glucoamylase and two a-glucosidases, named I and II), whose molecular weights determined by SDS-PAGE corresponded to 77, 59 and 55 kDa. The isoelectric points and carbohydrate content were 3.8 and 15% for glucoamylase, 6.6 and 4% for -glucosidase I and 6.8 and 29% for -glucosidase II, respectively. The glucoamylase optimum pH was 5.0-5.5 and 6.0 for -glucosidases I and II. The optimum reaction temperatures were 65° C for all studied enzymes and all of them showed stability at 60 and 65°C. The glucoamylase presented high affinity for starch and -glucosidase I presented high affinity for starch, glycogen and maltose. The highest catalytic efficiency was observed using glycogen, starch and maltose as substrates. The -glucosidase II hydrolyzed several substrates and the kcat/Km values showed greater performance under glycogen, followed by starch, amylopectin, maltose and -NPG hydrolysis. The Circular Dichroism (CD) analyses showed that all the studied amylases were predominantly constituted by -helices in its secondary structure. The amino acid sequencing revealed similarity among the glucoamylase from A. niveus, A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi and A. shirousami. Comparing the sequencing of a-glucosidases I and II from A. niveus, both showed homology with other a-glucosidases from A. fumigatus. Studies about the effect of N-glycans under enzymatic properties were done by addition of tunicamycin in the culture medium. Glucoamylase and a-glucosidase I lost significantly their substrate specificity, and a- glucosidase II lost its thermostability after the N-glycans removal. Glucoamylase and a- glucosidase II were immobilized in ionic interaction supporters and by covalent bonds. The ion exchangers supporters used were glyoxylic-PEI, glyoxylic-MANA, DEAESephacel and Sepharose Q. The supporters used for covalent interaction were agarose activated with cyanogen bromide (BRCN) and glyoxylic-Agarose, pH 10.5. The stability presented with derivatives formed by covalent bonds was higher than those reported for the derivatives formed from ionic bonds. The use of trehalose as an additive really improved the stability of all derivatives.

Orientador: Taís de Souza Barbosa / Texto em inglês e português / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-25T06:55:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amato_JulianaNeide_M.pdf: 1027609 bytes, checksum: 3cbd740a1aa393a89f3a3c9d7e1a944a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Objetivo: Este estudo objetivou avaliar a presença de bruxismo do sono, maloclusões e disfunções orofaciais bem como os níveis salivares de cortisol e alfa-amilase em crianças asmáticas. Material e Métodos: A amostra consistiu de 108 crianças, de ambos os gêneros, com idade entre sete e nove anos, selecionados da Policlínica Santa Teresinha Doutor Antonio Haddad Dib (grupo com asma, n=53) e das escolas públicas (grupo controle, n=55), ambos do município de Piracicaba, SP, Brasil. O diagnóstico de bruxismo do sono foi confirmado pelo relato dos pais sobre ranger os dentes (pelo menos três vezes por semana) e pela presença de facetas de desgaste em incisivos e/ou molares permanentes. O Índice de Necessidade de Tratamento Ortodôntico ¿ Componente Dentário (IOTN-DHC) foi utilizado para avaliar a oclusão. As disfunções orofaciais foram avaliadas pela versão Brasileira do Nordic Orofacial Test-Screening (NOT-S). O cortisol salivar (?g/dl) e a alfa-amilase (U/ml) foram analisador por kit enzimaimunoensaio. Os dados foram expressos em "resposta ao acordar" (RA), calculada pela diferença entre os valores imediatamente ao acordar e 30 minutos após acordar, e "declínio diurno" (DD), calculado pela diferença entre os valores 30 minutos após acordar e antes de dormir. Os dados foram analisados utilizando os testes Shapiro Wilk/Kolmogorov-Smirnov, Qui-quadrado, teste t não pareado/Mann-Whitney e teste t pareado/Wilcoxon. Resultados: O bruxismo foi mais prevalente em crianças com asma do que controles (47,2% vs. 27,3%, p<0.05). Mais de metade das crianças com asma apresentaram gravidade intermitente (50,9%, p<0.001). O grupo com asma apresentou maiores escores do NOT-S total e entrevista do que o grupo controle (p<0.05). Sintomas de disfunções orais relacionados a (I) Função Sensorial e (IV) Mastigação e Deglutição foram mais frequentes em crianças com asma do que controles (p<0.05). A RA de cortisol salivar no final de semana foi significativamente maior no grupo com asma do que controles (p<0.05). No grupo controle, o DD de cortisol salivar foi significativamente maior em dia de semana do que no final de semana (p<0.05). Conclusões: A presença de asma em crianças esteve associada com sinais e sintomas de bruxismo do sono, percepção negativa das funções sensoriais, mastigação e deglutição e maior concentração de cortisol salivar no final de semana / Abstract: Objective: This study aimed to evaluate the presence sleep bruxism, malocclusions and orofacial dysfunctions as well as the salivary levels of cortisol and alpha-amylase in asthmatic children. Material and Methods: The sample consisted of 108 children of both genders in the age-range from seven to nine years, selected from Policlinic Santa Teresinha Doutor Antonio Haddad Dib (asthma group, n=53) and from public schools (control group, n=55), both of Piracicaba, SP, Brazil. Sleep bruxism diagnosis was confirmed by parental report of grinding sounds (at least three times a week) and the presence of shiny and polish facets on incisors and/or first permanent molars. The Index of Orthodontic Treatment Need ¿ Dental Health Component (IOTN-DHC) was used for occlusion evaluation. Orofacial dysfunctions were evaluated using the Brazilian Portuguese version of the Nordic Orofacial Test-Screening (NOT-S). Salivary cortisol (?g/dl) and alpha-amylase (U/ml) were assayed using enzyme immunoassay kit. These data were expressed as ``awakening response¿¿ (AR), calculated as the difference between levels immediately after awakening and 30 min after waking, and "diurnal decline" (DD), calculated as the difference between levels at 30 min after waking and at bedtime. Data were analyzed using Shapiro-Wilk/Kolmogorov-Smirnov, Chi-square, unpaired t test/Mann-Whitney and paired t/Wilcoxon tests. Results: Sleep bruxism was more prevalent in children with asthma than controls (47.2% vs. 27.3%, p<0.05). More than half of the asthmatic children had intermittent severity (50.9%, p<0.001). The asthma group had higher scores of NOT-S total and interview than control group (p<0.05). Symptoms of oral dysfunctions related to (I) Sensory Function and (IV) Chewing and Swallowing were more frequent in children with asthma than controls (p<0.05). Salivary cortisol AR on weekend was significantly higher for asthma group than controls (p<0.05). In control group, salivary cortisol DD was significantly higher on weekday than weekend (p<0.05). There were no significant differences in alpha-amylase values in and between groups. Conclusions: The presence of asthma in children was associated with signs and symptoms of sleep bruxism, negative perception of sensory, chewing and swallowing functions, and higher concentrations of salivary cortisol on weekend / Mestrado / Odontopediatria / Mestra em Odontologia

Este trabalho objetivou coletar e isolar fungos filamentosos de diferentes regiões do estado de São Paulo com potenciais para produção de enzimas amilolíticas com características físico-químicas desejáveis para aplicação industrial. Foram coletados 19 fungos nas três coletas realizadas e estes juntamente com outros cinco fungos, isolados anteriormente durante o projeto Biota/FAPESP, foram submetidos a uma seleção para a escolha do melhor produtor de amilases. Aspergillus niveus foi o que melhor produziu amilases nas condições avaliadas e foi tomado para dar continuidade ao trabalho. A etapa seguinte consistiu em avaliar as melhores condições de cultivo para a produção das amilases. Os maiores níveis de atividade enzimática foram detectados em meio Khanna, em cultivos estáticos, pH inicial 6,0, a 40°C, com 72 horas de crescimento. Milho moído, farinha de aveia, palha de arroz, maisena, amido solúvel, casca de mandioca, maltose, farelo de trigo, penetrose, amilopectina e rafinose foram as fontes de carbono que melhor induziram a síntese de amilases. Extratos enzimáticos de A. niveus obtidos sob condições ótimas de cultivo, foram submetidos a eluição em diferentes colunas cromatográficas (DEAE-Fragtogel e Sephacryl S-200) e três amilases foram purificadas (uma glucoamilase e 2 a-glucosidases- I e II), cujas massas moleculares determinadas por SDS-PAGE corresponderam à 77, 59 e 55 kDa. Os pontos isoelétricos e o conteúdo de carboidrato corresponderam respectivamente a de 3,8 e 15% para glucoamilase, 6,6 e 4% para a-glucosidase I e 6,8 e 29% para a- glucosidase II. O pH ótimo para atividade de glucoamilase foi de 5,0-5,5 e pH 6,0 para a atividade de a-glucosidase I e II. A temperatura ótima para as três enzimas foi de 65°C e as mesmas apresentaram boa estabilidade a 60 e 65°C. A glucoamilase apresentou alta afinidade para o amido, já a a-glucosidase I apresentou alta afinidade para amido, glicogênio e maltose. A maior eficiência catalítica foi verificada na presença de VII glicogênio, seguido de amido e maltose. A a-glucosidase II apresentou atividade sobre vários substratos e os valores de Kcat/Km obtidos mostraram maior preferência dessa enzima pelo glicogênio, seguido de amido, amilopectina, maltose e -NPG. A análise de Dicroísmo Circular demonstrou que as três amilases são ricas em a-hélices nas suas estruturas secundárias e o sequenciamento de aminoácidos revelou similaridade da glucoamilase de A. niveus com glucoamilases de A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi e A. shirousami. O sequenciamento das a-glucosidases I e II revelaram homologia destas com a-glucosidase de A. fumigatus. Estudos do efeito de N-glicanas nas propriedades das enzimas foram avaliados mediante tratamento do meio de cultivo com tunicamicina. A glucoamilase e a a-glucosidase I perderam significativamente a especificidade pelo substrato, já a a-glucosidase II perdeu termoestabilidade com a remoção das N-glicanas. Glucoamilase e a-glucosidase II foram imobilizadas em suportes com interação iônica e por ligação covalente. Os suportes trocadores iônicos usados foram Glioxil-PEI, Glioxil-MANAE, DEAESephacel e Sepharose Q. Os suportes utilizados para interação covalente foram agarose ativada com brometo de cianogênio (BrCN) e Glioxil-Agarose, pH 10,5. A estabilidade apresentada com os derivados formados por ligações covalentes foi maior que aquela apresentada para os derivados formados a partir de ligações iônicas. O uso da trealose como aditivo aumentou significativamente a estabilidade de todos os derivados / This study aimed to collect and isolate filamentous fungi from different regions of São Paulo state with potential for amylases production with desirable physical and chemical characteristics for industrial application. It was collected 19 fungi during three different expeditions. These fungi with other five microorganisms previously isolated during the Biota project were submitted to screening tests to select a good amylases producer. Aspergillus niveus was one of the best amylase producers under experimental conditions and was chosen to continue this work. The next step was to determine the best growth conditions for the amylases production. The highest levels of enzymatic synthesis were detected in Khanna medium under static conditions, initial pH 6.0, at 40°C during 72 hours. Corn, oatmeal, rice straw, corn starch, soluble starch, cassava peel, maltose, wheat bran, penetrose, amylopectin and raffinose were the best carbon sources for amylase production. Enzymatic extracts from A. niveus obtained under the optimal culture conditions, were loaded in different chromatography columns (DEAE-Fragtogel and Sephacryl S200) where three amylases were purified (a glucoamylase and two a-glucosidases, named I and II), whose molecular weights determined by SDS-PAGE corresponded to 77, 59 and 55 kDa. The isoelectric points and carbohydrate content were 3.8 and 15% for glucoamylase, 6.6 and 4% for -glucosidase I and 6.8 and 29% for -glucosidase II, respectively. The glucoamylase optimum pH was 5.0-5.5 and 6.0 for -glucosidases I and II. The optimum reaction temperatures were 65° C for all studied enzymes and all of them showed stability at 60 and 65°C. The glucoamylase presented high affinity for starch and -glucosidase I presented high affinity for starch, glycogen and maltose. The highest catalytic efficiency was observed using glycogen, starch and maltose as substrates. The -glucosidase II hydrolyzed several substrates and the kcat/Km values showed greater performance under glycogen, followed by starch, amylopectin, maltose and -NPG hydrolysis. The Circular Dichroism (CD) analyses showed that all the studied amylases were predominantly constituted by -helices in its secondary structure. The amino acid sequencing revealed similarity among the glucoamylase from A. niveus, A. terreus, A. niger, A. ficcum, A. awamori, A. kawachi and A. shirousami. Comparing the sequencing of a-glucosidases I and II from A. niveus, both showed homology with other a-glucosidases from A. fumigatus. Studies about the effect of N-glycans under enzymatic properties were done by addition of tunicamycin in the culture medium. Glucoamylase and a-glucosidase I lost significantly their substrate specificity, and a- glucosidase II lost its thermostability after the N-glycans removal. Glucoamylase and a- glucosidase II were immobilized in ionic interaction supporters and by covalent bonds. The ion exchangers supporters used were glyoxylic-PEI, glyoxylic-MANA, DEAESephacel and Sepharose Q. The supporters used for covalent interaction were agarose activated with cyanogen bromide (BRCN) and glyoxylic-Agarose, pH 10.5. The stability presented with derivatives formed by covalent bonds was higher than those reported for the derivatives formed from ionic bonds. The use of trehalose as an additive really improved the stability of all derivatives.

The aim of this diploma thesis was to study the possibility of using waste bread to bioproduction of selected metabolites. As bakery waste was used waste bread that came from coffee-house “Zastávka”. Bread was pre-treated by grinding into small particles and then it was made to form 15% w/v suspension, which was subjected to enzymatic hydrolysis. For the hydrolysis has been used the -amylase for liquefaction of the substrate and that was followed by a glucoamylase which sacharificated the substrate. There have been several methods of hydrolysis from which was chosen the optimal method for pre-treatment of the substrate prior to fermentation. The effectivity and a process of hydrolysis were determined spectrophotometrically by Somogyi-Nelson method. Final yields of glucose from hydrolysis were determined by HPLC method. Enzymatic hydrolysis was followed by fermentation, which was carried out in two ways, namely by adjusting the pH of the hydrolyzate to pH 5, and without pH adjustment. During the fermentation was carried out sampling in which was determined the content of glucose, glycerol and ethanol by HPLC method. The yeasts Saccharomyces cerevisiae were used for the fermentation which was performed at 30 °C. High yield of glucose was achieved by hydrolysis in two steps (70,28 gl-1), but for the fermentation was used mixed hydrolysis (second method of mixed hydrolysis) with yield 67,94 gl-1. High ethanol yield was achieved during fermentation without treatment pH, namely 31,5 gl-1.

Orientador: Paulo Cezar Ceresini / Resumo: Rhizoctonia solani AG-1 IA é um patógeno habitante do solo que causa doenças em pastagens e plantas cultivadas, em vários estados brasileiros. Para penetrar e colonizar os tecidos do hospedeiro, o microrganismo utiliza enzimas que podem ser de interesse biotecnológico e industrial. O objetivo do presente trabalho foi produzir e caracterizar a α-amilase secretada por R. solani AG-1 IA utilizando produtos e resíduos agroindustriais como substratos para fermentação. Para todos os ensaios foi adotado o processo de cultivo em estado sólio (CES) à temperatura de 25 °C e umidade inicial de 60%. Inicialmente, nove isolados de R. solani provenientes de diferentes hospedeiros (arroz, braquiária e soja) foram comparados quanto à produção amilolítica. As maiores atividades enzimáticas foram proporcionadas pelos isolados TO_022 e MT_SO85, procedentes da cultura da soja. Na etapa seguinte, foi avaliado o efeito do substrato sobre a produção enzimática. Farelo de trigo (12,98 U mL-1; TO_022), farelo de soja (3,97 U mL-1; MT_SO85) e braquiária lavada (4,95 U mL-1; TO_022) induziram eficientemente a produção amilolítica. O perfil de produção enzimática no farelo de trigo, melhor substrato avaliado no cultivo, indicou o tempo de 216 h como o mais apropriado para a obtenção de α-amilases pelo isolado TO_022 (22,14 U mL-1), e 240 h para o isolado MT_SO85 (22,84 U mL-1). Para caracterização físico-química da enzima foi utilizado o extrato enzimático bruto do isolado TO_022. A α-amilase de R. sola... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Rhizoctonia solani AG-1 IA is a soil-borne pathogen that causes diseases in pastures and cultivated plants in several Brazilian states. To penetrate and colonize host tissues, the microorganism uses enzymes that may be of biotechnological and industrial interest. The aim of the present work was to produce and characterize the α-amylase secreted by R. solani AG-1 IA using agroindustrial products and residues as substrates for fermentation. For all the tests, the solid state cultivation process (SSC) at 25 °C and initial humidity of 60% was adopted. Initially, nine isolates of R. solani from different hosts (rice, Brachiaria grass and soybean) were compared for amylolytic production. The major enzymatic activities were provided by the isolates TO_022 and MT_SO85, from the soybean crop. In the next step, the effect of the substrate on the enzymatic production was evaluated. Wheat bran (12.98 U mL-1; TO_022), soybean meal (3.97 U mL-1, MT_SO85) and washed ruzigrass (4.95 U mL-1; TO_022) efficiently induced amylolytic production. The enzymatic production profile in wheat bran, the best substrate evaluated in the culture, indicated the time of 216 h as the most appropriate to obtain α-amylases by the TO_022 isolate (22.14 U mL-1), and 240 h for the isolated MT_SO85 (22.84 U mL-1). For the physicochemical characterization of the enzyme, the crude enzymatic extract of the TO_022 isolate was used. The α-amylase of R. solani TO_022 exhibited maximum activity at 55 °C and pH 5.5, and ma... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by LOUISE GARBELOTTI GONÇALVES (lou_ise_gg@hotmail.com) on 2016-05-31T17:27:57Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_GONÇALVES, Louise G._2016.pdf: 1045451 bytes, checksum: 2b2d475a38ba54ed6a247190f4fc82b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-05-31T17:56:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 goncalves_lg_me_rcla.pdf: 1045451 bytes, checksum: 2b2d475a38ba54ed6a247190f4fc82b0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-31T17:56:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 goncalves_lg_me_rcla.pdf: 1045451 bytes, checksum: 2b2d475a38ba54ed6a247190f4fc82b0 (MD5) Previous issue date: 2016-04-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O desenvolvimento de bioprocessos para produção de alimentos e energia, que utilizam resíduos agroindustriais como matéria-prima, é alvo de intensas pesquisas no mundo devido às limitações de novas fronteiras agrícolas e de fontes de energia renováveis. A utilização de enzimas nesses processos produtivos surge como uma forte tendência, dentre elas, as amilases. O objetivo desse estudo foi a otimização da produção de amilases empregando o fungo Rhizopus microsporus var. oligosporus, cultivado em Fermentação em Estado Sólido (FES), tendo como substrato os resíduos agroindustriais: farelo de trigo, bagaço de mandioca e bagaço de cana de açúcar. O hidrolisado obtido da hidrólise do bagaço de mandioca foi avaliado quanto à sua fermentabilidade por meio da fermentação alcoólica em batelada alimentada por Saccharomyces cerevisiae. A melhor fonte de carbono como substrato para formulação do meio de cultivo foi aquele contendo 100% de farelo de trigo. Em relação às fontes de nutrientes para produção de amilases, a maior atividade amilolítica (418 U/g) foi para a solução de nutrientes contendo (%): 1,34 de sulfato de amônio, 0,54 de monofosfato de amônio (MAP) e 1,86 de ureia. Porém, foi observado que, ao acrescentar um mínimo de 0,01 % (m/m) de extrato de levedura na solução de nutrientes, obteve-se aumento na atividade amilolítica de 418 U/g para 551 U/g. A hidrólise enzimática do bagaço de mandioca foi feita com a associação de celulases comerciais (Novozyme) (10 FPU/g no tempo zero horas) e com o extrato amilolítico (12 U/g no tempo 10 horas de reação) produzido em FES para a obtenção de um hidrolisado concentrado. Com estas condições foi possível converter 63% de bagaço em açúcares redutores com predomínio de glicose. Por meio da fermentação alcoólica em batelada alimentada por Saccharomyces cerevisiae, obteve-se eficiências de 74,6 e 76,8%, e produtividades etanólicas com 3,14 g L-1h-1 e 1,61 g L-1h-1 em 12 e 24 h, respectivamente. A produção de etanol a partir de um hidrolisado de bagaço de mandioca nas condições de hidrólise proposta foi possível, o que corresponde a uma alternativa à tecnologia da cana-de-açúcar para produção deste biocombustível. / The development of bioprocesses for food and energy production, which makes use of agricultural waste as raw material, is focus of intense research around the world due to limitations on new agricultural frontiers and on renewable energy sources. The use of enzymes in these processes emerges as a strong trend, among them, amylases. The aim of this study was the amylase production optimization employing fungus Rhizopus microsporus var. oligosporus, grown by Solid Station Fermentation (SSF), using as substrate these agricultural waste: wheat bran, cassava bagasse and sugarcane bagasse. The hydrolizate obtained from cassava bagasse hydrolysis was evaluated with regards to its fermentability through fed-batch alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae. The best carbon source as substrate for the culture medium formulation was the one containing 100% wheat bran. Regarding salts sources for amylases production, the higher amylolytic activity (418 U/g) was for the nutrient solution containing (%): ammonium sulfate 1.34; ammonium monophosphate 0.54 and urea 1.86. However, the addiction of 0.01% (w/w) yeast extract in salts solution, amylolytic activity increased from 418 U/g to 551 U/g. The enzymatic hydrolysis of cassava bagasse was performed with the combination of commercial cellulases (Novozyme) (10 FPU/g at time zero hours) and the amylolytic extract (12 U/g at time 10 hours) produced by SSF to obtain a hydrolizate concentrate. With these conditions it was possible to convert 63% of bagasse in reducing sugars predominantly glucose. Through the fed-batch alcoholic fermentation tests by Saccharomyces cerevisiae, efficiencies were determined as 74.6 and 76.8%, and the ethanolic productivities with 3.14 gL-1h-1 and 1.61 gL-1h-1, at 12 and 24 h, respectively. Ethanol production from cassava bagasse hydrolyzate in hydrolysis conditions proposal was possible, which corresponds to an alternative technology of sugarcane for production of biofuel.

Submitted by Biblioteca Central (biblioteca@unicap.br) on 2017-12-13T18:19:23Z No. of bitstreams: 1 dissertacao_daniel_paulo_oliveira.pdf: 38291048 bytes, checksum: cb2f1b941a2d83e08674ae871266ad51 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-13T18:19:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_daniel_paulo_oliveira.pdf: 38291048 bytes, checksum: cb2f1b941a2d83e08674ae871266ad51 (MD5) Previous issue date: 2007-08-08 / The enzymatic biotechnology industry is growing up progressively in the last decades with the utilization e production of diverse microbial enzymes. Amylases are enzymes which hydrolyze starch molecules to give diverse products including dextrin's and progressively glucose units. They play a wide field of applications. In food industries, in beer industry and others fermented drinks, in cereal for baby's food and animal feed, in paper and cellulose industry, textile industry, in detergent and cleaning products industry, in chemical and pharmaceutical industry. Screening was carrying out in solid media to amylase production in 5 strains isolated from contaminated ambient by petroleum in different temperatures (28 °C and 37 °C), respectively. The results obtained evidenced that the isolated Bacillus licheniformis UCP 1009 showed the halo formation characteristically of the 55 mm to amylase, after 72 hours of incubation. After the selection of the microorganism, fermentations was carrying out to amylase production, replacing the soluble starch, by corn starch and potato starch, trough of factorial planning 23 with 4 central's points, having a amylase's production as a answering variable, during 96 hours. The microbial growth profile was established, the pH, the glucose consumption by the DNS and determination of specific enzyme activity. The results obtained evidenced that the corn starch shown an specific activity of 0.756 U/mg, at a pH of 8.82 and a enzymatic activity of amylase 0.99 U/dL, showing a industrial potential. / A indústria biotecnológica enzimática vem aumentando progressivamente nas últimas décadas com a utilização e produção de diversas enzimas microbianas. As amilases são enzimas que hidrolisam moléculas de amido liberando diversos produtos secundários, incluindo as dextrinas e progressivamente por unidades de glicose. Apresentam um amplo campo de aplicações na indústria de alimentos, em cervejarias e bebidas fermentadas, em cereais para alimentação infantil e ração animal, indústrias de papel e celulose, têxtil, de detergentes, química, farmacêutica e produtos de limpeza. Foram realizados ensaios de seleção em meio sólido para produção de amilase por 05 isolados de ambientes contaminados por petróleo em diferentes temperaturas (28 e 37 °C), respectivamente. Os resultados obtidos evidenciaram que o isolado Bacillus licheniformis UCP 1009 apresentou a formação de halo característico de 55 mm para amilase, após 72 horas de incubação. Após a seleção do microrganismo, foram realizados fermentações para produção de amilase, substituindo o amido solúvel, pelo amido de milho e de batata, através de um planejamento fatorial 23 com quatro pontos centrais, tendo a variável de resposta a produção de amilase, durante 96 horas. Foram estabelecidos o perfil de crescimento microbiano, o pH, o consumo de glicose pelo método do DNS e a determinação da atividade específica da enzima. Os resultados obtidos evidenciaram que o amido de milho apresentou uma atividade específica de 0,756 U/mg, a um pH de 8,82 e uma atividade enzimática da amilase de 0,99 U/dL, demonstrando um potencial industrial.