Le trafic intracellulaire est un processus fondamental qui maintient l'homéostasie cellulaire. Les RAB GTPases sont des régulateurs clés du trafic intracellulaire. RAB6 est la RAB résidente la plus abondante du Golgi. RAB6 est un régulateur clé de l'homéostasie Golgienne. Mon projet de thèse s'est intéressé à l'étude de la fonction de RAB6 dans la sécrétion post-Golgienne. Des études précédentes ont montré que la déplétion de RAB6 inhibe l'arrivée à la membrane plasmique de différents cargos : dans des cellules HeLa, NPY et VSV-G, et TNFα dans les macrophages. Nous avons donc émis l'hypothèse que RAB6 pourrait être un régulateur général de la sécrétion post-Golgienne. A l'aide de cellules MEFs RAB6 KO, nous avons d'abord montré que la sécrétion de toutes les protéines nouvellement synthétisées est inhibée. Pour comprendre les mécanismes entraînant cet effet, nous avons étudié le rôle de RAB6 dans le transport post-Golgien de trois types différents de cargos : GPI-APs (PLAP et CD59), collagen X, une protéine soluble, et une protéine transmembranaire TNFα. Afin de synchroniser le transport de cargos, nous avons utilisé le système RUSH. Ainsi, nous avons montré que RAB6 est présent sur les vésicules post-Golgiennes contenant les 3 types de cargos et que la déplétion de RAB6 affecte leur sécrétion. Les effecteurs de RAB6 sont aussi impliqués: Myosine II dans leur fission du Golgi, KIF5B dans leur transport vers la périphérie cellulaire, ELKS dans leur arrimage à la membrane plasmique. Finalement, nous avons pu montrer que les 3 cargos sont présents dans les mêmes vésicules post-Golgiennes avec RAB6. Ces résultats montrent que RAB6 régule la sécrétion de différents cargos. / Intracellular trafficking is a fundamental process which ensures cell homeostasis. RAB GTPases are key regulators of intracellular trafficking. RAB6 is the most abundant Golgi resident RAB and is a key regulator of Golgi homeostasis. My Ph.D project focused on understanding the function of RAB6 in post-Golgi secretion.Previous reports have shown that RAB6 depletion impairs the arrival at the plasma membrane of different cargoes: in HeLa cells, NPY and VSV-G and TNFα in macrophages. We thus hypothesized that RAB6 could be a general regulator of post-Golgi transport steps. Using MEF cells from RAB6 KO mice, we first showed that the secretion of all newly synthesized proteins is affected. To decipher the mechanisms leading to this inhibition, we have then investigated the role of RAB6 in the post-Golgi transport of three different classes of proteins, GPI-anchored proteins (such as Placental Alkaline phosphatase or PLAP and CD59), collagen X, a soluble protein, and the transmembrane protein TNFα. In order to synchronize transport of newly-synthetized cargoes along the secretory pathway, we used the RUSH system. Here, we show that RAB6 is present on post Golgi vesicles containing the three types of cargo and that RAB6 depletion affects their secretion to the plasma membrane. RAB6 effectors are also implicated: Myosin II for their fission from the Golgi, KIF5B for their transport to the cell periphery, ELKS/RAB2IP2 for their docking with the plasma membrane. Finally, we could show that these three cargoes are present in the same post-Golgi transport carriers with RAB6. Altogether, these results show that RAB6 regulates the secretion of a wide number of cargo proteins.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

C. albicans est le pathogène opportuniste le plus fréquemment incriminé lors de candidoses nosocomiales. Sa paroi est une cible majeure pour le développement de nouvelles molécules thérapeutiques. Une classe majoritaire des protéines de paroi est composée par les protéines à ancre GPI dont la famille la plus étendue est représentée par les protéines Iff. La fonction des 12 protéines Iff est largement inconnue, mais des indications ont été récemment obtenues pour trois d'entre elles. Hyr1, régulée par la morphogenèse, a été identifiée comme un facteur de virulence, Iff4 est impliquée dans l'adhérence aux plastiques et Iff11, la seule protéine secrétée de la famille, est impliquée dans la biosynthèse de la paroi et dans la virulence. Dans ce travail, nous avons montré que les gènes de cette famille, à l'exception de HYR1, étaient peu exprimés en conditions de croissance au laboratoire et également in vivo chez la souris. Le gène IFF2 est cependant fortement induit sur milieu minimum en phase stationnaire. Nous avons construit des mutants nuls homozygotes pour chacun de ces gènes, sauf pour IFF3 et IFF9, identiques à 99% en séquence et probablement essentiels. Les mutants obtenus ne présentent aucun défaut détectable au niveau de la biosynthèse de la paroi, de leur réponse au pH, à un stress oxydatif ou à une forte température. Ils ne sont pas davantage affectés dans leur adhérence sur cellules épithéliales HeLa ou dans leur survie en présence de macrophages J774. En milieu de croissance des cellules HeLa, la délétion de IFF2, IFF6, IFF7 et IFF8 semble cependant affecter la transcription d'IFF3 et d'IFF9, suggérant l'existence de mécanismes de régulations croisées.

Plasmodium falciparum est responsable de la forme la plus grave de paludisme avec plus de 600 000 décès par an. L'absence de vaccin efficace, combinée à l'émergence de résistances aux traitements récurrents, exige le développement de nouvelles molécules. Afin de limiter ces résistances, il est nécessaire de cibler de nouvelles voies métaboliques indispensables à la survie du parasite. Ce travail de thèse repose sur l'étude de deux voies métaboliques essentielles au parasite que sont la voie de recyclage des bases puriques et la voie de biosynthèse des ancres glycosylphosphatidylinositol (GPI).En ce qui concerne la voie de recyclage des bases puriques, la détermination des structures cristallines de l' « IMP specific 5‘-nucleotidase » (PfISN1) associée aux études biochimiques et biophysiques (SAXS, EM, MALS…), a permis de préciser le mécanisme d'action fournissant ainsi une base solide pour la mise au point d'inhibiteurs. Une banque de plus 3000 composés a été criblée par Fluorimétrie à Balayage Différentiel et les effets des molécules sélectionnées seront évalués sur l'enzyme et sur la croissance du parasite en culture.Quatre cibles thérapeutiques potentielles appartenant à la voie de biosynthèse des ancres GPI ont été sélectionnées. L'utilisation de plusieurs systèmes d'expression disponibles au laboratoire (bactérie, levure, acellulaire en germe de blé) ou via des plateformes européennes pour l‘expression en cellules de mammifères HEK293T (Oxford), de cellules BHK21 transfectées avec le virus de la vaccine modifié, T7-MVA, (Strasbourg) ou la plateforme ESPRIT (Grenoble) ont permis de passer outre les difficultés rencontrées pour exprimer les protéines d'intérêt. L'une des quatre cibles, la mannose-1-phosphate guanylyltransférase (PfMPG), a pu être exprimée de manière suffisante quantitativement et qualitativement pour une caractérisation biochimique et structurale. Une analyse par SAXS et cristallographie aux rayons X a été réalisée / Plasmodium falciparum is responsible for the most severe form of malaria with more than 600,000 deaths per year. The lack of an effective vaccine, combined with the emergence of drug resistant parasites, necessitates the development of new drugs. In order to limit these resistances, it is necessary to target new metabolic pathways essential for parasite survival. This thesis work is based on the study of two metabolic pathways essential to the parasite, the purine salvage pathways and the glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor biosynthesis pathway.Concerning the purine salvage pathway, the determination of the crystal structures of the IMP -specific 5'-nucleotidase (PfISN1) associated with biochemical and biophysical studies (SAXS, EM, MALS, etc.) have allowed to propose a reaction mechanism, thereby providing a solid basis for the conception and development of inhibitors. A library of more than 3000 compounds was screened by Differential Scanning Fluorimetry and the selected molecules will be evaluated for their inhibitory effect on the enzyme and on the growth of parasites in culture.Four potential therapeutic targets belonging to the GPI anchor biosynthesis pathway were selected. The use of several in-house available expression systems (bacteria, yeast, and acellular wheat germ) as well as European platforms for the expression in HEK293T mammalian cells (Oxford), in BHK21 cells transfected with the modified vaccinia virus, T7-MVA, (Strasbourg) or the ESPRIT platform (Grenoble) has allowed us to overcome the difficulties encountered on obtaining the selected protein targets. One of the four targets has been expressed in sufficient amount and quality for biochemical- and structural characterization, namely the mannose-1-phosphate guanylyltransferase (PfMPG). SAXS and X-ray crystallography analyses have been carried out

ABP1 (Auxin Binding Protein 1), qui peut se lier à l'auxine, est essentielle pour le développement des plantes. Il a été prouvé qu’elle a la capacité de se lier à l’auxine et de conduire le signal auxine dans les cellules. ABP1 est supposé être localisée et avoir des fonctions à la surface extérieure de la membrane plasmique à travers une composante inconnue. Au cours ma thèse, nous avons essayé d’étudier l'interaction entre ABP1 et le candidat de la composante inconnue, CBP1 (chez le maïs), qui est une protéine à ancres GPI déjà identifiée comme ayant la capacité de liaison au peptide de synthèse C-terminale d’ABP1 en 2006. L'orthologue de CBP1 chez arabidopsis appartient à une famille de gènes contenant 19 membres, dont seulement trois d'entre eux ont été prédit comme était des protéines à ancres GPI. Nous avons fait les caractérisations fonctionnelles de ces trois membres. Les données suggèrent que les protéines SKS à ancres GPI sont impliquées dans l'orientation de la cellule, le développement des gamétophytes et de l'embryon. / ABP1 (Auxin Binding Protein1), who can bind auxin, is essential for the development of plants. It was proved to have the ability to bind auxin and transduce auxin signal into the cells. It is supposed to be localized and functions at the outer surface of plasma membrane through unknown component. In my thesis, we tried to invesitgate the interaction between ABP1 and the candidate of the unknown component, CBP1 (From maize), which is GPI-acnhored and already identified as the binding ability to synthesized C-terminus peptide of ABP1 in 2006. The orthologous of CBP1 in arabidopsis belongs to a gene family with 19 members, in which only three of them were prediceted to be GPI anchored. We did the functional characterisation of these three GPI-anchored members. Data suggested that GPI-anchored SKS were involved in cell orientation, gametophyte and embryo development.