Esta tese tem como tema central o conceito de febre comportamental, que tem-se definido como o aumento da temperatura corporal pela efetivação da mudança nas temperaturas preferidas devido ao reconhecimento, por parte do corpo, de uma infecção ou patógeno. O trabalho está composto por três partes. Na Introdução Geral é discutida a febre comportamental em sete pontos fundamentais no entendimento desta resposta dentro da Ecofisiologia, começando pela definição, as pesquisas de laboratório e campo existente até o momento, até as limitações ecológicas dos indivíduos e as implicações do tema na conservação. No capítulo 1, com formato de texto científico, apresentamos a pesquisa na qual estudamos o comportamento e a preferência termal da espécie Proceratophrys boiei em condições experimentais com indivíduos injetados com lipopolisacáridos (LPS), para simular uma infecção, e indivíduos intactos (injetados com salina, grupo controle). Nessa pesquisa consideramos duas alternativas de respostas no comportamento, tal como discutido na introdução geral: a) febre comportamental, que é caracterizada por um aumento da temperatura corporal dos indivíduos pela mudança nas temperaturas preferidas dentro de uma paisagem termal; b) comportamento de doente, que no contexto do desenho experimental seria reconhecido pela diminuição da atividade dos indivíduos. Assim, registramos os seguintes tratamentos durante 24 horas com uma câmara termográfica: 1) indivíduos intactos no gradiente termal desligado, 2) indivíduos intactos no gradiente termal ligado, 3) indivíduos injetados com salina, no gradiente termal ligado 4) indivíduos injetados com LPS no gradiente termal ligado. Para cada um dos tratamentos foi registrada a distância de locomoção e as preferências termais, junto com outros detalhes do comportamento e as preferências termais. A partir de nossos resultados, concluímos que os indivíduos de P. boiei apresentam comportamento de doente como resposta dominante ao ser injetados com LPS, e que as preferências termais destes são consequência do comportamento de doente e não da termorregulação comportamental. Finalmente, a discussão geral explica como o capitulo 1 contribui na discussão de cada um dos sete pontos tratados na introdução geral tentando propor metodologias e estudos mais completos para manter o diálogo entre a fisiologia e a ecologia dos indivíduos no contexto de infecção e doenças / The central theme of this thesis is the concept of behavioral fever, which has been defined as the increase of body temperature by effecting the change in preferred temperatures due to the recognition by the body of an infection or pathogen. The thesis is composed of three parts. In the General Introduction, behavioral fever is presented around seven fundamental points to the understanding of this response within Ecophysiology, starting with the definition, the laboratory and field research until now, to the ecological limitations of individuals and the implications of this theme in conservation. In the first chapter, with scientific text format, we present the research in which we studied the behavior and thermal preference of Proceratophrys boiei species under experimental conditions in individuals injected with lipopolysaccharides (LPS), to simulate an infection, and in intact individuals (injected with Saline, a control group). In this research we considered two alternatives of behavioral responses, as discussed in the General Introduction: a) behavioral fever, which is characterized by an increase in the individuals body temperature by changing the preferred temperatures within a thermal landscape; B) patient behavior, which, in the context of experimental design, would be recognized by the decrease in the activity of individuals. Thus, we recorded the following treatments for 24 hours with a thermographic camera: 1) intact individuals in the thermal gradient switched off, 2) intact individuals in the connected thermal gradient, 3) individuals injected with saline, in the bound thermal gradient 4) individuals injected with LPS in the thermal gradient on. For each of the treatments it was recorded the locomotion distance and the thermal preferences, along with other details of the behavior and the thermal preferences. From our results, we conclude that the individuals of P. boiei present a patient\'s behavior as a dominant response when injected with LPS and their thermal preferences are a consequence of patient behavior and not behavioral thermoregulation. Finally, the general discussion explains how chapter 1 contributes to the discussion of each of the seven points highlighted in the general introduction attempting to propose a complete methodology and studies to maintain the dialogue between the physiology and the ecology of individuals in the context of infection and disease

As atividades humanas vêm aumentando dramaticamente a quantidade de nitrogênio inorgânico liberado nos ecossistemas, seja através da aplicação de fertilizantes na agricultura, da descarga de dejetos humanos e de seus rebanhos, ou da queima de combustíveis fósseis. Os excessos de nitrogênio são eventualmente transportados para corpos d´água, onde podem, na forma de nitrato, nitrito e amônio, atingir concentrações tóxicas para organismos aquáticos. Nesta pesquisa tive dois objetivos principais. O primeiro foi testar em laboratório a toxicidade relativa dos íons nitrato, nitrito e amônio, e a variação interespecífica na sensibilidade a esses íons, em larvas de cinco espécies de anuros (Rhinella ornata, Hypsiboas faber, Hypsiboas pardalis, Physalaemus cuvieri e Physalaemus olfersii ). Para isso utilizei bioensaios seguindo protocolos internacionalmente padronizados para testes de ecotoxicidade com organismos aquáticos, e que portanto permitem máximas reprodutibilidade e comparabilidade de resultados entre compostos, espécies, e laboratórios. No entanto, estes bioensaios carecem de realismo uma vez que simulam um cenário de exposição aguda a altas concentrações de contaminantes quando na natureza o cenário de exposição tende a ser crônico e prolongado a baixas concentrações. Além disso, bioensaios usam mortalidade como principal variável de resposta, quando também efeitos subletais podem influenciar a persistência de populações ao modular o sucesso dos indivíduos. Por isso, meu segundo objetivo foi testar em laboratório se concentrações relativamente baixas e ecologicamente relevantes de nitrato, nitrito e amônio podem afetar a sobrevivência, o crescimento, o desenvolvimento e o comportamento das larvas de R. ornata, P. cuvieri e H. faber. Demonstrei através dos bioensaios de exposição aguda que nitrato, a forma mais abundante na natureza, é de baixa toxicidade quando comparada a nitrito e amônio. Demonstrei também que há significativa variação interespecífica na sensibilidade ao nitrogênio inorgânico, e que o ranqueamento de sensibilidade das espécies ao nitrato e ao nitrito foram similares, possivelmente por conta de mecanismos comuns de ação tóxica. Através de experimentos de exposição crônica demonstrei que concentrações relativamente baixas de nitrogênio inorgânico podem causar efeitos letais e subletais às larvas de anuros se houver exposição prolongada. O nitrato causou redução no desenvolvimento larval de P. cuvieri e o amônio na sobrevivência e nas taxas de atividade nos girinos de H. faber. A exposição crônica ao nitrito também reduziu significativamente a sobrevivência das três espécies testadas, o crescimento de H. faber e as taxas de atividade de R. ornata. Contudo, é improvável que as concentrações de nitrito que manipulei em laboratório sejam comuns na natureza, especialmente em condições aeróbicas. Esta pesquisa, além de fornecer importantes informações sobre os possíveis efeitos da poluição por nitrogênio em larvas de anuros, contribui para o avanço da ecotoxicologia no Brasil ao estabelecer as bases para o emprego de espécies nativas de anfíbios como sistema-modelo experimental. Estudos futuros que almejem avaliar o risco ambiental da contaminação por nitrogênio deverão por um lado monitorar concentrações em hábitats naturais e por outro avaliar as consequências das interações sinérgicas entre nitrogênio inorgânico e outros estressores físicos, químicos ou biológicos para larvas de anfíbios. / Human activities dramatically increased the amount of inorganic nitrogen released in ecosystems through the application of fertilizers in agriculture, the generation of human and livestock waste, and the combustion of fossil fuels. This nitrogen eventually reaches water bodies where it can, in the form of nitrate, nitrite and ammonium, be toxic to aquatic organisms. In this study I had two main objectives. The first was to test the relative toxicity of nitrate, nitrite and ammonium, and the interspecific variation in sensitivity to these ions, in tadpoles of five anuran species (Rhinella ornata, Hypsiboas faber, Hypsiboas pardalis, Physalaemus cuvieri and Physalaemus olfersii ). This objective was accomplished by laboratory bioassays following internationally standardized protocols for ecotoxicity tests with aquatic organisms, therefore allowing maximum reproducibility and comparability of results among compounds, species and laboratories. However, these bioassays lack realism for simulating a scenario of acute exposure to high concentrations of contaminants, while exposure in nature tends to be chronic and prolonged at low concentrations. Furthermore, bioassays use mortality as the main response variable, whereas sublethal effects may also influence the persistence of populations by modulating individual success. My second objective was therefore to test in the laboratory if low and environmentally relevant concentrations of nitrate, nitrite and ammonium affect survival, growth, development and behavior of R. ornata, P. cuvieri and H. faber larvae. Through acute exposure bioassays I demonstrated that nitrate, the most abundant N form in nature, has low toxicity when compared to nitrite and ammonium. I also demonstrated that there is significant interspecific variation in the sensitivity to inorganic nitrogen, and that the ranking of species sensitivity to nitrate and nitrite were similar, possibly due to common mechanisms of toxic action. Through chronic exposure I demonstrated that relatively low concentrations of inorganic nitrogen can cause lethal and sublethal effects on anuran larvae if there is extended exposure. Nitrate decreased developmental rate in P. cuvieri and ammonia decreased survival and activity rates in H. faber tadpoles. Chronic exposure to nitrite also significantly reduced survival of all three species tested, growth of H. faber and activity rates of R. ornata. However, it is unlikely that the concentrations of nitrite manipulated in the laboratory are common in nature, especially in aerobic conditions. This is the first study to document deleterious effects of nitrogen pollution to Brazilian amphibian species, and contributes to the development of ecotoxicology in Brazil by establishing the basis for the employment of native amphibians as model experimental system. Future studies that aim to assess the environmental risk of nitrogen contamination should monitor concentrations in natural habitats and evaluate the effects of synergistic interactions between inorganic nitrogen and other physical, chemical or biological stressors to amphibian larvae.

O gênero Ranavirus, especialmente a espécie Frog virus 3 (FV3), é considerado uma ameaça crescente às populações de anfíbios em diversas partes do mundo, desencadeando surtos que frequentemente resultam em mortalidade em massa e perdas econômicas substanciais. Neste sentido, propusemos o isolamento de uma estirpe patogênica de FV3-like, associada a surto com alta mortalidade de anfíbios adultos (Lithobates catesbeianus) em uma ranicultura do Estado de São Paulo, Brasil, bem como a caracterização molecular e fenotípica do vírus isolado. No mais, objetivamos verificar a possível indução de morte celular por apoptose por essa estirpe. O isolamento viral foi realizado a partir de fragmentos de órgãos de animais que vieram à óbito, os quais foram inoculados em células BF-2 (Lepomis macrochirus). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi conduzida com primers específicos e dirigidos para duas regiões altamente conservadas do genoma dos ranavírus: MCP e 53R. O sequenciamento parcial do gene que codifica a proteína principal do capsídeo (MCP) foi realizado, seguido de alinhamento e análise filogenética com outros ranavírus. Outras técnicas diagnósticas, incluindo microscopia eletrônica de transmissão, imunofluorescência indireta e Western blot foram utilizadas na caracterização e confirmação do isolamento. Dois marcadores apoptóticos foram utilizados para investigar a possível ativação da apoptose em células BF-2 infectadas e amostradas de 4 à 16 horas, incluindo a ativação de caspases efetoras e a fragmentação do DNA celular pelo ensaio de TUNEL. Obtivemos o isolamento de uma estirpe de FV3-like com efeitos citopáticos típicos para ranavírus. A PCR confirmou a presença de DNA viral nas culturas de células BF-2 infectadas, com resultados positivos para os oligonucleotídeos direcionados para MCP e 53R. A análise da sequência nucleotídica obtida para MCP revelou alta homologia (99%) com Frog virus 3, espécie-tipo do gênero Ranavirus (família Iridoviridae) e, na reconstrução filogenética, a cepa isolada mostrou ser intimamente relacionada com outros ranavírus detectados no Brasil. As micrografias eletrônicas mostraram partículas icosaédricas em células BF-2 infectadas, com nucleocapsídeo medindo cerca de 150 ηm, semelhante aos ranavírus. No ensaio de imunofluorescência indireta, células BF-2 infectadas com o isolado FV3-like, apresentaram marcação de imunofluorescência positiva para MCP, enquanto que MCP foi demonstrada por um ensaio de Western blot, onde observamos um polipeptídeo com massa molecular estimada em 50 kDa. Por fim, verificamos que o isolado FV3-like é capaz de induzir apoptose em células BF-2, uma vez que foram detectadas caspases efetoras em todos os tempos experimentais, sugerindo ser um mecanismo caspase-dependente. A fragmentação do DNA celular, claramente observada em todos os tempos experimentais, confirmou a indução de apoptose pela estirpe brasileira de FV3-like. Os resultados aqui obtidos tornam-se a base para diversos estudos futuros, podendo ainda contribuir como subsídio para a melhor compreensão dos surtos provocados por estes vírus no país. / The genus Ranavirus, especially the Frog virus 3 (FV3) species, is considered a growing threat to amphibian populations in various parts of the world, triggering outbreaks that often result in mass mortality and substantial economic losses. In this sense, it was proposed the isolation of a pathogenic FV3-like strain associated with an outbreak with high mortality of adult amphibians (Lithobates catesbeianus) in a frog farm in the State of São Paulo, Brazil, as well as the molecular and phenotypic characterization of the isolated virus. In addition, we aimed to verify the possible induction of the mechanism of cell death by apoptosis by this strain. Virus isolation was performed from organ fragments of animals that died, which were inoculated into BF-2 cells (Lepomis macrochirus). The polymerase chain reaction (PCR) technique was conducted with specific primers and directed to two highly conserved genome regions of the ranavirus: MCP and 53R. Partial sequencing of the gene encoding the major capsid protein (MCP) was performed, followed by alignment and phylogenetic analysis with other ranaviruses. Other diagnostic techniques, including transmission electron microscopy, indirect immunofluorescence and Western blot were used in the characterization and confirmation of the isolation. Two apoptotic markers were used to investigate the possible activation of apoptosis in infected BF-2 cells and sampled from 4 to 16 hours, including the activation of effector caspases and the fragmentation of cellular DNA by the TUNEL assay. We obtained the isolation of an FV3-like strain with typical cytopathic effects for ranavirus. PCR confirmed the presence of viral DNA in cultures of infected BF-2 cells, with positive results for MCP and 53R oligonucleotides. Analysis of the nucleotide sequence obtained for MCP revealed high homology (99%) with Frog virus 3, type species member of the genus Ranavirus (family Iridoviridae) and, in phylogenetic reconstruction, the isolated strain showed to be closely related to other ranaviruses detected in Brazil. Electron micrographs showed icosahedral particles in infected BF-2 cells, with a nucleocapsid measuring about 150 ηm, similar to ranaviruses. In the indirect immunofluorescence assay, BF-2 cells infected with the FV3-like isolate showed positive immunofluorescence labeling for MCP, whereas MCP was demonstrated by a Western blot assay, where we observed a polypeptide with a molecular mass estimated at 50 kDa. Finally, we verified that the FV3-like isolate is able to induce apoptosis in BF-2 cells, since effector caspases were detected at all experimental times, suggesting to be a caspase-dependent mechanism. The fragmentation of cellular DNA, clearly observed at all experimental times, confirmed the induction of apoptosis by the Brazilian FV3-like strain. The results obtained here become the basis for several future studies, and may contribute as a subsidy to better understand the outbreaks caused by these viruses in the country.

A aquicultura é apontada como um mercado estratégico para o desenvolvimento sustentável, produção de alimentos e ampliação de fronteiras inexploradas no Brasil. No entanto, como outros sistemas de produção animal, este setor enfrenta problemas com doenças resultantes de sua intensificação, como os aspectos sanitários da produção e a falta de estrutura para o diagnóstico das principais enfermidades infecciosas. Durante os últimos 20 anos, os vírus da família Iridoviridae, em especial membros do gênero Ranavirus, têm sido responsáveis por epizootias de grande impacto ecológico e econômico, envolvendo um grande número de espécies de peixes, anfíbios e répteis de importância na aquicultura de várias partes do mundo. No entanto, as informações sobre a ocorrência de infecções de peixes e anfíbios causadas por ranavírus no Brasil são limitadas. O presente projeto compreendeu o isolamento em cultivo celular de estirpe de Frog Virus 3-símile, no Estado de São Paulo, confirmada por sequenciamento nucleotídico do gene MCP e subsequente RFLP, assim como caracterização fenotípica e de cinética de replicação do isolado. Amostras de fígado, baço e rins de rãs-touro gigante provenientes de ranário comercial, positivas ao diagnóstico molecular para Ranavirus, foram utilizadas para isolamento viral em cultivo celular. Efeito citopático foi detectado na segunda passagem em células BF-2 e posterior confirmação do isolamento foi feita por PCR e RFLP. A caracterização fenotípica viral foi feita com microscopia eletrônica de transmissão, a qual permitiu a confirmação de morfologia semelhante às partículas de Ranavirus, além da realização de curva de replicação, indicando maiores títulos virais no quarto dia após inoculação. Também foi feito teste de susceptibilidade a solventes, que confirmou a presença de partículas envelopadas. Os resultados obtidos nesse estudo poderão contribuir para a futura compreensão da biologia dos iridovírus circulantes como agentes etiológicos de ranaviroses em anfíbios no Estado de São Paulo. / Aquaculture is appointed as a strategic market for sustainable development, food production and expansion of unexplored frontiers in Brazil. However, just like other animal production systems, this area faces problems due its intensification, like the production sanitation aspects and the lack of structure for the diagnosis of major infectious diseases. During the last 20 years, viruses from Iridoviridae family, especially Ranavirus genera, have been responsible for major economic and ecological impactant epizootic diseases in a great number of fish, amphibian and reptile species in many parts of the world. However, information on the occurrence of infections in fishes and amphibians caused by Ranavirus in Brazil are limited. In this context, this project aimed to isolate a Frog Virus 3-like strain detected in São Paulo state in cell culture, which was later confirmed by nucleotide sequencing of MCP gene and further RLFP technique and also phenotipical characterization and replication kinetics of the obtained strain. Liver, spleen and kidney samples from american bullfrogs from commercial frog ponds, positive by molecular diagnostic for Ranavirus, were used for viral isolation in cell culture. Citopathic effect was detected during the second passage in cells and later confirmed by PCR and RFLP. The viral characterization was carried out with transmission electronic microscopy, which confirmed similar morphology of viral particles to those of Ranavirus, besides the construction of a growth curve which indicated larger titres on the fourth day post inoculation. A test for solvent sensitivity was also performed and confirmed the presence of enveloped particles. The results obtained in this study will contribute to the understanding of the biology of the circulating iridovirus in São Paulo state as an etiological agent of Ranavirus infection in amphibians.

Dentre as atividades envolvidas no processo de mudança do uso da terra, está a mineração de bauxita, cuja atividade leva à constante perda de hábitat. Uma forma de reparar a degradação antrópica à diversidade e ao funcionamento dos ecossistemas naturais é utilizar o processo de restauração ecológica. Este trabalho utilizou armadilhas-de-queda para estudar o efeito da restauração florestal após a mineração de bauxita na abundância de anuros de serapilheira. Os pontos amostrais encontram-se em um mosaico vegetacional no planalto de Poços de Caldas, MG, sendo dois locais em processo de reabilitação, cinco em processo de restauração e dois locais em remanescentes secundários de Floresta Estacional Semidecidual Montana. Foram coletados dados referentes a características da vegetação (área basal; densidade; abertura do dossel e espessura da serapilheira) e a altitude em cada ponto amostral. O Critério de Informação de Akaike corrigido (AICc) foi usado para avaliar a eficácia de nove modelos construídos a priori na predição da abundância das duas espécies coletadas que apresentaram suficiência amostral, separadamente. A abundância de Rhinella pombali foi inversamente relacionada com a densidade da vegetação e com a altitude. O modelo com a abertura do dossel influenciou positivamente a abundância de Ischnocnema juipoca. A restauração florestal possibilitou a recolonização por duas espécies de anuros - E. juipoca e R. pombali, evidenciando a importância dessa atividade na reconstrução de habitats para a biodiversidade nativa. / Bauxite mining is one of the activities involved in land-use change that leads to total habitat loss. The process of ecological restoration is a way to repair anthropic damages to biodiversity and to natural ecosystems functioning. In this work, pitfall traps with drift fences were used to verify the influence of restoration of forest areas priorly submitted to bauxite mining on the abundance of leaf litter anurans. Sample sites were located in vegetation patches on the plateau of Poços de Caldas-MG, Brazil: two in areas under rehabilitation process, five in areas under restoration process and two in secondary fragments of Montane Semideciduous Seasonal Forest. Data concerning characteristics of vegetation (basal area, density, canopy openness and litter thickness) and height were collected in each sample site. The corrected Akaike Information Criterion (AICc) was used to evaluate the efficiency of nine models constructed a priori to predict abundance of two species collected that presented sampling sufficiency, analysed as separate groups. Abundance of Rhinella pombali was inversely related to height and vegetation density. The canopy openness model positively influenced abundance of Ischnocnema juipoca. Recolonization by two anuran species E. juipoca and R. pombali was possible due to forest restoration, which shows the importance of this process in reconstructing habitats for native biodiversity.

Nas últimas três décadas, o crescimento na demanda por biocombustíveis promoveu a expansão das culturas de cana-de-açúcar no Brasil e, consequentemente, o aumento no consumo de pesticidas. Diversas espécies de anfíbios estão sujeitas à exposição a pesticidas por ocorrerem dentro e ao redor de canaviais. Entretanto, mesmo avaliações de risco preliminares são inviabilizadas pela raridade de estudos ecotoxicológicos com espécies de anfíbios nativas. Esta dissertação propôs testar experimentalmente as hipóteses de que (1) os principais herbicidas utilizados na cultura de cana-de-açúcar no Brasil, embora desenvolvidos especificamente para o controle de ervas daninhas, são capazes de causar mortalidade em larvas de anfíbios (2) esta mortalidade se manifesta mesmo quando larvas de anfíbios são expostas a concentrações ambientalmente relevantes destes herbicidas (3) além de efeitos letais, a exposição de larvas de anfíbios a concentrações ambientalmente relevantes dos principais herbicidas utilizados na cultura da cana-de-açúcar no Brasil causa efeitos subletais em termos de crescimento, desenvolvimento, comportamento, imunocompetência, e atividade enzimática, e estes efeitos subletais podem ser importantes em influenciar o rendimento dos indivíduos. Foram utilizadas como modelo biológico larvas do leiuperídeo Physalaemus cuvieri e dos hilídeos Hypsiboas faber e Hypsiboas pardalis. As três espécies têm áreas de distribuição parcialmente coincidentes com a área de cultivo da cana-de-açúcar, sendo que as duas primeiras sabidamente ocorrem dentro de canaviais. Estas espécies foram expostas aos herbicidas glifosato, ametrina, 2,4-D, metribuzim e acetocloro, na forma de seus ingredientes ativos. Somados, estes herbicidas correspondem a ~2/3 do volume de herbicidas utilizados em importantes regiões produtoras de cana-de-açúcar; por sua vez, herbicidas constituem a maior parte dos pesticidas usados na cultura. Os experimentos de exposição aguda com P. cuvieri e H. pardalis demonstraram que todos os herbicidas testados são tóxicos a larvas de anfíbios, embora alguns deles apenas em concentrações bastante elevadas. Houve uma hierarquia relativamente clara na letalidade dos herbicidas testados (glifosato < metribuzim < ametrina < acetocloro). Uma comparação com os dados disponíveis da toxicidade dos mesmos herbicidas para outras espécies de anfíbios, e para outros animais aquáticos, sugere que as espécies testadas nesta dissertação tendem a ser relativamente robustas, e que, ao contrário de uma hipótese amplamente difundida, anfíbios não aparentam ser particularmente sensíveis a contaminantes. Os experimentos de exposição crônica procuraram simular cenários realistas de exposição ao manipular as doses mínimas (H. faber) e máximas (H. faber, H. pardalis) de aplicação recomendadas pelos fabricantes para o controle de ervas daninhas na cultura de cana-de-açúcar. Conforme esperado, um prolongamento da exposição induziu mortalidade em concentrações muito inferiores àquelas necessárias para causar efeito em exposição aguda. Glifosato, ametrina e acetocloro em doses ambientalmente relevantes induziram mortalidade significativa de larvas de anfíbios, ao menos para H. pardalis. Glifosato, 2,4-D e metribuzim retardaram significativamente o desenvolvimento de H. faber, enquanto que ametrina, testada apenas para H. pardalis, levou a uma diminuição no ganho de massa e no estágio de desenvolvimento final atingido pelas larvas. A atividade de AChE foi inibida pelo metribuzim em H. faber e estimulada pelo glifosato, ametrina e 2,4-D em H. pardalis; por sua vez, a atividade de GST, inalterada pela exposição a herbicidas em H. faber, foi estimulada pela ametrina e pelo acetocloro em H. pardalis. Nenhum composto induziu alterações significativas no perfil leucocitário. Herbicidas também tiveram efeitos comportamentais: a taxa de atividade de H. pardalis foi significativamente reduzida sob exposição à ametrina e ao acetocloro. Esta dissertação sugere portanto que a exposição a doses ambientalmente relevantes dos principais herbicidas utilizados em cultura de cana-de-açúcar no Brasil podem causar efeitos letais e subletais em larvas de espécies nativas de anfíbios. Alguns destes efeitos subletais, como uma diminuição nas taxas de atividade, de crescimento e de desenvolvimento, podem ter importantes consequências para o sucesso dos indivíduos por prolongar o período larval e assim aumentar o risco de dessecação em corpos d´água temporários e semi-permanentes. Estudos futuros devem buscar realismo adicional rumo a uma análise de risco da contaminação ambiental por herbicidas por meio de experimentos manipulando não apenas ingredientes ativos, mas também formulações comerciais, bem como interações dos contaminantes entre si e com outros estressores ambientais, calibrados por concentrações medidas em campo. / In the last three decades, the increasing demand for biofuels in Brazil favored the expansion of sugarcane and, as a consequence, an increase in the consumption of pesticides. Several species of amphibians are subject to pesticide exposure for occuring in or around sugarcane fields. However, a preliminary risk assessment of pesticide exposure is not possible due to the absolute scarcity of ecotoxicological studies with native amphibian species. This thesis proposed to test the hypotheses that (1) the main herbicides used in sugarcane crops in Brazil, although designed for weed control, cause mortality of amphibian larvae (2) this mortality manifests even when amphiban larvae are exposed to environmentally relevant herbicide concentrations (3) in addition to any lethal effects, exposure of amphibian larvae to environmentally relevant herbicide concentrations causes sublethal effects in terms of growth, development, behavior, immunocompetence, and enzimatic activity, and these effects may be important in influencing individual performance. We used as model system the leiuperid frog Physalaemus cuvieri and the hylid frogs Hypsiboas faber and Hypsiboas pardalis. The distributional ranges of these species partially overlap with the region of cultivation of sugarcane in the country, and the first two species are known to colonize waterbodies in or around sugarcane fields. These three species were exposed to glyphosate, ametryn, 2,4-D, metribuzin and acetochlor, presented as active ingredients. These herbicides account to ~2/3 of the volume of herbicides employed in an important sugarcane producing region in the country; herbicides correspond to the majority of pesticides used in this crop. Experiments of acute exposure of P. cuvieri and H. pardalis showed that all herbicides are toxic to amphibian larvae, albeit some of them only in very high doses. There was a relatively consistent ranking in lethality among the compounds (glyphosate < metribuzin < ametryn < acetochlor). A literature review suggests that the species tested tend to be relatively robust when compared to other amphibians and other freshwater animals, and that, contrary to a broadly disseminated hypothesis, amphibians do not seem to be particularly sensitive to contaminants. Experiments of chronic exposure aimed at simulating realistic scenarios of exposure by manipulating minimum (H. faber) and maximum application doses (H. faber, H. pardalis), as recommended by manufacturers for weed control in sugarcane fields. As expected, prolonged exposure induced mortality at much lower concentrations than those manipulated in the experiments of acute exposure. Environmentally relevant concentrations of glyphosate, ametryn and acetochlor induced significant mortality in larval amphibians, at least for H. pardalis. Glyphosate, 2,4-D and metribuzin significantly slowed development in H. faber, whereas ametryn slowed development and growth in H. pardalis. Herbicides also had behavioral effects: activity rates of H. pardalis were significantly reduced under exposure to ametryn and acetochlor. AChE activity was inhibited by metribuzin in H. faber but stimulated by glyphosate, ametryn and 2,4-D in H. pardalis; in turn, GST activity, which was not influenced by exposure to herbicides in H. faber, was stimulated by ametryn and acetochlor in H. pardalis. No herbicide induced significant changes in leukocyte profiles. In conclusion, this thesis suggests that exposure to environmentally relevant doses of the main herbicides employed in sugarcane fields in Brazil can cause lethal and sublethal effects on native species of larval amphibians. Some of these sublethal effects, including the decrease in activity, growth and developmental rates, may have important consequences for individual performance for extending the larval period and as such increasing the risk of dessication in temporary and semi-permanent ponds. Future studies should seek additional realism towards a risk analysis of the environmental contamination by herbicides through experiments manipulating not only active ingredients but also commercial formulations, as well as interactions among contaminants and other environmental stressors, calibrated by field-measured conditions.

A comunicação vocal é de extrema importância em diversos grupos de animais, uma vez que a informação transmitida pode indicar as condições ambientais, algumas características do emissor, como idade e sexo, e até mesmo seu grau de parentesco (indivíduos menos e mais aparentados). Em anfíbios anuros, o canto de anúncio, usado para reconhecimento espécie-específico pode apresentar variações individuais nas propriedades acústicas, o que pode tornar possível a individualização e o reconhecimento de cada macho vocalizador. O objetivo desse estudo foi testar justamente as hipóteses de segregação individual e assinatura vocal no canto de anúncio de quatro hilídeos (Anura, Hylidae) neotropicais: Hypsiboas faber, Hypsiboas bischoffi, Hypsiboas prasinus e Aparasphenodon arapapa. No total foram analisados 600 cantos de H. faber, 510 de A. arapapa, 91 de H. bischoffi e 98 cantos de H. prasinus, Foram mensuradas cinco variáveis espectrais e cinco temporais testadas através de Análise de Componentes Principais (PCA), Análise de Variância Multivariada (MANOVA) e coeficientes de variação intra e interindividual. Confirmamos a presença de individualização nos parâmetros analisados nas quatro espécies em estudo. Já a expectativa de assinatura vocal não foi corroborada. Os parâmetros acústicos que promoveram a segregação dos cantos foram bem variáveis. Essa ampla variação individual e intrínseca a cada indivíduo mostra como as vocalizações dos anuros em estudo apresentam plasticidade e complexidade maiores do que se imaginava. / Vocal communication is extremely important in a large diversity of animals, once the transferred information can indicates environmental condition or a few characteristics as age, sex and even kinship of the signaller. The advertisement call used by amphibians anurans as specie specific call, may present individual variation on its acoustics properties, which makes both individualization and signaller Hylids: Hypsiboas faber, Hypsiboas bischoffi, Hypsiboas prasinus and Aparasphenodon arapapa recognition possible. The goal of this study was try out the individual segregation and vocal signature hypothesis in the call of four Neotropical. In total we analysed 600 call of H. Faber, 510 of A. arapapa, 91 of H. Bischoffi and 98 of H. prasinus. We extract five spectral and five temporal variables and tested with Principal Components Analysis (PCA), Analysis of Multivariated Variancy (MANOVA) and coefficient of variation among and within individuals. We could sustain the presence of individualization in the parameters analysed in all four species studied. In the other hand, our expectation about vocal signature was not corroborated. This wide individual variation and intrinsic to each individual shows how anurans vocalization presents a plasticity and complexity higher than we thought. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Anfíbios em geral têm sofrido um forte declínio populacional, sendo extremamente necessário o conhecimento de sua biodiversidade para a criação de estratégias de manejo mais eficientes. O Brasil possui a maior riqueza de espécies destes animais, porém com poucos estudos se comparado a essa grande biodiversidade. Dentre os anfíbios encontra-se o gênero Scinax (Anura, Hylidae), que se apresenta com uma história taxonômica complexa, incluindo um grande número de espécies, algumas destas consideradas complexos de espécies. Para ajudar a revelar novas peças desse quebra-cabeças taxonômico e filogenético nós caracterizamos o DNA barcode de algumas espécies de dois clados do gênero - S. catharinae e S. ruber e os haplótipos de espécies com maior número de amostras – S. fuscovarius e S. perereca. Para S. fuscovarius foram encontrados 21 haplótipos e para S. perereca 7 haplótipos. Nós levantamos a possibilidade de um complexo de espécies dentro de S. perereca, sendo encontrada grande diversiade genética e haplotípica entre indivíduos vivendo em simpatria. Também detectamos alguns haplótipos compartilhados por espécimes de S. fuscovarius distantes aproximadamente 700 km e caracterizamos pela primeira vez a região COI de S. longilineus, S. perereca, S. skaios e S. x-signatus, o que ajudará em futures estudos de taxonomia molecular. / As amphibians in general have suffered a strong population decline, it is extremely necessary to know its biodiversity for creating more efficient handling strategies. Brazil has the largest species richness of these animals, however with few studies compared to this great biodiversity. Among the amphibians the Scinax genus (Anura, Hylidae), presents a puzzling taxonomic history and a large number of species, some of them considered species complex. In this paper we characterized the DNA barcode of some species of two clades of the genus - S. catharinae and S. ruber and the haplotypes of the species with the highest number of samples – S. fuscovarius and S. perereca. For S. fuscovarius we found 21 haplotypes and for S. perereca 7 haplotypes. We brought up the possibility of a species complex within S. perereca, being found a high genetic and haplotype diversity among individuals living in sympatry. Also we detected the same haplotype shared by specimes of S. fuscovarius as far as 700 km and we characterized the first COI region of S. longilineus, S. perereca, S. skaios and S. x-signatus, which will help in future studies of molecular taxonomy. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Submitted by Gizele Lima (gizele.lima@inpa.gov.br) on 2017-08-11T13:33:19Z No. of bitstreams: 2 Dissertação de Mestrado - Lucas Ferrante.pdf: 1606203 bytes, checksum: 620bbdcdee327fb01bd898acef0659e2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-11T13:33:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação de Mestrado - Lucas Ferrante.pdf: 1606203 bytes, checksum: 620bbdcdee327fb01bd898acef0659e2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The planet is undergoing an unprecedented loss of biodiversity, so much so that it is considered the sixth mass extinction event. The most drivers of species decline are habitat loss and fragmentation, affecting all natural ecosystems, especially tropical forests. Amphibians are particularly sensitive to fragmentation and habitat loss and many species are strict forest inhabitants. We evaluated 22 fragments of Atlantic Forest in southeastern Brazil, between 5 and 1570 hectares, in order to evaluate the potential of small fragments to be useful for the conservation of anurans and to determine if this group of animals has also vanished from larger areas, implying in the defaunation of forest fragments. For each fragment, we sample the number of individuals, species richness and composition in anuran assemblages in relation to the area, habitat heterogeneity and vegetation quality. The structure of the anurans composition in assemblages and guilds was tested in relation to the gradients of heterogeneity, vegetation quality and size of forest fragments, searching for patterns of species loss (nested) or to species substitutions (turnover). We not observed relation between the variables of the fragments with individuals number or structuring patterns for the species considering all anurans in the assemblages. However, when we analyzed separately in guilds, considering restricted forest species and species with high scatterability in the landscape, the effects on the structure of the assemblages were different. Our data indicate that the individuals number in the assemblages or guilds was not affected by the area, heterogeneity or quality of the habitat, suggesting that in each fragment there are resources to support the same individuals number. The all species in the assemblage and the strictly forest guild showed a decrease in number of species associated only with the habitat quality variable. The species composition in both guilds presented different patterns of structuration. The strictly forested guild presented a nested pattern in relation to vegetation quality, habitat heterogeneity and area of the fragments, while the dispersers guild presented a turnover pattern only in relation to habitat quality. We conclude that restricted forest species depend on a greater set of factors to maintain their populations in forest fragments, such as the fragment area, quality and heterogeneity of habitat. We considered, that the presence of species with wide displacement in the landscape is defined by the fragment quality. In this scenario, many small fragments supported a relatively high number of restricted forest species when compared to larger fragments, but with a greater degree of degradation, demonstrating the importance of these fragments have for the conservation of many species. In addition, some fragments presented total defaunation of strictly forest species and in some cases for all anurans assemblage, becoming empty fragments. / O planeta está passando por uma perda de biodiversidade sem precedentes, tanto que é considerado como o sexto evento de extinção em massa. Os maiores condutores para este declínio de espécies são a perda e a fragmentação de habitat, que vem afetando todos os ecossistemas naturais, especialmente as florestas tropicais. Os anfíbios são particularmente sensíveis à fragmentação e perda de habitat e muitas espécies são restritamente florestais. Nós avaliamos 22 fragmentos de Mata Atlântica no sudeste do Brasil, entre 5 e 1570 hectares, com a finalidade de avaliar o potencial de pequenos fragmentos serem uteis para a conservação de anuros e determinar se este grupo de animais também tem desaparecido de áreas maiores, implicando na defaunação de fragmentos florestais. Para cada fragmento foram amostrados o número de indivíduos, riqueza e composição de espécies nas assembleias de anuros em relação a área, heterogeneidade de habitat e qualidade da vegetação. A estruturação da composição de anuros nas assembleias e guildas foi testada em relação aos gradientes de heterogeneidade, qualidade da vegetação e tamanho dos fragmentos florestais, buscando padrões de perda de espécies (aninhamento) ou substituições de espécies (turnover). Não foram observadas relações entre as variáveis dos fragmentos com o número de indivíduos ou padrões de estruturação para as espécies considerando toda a assembleia de anuros. Entretanto, quando analisamos separadamente em guildas, considerando espécies restritamente florestais e espécies com alta capacidade de dispersão na paisagem, os efeitos sobre a estrutura das assembleias foram distintos. Nossos dados indicam que o número de indivíduos na assembleia ou guildas não foi afetado pela área, heterogeneidade ou qualidade do habitat, sugerindo que em cada fragmento existem recursos para suportar um mesmo número de indivíduos. A assembleia considerando todas as espécies e a guilda restritamente florestal apresentou uma diminuição do número de espécies e essa foi associada apenas a variável qualidade do habitat. A composição de espécies em ambas as guildas, apresentaram padrões de estruturação diferenciados. A guilda restritamente florestal apresentou um padrão de aninhamento em relação qualidade da vegetação, heterogeneidade de habitat e área dos fragmentos, em quanto que a guilda vágil apresentou um padrão de “turnover” apenas em relação a qualidade do habitat. Concluímos que espécies restritamente florestais dependem de um maior conjunto de fatores para manutenção de suas populações em fragmentos florestais, como a área do fragmento, qualidade e heterogeneidade do habitat. Enquanto, a presença de espécies com amplo deslocamento na paisagem é definida pela qualidade do fragmento. Neste cenário, muitos fragmentos pequenos suportaram um número relativamente alto de espécies restritamente florestais quando comparados a fragmentos maiores, mas com maior grau de degradação, demostrando a importância que estes fragmentos têm para a conservação de muitas espécies. Além disso, alguns fragmentos apresentaram defaunação total de espécies restritamente florestais e em alguns casos até mesmo de toda a assembleia de anuros, se tornado fragmentos vazios.

As Caatingas formam um domínio morfoclimático exclusivo do Brasil, caracterizado por índices pluviométricos baixos e imprevisíveis, além de temperaturas elevadas. Em certos grupos de anuros, a sobrevivência durante o período de estiagem está associada ao comportamento de estivação, um conjunto de alterações observadas que permitem a sobrevivência em condições áridas. Os sapos Pleurodema diplolistris (Leiuperidae/Anura) são encontrados enterrados na Caatinga na fase de seca e evidências indicam que esses indivíduos apresentam menor atividade durante essa fase, apesar de exibirem certa migração vertical no substrato acompanhando a diminuição da umidade deste. O padrão de alterações nas concentrações de lipídeos e glicogênio em diferentes amostras de tecido corrobora a hipótese de diminuição do metabolismo durante o período de estiagem. No músculo dos membros posteriores, a manutenção dos níveis protéicos próximos aos valores observados em animais ativos coletados durante a fase de chuvas, sugere a preservação da capacidade funcional do tecido mesmo nos meses mais adversos. A capacidade aeróbia esteve reduzida durante a fase seca em comparação a fase de atividade e a capacidade glicolítica anaeróbia manteve-se preservada. Verificou-se também um gradiente de umidade vertical no abrigo, evidenciando uma diminuição da umidade a partir da superfície, ao longo da fase de estiagem, o que poderia corroborar a migração vertical. / Caatinga is a Brazilian semi-arid bioma that is characterized by the dryness and the unpredictable seasonality of rains. In some anurans the survive is associate with aestivation, a set of strategies for survival in arid conditions. Pleurodema diplolistris frogs (Leiuperidae/Anura) are found buried in the Caatinga during the dry time. Evidences indicate that individuals of this group have lower activity during this phase, although some exhibit vertical migration in the substrate following the decrease in the moisture of it. The pattern of changes in concentrations of lipids and glycogen in different samples of tissue supports the hypothesis of a reduction of metabolism during the drought. In the muscle of the hindquarters, the maintenance of protein levels close to those values observed in active animals collected during the rainy season, suggests the preservation of functional capacity of the tissue even in most adverse months. The aerobic capacity was reduced during the drought compared to the period of anaerobic glycolytic activity and the capacity has remained preserved. It was also found a gradient of moisture under the vertical, showing a decrease in moisture from the surface, during the drought, which could corroborate the vertical migration.