Les protéines étant au coeur d’un grand nombre de processus biologiques, elles sont des cibles thérapeutiques largement convoitées. Les foldamères, notamment les oligoamides aromatiques, présentent une structure bien définie, prévisible, stable en solution et à l’état solide. Ajouté à cela, leur taille moyenne en fait de bons candidats pour la reconnaissance de surfaces de protéines, grâce à leurs chaînes latérales protéinogènes. Cette thèse présente les différentes étapes de leur conception, de la synthèse de la brique constitutive à l’obtention d’un foldamère fonctionnalisé grâce à la synthèse en phase supportée. La stratégie d’investigation des interactions entre un foldamère et une protéine est détaillée. L’originalité réside dans le fait que le foldamère est ancré directement à la protéine et le dichroïsme circulaire sert de méthode de screening. L’analyse structurale des hits permet de générer de nouveaux foldamères dans le but d’améliorer les interactions avec la protéine : c’est une stratégie itérative. Cette approche est appliquée premièrement à l’anhydrase carbonique humaine II, protéine modèle qui sert de preuve de principe pour cette approche ; puis à des protéines d’intérêt thérapeutique plus important : l’interleukine 4 et la cyclophiline A. Enfin, une étude concernant l’introduction de flexibilité au sein de foldamères de quinolines est présentée. / Since proteins are at the basis of many biological processes, they are widely studied as therapeutic targets. Aromatic oligoamide foldamers have a very well defined structure, predictable and stable both in solution and solid state. Because of their medium size, they appear as potent candidates for protein surface recognition thanks to their proteinogenic side chains. This manuscript presents the different steps of their design, from the scaffold’s synthesis to obtaining a functionalized foldamer, thanks to solid phase synthesis. The strategy to investigate protein/foldamer interactions will be detailed. Its originality lies in the fact that the foldamer is anchored to the protein. Circular dichroism has been used as a screening method to detect foldamer/protein interactions. Structural analysis of the hits will allow the design of new foldamers with the objective of enhancing foldamer/protein interactions: it is an iterative strategy. This approach has been applied firstly to human carbonic anhydrase II (HCA). This protein is used as a model system and proof of concept before moving to more therapeutically relevant proteins; interleukin 4 and cyclophilin A. Finally, a study on introducing flexibility in quinoline foldamers is presented.

Einleitung: Bei der Dystonie handelt es sich um eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Sie ist charakterisiert durch ungewollte, dauerhafte oder wiederkehrende Muskelkontraktionen, die zu abnormalen Bewegungsabläufen und Haltungen führen. Sie ist die dritthäufigste Bewe-gungsstörung beim Menschen. Bisherige Befunde beim Menschen und Untersuchungen an Tier-modellen weisen u.a. auf eine besondere Bedeutung der Basalganglien-Thalamus-Schleife hin, die an der Kontrolle von willkürlichen und unwillkürlichen Bewegungen beteiligt ist. So konnten bei unterschiedlichen Tiermodellen Veränderungen im Striatum (STR), der Eingangsstruktur der Basalganglien, nachgewiesen werden. Beim dtsz Hamster, einem gut etablierten Tiermodell für die paroxysmale Dystonie, konnte neben vielen striatalen Veränderungen eine Reduktion der GABAergen Interneurone (IN), wie Parvalbumin-positive (PV+) IN, zum Zeitpunkt der maximalen Ausprägung der Dystonie gezeigt werden. Ziele der Untersuchung: Die Gründe für den Mangel an striatalen GABAergen IN bei der dtsz Hamstermutante sollten weiter untersucht werden, indem der Frage nachzugehen war, ob beim dtsz Hamster eine Migrations- oder Ausreifungsstörung der IN vorliegt. Dazu wurde das Homöodomänprotein Nkx 2.1, als Marker für aus dem medialen Ganglienhügel eingewanderte IN, im STR der dtsz Hamstermutante untersucht. Die Expression des Brain-derived neurotrophic factors (BDNF), des Kalium-Chlorid-Kotransporters 2 (KCC2) und die zytosolische Carboanhydrase vom Isotyp 7 (CAH7) wurden als Indikatoren für die Ausreifung von GABAergen IN herangezogen. Tiere, Material und Methoden: Die Untersuchungen wurden vergleichend an dtsz Hamstern und Kontrollhamstern durchgeführt. Beim dtsz Hamster zeigt die Dystonie einen altersabhängigen Verlauf (Beginn: ca. 16. Lebenstag (LT); Maximum: 30.-42. LT; Remission: 70. LT). Deshalb wurden als Untersuchungszeitpunkte der 18. LT und der 33. LT gewählt. Um die Migration der striatalen IN zu untersuchen, wurde im STR bei 33 Tage alten Hamsterns die Dichte der immun-histochemisch markierten Nkx 2.1-positiven Zellen stereologisch ermittelt. Der mRNA-Gehalt wurde relativ mittels „quantitativer Echtzeit-PCR“ (qPCR) bestimmt. Zusätzlich wurde die mRNA-Expression von Nkx 2.1 bei 18 Tage alten Tieren untersucht. Von KCC2 und CAH7 wurde die mRNA mittels qPCR bei 18 und 33 Tage alten Hamstern im STR untersucht. Die Expression von BDNF wurde mittels ELISA-System im Kortex (Cx), STR und im restlichen Gehirngewebe („R“) bei 33 und 18 Tage alten Tieren bestimmt. Der BDNF-mRNA Gehalt wurde im Cx (18. und 33. LT) und im STR (33. LT) untersucht. Des Weiteren sollte BDNF bei 33 Tage alten Hamstern mittels immunhistochemischer Markierung im Cx und STR untersucht werden. Die Untersuchung von BDNF im Cx ist deshalb wichtig, weil BDNF vom Cx in das STR trans-portiert wird. Zusätzlich wurde Parvalbumin (PV) zusammen mit Nkx 2.1 immunhistochemisch markiert und die mRNA-Expression von PV bei 18 und 33 Tage alten Tieren bestimmt. Ergebnisse: Für Nkx 2.1 konnte kein Unterschied in der Zelldichte zwischen dtsz- und Kontroll-hamstern gefunden werden. Ebenfalls gab es weder bei 18 noch bei 33 Tage alten Tieren einen Unterschied in der Nkx 2.1-mRNA-Expression. Unterschiede in der mRNA-Expression von KCC2 und CAH7 im STR (18. und 33. LT) lagen auch nicht vor. Die Expression der PV-mRNA im STR bei 33 Tage alten Tieren war jedoch erwartungsgemäß vermindert. Auf mRNA-Ebene konnte im Cx für BDNF kein Unterschied zwischen dtsz- und Kontrolltiergruppe gefunden wer-den. Bei beiden Tiergruppen wurde mittels ELISA im STR mehr BDNF nachgewiesen als im Cx und im R (18. und 33. LT) nachweisbar. Entgegen der Hypothese war nach Analyse der Daten mittels Zwei-Wege ANOVA eine geringe Erhöhung der BDNF-Expression im Cx und STR bei 33 Tage alten dtsz Hamstern nachweisbar. Dies lag daran, dass die BDNF-Expression nur bei den Kontrolltieren am 33. LT im Vergleich zum 18. LT herunterreguliert war. Die Ergebnisse der BDNF-Immunhistologie waren in Hinblick auf die Spezifität zweifelhaft. Schlussfolgerung: Die Nkx 2.1 Daten lassen auf eine ungestörte Migration striataler IN bei der dtsz Mutante schließen. Wahrscheinlich ist eine Ausreifungsstörung für den Mangel an GABAer-gen IN verantwortlich. Die Ergebnisse von KCC2 und CAH7 zeigen, dass keine generelle Ausreifungsstörung von GABAergen Neuronen vorliegt, wobei dies für kleinere Subpopulationen nicht ausgeschlossen werden kann. Entgegen der Arbeitshypothese konnte keine Verringerung sondern eine leichte Erhöhung von BDNF zum 33. LT bei der dtsz Hamstermutante festgestellt werden. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass BDNF auf Grund der verzögert einsetzenden Entwicklung der IN nicht herunterreguliert wird. Die Gründe für diese Erhöhung wie auch weitere Marker für die neuronale Ausreifung werden durch weiterführende Studien untersucht.

Les techniques de criblage actuelles (in vitro et in silico) sont dépendantes des efforts menés en biologie médicinale pour identifier des cibles biologiques pertinentes ; cibles difficiles à définir pour les maladies génétiques dites "perte de fonction". De plus, les composés issus de ces cribles s'avèrent souvent inefficaces et/ou toxiques une fois confrontés à la complexité physiologique d'un organisme entier. Pour contourner ce problème, nous proposons d'utiliser le nématode C. elegans, notamment pour des maladies répondant aux critères suivants : i) physiopathologie complexe et/ou mal comprise excluant le développement à court terme de médicaments sur une base rationnelle, ii) peu d'espoir de thérapie génique/cellulaire à court terme, iii) conservation chez C. elegans du gène relié à la maladie humaine et induisant un phénotype exploitable une fois inactivé. Nous démontrons ici que ce petit nématode permet de tester, à moindre coût, un grand nombre de composés chimiques tout en conservant la complexité physiologique d'un animal entier. De plus, la souplesse génétique de cet animal permet d'apporter rapidement des informations sur le mode d'action des composés identifiés. Ainsi, en plus du but initial visant à identifier des molécules bioactives à intérêt thérapeutique, cette approche peut permettre de dégager de nouvelles cibles moléculaires utiles pour l'industrie chimique, et cruciales pour la recherche de traitements contre les maladies perte de fonction. Finalement, nous présentons comment mettre en place une telle stratégie, notamment pour la myopathie de Duchenne, l'amyotrophie spinale et le syndrome de Schwartz-Jampel. Enfin, nous présentons les résultats obtenus lors des différentes campagnes de criblage, les validations des molécules les plus prometteuses et les travaux effectués pour tenter de comprendre leur mode d'action chez le nématode.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2009. / Härtill 4 uppsatser. Även tryckt utgåva.

It is widely known that early estimates about the binding properties of drug candidates are important in the drug discovery process. Surface plasmon resonance (SPR) biosensors have become a standard tool for characterizing interactions between a great variety of biomolecules and it offers a unique opportunity to study binding activity. The aim of this project was to develop a SPR based assay for pre-screening of low molecular weight (LMW) drug compounds, to enable filtering away disturbing compounds when interacting with drugs. The interaction between 47 LMW compounds and biological ligands were investigated using the instrument BiacoreTM, which is based on SPR-technology.

This dissertation describes the advantages and feasibility of newly synthesized near-infrared (NIR) bis-heptamethine cyanine (BHmC) dyes for non-covalent labeling schemes. The NIR BHmCs were synthesized for biomolecule assay. The advantages of NIR BHmCs for biomolecule labeling and the instrumental advantages of the near-infrared region are also demonstrated. Chapter 1 introduces the theory and applications of dye chemistry. For bioanalysis, this chapter presents covalent and non-covalent labeling. The covalent labeling depends on the functionality of amino acids and the non-covalent labeling relies on the binding site of a protein. Due to the complicated binding process in non-covalent labeling, this chapter also discusses the binding equilibria in spectroscopic and chromatographic analyses. Chapter 2 and 3 evaluate the novel BHmCs for non-covalent labeling with human serum albumin (HSA) and report the influence of micro-environment on BHmCs. The interesting character of BHmCs in aqueous solutions is that the dyes exhibit non- or low-fluorescence compared to their monomer counterpart, RK780. It is due to their H-type closed clam-shell form in the solutions. The addition of HSA or organic solvents opens up the clam-shell form and enhances fluorescence. The binding equilibria are also examed. Chapter 4 provides a brief introduction that summaries the use of capillary electrophoresis (CE), and offers a detailed instrumentation that discusses the importance and advantage of a detector in NIR region for CE separation. Chapter 5 focuses on the use of NIR cyanine dyes with capillary electrcophoresis with near-infrared laser induce fluorescence (CE-NIR-LIF) detection. The NIR dyes with different functional groups show that RK780 is a suitable NIR dye for HSA labeling. The use of BHmCs with CE-NIR-LIF reduces signal noises that are commonly caused by the interaction between NIR cyanine dyes and negatively charged capillary wall. In addition, bovine carbonic anhydrase II (BCA II) is applied to study the influence of hydrophobicity on non-covalent labeling. Finally, chapter 6 presents the conformational dependency of BHmCs on the mobility in capillary and evaluates the further possibility of BHmCs for small molecule detection. Acridine orange (AO) is used as a sample and it breaks up the aggregate and enhances fluorescence. The inserted AO into BHmC changes the mobility in capillary, owing to the conformational changes by AO.

Einleitung: Bei der Dystonie handelt es sich um eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Sie ist charakterisiert durch ungewollte, dauerhafte oder wiederkehrende Muskelkontraktionen, die zu abnormalen Bewegungsabläufen und Haltungen führen. Sie ist die dritthäufigste Bewe-gungsstörung beim Menschen. Bisherige Befunde beim Menschen und Untersuchungen an Tier-modellen weisen u.a. auf eine besondere Bedeutung der Basalganglien-Thalamus-Schleife hin, die an der Kontrolle von willkürlichen und unwillkürlichen Bewegungen beteiligt ist. So konnten bei unterschiedlichen Tiermodellen Veränderungen im Striatum (STR), der Eingangsstruktur der Basalganglien, nachgewiesen werden. Beim dtsz Hamster, einem gut etablierten Tiermodell für die paroxysmale Dystonie, konnte neben vielen striatalen Veränderungen eine Reduktion der GABAergen Interneurone (IN), wie Parvalbumin-positive (PV+) IN, zum Zeitpunkt der maximalen Ausprägung der Dystonie gezeigt werden. Ziele der Untersuchung: Die Gründe für den Mangel an striatalen GABAergen IN bei der dtsz Hamstermutante sollten weiter untersucht werden, indem der Frage nachzugehen war, ob beim dtsz Hamster eine Migrations- oder Ausreifungsstörung der IN vorliegt. Dazu wurde das Homöodomänprotein Nkx 2.1, als Marker für aus dem medialen Ganglienhügel eingewanderte IN, im STR der dtsz Hamstermutante untersucht. Die Expression des Brain-derived neurotrophic factors (BDNF), des Kalium-Chlorid-Kotransporters 2 (KCC2) und die zytosolische Carboanhydrase vom Isotyp 7 (CAH7) wurden als Indikatoren für die Ausreifung von GABAergen IN herangezogen. Tiere, Material und Methoden: Die Untersuchungen wurden vergleichend an dtsz Hamstern und Kontrollhamstern durchgeführt. Beim dtsz Hamster zeigt die Dystonie einen altersabhängigen Verlauf (Beginn: ca. 16. Lebenstag (LT); Maximum: 30.-42. LT; Remission: 70. LT). Deshalb wurden als Untersuchungszeitpunkte der 18. LT und der 33. LT gewählt. Um die Migration der striatalen IN zu untersuchen, wurde im STR bei 33 Tage alten Hamsterns die Dichte der immun-histochemisch markierten Nkx 2.1-positiven Zellen stereologisch ermittelt. Der mRNA-Gehalt wurde relativ mittels „quantitativer Echtzeit-PCR“ (qPCR) bestimmt. Zusätzlich wurde die mRNA-Expression von Nkx 2.1 bei 18 Tage alten Tieren untersucht. Von KCC2 und CAH7 wurde die mRNA mittels qPCR bei 18 und 33 Tage alten Hamstern im STR untersucht. Die Expression von BDNF wurde mittels ELISA-System im Kortex (Cx), STR und im restlichen Gehirngewebe („R“) bei 33 und 18 Tage alten Tieren bestimmt. Der BDNF-mRNA Gehalt wurde im Cx (18. und 33. LT) und im STR (33. LT) untersucht. Des Weiteren sollte BDNF bei 33 Tage alten Hamstern mittels immunhistochemischer Markierung im Cx und STR untersucht werden. Die Untersuchung von BDNF im Cx ist deshalb wichtig, weil BDNF vom Cx in das STR trans-portiert wird. Zusätzlich wurde Parvalbumin (PV) zusammen mit Nkx 2.1 immunhistochemisch markiert und die mRNA-Expression von PV bei 18 und 33 Tage alten Tieren bestimmt. Ergebnisse: Für Nkx 2.1 konnte kein Unterschied in der Zelldichte zwischen dtsz- und Kontroll-hamstern gefunden werden. Ebenfalls gab es weder bei 18 noch bei 33 Tage alten Tieren einen Unterschied in der Nkx 2.1-mRNA-Expression. Unterschiede in der mRNA-Expression von KCC2 und CAH7 im STR (18. und 33. LT) lagen auch nicht vor. Die Expression der PV-mRNA im STR bei 33 Tage alten Tieren war jedoch erwartungsgemäß vermindert. Auf mRNA-Ebene konnte im Cx für BDNF kein Unterschied zwischen dtsz- und Kontrolltiergruppe gefunden wer-den. Bei beiden Tiergruppen wurde mittels ELISA im STR mehr BDNF nachgewiesen als im Cx und im R (18. und 33. LT) nachweisbar. Entgegen der Hypothese war nach Analyse der Daten mittels Zwei-Wege ANOVA eine geringe Erhöhung der BDNF-Expression im Cx und STR bei 33 Tage alten dtsz Hamstern nachweisbar. Dies lag daran, dass die BDNF-Expression nur bei den Kontrolltieren am 33. LT im Vergleich zum 18. LT herunterreguliert war. Die Ergebnisse der BDNF-Immunhistologie waren in Hinblick auf die Spezifität zweifelhaft. Schlussfolgerung: Die Nkx 2.1 Daten lassen auf eine ungestörte Migration striataler IN bei der dtsz Mutante schließen. Wahrscheinlich ist eine Ausreifungsstörung für den Mangel an GABAer-gen IN verantwortlich. Die Ergebnisse von KCC2 und CAH7 zeigen, dass keine generelle Ausreifungsstörung von GABAergen Neuronen vorliegt, wobei dies für kleinere Subpopulationen nicht ausgeschlossen werden kann. Entgegen der Arbeitshypothese konnte keine Verringerung sondern eine leichte Erhöhung von BDNF zum 33. LT bei der dtsz Hamstermutante festgestellt werden. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass BDNF auf Grund der verzögert einsetzenden Entwicklung der IN nicht herunterreguliert wird. Die Gründe für diese Erhöhung wie auch weitere Marker für die neuronale Ausreifung werden durch weiterführende Studien untersucht.

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La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués. Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991. / Peptide mapping is a routine method for identifying post-translational modifications of proteins. It involves three steps: 1) enzymatic proteolysis, 2) separation of the peptide fragments by capillary electrophoresis (CE) or high performance liquid chromatography (HPLC), 3) identification of the peptide fragments by photometric methods or mass spectrometry (MS). During the past decade, immobilized enzymes for proteolysis have been gaining in popularity because they can be reused and they provide fast protein digestion due to the high ratio of enzyme-to-substrate. In order to study new immobilization techniques developed in the Waldron laboratory, peptide mapping by CE is frequently used, where the total number of peptides detected and their abundance are related to enzymatic activity. CE allows very high resolution separations and, when coupled to laser-induced fluorescence (LIF), provides excellent detection limits that are 1000 times lower than with UV-Vis absorbance. In the typical method, the peptides produced in step 1) above are derivatized with a fluorophore before separation by CE-LIF. Although the detection sensitivity of LIF can approach 10 12 M for a highly efficient fluorophore, a major disadvantage is that the derivatization reaction requires analyte concentrations to be approx. 10 7 M or higher. Therefore, it is not feasible to study enzymes using CE-LIF of the peptides derivatized after proteolysis if the initial protein substrate concentration is <10-7 M because additional dilution occurs during proteolysis. Instead, to take advantage of CE-LIF to evaluate the efficiency of immobilized enzyme digestion of low concentrations of substrate, we propose using fluorescently derivatized protein substrates that can be purified then diluted. Three methods for conjugating fluorophore to protein were investigated in this work as a means to study both soluble and immobilized enzymes. The fluorophores studied for derivatization of protein standards included naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA), fluoresceine-5-isothiocyanate (FITC) and 6-carboxyfluorescein N-succinimide ester (FAMSE). The FAMSE was found to be an excellent reagent that conjugates quickly with primary amines and the derivatized substrate was stable over time. The studied substrates were -lactalbumin (LACT), carbonic anhydrase (CA) and insulin chain-B (INB). The CE-LIF peptide maps were generated from digestion of the fluorescently derivatized substrates by trypsin (T), chymotrypsin (CT) or pepsin (PEP), either in soluble or insoluble forms. The soluble form of an enzyme is more active than the immobilized form and this allowed us to verify that the conjugated proteins were still recognized as substrates by each enzyme. The digestion of the derivatized substrates with different types of chymotrypsin (CT) was compared: free (i.e., soluble) chymotrypsin, chymotrypsin cross-linked with glutaraldehyde (GACT) and chymotrypsin immobilized on agarose gel particles (GELCT), which was available commercially. The study showed that, according to the chymotrypsin used, the peptide map would vary in the number of peaks and their intensities. It also showed that the digestion by immobilized enzymes was quite reproducible. Several quantitative parameters were studied to evaluate the efficacy of the methods. The detection limit of the overall method (CE-LIF peptide mapping of FAM-derivatized protein digested by chymotrypsin) was 3.010-10 M (S/N = 2.7) carbonic anhydrase using insoluble GACT and 2.010-10 M (S/N = 4.3) CA using free chymotrypsin. Our studies also showed that the standard curve was linear in the working region (1.0×10-9-1.0×10-6 M) with a correlation coefficient (R2) of 0.9991.

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