Orientador: Wagner José Fávaro / Banca: Cintia Yuri Matsumura / Banca: Flávio de Oliveira Lima / Resumo: Agonistas dos receptores Toll-like (TLRs) podem representar candidatos promissores a serem desenvolvidos como medicamentos contra o câncer. Atualmente, a terapia mais eficaz para o câncer de bexiga urinária não-músculo invasivo (CBNMI) é a imunoterapia com BCG (Bacillus Calmette-Guerin), embora sua utilização esteja limitada a efeitos colaterais de intensidades variadas. Diante deste cenário destaca-se o P-MAPA, que por sua grande versatilidade e mínima citoxicidade, abre uma nova perspectiva para o combate de alguns tipos de cânceres, incluindo o CBNMI. Assim, os objetivos principais deste estudo foram caracterizar os efeitos histopatológicos e moleculares da imunoterapia intravesical com P-MAPA envolvendo as vias de sinalização dos TLRs 2 e 4 no tratamento do CBNMI induzido quimicamente em camundongos selvagens (wild type - WT) e knockouts (-/-) para TLR4 e MyD88. Os efeitos da imunoterapia com P-MAPA foram comparados com o tratamento com BCG. Foram utilizados 20 camundongos fêmeas de cada linhagem (WT, TLR4-/- e MyD88-/-), todos com 60 dias de idade e mantidos no Centro de Medicina Nuclear da Faculdade de Medicina/USP - São Paulo. Os animais foram divididos em 4 grupos de 5 animais, para cada linhagem: Grupo Controle (CTL): recebeu uma dose intravesical de solução fisiológica por 3 semanas consecutivas; Grupo MNU: recebeu uma dose intravesical de N-metil-N-nitrosouréia (MNU) a cada 15 dias, totalizando 3 doses; Grupo MNU+BCG: recebeu uma dose intravesical de BCG por 3 semanas consecutivas; Grupo MNU+P-MAPA: recebeu uma dose intravesical de P-MAPA por 3 semanas consecutivas. Após 09 semanas de experimento, as bexigas urinárias foram coletadas e submetidas às análises histopatológicas e Western Blotting. O presente trabalho demonstrou que a imunoterapia com P-MAPA promoveu distinta ativação do sistema imune inato mediada por TLRs 2 e 4 em relação ao BCG, resultando no aumento da via de sinalização para... / Abstract: Compounds that are able to act as Toll-like receptors (TLRs) agonists may represent promising candidates to be developed as drugs against cancer. Currently, the most effective therapy for non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) is immunotherapy with BCG (Bacillus Calmette-Guerin) associated with transurethral resection. However, the use of BCG is associated with side effects of varying strengths and in this scenario highlights the P-MAPA, which in great versatility and minimal cytotoxicity, opens a new perspective for fighting certain types of cancers, including NMIBC. Thus, the main objectives of this study were to characterize the histopathological and molecular effects of intravesical immunotherapy with P-MAPA involving the signaling pathways of TLRs 2 and TLR4 in the NMIBC treatment chemically induced in Wild Type mice (Wild Type - WT) and knockouts (-/-) for TLR4 and MyD88. The effects of P-MAPA immunotherapy were compared with BCG treatment. It were utilized 20 female mice of each strain (WT, TLR4 -/- and MyD88 -/-), all with 60 days of age and kept in the Nuclear Medicine Center, School of Medicine / USP - São Paulo. The animals were divided into 4 groups of 5 animals for each strain: Control Group (CTL): received intravesical dose of saline for 3 consecutive weeks; MNU Group: received a intravesical dose of N-methyl-N-Nitrosourea (MNU) every 15 days, a total of 3 doses; MNU+BCG Group: received received intravesical dose of BCG for 3 consecutive weeks; MNU+P-MAPA Group: received intravesical dose of P-MAPA for 3 consecutive weeks. After 09 weeks of experiment, urinary bladders were collected and submitted to histopathological and Western blotting analysis. The present study showed that P-MAPA immunotherapy led to distinct activation of the innate immune system TLR2 and 4-mediated when compared to BCG, resulting in increased signaling pathway for interferon (TRIF, IRF3, IFN-α and IFN-γ ) and restoration of the p53 protein ... / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Psicologia, Programa de Pós-Graduação em Ciência do Comportamento, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-06-06T11:17:04Z No. of bitstreams: 1 2013_MarcelodeFariaSalviano.pdf: 1619582 bytes, checksum: 0cf9e27cffae8406edbeb386e1ca605c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-06T12:07:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarcelodeFariaSalviano.pdf: 1619582 bytes, checksum: 0cf9e27cffae8406edbeb386e1ca605c (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-06T12:07:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarcelodeFariaSalviano.pdf: 1619582 bytes, checksum: 0cf9e27cffae8406edbeb386e1ca605c (MD5) / Diversos modelos animais geneticamente modificados têm sido recentemente utilizados no estudo experimental de funções psicológicas e psicopatologias. Usualmente, tais modelos são desenvolvidos por meio de cruzamentos seletivos bidirecionais ou pela engenharia genética, tais como animais knock in, knock out ou transgênicos. O presente estudo analisou a correlação fisiológica e comportamental de dois modelos genéticos diferentes. No experimento 1, machos da 5ª geração de uma nova linhagem de ratos Wistar selecionados para alta (CAC) ou baixa (CBC) resposta de congelamento ao contexto foram utilizados para avaliar o nível sanguíneo de corticosterona e ratos machos e fêmeas da 10ª geração foram utilizados para avaliar reações indicativas de ansiedade no labirinto em cruz elevado (LCE), comportamento indicativo de depressão no teste do nado forçado (TNF), assim como medo condicionado ao contexto. As medidas fisiológicas indicaram concentrações semelhantes de corticosterona nos machos das linhagens CAC e CBC da 5º geração. Nos testes comportamentais da 10ª geração, as fêmeas da linhagem CAC apresentaram maior nível de comportamento indicativo de ansiedade do que a linhagem CBC, assim como maior congelamento ao contexto previamente associado ao choque elétrico. Os machos apresentaram comportamentos indicativos de ansiedade semelhantes entre as linhagens e maior congelamento ao contexto da linhagem CAC comparado à CBC. No TNF, não houve diferenças entre as linhagens ou entre os sexos analisados. Essas diferenças nas respostas emocionais da nona geração de ratos selecionados, somados a resultados prévios de outras gerações, indicam um potencial uso desse modelo no estudo de correlações entre traço de ansiedade e reações de defesa. No segundo experimento, foram investigados os efeitos do isolamento social sobre o comportamento de camundongos machos e fêmeas transgênicos para a doença de Alzheimer (cepa 5xFAD) e seu grupo controle (B6SJL) submetidos a uma bateria de testes que incluíram testes de reatividade à manipulação, ansiedade, desamparo aprendido e memória e aprendizagem. Os resultados mostraram que o isolamento social, especialmente entre camundongos fêmeas, causou perda de peso, aumento de reatividade à manipulação e diminuição de comportamento indicativo de depressão, mas não afetou medidas de ansiedade e atividade locomotora. Além disso, fêmeas isoladas tiveram prejuízo na memória de medo condicionado ao contexto e um pequeno prejuízo na memória visuo-espacial. Camundongos 5xFAD tiveram menores níveis de comportamentos indicativos de ansiedade e depressão, mas sem prejuízos cognitivos significativos comparados com o grupo controle, e os 5xFAD isolados não se mostraram mais sensíveis aos efeitos da separação do que animais controle. Desses resultados, concluímos que o período de um mês de isolamento social não foi suficiente para induzir comportamentos indicativos de depressão, mas afetou a memória espacial e a aversiva de camundongos fêmeas. A validação desses dois modelos animais geneticamente modificados para simular experimentalmente transtornos de ansiedade e a doença de Alzheimer em humanos é discutida. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Several animal models genetically modified have recently used in the experimental study of psychological functions and psychopathologies. These models are usually developed through bidirectional selective breeding or by using genetic engineering, sush as knock in, knock out or transgenic animals. The present study further analyzed behavioral and physiological correlates of two different genetic models. In experiment 1, males from the 5TH generation of new lines of Wistar rats selectively bred for high (CHF) and low (CLF) contextual freezing response were used to analyze blood corticosterone levels and males and females from the 10th generation were used to investigate anxiety-like reactions in the elevated plus-maze (EPM), depressive-like behavior in the forced swim test (FST) as well as contextual fear conditioning. Physiological measures showed similar corticosterone concentrations in males from both lines CHF and CLF. Behavioral results of the 10th generation showed that female CHF line rats had higher anxiety-like behavior compared to CLF line and higher freezing in a context previously associated with electric shock as well. Male rats showed similar anxiety-like behavior between both lines and a higher contextual freezing of CHF line compared to CLF. In FST, there were no differences between lines or sexes. These differences in emotionality responses from the tenth generation of selected rats, added to previous results from other generations, indicates a potential use of this model in the study of correlations between anxiety trait and defensive reactions. In a second experiment, we investigated the effects of social isolation on behavior of male and female transgenic mice of Alzheimer disease (5XFAD strain) and their B6SJL wildtype (WT) littermates in a test battery including wildness, anxiety, behavioral despair and learning and memory tests. Our results indicate that social isolation, especially between female mice, caused body weight loss, increased wildness scores and decreased depression-like behavior but did not affect measures of anxiety or locomotion activity. Furthermore, isolated females showed an impaired context conditioned fear memory and a minor impaired visuo-spatial memory. The 5xFAD mice had impaired anxiety and depressive-like behaviors, but no significant impairments on cognition were found, and 5xFAD isolated mice were not more sensitive to the effects of separation than their wildtype littermates. From these results we conclude that the period of one month of social separation was not enough to induce behavioral despair but it did affected spatial memory and aversive memory of female mice. The validity of these two animal models genetically modified to experimentally simulate anxiety disorders and Alzheimer disease in humans is discussed.

Orientador: Helena Coutinho Franco de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T19:02:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Casquero_AndreaCamargo_D.pdf: 1109200 bytes, checksum: 0d66891096f39e7b47251643d7d9d885 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: As diferenças entre gêneros quanto ao perfil de lipoproteínas (LP) plasmáticas e risco de doenças ateroscleróticas são geralmente atribuídas aos efeitos protetores dos estrógenos e/ou pró-aterogênicos dos andrógenos. Neste trabalho realizamos três estudos dos efeitos de variações da concentração de testosterona sobre o metabolismo das LP e aterosclerose em camundongos que expressam a proteína de transferência de colesteril éster (CETP) com ou sem deficiência parcial do receptor de LDL. No primeiro estudo, mostramos que a deficiência de testosterona aumentou os níveis plasmáticos de LDL e de anticorpos anti-LDL oxidada e duplicou o tamanho médio da lesão aterosclerótica da raiz da aorta. A expressão da CETP neste modelo levou a um menor aumento de LDL e redução significativa do tamanho da lesão aterosclerótica. No segundo trabalho, comparamos os efeitos da suplementação com testosterona, na sua forma metabolizável ou não. Mostramos que a testosterona, seja metabolizável ou não, induziu elevações significativas de LDL e HDL. Somente a testosterona metabolizável aumentou a expressão da CETP e reduziu a de lipase hepática. No terceiro estudo, investigamos a interação entre os efeitos da testosterona não metabolizável (Mesterolona) e do exercício físico. Verificamos que o exercício físico aumentou HDL, de maneira mais potente nos animais que expressavam a CETP e nos animais que não foram tratados com Mesterolona. O exercício também reduziu a atividade da CETP, os níveis de triglicérides e ácidos graxos livres, independentemente do tratamento com Mesterolona. O tratamento com Mesterolona aumentou VLDL, independente do genótipo e do estado de atividade física, e reduziu HDL nos animais exercitados / Abstract: Gender differences in lipoprotein profile and atherosclerotic disease risk are generally attributed to an attenuating effect of estrogen and/or to a proatherogenic action of androgens. In this work we studied the effects of dificiency and excess of testosterone on the lipoprotein metabolism and development of atherosclerosis in transgenic mice expressing CETP with or without partial deficiency of the LDL receptor. In the first study, we showed that testosterone deficiency increased the levels of plasma LDL-cholesterol, and the titers of auto-antibodies anti-oxidized LDL and doubled the size of atherosclerotic lesions in the aortic roots. CETP expression in this animal model led to a less pronounced elevation of LDL-cholesterol and reduced significantly the atherosclerotic lesion size. In the second study, we compared the effects of two types of testosterone supplementation, metabolizable or not. We showed that either type of testosterone induced significant elevations in LDL- and HDL- cholesterol. Howerver, only the metabolizable testosterone promoted an increase in the CETP and a reduction in the hepatic lipase expression. In the third work, we investigated the interaction between the effects of non metabolizable testosterone (mesterolone) and physical exercise. We observed that the physical exercise increased HDL, more potently in animals expressing CETP and without mesterolone treatment. Physical exercise also reduced the CETP activity, triglycerides and free fatty acids levels, independently of the mesterolone treatment. The treatment with mesterolone increased VLDL, independently of the genotype and physical active state, and reduced HDL in the exercised mice / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Muitas das técnicas utilizadas para gerar animais transgênicos são caras e laboriosas. Neste contexto, a transferência gênica mediada por espermatozóides (TGME) pode ser uma alternativa para a produção em larga escala de animais transgênicos. Estudos de SMGT têm seu foco no número de cópias de DNA incorporada pelo espermatozóide. Por isso, há pouca informação disponível sobre como as moléculas de DNA se comportam durante o processo de fecundação e quais os efeitos dos protocolos de TGME sobre a célula espermática. Neste sentido, com o objetivo de avaliar a existência de sitio de integração preferencial das moléculas exógenas de DNA no genoma hospedeiro, utilizamos a hibridização in situ para acompanhar a veiculação do transgene durante o processo de fecundação. Foram avaliadas as membranas acrossomais, plasmática e potencial de membrana mitocondrial de espermatozóides submetidos a TGME. Para isso, o sêmen de três diferentes touros foram submetidos ao gradiente de Percoll 45-90%. As células viáveis foram incubadas com o vetor recombinante pCX-EGFP (0, 250, 500 ou 1000ng/106 células) seguidas ou não de eletroporação (300v, 35µF e 0,25ms). Os espermatozóides tratados foram utilizados para a produção in vitro de embriões. Os embriões foram cultivados por sete dias até o estágio de blastocisto. Espermatozóides e embriões produzidos in vitro foram submetidos ao ensaio de hibridização in situ, com metodologia descrita Whyte et al. (2000). O potencial de membrana mitocondrial (PMM), integridade de membrana acrossomal (MA) e plasmática (MP) foram avaliados por citometria de fluxo (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) utilizando as sondas fluorescentes JC1, FITC-PSA e PI (Molecular Probes), respectivamente. Os dados foram analisados pelo teste paramétrico ANOVA (teste LSD) usando o programa estatístico SAS for Windows, com nível de significância de 5%. A hibridização in situ não foi possível em espermatozóides bovinos, pois não houve hibridação da sonda controle. Blastocistos oriundos de espermatozóides incubados com DNA exógeno apresentaram integração de forma difusa, embriões oriundos de espermatozóides eletroporados apresentaram integração pontual. As diferentes concentrações de DNA não exerceram efeitos deletérios nas MP ou PMM, a adição de 500ng de DNA causou aumento de lesão na MA (p<0,05). A eletroporação não afeta a MP e MA, mais apresenta grande efeito no PMM causando redução da função mitocondrial. Este estudo conclui que maiores esforços são necessários para elucidar o comportamento das moléculas exógenas de DNA durante o processo de fecundação e quais são os efeitos da TGME sobre a célula espermática. / Most techniques used to produce transgenic animals are laborious and expensive. In this manner, sperm mediated gene transfer (SMGT) may be a viable alternative for long-scale production of transgenic animals. Many SMGT studies have focused the DNA internalization and number of DNA copies incorporated by spermatozoa. However, limited data is available about how foreign DNA molecules behave during fertilization and the direct effects of the SMGT technique on sperm cells. Hence, in order to monitor the existence of preferential integration sites by the exogenous DNA at the host genome, in situ hybridization was used to track the transgene conveyance during in vitro fertilization. In addition, acrosome and plasmatic membrane integrity and mitochondrial membrane potential of sperm cells subjected to SMGT were assessed. Briefly, thawed semen from three different bulls was submitted to a 45- 90% Percoll gradient. Viable cells were incubated with recombinant PCX-EGFP vector (0, 250, 500 or 1000ng/106 sperm cells) or incubated and electroporated (300V, 35µF and 0.25ms). Treated sperm cells were then used for in vitro production of embryos. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. Treated spermatozoa and in vitro produced blastocysts were submitted to in situ hybridization assay, as described by Whyte et al. (2000). The mitochondrial membrane potential (MMP), acrosomal membrane (AM) and plasmatic membrane (PM) integrity were assessed by flow cytometry (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) using JC1, FITC-PSA and PI probes (Molecular Probes), respectively. Data were analyzed by parametric ANOVA (LSD test) using SAS for Windows software, at a 5% level. The transgene was not observed at the bovine spermatozoa because the control probe could not be hybridized. In situ hybridization revealed that blastocysts produced from incubated sperm cells had a diffuse foreign DNA integration while blastocysts produced from electroporated sperm cells had a punctual DNA integration. No deleterious effects of exogenous DNA concentrations on PM or MMP were observed. However, the addition of 500ng of exogenous DNA caused sperm AM injury (P<0.05). Electroporation did not affect PM or AM integrity, but it had a great effect on MMP, which may cause a reduction of mitochondrial function. This study suggest that more efforts are needed to elucidate the behavior of exogenous DNA during fertilization and the effects of SMGT in bovine sperm cells.

Muitas das técnicas utilizadas para gerar animais transgênicos são caras e laboriosas. Neste contexto, a transferência gênica mediada por espermatozóides (TGME) pode ser uma alternativa para a produção em larga escala de animais transgênicos. Estudos de SMGT têm seu foco no número de cópias de DNA incorporada pelo espermatozóide. Por isso, há pouca informação disponível sobre como as moléculas de DNA se comportam durante o processo de fecundação e quais os efeitos dos protocolos de TGME sobre a célula espermática. Neste sentido, com o objetivo de avaliar a existência de sitio de integração preferencial das moléculas exógenas de DNA no genoma hospedeiro, utilizamos a hibridização in situ para acompanhar a veiculação do transgene durante o processo de fecundação. Foram avaliadas as membranas acrossomais, plasmática e potencial de membrana mitocondrial de espermatozóides submetidos a TGME. Para isso, o sêmen de três diferentes touros foram submetidos ao gradiente de Percoll 45-90%. As células viáveis foram incubadas com o vetor recombinante pCX-EGFP (0, 250, 500 ou 1000ng/106 células) seguidas ou não de eletroporação (300v, 35µF e 0,25ms). Os espermatozóides tratados foram utilizados para a produção in vitro de embriões. Os embriões foram cultivados por sete dias até o estágio de blastocisto. Espermatozóides e embriões produzidos in vitro foram submetidos ao ensaio de hibridização in situ, com metodologia descrita Whyte et al. (2000). O potencial de membrana mitocondrial (PMM), integridade de membrana acrossomal (MA) e plasmática (MP) foram avaliados por citometria de fluxo (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) utilizando as sondas fluorescentes JC1, FITC-PSA e PI (Molecular Probes), respectivamente. Os dados foram analisados pelo teste paramétrico ANOVA (teste LSD) usando o programa estatístico SAS for Windows, com nível de significância de 5%. A hibridização in situ não foi possível em espermatozóides bovinos, pois não houve hibridação da sonda controle. Blastocistos oriundos de espermatozóides incubados com DNA exógeno apresentaram integração de forma difusa, embriões oriundos de espermatozóides eletroporados apresentaram integração pontual. As diferentes concentrações de DNA não exerceram efeitos deletérios nas MP ou PMM, a adição de 500ng de DNA causou aumento de lesão na MA (p<0,05). A eletroporação não afeta a MP e MA, mais apresenta grande efeito no PMM causando redução da função mitocondrial. Este estudo conclui que maiores esforços são necessários para elucidar o comportamento das moléculas exógenas de DNA durante o processo de fecundação e quais são os efeitos da TGME sobre a célula espermática. / Most techniques used to produce transgenic animals are laborious and expensive. In this manner, sperm mediated gene transfer (SMGT) may be a viable alternative for long-scale production of transgenic animals. Many SMGT studies have focused the DNA internalization and number of DNA copies incorporated by spermatozoa. However, limited data is available about how foreign DNA molecules behave during fertilization and the direct effects of the SMGT technique on sperm cells. Hence, in order to monitor the existence of preferential integration sites by the exogenous DNA at the host genome, in situ hybridization was used to track the transgene conveyance during in vitro fertilization. In addition, acrosome and plasmatic membrane integrity and mitochondrial membrane potential of sperm cells subjected to SMGT were assessed. Briefly, thawed semen from three different bulls was submitted to a 45- 90% Percoll gradient. Viable cells were incubated with recombinant PCX-EGFP vector (0, 250, 500 or 1000ng/106 sperm cells) or incubated and electroporated (300V, 35µF and 0.25ms). Treated sperm cells were then used for in vitro production of embryos. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. Treated spermatozoa and in vitro produced blastocysts were submitted to in situ hybridization assay, as described by Whyte et al. (2000). The mitochondrial membrane potential (MMP), acrosomal membrane (AM) and plasmatic membrane (PM) integrity were assessed by flow cytometry (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) using JC1, FITC-PSA and PI probes (Molecular Probes), respectively. Data were analyzed by parametric ANOVA (LSD test) using SAS for Windows software, at a 5% level. The transgene was not observed at the bovine spermatozoa because the control probe could not be hybridized. In situ hybridization revealed that blastocysts produced from incubated sperm cells had a diffuse foreign DNA integration while blastocysts produced from electroporated sperm cells had a punctual DNA integration. No deleterious effects of exogenous DNA concentrations on PM or MMP were observed. However, the addition of 500ng of exogenous DNA caused sperm AM injury (P<0.05). Electroporation did not affect PM or AM integrity, but it had a great effect on MMP, which may cause a reduction of mitochondrial function. This study suggest that more efforts are needed to elucidate the behavior of exogenous DNA during fertilization and the effects of SMGT in bovine sperm cells.