O estabelecimento e a evolução da leptospirose em hamster (Mesocricetus auratus) pela infecção experimental com Leptospira interrogans sorovar Canicola, estirpe LO4, pela exposição cutânea íntegra e escarificada, tendo como controle a via intraperitoneal foram avaliados, bem como o efeito da freqüência de exposições e da concentração do inóculo infectante quanto ao estabelecimento da doença e do portador renal e/ou genital, o potencial de transmissão e disseminação ambiental entre hamsters doentes e saudáveis com pele íntegra e escarificada e a resposta humoral induzida pela infecção experimental e exposição ambiental. O experimento foi conduzido em duas fases. No experimento 1, foram utilizados 130 hamsters fêmeas divididos em 12 grupos de acordo com a concentração do inóculo infectante (30 e 100 leptospiras/campo), a freqüência de exposição (uma, duas e quatro exposições) e a via de inoculação (pele escarificada e pele íntegra). No experimento 2, foram formados dois grupos de 10 animais, separados em caixas de polipropileno: animais sadios com escarificação cutânea (G1); e animais sadios com pele íntegra (G2). Nas caixas de ambos os grupos foi introduzido um hamster previamente infectado com Leptospira interrogans sorovar Canicola, estirpe LO4, por escarificação cutânea na dose de 100 leptospiras/campo. As condições de umidade foram mantidas por borrifações diárias (duas vezes ao dia) com água, por um período de 21 dias. Em ambas as fases, os animais foram observados duas vezes ao dia, durante 21 dias. Os animais que vieram a óbito foram necropsiados e colhidos assepticamente rins, fígado, sistema genital (útero e ovário) e cérebro. Os animais sobreviventes foram eutanasiados após 21 dias. Foram ainda colhidas amostras de soro sanguíneo por punção cardíaca para a pesquisa de aglutininas antileptospiras nos animais sobreviventes. Para a detecção de leptospiras, foram utilizados microscopia direta a fresco, cultivo microbiológico e coloração pelo método de Whartin-Starry. Para a observação das alterações patológicas dos órgãos foi utilizada a coloração por Hematoxilina-Eosina. O teste de soroaglutinação microscópica (SAM) foi utilizado para a detecção de aglutininas antileptospiras. As técnicas de microscopia direta e o cultivo microbiológico foram eficientes na identificação de leptospiras nos órgãos de hamsters inoculados com o sorovar Canicola, estirpe LO4. A via cutânea escarificada induziu maior letalidade quando comparada com a pele integra nas duas concentrações do inóculo infectante, com estabelecimento e evolução da leptospirose com lesões típicas da doença; por outro lado, a via cutânea íntegra induziu mais freqüentemente o estado de portador renal e/ou genital para leptospirose. A freqüência de exposição e a concentração do inóculo infectante não influenciaram no estado de portador renal e/ou genital ou mesmo na presença de leptospiras no tecido cerebral nas duas condições cutâneas empregadas na infecção experimental. A estirpe LO4 apresentou baixo poder imunogênico, não apresentando soroconversão na SAM, em ambas as condições de inoculação cutânea. Foi possível a transmissão da bactéria entre hamsters pela exposição ao ambiente contaminado. / The establishment and evolution of leptospirosis in hamster (Mesocricetus auratus) by experimental infection with Leptospira interrogans serovar Canicola, strain LO4, by intact and scratched skin exposures, having as control the intraperitoneal route, were evaluated, as well as the effect of the frequency of exposures and concentration of the infectant inoculum regarding the establishment of the disease and the renal and/or genital carrier states, the potential of environmental transmission and spread among diseased and healthy hamsters with intact and scratched skin and the humoral response induced by experimental infection and environmental exposure. The experiment was conducted in two phases. In the experiment 1, 130 female hamsters were distributed in 12 groups according to concentration of the infectant inoculum (30 and 100 leptospires/microscopic field), frequency of exposure (one, two and four exposures) and inoculation route (intact and scratched skin). In the experiment 2, two groups of 10 animals were allocated in polypropylene boxes: healthy animals with scratched skin (G1); and healthy animals with intact skin (G2). A hamster previously infected with Leptospira interrogans serovar Canicola, strain LO4, by cutaneous scratch at a concentration of 100 leptospires/microscopic field was introduced inside the boxes. The humidity terms were kept by daily aspersions (twice in a day) with water, by a period of 21 days. In both phases, animals were observed twice in a day during 21 days. Animals that died were necropsied and kidneys, liver, genital tract (uterus and ovaries) and brain were aseptically collected. On the 21st post-inoculation day, surviving animals were euthanized. In these animals, serum samples were also collected by cardiac puncture to antileptospires agglutinins research. Fresh direct microscopy, microbiological culture and Whartin-Starry staining method were used for the detection of leptospires. For the observation of pathological changes in organs, Hematoxilin-Eosin staining method was used. Microscopic agglutination test (MAT) was carried out to the detection of anti-leptospires agglutinins. Direct microscopy and microbiological culture were efficient in the identification of leptospires in organs from hamsters inoculated with serovar Canicola, strain LO4. Scratched skin route induced larger lethality when compared to intact skin route at the two concentrations of the infectant inoculum, with establishment and evolution of leptospirosis with typical lesions of the disease; on the other hand, intact skin route induced renal and/or genital carrier state more frequently. The frequency of exposure and the concentration of the infectant inoculums had no influence in the renal and/or genital carrier state, as well as in the presence of leptospires in brain tissue in the two cutaneous routes employed to experimental infection. LO4 strain presented low immunogenic power, characterized by no soroconversion at the MAT in both cutaneous routes. The transmission of the bacterium among hamsters by exposure to contaminated environment was possible.

O estabelecimento e a evolução da leptospirose em hamster (Mesocricetus auratus) pela infecção experimental com Leptospira interrogans sorovar Canicola, estirpe LO4, pela exposição cutânea íntegra e escarificada, tendo como controle a via intraperitoneal foram avaliados, bem como o efeito da freqüência de exposições e da concentração do inóculo infectante quanto ao estabelecimento da doença e do portador renal e/ou genital, o potencial de transmissão e disseminação ambiental entre hamsters doentes e saudáveis com pele íntegra e escarificada e a resposta humoral induzida pela infecção experimental e exposição ambiental. O experimento foi conduzido em duas fases. No experimento 1, foram utilizados 130 hamsters fêmeas divididos em 12 grupos de acordo com a concentração do inóculo infectante (30 e 100 leptospiras/campo), a freqüência de exposição (uma, duas e quatro exposições) e a via de inoculação (pele escarificada e pele íntegra). No experimento 2, foram formados dois grupos de 10 animais, separados em caixas de polipropileno: animais sadios com escarificação cutânea (G1); e animais sadios com pele íntegra (G2). Nas caixas de ambos os grupos foi introduzido um hamster previamente infectado com Leptospira interrogans sorovar Canicola, estirpe LO4, por escarificação cutânea na dose de 100 leptospiras/campo. As condições de umidade foram mantidas por borrifações diárias (duas vezes ao dia) com água, por um período de 21 dias. Em ambas as fases, os animais foram observados duas vezes ao dia, durante 21 dias. Os animais que vieram a óbito foram necropsiados e colhidos assepticamente rins, fígado, sistema genital (útero e ovário) e cérebro. Os animais sobreviventes foram eutanasiados após 21 dias. Foram ainda colhidas amostras de soro sanguíneo por punção cardíaca para a pesquisa de aglutininas antileptospiras nos animais sobreviventes. Para a detecção de leptospiras, foram utilizados microscopia direta a fresco, cultivo microbiológico e coloração pelo método de Whartin-Starry. Para a observação das alterações patológicas dos órgãos foi utilizada a coloração por Hematoxilina-Eosina. O teste de soroaglutinação microscópica (SAM) foi utilizado para a detecção de aglutininas antileptospiras. As técnicas de microscopia direta e o cultivo microbiológico foram eficientes na identificação de leptospiras nos órgãos de hamsters inoculados com o sorovar Canicola, estirpe LO4. A via cutânea escarificada induziu maior letalidade quando comparada com a pele integra nas duas concentrações do inóculo infectante, com estabelecimento e evolução da leptospirose com lesões típicas da doença; por outro lado, a via cutânea íntegra induziu mais freqüentemente o estado de portador renal e/ou genital para leptospirose. A freqüência de exposição e a concentração do inóculo infectante não influenciaram no estado de portador renal e/ou genital ou mesmo na presença de leptospiras no tecido cerebral nas duas condições cutâneas empregadas na infecção experimental. A estirpe LO4 apresentou baixo poder imunogênico, não apresentando soroconversão na SAM, em ambas as condições de inoculação cutânea. Foi possível a transmissão da bactéria entre hamsters pela exposição ao ambiente contaminado. / The establishment and evolution of leptospirosis in hamster (Mesocricetus auratus) by experimental infection with Leptospira interrogans serovar Canicola, strain LO4, by intact and scratched skin exposures, having as control the intraperitoneal route, were evaluated, as well as the effect of the frequency of exposures and concentration of the infectant inoculum regarding the establishment of the disease and the renal and/or genital carrier states, the potential of environmental transmission and spread among diseased and healthy hamsters with intact and scratched skin and the humoral response induced by experimental infection and environmental exposure. The experiment was conducted in two phases. In the experiment 1, 130 female hamsters were distributed in 12 groups according to concentration of the infectant inoculum (30 and 100 leptospires/microscopic field), frequency of exposure (one, two and four exposures) and inoculation route (intact and scratched skin). In the experiment 2, two groups of 10 animals were allocated in polypropylene boxes: healthy animals with scratched skin (G1); and healthy animals with intact skin (G2). A hamster previously infected with Leptospira interrogans serovar Canicola, strain LO4, by cutaneous scratch at a concentration of 100 leptospires/microscopic field was introduced inside the boxes. The humidity terms were kept by daily aspersions (twice in a day) with water, by a period of 21 days. In both phases, animals were observed twice in a day during 21 days. Animals that died were necropsied and kidneys, liver, genital tract (uterus and ovaries) and brain were aseptically collected. On the 21st post-inoculation day, surviving animals were euthanized. In these animals, serum samples were also collected by cardiac puncture to antileptospires agglutinins research. Fresh direct microscopy, microbiological culture and Whartin-Starry staining method were used for the detection of leptospires. For the observation of pathological changes in organs, Hematoxilin-Eosin staining method was used. Microscopic agglutination test (MAT) was carried out to the detection of anti-leptospires agglutinins. Direct microscopy and microbiological culture were efficient in the identification of leptospires in organs from hamsters inoculated with serovar Canicola, strain LO4. Scratched skin route induced larger lethality when compared to intact skin route at the two concentrations of the infectant inoculum, with establishment and evolution of leptospirosis with typical lesions of the disease; on the other hand, intact skin route induced renal and/or genital carrier state more frequently. The frequency of exposure and the concentration of the infectant inoculums had no influence in the renal and/or genital carrier state, as well as in the presence of leptospires in brain tissue in the two cutaneous routes employed to experimental infection. LO4 strain presented low immunogenic power, characterized by no soroconversion at the MAT in both cutaneous routes. The transmission of the bacterium among hamsters by exposure to contaminated environment was possible.

A taxonomia dos agentes etiológicos da malária aviária é bastante controversa e a grande maioria dos estudos se baseia apenas na identificação morfológica. Embora estudos recentes utilizando técnicas de biologia molecular tenham gerado sequências no GenBank, muitas delas foram diagnosticadas somente ao nível do gênero. A correta identificação destes parasitas é essencial para melhor entendimento da interação hospedeiro-parasita. Assim, a combinação da microscopia com métodos moleculares, e em alguns casos a realização de infeções experimentais, contribuem para a obtenção de informações sobre as características do parasita bem como permitem analisar coinfecções em aves por diferentes espécies de hemosporídeos. O presente trabalho visou identificar as espécies das linhagens de Plasmodium detectadas em aves amostradas na Fundação Parque Zoológicas de São Paulo (FPZSP) em um estudo anterior, através de um modelo experimental para o desenvolvimento eritrocítico de parasitas da malária. Paralelamente, buscou identificar hemosporídeos (Plasmodium, Haemoproteus e Leucocytozoon) em aves de vida livre da região Neotropical. Para a primeira proposta, 15 pintinhos naives foram inoculados com uma mistura de solução de citrato de sódio e sangue coletado de 8 aves da FPZSP. A cada 4 dias durante 35 dias, as aves inoculadas foram testadas para verificar a parasitemia através de esfregaços sanguíneos, onde constatou-se a presença de trofozoítos no 4° dia pós inoculação (dpi) nas aves inoculadas com sangue de Pavo muticus (pavão-verde). Porém, ao longo do período do experimento a parasitemia não aumentou. Não foram verificadas formas evolutivas dos parasitas e as poucas formas que existiam desapareceram. Ao fim de 35 dpi foram efetuados testes moleculares, porém as aves inicialmente positivas apresentaram resultados negativos, o que se acredita tratar de uma infecção abortiva. Em relação às aves de vida livre, foram testadas 531 amostras de sangue para a identificação de hemosporídeos em comunidades de aves da região Neotropical. Dessas, 72 foram positivas para hemosporídeos. As amostras positivas foram sequenciadas tendo-se obtido 42 diferentes linhagens de cytb, sendo 12 Haemoproteus, 25 Plasmodium e 5 Leucocytozoon. Algumas das linhagens encontradas no presente trabalho já foram descritas no Brasil e em outros países, mas 18 linhagens são novas descrições. Entretanto, as baixas parasitemias encontradas nas lâminas positivas impossibilitaram a descrição de novas espécies. Os resultados obtidos no presente estudo reforçam a necessidade do estabelecimento de um modelo para identificação de espécies de linhagens, assim como a importância da combinação microscopia/PCR/sequenciamento para a correta identificação de parasitas. Essas abordagens são essenciais para o conhecimento da biodiversidade e história evolutiva dos hemosporídeos, principalmente na região Neotropical. / The taxonomy of avian malaria etiological agents is quite controversial, and most studies are based only on morphological identification. Although recent studies using molecular biology techniques have generated sequences in GenBank, many of them have been diagnosed only at the genus level. Correct identification of these parasites is essential for a better understanding of host-parasite interaction. Thus, the combination of microscopy with molecular methods, and in some cases the realization of experimental infections, contribute to obtain information on the parasite characteristics as well as to analyze different species of hemosporidian parasites in coinfections. The present work aimed to identify the species of Plasmodium lineages widely detected in birds sampled at the São Paulo Zoological Park Foundation (FPZSP) in a previous study, through an experimental model for the erythrocytic development of malaria parasites. At the same time, it sought to identify hemosporidian parasites (Plasmodium, Haemoproteus and Leucocytozoon) in free-living birds of the Neotropical region. For the first proposal, 15 naive chicks were inoculated with a mixture of sodium citrate solution and blood collected from 8 FPZSP birds. Every 4 days for 35 days, the inoculated birds were tested for parasitemia by thin blood smears, where trophozoites were found on the 4th post-inoculation day (dpi) in birds inoculated with Pavo muticus (green peafowl) blood. However, over the period of the experiment, parasitemia did not increase. No evolutionary forms of the parasites were verified and the few forms that existed disappeared. After 35 dpi, molecular tests were performed, but initially positive birds showed negative results, which is believed to be an abortive infection. Regarding free-living birds, 531 blood samples were tested for identification of hemosporidian parasites in Neotropical bird communities. Of these, 72 were positive and 42 different lineages of cytb were obtained: 12 Haemoproteus, 25 Plasmodium and 5 Leucocytozoon. Some of the lineages have already been described in Brazil and other countries, but 18 are new descriptions. However, the low parasitemias found in the positive slides made it impossible to describe new species. The results obtained in the present study reinforce the need to establish a model for the identification species, as well as the importance of the microscopy/PCR/sequencing combination for the correct identification of parasites. These approaches are essential for knowledge of the biodiversity and evolutionary history of hemosporidian parasites, especially in the Neotropical region.

Nesse trabalho avaliamos a proteção que o anticorpo monoclonal (AcM) contra CMH e contra Hsp60 fornecem aos animais infectados com as leveduras de Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii em modelo profilático. O tratamento com os AcMs de isotipos IgG2a e IgG2b foram protetores, induzindo a secreção das citocinas IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g e TNF-<font face=\"Symbol\">a, padrão de resposta imune Th1. Nós mostramos por imunomarcação que moléculas de CMH e Hsp60 estão acessíveis na célula. E o anticorpo monoespecífico contra CMH e os anticorpos policlonais contra melanina, gerados nesse trabalho foram eficazes nos ensaios in vitro de proteção. Foram gerados anticorpos monoclonais contra glicoproteina extraída de Pb18, o AcM reconheceu, por imunomarcação, estruturas internas e a parede celular da levedura. Avaliamos um novo modelo de hospedeiro, com o uso da larva Galleria mellonella, o que pode servir de triagem e reduzir desta forma o uso excessivo de camundongos, as leveduras P. lutzii e H. capsulatum são letais para as larvas e evocam resposta celular que se organizam semelhante a um granuloma. / In this work we evaluated the protection that the monoclonal antibody (MAb) against Hsp60 and against CMH provides the animals infected with the yeast Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii in prophylactic model. The treatment with the MAbs of IgG2a and IgG2b isotypes were protective, inducing the secretion of IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g and TNF-<font face=\"Symbol\">a, Th1 pattern of immune response. We show by immunogold that Hsp60 and MHC molecules are accessible on the cell. And the monospecific antibody against HCM and polyclonal antibodies against melanin, generated in this study were effective in in vitro assays of protection. Monoclonal antibodies were generated glycoprotein extracted from Pb18, Mab recognized by immunogold, internal structures and cell wall material. Evaluated a new type of host, using the larvae Galleria mellonella, which can serve as a screening and reduce thus the overuse of mice, yeast P. lutzii and H. capsulatum are lethal to larvae and evoke cellular responses that are organized like a granuloma.

Nesse trabalho avaliamos a proteção que o anticorpo monoclonal (AcM) contra CMH e contra Hsp60 fornecem aos animais infectados com as leveduras de Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii em modelo profilático. O tratamento com os AcMs de isotipos IgG2a e IgG2b foram protetores, induzindo a secreção das citocinas IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g e TNF-<font face=\"Symbol\">a, padrão de resposta imune Th1. Nós mostramos por imunomarcação que moléculas de CMH e Hsp60 estão acessíveis na célula. E o anticorpo monoespecífico contra CMH e os anticorpos policlonais contra melanina, gerados nesse trabalho foram eficazes nos ensaios in vitro de proteção. Foram gerados anticorpos monoclonais contra glicoproteina extraída de Pb18, o AcM reconheceu, por imunomarcação, estruturas internas e a parede celular da levedura. Avaliamos um novo modelo de hospedeiro, com o uso da larva Galleria mellonella, o que pode servir de triagem e reduzir desta forma o uso excessivo de camundongos, as leveduras P. lutzii e H. capsulatum são letais para as larvas e evocam resposta celular que se organizam semelhante a um granuloma. / In this work we evaluated the protection that the monoclonal antibody (MAb) against Hsp60 and against CMH provides the animals infected with the yeast Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii in prophylactic model. The treatment with the MAbs of IgG2a and IgG2b isotypes were protective, inducing the secretion of IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g and TNF-<font face=\"Symbol\">a, Th1 pattern of immune response. We show by immunogold that Hsp60 and MHC molecules are accessible on the cell. And the monospecific antibody against HCM and polyclonal antibodies against melanin, generated in this study were effective in in vitro assays of protection. Monoclonal antibodies were generated glycoprotein extracted from Pb18, Mab recognized by immunogold, internal structures and cell wall material. Evaluated a new type of host, using the larvae Galleria mellonella, which can serve as a screening and reduce thus the overuse of mice, yeast P. lutzii and H. capsulatum are lethal to larvae and evoke cellular responses that are organized like a granuloma.