O objetivo do presente estudo foi avaliar a aptidão reprodutiva de cães da raça Golden Retriever afetados pela distrofia muscular. Realizou-se avaliações andrológicas em 11 cães com idades entre 10 meses e 4 anos. Destes, 7 eram afetados pela distrofia muscular e 4 sadios, utilizados como controle. Todos foram submetidos a exame clinico, análise seminal e ultra-sonografia dos órgãos reprodutores. Analisou-se também a morfologia dos testículos e seus respectivos funículos espermáticos dos cães que foram a óbito. Detectou-se as seguintes alterações nos cães afetados pela distrofia: atrofia muscular, andar rígido, pneumonia por aspiração, fragilidade do diafragma com projeção do estomago para a cavidade torácica, megaesôfago e cardiomiopatia dilatada. Em relação aos órgãos genitais dois dos cães apresentaram criptorquidismo bilateral. Os resultados das análises seminais mostraram que os cães afetados pela distrofia possuem maior quantidade de defeitos espermáticos maiores e totais. Nas avaliações ultra-sonográficas não foram identificadas diferenças entre os cães afetados pela distrofia quando comparados com cães sadios. As análises histopatológicas evidenciaram alterações morfológicas nos testículos e músculos cremáster de cães afetados pela doença. Os testículos apresentaram degeneração testicular e o músculo cremáster retração de fibras musculares com hialinizacao dos miócitos. Conclui-se então que a distrofia muscular em cães da raça Golden Retriever pode comprometer sua aptidão reprodutiva. / The aim of the present research was to evaluate the reproductive condition of Golden Retriever dogs affected by muscular dystrophy. Breeding soundness examination was performed in 11 male dogs aged between 10 months and 4 years. Seven of this total were affected by muscular dystrophy and 4 healthy dogs that served as control. All dogs were submitted to a through physical exam, seminal evaluation and ultrasound of the reproductive tract. Testicle and spermatic cord morphology of post-mortem dogs were also examined. The following alterations were observed for the affected dogs: muscular atrophy, stiff walk, aspiration pneumonia, diaphragmatic fragility with stomach projection to the torax, megaesophagus e dilated cardiomyopathy. In relation to the genital tract, two dogs presented with bilateral cryptorchidism. Semen evaluation revealed high percentage of major and total sperm defects in affected dogs. Ultrasonographic exams were similar among healthy and affected dogs. Histophatology of the testicle and cremaster muscle revealed morphologic alterations in affected dogs represented by degeneration and muscular retraction with miocyte hyalinization, respectively. In conclusion, affected Golden Retriever dogs have their reproductive performance compromised by the muscular dystrophy.

A sobrevivência da maioria das espécies de Felideos selvagens conhecidas, foi colocada em risco por diversos fatores, entre eles a perda difusa de habitat, a caça ilegal e a fragmentação e degradação de suas áreas de ocorrência. Para o sucesso de um plano conservacionista faz-se necessária a utilização de biotecnologias direcionadas à preservação da variabilidade genética das populações de animais selvagens. Na prática, a aplicação de biotécnicas reprodutivas no manejo destas populações enfrenta dificuldades como a distância entre os indivíduos que se deseja acasalar ou a distância destes em relação aos centros de pesquisa onde se encontra a estrutura necessária para manipulação de seus gametas. O resfriamento é uma técnica de conservação de sêmen frequentemente utilizada para contornar estes problemas, porém pode submeter os gametas ao estresse oxidativo. Sabe-se que as espécies reativas ao oxigênio responsáveis por este estresse podem causar danos estruturais significantes às membranas e, principalmente, ao material genético dos espermatozóides. O uso de diluidores e antioxidantes que possam promover uma proteção aos espermatozóides contra os danos do estresse oxidativo pode ser uma alternativa para manter a qualidade do sêmen sob refrigeração. Para avaliar esta hipótese, o sêmen do gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus, SCHREBER, 1775) foi submetido a testes convencionais e funcionais em diferentes tempos de refrigeração a 4°C (2, 12 e 24 horas), utilizando-se três diluidores (TCM 199, Ham F10 e tris-gema-citrato) e o tratamento com glutationa reduzida (GSH) em diferentes concentrações (0; 0,5; 1,0 e 1,5mM) para obter uma melhora na qualidade do sêmen. Os testes convencionais utilizados foram a motilidade e vigor. Os funcionais compreenderam as avaliações da integridade das membranas plasmática e acrossomal, da atividade mitocondrial, e da fragmentação do material genético. Também foi avaliada a suscetibilidade das células espermáticas à peroxidação lipídica induzida através da mensuração da concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os resultados obtidos para as provas convencionais e funcionais, com exceção da resistência dos espermatozóides ao estresse oxidativo por meio da dosagem TBARS, indicaram que o diluidor tris-gema-citrato (TGC) foi superior aos diluidores TCM 199 (TCM) e Ham F10 (HAM), sendo que não houve efeito do tratamento com GSH. Para todos os diluidores as variáveis referentes aos testes funcionais apresentaram correlação com as variáveis referentes aos testes convencionais. Apenas para os diluidores HAM e TGC a concentração de TBARS apresentou correlação com a atividade mitocondrial e integridade acrossomal. Nas amostras diluídas no TGC não foram verificados efeitos do tratamento com GSH, ou do tempo de refrigeração no grau de integridade do DNA das células espermáticas. Também nas amostras diluídas em TGC, a integridade do DNA correlacionou-se com a concentração de TBARS e com aatividade mitocondrial, mas não com os testes convencionais e os outros testes funcionais. Conclui-se que o melhor diluidor para manter o sêmen do gato-do-mato-pequeno sob refrigeração a 4ºC, por 24 horas, é o diluidor à base de gema de ovo (TGC), sendo que o tratamento antioxidante com GSH nas concentrações utilizadas não apresentou efeito sobre a qualidade deste sêmen. / The survival of most of the known wild feline species was jeopardized by diffuse habitat lost, illegal hunting and fragmentation and devastation of their occurrence areas. The use of biotechnologies aiming to preserve the genetic variability of wild animal populations is crucial for the success of a conservationist program. The practical application of reproductive biotechnologies on the management of these populations faces difficulties such as the distance between individuals included in a breeding plan or between the animals and the research centers where the necessary structure to manipulate their gametes is located. Semen cooling is a conservation technique frequently used to overcome those problems. However such technology may submit the spermatozoa to the oxidative stress. It is well known that the reactive oxygen species which are responsible for this stress can cause structural damages to the membranes and especially to the genetic material of the spermatozoa. The use of extenders and antioxidants that could protect the spermatozoa against oxidative damages can be an alternative to maintain the quality of semen samples under cooling. In order to test this hypothesis semen samples of tigrina (Leopardus tigrinus, SCHREBER, 1775) was submitted to conventional and functional tests at different cooling periods (4°C; 2, 12 and 24 hours), using three extenders (TCM 199, Ham\'s F10 and Tris-egg yolk-citrate) and treatment with reduced glutathione (GSH) in different concentrations (0, 0.5, 1.0 and 1.5mM). Conventional tests used in the present experiment were motility and vigor. Functional tests included the evaluation of plasmatic and acrosomal membrane integrity, of mitochondrial activity and of DNA fragmentation. The susceptibility of the spermatozoa to the induced lipidic peroxidation followed by the measurement of thiobarbituric acid reactive substances concentration (TBARS) was used as an index of oxidative stress. Results obtained for the conventional and functional tests indicated that the tris-egg yolk citrate (TGC) extender was superior to the TCM 199 (TCM) and the Ham\'s F10 (HAM). No effect of GSH was observed. For all extenders, correlations were found between the functional tests and the conventional tests variables. Only for the HAM and TGC extenders, the concentration of TBARS showed negative correlation with mitochondrial activity and acrosomal integrity. For the samples diluted in TGC, no effects of GSH treatment or cooling time was observed on the spermatic cells DNA integrity. Also in sample diluted in TGC, the DNA integrity was correlated with the concentration of TBARS and the mitochondrial activity, but not with conventional tests the others functional tests. Results of the present experiment suggested that the best extender to maintain the semen of tigrina under 4°C for 24 hours is the one containing egg yolk (TGC), and the antioxidant treatment with GSH showed no effect on semen quality.

Foram analisadas, para fins de diagnóstico das micoplasmoses da reprodução, 105 amostras de muco prepucial e 80 amostras de sêmen in natura, provenientes de touros de quatro propriedades rurais e 70 amostras de muco prepucial e 63 amostras de sêmen in natura, provenientes de touros de uma central de inseminação artificial, localizadas no Estado de São Paulo. As amostras foram submetidas ao isolamento bacteriano e PCR, para demonstração de presença de Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium e Ureaplasma diversum. Colheitas foram realizadas no período de 1999 à 2002, antes e após a implantação de dois métodos de antibioticoterapia, utilizando-se para tal, oxitetraciclina di-hidratada ou fumarato de hidrogênio de tiamulin. O Sistema MGSO/GPO-1 de detecção de Mycoplasmatales pela PCR foi testado frente ao isolamento bacteriano. A associação entre a idade e forma de manejo reprodutivo, além da qualidade seminal e a presença dos microrganismos foi analisada através da odds ratio. A eficiência dos métodos de tratamento sobre a qualidade seminal dos touros foi analisada estatisticamente pelos testes de Mann Whitney e Wilcoxon. As freqüências de detecção de Mycoplasma spp pelo isolamento e pela PCR nas amostras de muco prepucial, foram 45,1 e 63,7%, respectivamente. Nas amostras de sêmen, as freqüências foram 22,5% (isolamento) e 24,1 (PCR). O Sistema MGSO/GPO-1 mostrou-se pouco eficiente na detecção dos agentes. Análise estatística revelou que animais com menos de quatro anos têm de 1,39 (M. bovigenitalium) até 7,54 (U. diversum) vezes mais chance de serem portadores dos microrganismos. A odds ratio de 4,01 até 4,68 (muco prepucial) e de 1,71 até 18,29 (sêmen) mostrou a importância da higiene no manejo reprodutivo. Os animais da Central de Inseminação Artificial apresentaram resposta significativa sobre a motilidade espermática no tratamento com oxitetraciclina (p=0,033). As estimativas de risco, pós-tratamento, foram menores para os parâmetros motilidade e defeitos menores, associados à Mycoplasma spp e, motilidade e defeitos maiores, associados à U. diversum . / Prepucial mucuses and fresh semen were collected from bulls under two kinds of reproductive management: a) natural breeding with cows in four farms, b) an Artificial Insemination Center. All of them located in São Paulo State, Brazil. The samples were collected from 1999 to 2002. In the farms it were collected 105 samples of prepucial mucuses and 80 samples of fresh semen and in the Artificial Insemination Center, 70 samples of prepucial mucuses and 63 of fresh semen. The laboratory tests applied for demonstration of Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium and Ureaplasma diversum were classical cultivation and polymerase chain reaction (PCR). The therapeutic assay were performed with oxytetracicline, 20 mg./kg. of body weight, IM, or tiamulin hydrogen fumarate, 15 mg./kg. of body weight, IM. Mycoplasma spp was demonstrated in 45,1% and 63,7% of prepucial mucuses samples, respectively by cultivation and PCR and in 22,5% and 24,1% of fresh semen samples, respectively by cultivation and PCR. Ureaplasma diversum was demonstrated in 66,5% and 72,9% of prepucial mucuses samples, respectively by cultivation and PCR and in 51,7% and 56,6% of fresh semen samples, respectively by cultivation and PCR. The MGSO/GPO-1 PCR System, was able for demonstration of Mycoplasma spp DNA in bovine semen and U. diversum in prepucial mucuses, with results in agreement with cultivation. Animals younger than four years of age presented a higher infection rate than older: odds ratio 1.39 (M. bovigenitalium) and up to 7.54 (U. diversum). Odds ratio from 4.01 to 4.68 (prepucial mucuses) and from 1.71 to 18.29 (semen) showed the importance of the hygienic status of the reproduction management. The animals from Insemination Center, showed better motility after the treatment with oxytetracicline (p=0,033). After therapeutic assay, the odds ratio was small for the motility and morphologic aspects of the semen associated to Mycoplasma spp and U. diversum contamination.

O presente trabalho visou avaliar se, em cães, o estresse provoca efeitos deletérios sobre os parâmetros seminais e a composição do plasma seminal. Além disso, avaliou-se os efeitos da suplementação oral com vitamina E em animais estressados. Utilizaram-se 18 cães machos da raça rotweiller, com idade média de 4 anos. O tratamento foi inteiramente casualizado com esquema fatorial 2x2 (com e sem estresse X com e sem vitamina E). Os animais dos grupos suplementados com vitamina E receberam 500 mg de -tocoferol/animal/dia. O estresse foi induzido, sete dias após o início da suplementação com vitamina E através da aplicação intramuscular de 0,01mg/kg de dexametasona, durante 7 dias consecutivos. O estresse foi caracterizado através do cortisol sérico, consumo alimentar, escore corporal e peso vivo. Foram feitas duas colheitas semanais de sêmen através de manipulação digital e uma coleta semanal se sangue. Os parâmetros utilizados para avaliar os efeitos do tratamento foram: volume, densidade e pH do ejaculado, motilidade, vigor, concentração e morfologia espermáticos, integridade da membrana espermática (teste de expansão hipo-osmótico, coloração fluorescente IP/DCF, coloração tripla, coloração acrossomal simples e viabilidade espermática), proteínas totais, grau de peroxidação lipídica (concentração de TBARS), concentração de catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase no plasma seminal e nível de testosterona plasmática. Observou-se um efeito do estresse sobre o volume do ejaculado, pH do ejaculado, TBARS e porcentagem de células mortas com acrossoma reagido (classe 4 da coloração simples). A vitamina E atuou sobre a porcentagem de defeitos maiores, TBARS, a porcentagem de células com membrana acrossomal íntegra e sobre a viabilidade espermática. O efeito conjunto da vitamina E e do estresse foi observado sobre a motilidade, vigor e concentração espermáticos, a porcentagem de defeitos maiores, porcentagem de células íntegras pelo teste hipo-osmótico e através de sondas fluorescentes IP/DFC. Com base nos resultados obtidos neste experimento concluiu-se que o estresse influencia de maneira negativa a célula espermática e a composição do plasma e a suplementação oral com vitamina E modifica estes efeitos. / The present study aimed to evaluate if the stress in dogs may have deleterious effects on the sperm quality and on the composition of the seminal plasma. IN addition, the effect of supplementation with vitamin E on stressed dogs was also evaluated. Eighteen male adult rotweiller dogs were randomly allocated in a 2X2 factorial treatment design (stress and no stress X vitamin E supplementation and no supplementation). Animals of the supplemented group received 500 mg of -tocopherol/animal/day. The stress was induced 7 days after the beginning of the vitamin supplementation using dexamethasone (0.01 mg/kg intramuscular for 7 consecutive days). Stress was characterized through the measurement of plasmatic cortisol, food intake, body score and weight. Semen collections were performed twice a week through digital manipulation and blood collections were performed weekly. Semen parameters used to evaluate the effect of the treatments were: ejaculate volume, density and pH, sperm motility, vigor, concentration and morphology, sperm membrane integrity (hypo-osmotic swelling test - HOST, fluorescent probe IP/DCF, triple stain, simple acrosome stain and sperm viability), total protein concentration, lipid peroxidation rate (TBARS), enzymatic activity of the antioxidants catalase, superoxide dismutase, glutatione peroxidase in the seminal plasma and plasmatic testosterone concentration. The stress influenced the ejaculate volume and pH, TBARS and percentage of dead cells with reacted acrosome (class 4 of the simple stain). Vitamin E had na effect on the percentage of sperm major defects, TBARS, percentage of cells with intact acrosome and sperm viability. The effect of vitamin E and stress was observed on sperm motility, vigor and concentration, percentage of major sperm defects, percentage of intact membrane cells evaluated through the HOST and through the fluorescent probe IP/DFC. Results obtained indicated that the stress has a deleterious effect on the spermatic cell and that the composition of the seminal plasma and the oral vitamin E supplementation may modify this effects.

Considerando a importância comercial da perdiz (Rhynchotus rufescens), implantou-se algumas biotecnologias reprodutivas. Trinta animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: controle (sem selênio orgânico) e tratamento (com 0,2 a 0,8mg de selênio em 1000kgs de ração ), provenientes da FCAV-UNESP/Jaboticabal (2007-2008). Coletou-se semên por excitação manual que foram aliquotados em pools com 150&micro;L. Após a avaliação do volume, motilidade, vigor, números de espermatozóides, concentração e morfologia espermática, diluiu-se 20&micro;l de sêmen em 300&micro;l de solução fisiológica para testar a Integridade das membranas acrossomal e plasmática e avaliação da atividade mitocondrial. Uma outra alíquota de 20&micro;l foi utilizada para testar a resistência dos espermatozóides ao estresse oxidativo, induzido (vitamina C + sulfato ferroso), por meio da dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A amostra restante foi congelada diretamente em nitrogênio líquido para a realização do teste da integridade do DNA espermático e para medir a atividade das enzimas antioxidantes Catalase e Glutationa Peroxidase. Contou-se 200 células, para avaliação da integridade acrossomal e de membrana, atividade mitocondrial e ensaio cometa e classificou-as: 1) Acrossomo Íntegro: cor lilás e Não-Íntegro: róseo; 2)Células Vivas (não coradas) e Mortas (coradas), 3) Classes de I a IV, sendo Classe I (todas as mitocôndrias íntegras) com a peça intermediária totalmente corada e Classe IV (todas as mitocôndrias comprometidas) com a peça intermediária totalmente descorada e 4) Cometa I a IV, sendo Cometa I (DNA íntegro): células com halo ao seu redor e núcleo corado, porém sem cauda de cometa evidente e Cometa IV (DNA altamente fragmentado): célula com núcleo completamente descorado e apenas a cauda do cometa, respevtivamente. Os dados foram analisados pelo SAS, System for Windows. Nenhuma diferença foi encontrada para volume, motilidade, vigor, número de espermatozóides, concentração, integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática, Classes I e III da atividade mitocondrial, Cometa I,II e IV, TBARS e atividade da Glutationa. Foram encontradas diferenças nas Classes II (Se=33,39±2,93 e Controle=44,39±2,59, p=0.0125 e IV (Se=3,44±0,09 e Controle=1,50±0,38, p=0.0401) e Cometa III (Se=16,00 ± 0,82 e Controle=34,75 ± 1,44, p=<.0001), respectivamente. A diferença encontrada no DAB II pode ser devido aos danos causados na arquitetura da peça intermediária pela deficiência de selênio, o que compromete a mobilidade e a capacidade de fecundação do espermatozóide. Para o DAB IV, não era esperado esse resultado, que pode ser devido aos pequenos valores encontrados para essa variável (Se=3,44% e Controle=1,50%) em relação ao total das classes e que poderia não ser significante se levássemos em consideração as classes juntas. Em relação a porcentagem mais baixa de espermatozóides do grupo suplementado com selênio para a classe III do Ensaio Cometa, pode sugerir um efeito de proteção desta substância, possivelmente devido a um índice mais elevado da Glutationa Peroxidase. / Considering the commercial value of the partridges (Rhynchotus rufescens), the employment of reproductive biotechnologies has been attempted. Thirty animals were randomly assigned into two groups: control group (no selenium) and treatment group (supplemented with 0,2 a 0,8mg selenium/ 1000kgs ration). Animals were allocated at the FCAV - UNESP/Jaboticabal (2007-2008). Semen collections were performed by digital manipulation and divided in pools of at least 150&micro;L. After the immediate evaluation of volume, motility, vigour, concentration and morphology, an aliquot of 20&micro;L was diluted in 300&micro;L of physiologic solution in order to test acrosome and membrane integrities and mitochondrial activity. Another aliquot of 20 &micro;L was used to test the resistance of sperm against the induced oxidative stress (Vitamin C + ferrous sulphate), followed by the measurement of TBARS. The remaining semen sample was frozen directly in liquid nitrogen in orther to perform the comet assay and to measure the activity of the antioxidant enzymes catalase and glutathione peroxidase. Cells were evaluated respectively for acrosome and membrane integrities, mitochondrial activity and comet assay as follows: 1) Intact acrosome: lilac acrosome; Non-intact acrosome: pink acrosome; 2) Live cells: non stained; Dead: stained; 3) Classes I to IV, being Class I (full mitochondrial potential): midpiece totally stained and class IV (no mitochondrial potential): midpiece not stained; 4) Classes I to IV, being Class I (intact DNA): nucleus with intense fluorescence with no comet tail; Class IV (highly fragmented DNA): no nucleus, only a comet tail. Data was statistically anlysed using the SAS System for Windows. No differences were found on volume, motility, vigour, number of spermatozoa, concentration, acrosomal and membrane integrity, Classes I and III of mitochondrial activity, Comets I, II and IV, TBARS and Glutathione activity. Differences were found on as DAB Classes II (Se=33.39±2.93 and control=44.39±2.59, p=0.0125) and IV (Se=3.44±0.09 and control=1.50±0.38, p=0.0401) and comet class III (Se=16.00 ± 0.82 and control=34.75 ± 1.44, p=<.0001), respectively. The difference found on DAB II may be due to the damages caused by the selenium deficiency to the architecture of the midpiece, which compromises sperm mobility and fertilization capacity. On the other hand, the unexpected difference found on DAB IV may be due to the small values found for this variable in all animals (Se=3.44% and control=1.50%), which would be not significant taking into account all classes. The decreased percentage of sperm showing DNA fragmentation Class II found on the selenium supplemented group may suggest a protective effect of this substance on sperm DNA, possibly due to a higher GPx content.

Durante o processo de criopreservação o espermatozóide passa por mudanças estruturais nas membranas que resulta em diminuição da fertilidade. Este estudo foi realizado para comparar os efeitos de duas técnicas de congelação (técnica convencional e técnica automatizada), curvas de congelação e o uso de três crioprotetores (glicerol, etilenoglicol e dimetilformamida) sobre a motilidade, vigor e integridade das membranas espermáticas (plasmática, acrossomal e mitocondrial) do sêmen bovino. Foram utilizados cinco touros da raça Simental, coletados semanalmente por seis semanas. O semên foi avaliado e diluído em tris-gema (fração única), preparado previamente com os seguintes crioprotetores:- dimetilformamida (3%), etilenoglicol (7%) ou glicerol (7%). A metade das doses foi congelada pela técnica convencional (TC), da seguinte maneira:- seis quilogramas de gelo moído foi colocado em uma de uma caixa de isopor de 15 litros, quando então as palhetas a serem congeladas foram colocadas sobre um suporte, na posição horizontal, por 90 minutos (curva de resfriamento, -0,55°C/min). Imediatamente após, o suporte com as palhetas foi transferido para outra caixa de isopor onde as palhetas permaneceram em vapor de nitrogênio (3cm), por 15 minutos (curva de congelação, -19,1°C/min). A outra metade das palhetas foi criopreservada pela técnica automatizada (TA), utilizando-se um aparelho programável portátil de controle eletrônico (TK2000), com taxa de resfriamento de -0,23°C/minuto e taxa de congelação de -15,5°C/minuto. Após a congelação as palhetas foram mantidas em botijões criogênicos e descongeladas para avaliação da motilidade (%) e vigor (1-5) por microscopia óptica. A integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial foi avaliada utilizando-se o iodeto de propídio (PI); aglutinina de Pisum sativum conjugada a fluoresceína (FITC-PSA) e MitoTracker Green FM (MITO), respectivamente, por microscopia de epifluorescência. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Programa StatView® (SAS Institute, Cary, NC, USA). Não houve diferenças significativas entre as técnicas e nem interação entre crioprotetor e técnica de congelação (P>0,05) para os parâmetros avaliados. Houve diferença entre os crioprotetores (P<0,05), sendo que o glicerol preservou melhor a motilidade, o vigor e a integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial dos espermatozóides quando comparado ao etilenoglicol e a dimetilformamida. O etilenoglicol foi superior à dimetilformamida para as avaliações da motilidade e da integridade das membranas plasmática e mitocondrial (P<0,05). Uma vez que, 85% dos espermatozóides apresentaram algum grau de lesão, isto nos conduz a inferir que pesquisas são necessárias para que se obtenha melhoria nos resultados após a criopreservação do sêmen bovino / During cryopreservation, spermatozoa undergo many changes leading to membrane damage which result in decreased fertility. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing curves and the use of three cryoprotectants (glycerol, ethylene glycol and dimethylformamide) on the motility, vigor and integrity of spermatic membranes (plasmatic, acrosomal, and mitochondrial) of bovine semen. Five Simmental bulls ranging from 24 to 36 months age were submitted one a week to semen collection for six weeks. Semen samples were evaluated and diluted in TRIS-yolk medium (one step). Each semen collection dilutors were prepared previously with each of following cryoprotectants:- glycerol (7%), ethylene glycol (7%) or dimethylformamide (3%). Half of the amount of straws (0.5 mL) was frozen by a conventional manual technique (TC), as in following protocol:- six kilograms of ground ice were placed in the bottom of a thermal box (15 L), straws were cooled on a grid placed horizontally for 90 minutes (cooling rate, -0.55°C/min), immediately transferred to another thermal box and frozen in static liquid nitrogen vapor (15 min) on the same grid placed 3 cm above the liquid nitrogen (freezing rate, -19.1°C/min). The other half of straws was frozen by automated technique (TA). TA was performed using an electronic controlled programmed machine (TK2000) which cooling rate was -0.23°C/min and freezing rate was -15.5°C/min. Straws were plunged into liquid nitrogen and stored at -196°C. The motility (%) and vigor (1-5) were assessed using optic microscopy. The integrity of plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes were evaluated using propidium iodide (PI), fluorescein conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and MitoTracker Green FM (MITO), respectively, by fluorescence microscopy. Effects of treatment were analyzed by StatView® Program, (SAS Institute, Cary, NC, USA). There were no significant differences (P>0.05) between the two freezing techniques and no interaction among cryoprotectant and freezing techniques for all assessed parameters. Glycerol showed better results (P<0.05) than other two cryoprotectants for motility, vigor, and integrity of plasmatic, acrosomal and mitocondrial membranes. Ethylene glycol was superior (P<0.05) than dimethylformamide in preserve motility, and integrity of plasmatic and mitochondrial membranes. Because 85% of spermatozoa showed some kind of post thawing injury, further studies are required to improve cryopreservation techniques used routinely for bovine semen

A espécie Callithrix jacchus pode ser utilizada como modelo experimental para outras espécies de primatas neotropicais, principalmente Callithriquídeos. Colheu-se sêmen desta espécie com os objetivos de otimizar a colheita de sêmen por vibro estimulação peniana, validar técnicas de avaliação espermática que possam ser utilizadas a campo, comparar as características seminais de indivíduos de duas colônias (Brasil e Alemanha), testar diferentes protocolos de congelação espermática e avaliar a atividade citoquímica mitocondrial (DAB) e a fragmentação de DNA de espermatozóides congelados. As técnicas de coloração para avaliação espermática utilizadas foram: eosina-nigrosina, coloração dupla trypan-blue giemsa, coloração simples para acrossoma, FITC-PSA, SpermOscan®, Spermac®, coloração com 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) e ensaio Cometa alcalino. A congelação foi realizada com 100 µL de sêmen com meio TEST-Gema de ovo clarificado com glicerol 4% em palhetas 0,25 mL, e os protocolos de congelação testados foram: 1) fase de equilíbrio com curva de resfriamento (25°C-4°C) em 2 horas, 10 minutos no vapor de nitrogênio e finalmente imersão em nitrogênio líquido; 2) como Protocolo 1, mas sem fase de equilíbrio/resfriamento; e 3) diretamente no nitrogênio líquido. As palhetas foram descongeladas em água a 37°C por 5-10 segundos. A técnica de colheita resultou em 83,33% dos procedimentos com ejaculação. A coloração simples para acrossomo foi eficiente e pôde ser validada para utilização a campo. Não houve diferença significante (p<0,05) nas características seminais avaliadas entre as colônias do Brasil e da Alemanha. As análises pós-descongelação demonstraram queda nas variáveis motilidade e integridade da membrana plasmática com discreta superioridade no Protocolo 1, não houve diferença significante (p<0,05) entre os protocolos para a atividade citoquímica mitocondrial e o Protocolo 2 apresentou a menor taxa de fragmentação de DNA. / The Callithrix jacchus can be used as a model species for other Neotropical primates species, mainly Callithriquids, for reproductive studies. Semen samples were collected with the following objectives: to improve the penile vibrostimulation technique, validate sperm evaluation techniques for field work, analyse the semen characteristics from animals at 2 colonies (Brazil and Germany), use 3 different freezing protocols in common marmosets sperms, evaluate a cytochemical technique for mitochondrial activity demonstration and evaluate DNA damage in frozen-thawed sperms. The staining techniques used in this work were: Eosin-nigrosin, Trypan-blue Giemsa, simple staining for acrosome, FITC-PSA, SpermOscan®, Spermac®, demonstration of cytochrome c oxidase activity in situ by the oxidation of 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) and the Comet assay. Freezing was done in 100 µL semen with TESt-Yolk clarified medium plus 4% glycerol using 0.25 mL straws. The freezing protocols tested were: 1) straws at equilibrium phase with a 25°C to 4°C curve in 2 hours, 10 minutes at nitrogen vapour and finally into liquid nitrogen; 2) same as Protocol 1 without the equilibrium phase; and 3) straws directly into liquid nitrogen. All attempts resulted in 83,33% ejaculates. The simple staining technique for acrosome was validated and resulted in an obvious differentiation of the intact acrosome. Semen characteristics evaluation showed no difference between the 2 colonies. Post-thaw evaluation showed all protocols had negative effects on motility and plasmatic membrane integrity with a slightly superiority on Protocol 1. There was no difference between protocols in the mitochondrial activity demonstration and Protocol 2 presented the lowest DNA damage.

A perdiz (Rhynchotus rufescens) é um tinamídeo com amplos músculos peitorais muito apreciados por mercados especializados. No entanto, a produção em larga escala é inexpressiva, podendo ser melhorada através da inseminação artificial (IA). Sendo assim, o presente experimento teve como objetivos padronizar a coleta de sêmen, o teste hipo-osmótico, testar diferentes diluidores, tempos de refrigeração e doses inseminantes. Amostras seminais de 100 animais, pertencentes a FCAV/UNESP/Jaboticabal, foram empregadas na descrição do volume, pH, motilidade, vigor, concentração e alterações morfológicas. As coletas de sêmen foram realizadas em 2 ciclos. No primeiro ciclo foram realizadas a padronização da técnica de coleta de sêmen e a determinação do melhor meio hipo-osmótico, por meio de oito soluções. No segundo ciclo de coletas aplicou-se as técnicas já padronizadas; descreveu-se a motilidade e vigor espermático de amostras seminais diluídas em meios para sêmen de peru, TCM 199, TQC e solução fisiológica, refrigeradas por até 48h; além de terem sido realizadas IA em 128 fêmeas utilizando sêmen de 32 machos, os animais foram agrupados em quintetos (1 macho:4 fêmeas) no início do ciclo reprodutivo de 2004-2005. Metade dos quintetos foi mantida no sistema de monta natural e empregada como grupo controle (GC). A outra metade foi mantida em quintetos por apenas 2 meses. Em seguida, retirou-se os machos dos boxes das fêmeas, para formar os grupos inseminados (GI), cada um com uma dose inseminante de 10, 20, 30 ou 40x106sptz. No primeiro ciclo padronizou-se o método de coleta, no segundo empregou-se a técnica padronizada e os valores encontrados para a média e erro padrão da média de 231 amostras para volume, aspecto, motilidade, vigor, pH e concentração espermática foram: 23,59&plusmn;1,30&micro; l; 1,81&plusmn;0,03; 73,06&plusmn;1,41%; 3,06&plusmn;0,08; 8&plusmn;0; 5,25&plusmn;0,74x109sptz/ml; respectivamente. A motilidade correlacionou positivamente com a porcentagem média de células normais (r=0,4; p&lt;0,0001) e negativamente com as porcentagens de defeitos totais e de cabeça solta (r=-0,4; p&lt;0,0001). A porcentagem de caudas enroladas nas soluções hipo-osmóticas testadas variaram de 73,25&plusmn;3,3 a 84,52&plusmn;2,21%. A solução hipo-osmótica de 100mOsm demonstrou ser adequada e foi empregada em 81 amostras, resultando em 82,0&plusmn;1,38% de espermatozóides com membrana íntegra, gerando uma correlação positiva (r=0,4; p&lt;0,0002) entre esta variável e a motilidade. As amostras seminais diluídas em solução fisiológica não apresentaram motilidade e vigor após refrigeração, diferente das demais. As amostras refrigeradas por 24 e 48h em TCM 199 apresentaram melhores resultados de motilidade e vigor do que as que permaneceram no diluidor para sêmen de peru e TQC. Não foi possível observar diferenças estatísticas significantes entre os resultados da comparação dos índices reprodutivos entre GI e GC, porém os valores médios de ovos férteis obtidos no sistema de monta natural (2,22&plusmn;0,29) foram menores do que os grupos inseminados com 30 (4,44&plusmn;1,81) e 40x106sptz/dose inseminante (3,65&plusmn;1,66). Os resultados do presente experimento permitiram concluir que é possível a coleta e avaliação de sêmen de perdizes para o posterior emprego de biotecnologias tais como a inseminação artificial, sendo que esta pode ser utilizada a curtíssimo prazo, com a finalidade de aumentar a produção e melhorar o manejo genético deste animal. / The partridge (Rhynchotus rufescens) belongs to the tinamidae family and possesses breast muscles which are quite appreciated in high cuisine However, there is an insignificant large scale production, which could be improved using the artificial insemination (AI). The present experiment aimed to standardize semen collection and the hipoosmotic swelling test and to test dilutors, refrigeration times and insemination doses in partridges. Semen samples of 100 animals, belonging to the FCAV/UNESP/Jaboticabal, were used to describe the volume, pH, motility, vigor, concentration and morphologic alterations. Semen collections were performed in 2 stages. The first stage consisted of standardizing the technique of semen collection and of verifying the most adequate hipoosmotic medium (8 different osmolarities). In the second stage, the standardized techniques were applied; motility and vigor were evaluated in samples diluted in turkey semen extender, TCM 199, TQC and physiologic saline solution, refrigerated until 48 hours. Still in the second stage, 128 females and 32 males were allocated in groups of 5 (1 male:4 females) in the beginning of 2004-2005 reproductive season. Half of the quintets were bred using natural service (control group - CG); the other half was kept as quintets for 2 months, after which males were removed and allocated in quartets with no physical contact with the females. The females of this group were then inseminated (inseminated group ? IG) with 10, 20, 30 e 40x106sptz/ insemination dose. In the first experimental stage, 231 samples were evaluated for volume, aspect, motility, vigor, pH e sperm concentration with values averaging 23.59&plusmn;1.30&micro;l, 1.81&plusmn;0.03, 73.06&plusmn;1.41%, 3.06&plusmn;0.08; 8&plusmn;0; 5.25&plusmn;0.74x109sptz/ml, respectively. Motility was positively correlated with percentage of normal cells (r=0.4; p&lt;0.0001) and negatively correlated with the percentages of total sperm defects (r=-0.4; p&lt;0.0001) and detached head (r=-0.4; p&lt;0.0001). Percentage of swollen tails in the hipoosmotic solutions ranged from 73.25&plusmn;3.3 a 84.52&plusmn;2.21%. The solution of 100mOsm was the most adequate, being used in 81 samples, which averaged 82.0&plusmn;1.38% of sperm cells with intact membrane. A positive correlation (r=0.4; p&lt;0.0002) was found between the percentage of cells with intact membrane and motility. Neither motility or vigor were observed in samples diluted in physiologic saline solution, different for the other tested solutions. After both 24 and 48 hours of refrigeration, TCM 199 showed the highest results of motility and vigor when compared to the turkey extender and the TQC. No differences on the general reproductive indexes were found between animals from IG or CG. However, mean values of fertile eggs from CG (2.22&plusmn;0.29) were lower (p&lt;0.05) than groups inseminated with 30 (4.44&plusmn;1.81) and 40x106sptz/insemination dose (3.65&plusmn;1.66). Results allowed to infer that the techniques of semen collection and evaluation in partridges standardized in the present experiment may be used in a short term period for reproductive technologies such as artificial insemination, which could increase the production and improve the genetic management of these animals.

A perdiz (Rhynchotus rufescens) é um tinamídeo com amplos músculos peitorais muito apreciados por mercados especializados. No entanto, a produção em larga escala é inexpressiva, podendo ser melhorada através da inseminação artificial (IA). Sendo assim, o presente experimento teve como objetivos padronizar a coleta de sêmen, o teste hipo-osmótico, testar diferentes diluidores, tempos de refrigeração e doses inseminantes. Amostras seminais de 100 animais, pertencentes a FCAV/UNESP/Jaboticabal, foram empregadas na descrição do volume, pH, motilidade, vigor, concentração e alterações morfológicas. As coletas de sêmen foram realizadas em 2 ciclos. No primeiro ciclo foram realizadas a padronização da técnica de coleta de sêmen e a determinação do melhor meio hipo-osmótico, por meio de oito soluções. No segundo ciclo de coletas aplicou-se as técnicas já padronizadas; descreveu-se a motilidade e vigor espermático de amostras seminais diluídas em meios para sêmen de peru, TCM 199, TQC e solução fisiológica, refrigeradas por até 48h; além de terem sido realizadas IA em 128 fêmeas utilizando sêmen de 32 machos, os animais foram agrupados em quintetos (1 macho:4 fêmeas) no início do ciclo reprodutivo de 2004-2005. Metade dos quintetos foi mantida no sistema de monta natural e empregada como grupo controle (GC). A outra metade foi mantida em quintetos por apenas 2 meses. Em seguida, retirou-se os machos dos boxes das fêmeas, para formar os grupos inseminados (GI), cada um com uma dose inseminante de 10, 20, 30 ou 40x106sptz. No primeiro ciclo padronizou-se o método de coleta, no segundo empregou-se a técnica padronizada e os valores encontrados para a média e erro padrão da média de 231 amostras para volume, aspecto, motilidade, vigor, pH e concentração espermática foram: 23,59&plusmn;1,30&micro; l; 1,81&plusmn;0,03; 73,06&plusmn;1,41%; 3,06&plusmn;0,08; 8&plusmn;0; 5,25&plusmn;0,74x109sptz/ml; respectivamente. A motilidade correlacionou positivamente com a porcentagem média de células normais (r=0,4; p&lt;0,0001) e negativamente com as porcentagens de defeitos totais e de cabeça solta (r=-0,4; p&lt;0,0001). A porcentagem de caudas enroladas nas soluções hipo-osmóticas testadas variaram de 73,25&plusmn;3,3 a 84,52&plusmn;2,21%. A solução hipo-osmótica de 100mOsm demonstrou ser adequada e foi empregada em 81 amostras, resultando em 82,0&plusmn;1,38% de espermatozóides com membrana íntegra, gerando uma correlação positiva (r=0,4; p&lt;0,0002) entre esta variável e a motilidade. As amostras seminais diluídas em solução fisiológica não apresentaram motilidade e vigor após refrigeração, diferente das demais. As amostras refrigeradas por 24 e 48h em TCM 199 apresentaram melhores resultados de motilidade e vigor do que as que permaneceram no diluidor para sêmen de peru e TQC. Não foi possível observar diferenças estatísticas significantes entre os resultados da comparação dos índices reprodutivos entre GI e GC, porém os valores médios de ovos férteis obtidos no sistema de monta natural (2,22&plusmn;0,29) foram menores do que os grupos inseminados com 30 (4,44&plusmn;1,81) e 40x106sptz/dose inseminante (3,65&plusmn;1,66). Os resultados do presente experimento permitiram concluir que é possível a coleta e avaliação de sêmen de perdizes para o posterior emprego de biotecnologias tais como a inseminação artificial, sendo que esta pode ser utilizada a curtíssimo prazo, com a finalidade de aumentar a produção e melhorar o manejo genético deste animal. / The partridge (Rhynchotus rufescens) belongs to the tinamidae family and possesses breast muscles which are quite appreciated in high cuisine However, there is an insignificant large scale production, which could be improved using the artificial insemination (AI). The present experiment aimed to standardize semen collection and the hipoosmotic swelling test and to test dilutors, refrigeration times and insemination doses in partridges. Semen samples of 100 animals, belonging to the FCAV/UNESP/Jaboticabal, were used to describe the volume, pH, motility, vigor, concentration and morphologic alterations. Semen collections were performed in 2 stages. The first stage consisted of standardizing the technique of semen collection and of verifying the most adequate hipoosmotic medium (8 different osmolarities). In the second stage, the standardized techniques were applied; motility and vigor were evaluated in samples diluted in turkey semen extender, TCM 199, TQC and physiologic saline solution, refrigerated until 48 hours. Still in the second stage, 128 females and 32 males were allocated in groups of 5 (1 male:4 females) in the beginning of 2004-2005 reproductive season. Half of the quintets were bred using natural service (control group - CG); the other half was kept as quintets for 2 months, after which males were removed and allocated in quartets with no physical contact with the females. The females of this group were then inseminated (inseminated group ? IG) with 10, 20, 30 e 40x106sptz/ insemination dose. In the first experimental stage, 231 samples were evaluated for volume, aspect, motility, vigor, pH e sperm concentration with values averaging 23.59&plusmn;1.30&micro;l, 1.81&plusmn;0.03, 73.06&plusmn;1.41%, 3.06&plusmn;0.08; 8&plusmn;0; 5.25&plusmn;0.74x109sptz/ml, respectively. Motility was positively correlated with percentage of normal cells (r=0.4; p&lt;0.0001) and negatively correlated with the percentages of total sperm defects (r=-0.4; p&lt;0.0001) and detached head (r=-0.4; p&lt;0.0001). Percentage of swollen tails in the hipoosmotic solutions ranged from 73.25&plusmn;3.3 a 84.52&plusmn;2.21%. The solution of 100mOsm was the most adequate, being used in 81 samples, which averaged 82.0&plusmn;1.38% of sperm cells with intact membrane. A positive correlation (r=0.4; p&lt;0.0002) was found between the percentage of cells with intact membrane and motility. Neither motility or vigor were observed in samples diluted in physiologic saline solution, different for the other tested solutions. After both 24 and 48 hours of refrigeration, TCM 199 showed the highest results of motility and vigor when compared to the turkey extender and the TQC. No differences on the general reproductive indexes were found between animals from IG or CG. However, mean values of fertile eggs from CG (2.22&plusmn;0.29) were lower (p&lt;0.05) than groups inseminated with 30 (4.44&plusmn;1.81) and 40x106sptz/insemination dose (3.65&plusmn;1.66). Results allowed to infer that the techniques of semen collection and evaluation in partridges standardized in the present experiment may be used in a short term period for reproductive technologies such as artificial insemination, which could increase the production and improve the genetic management of these animals.

Na espécie equina, ao contrário do obtido com ruminantes, as técnicas de criopreservação de sêmen progridem lentamente, mas apesar das barreiras técnicas o emprego da inseminação artificial com sêmen congelado vem crescendo. Este experimento foi dividido em três etapas: na primeira comparou-se a utilização de diferentes diluentes e técnicas de congelação; determinação da eficiência do criotubo para envase do sêmen para a criopreservação; e na terceira determinou-se as taxas de prenhez das éguas artificialmente inseminadas com sêmen congelado envasado em criotubo. Seis garanhões foram submetidos à coleta do sêmen e doze éguas foram inseminadas artificialmente no primeiro estro da estação reprodutiva. As amostras foram diluídas em INRA82 ou Nagase, contendo 5% de glicerol, com concentração de 200 x 106 espermatozóides/ml. Parte do sêmen diluído foi envasado em palhetas (0,5ml), das quais uma parte foi imediatamente congelada. As palhetas restantes foram resfriadas previamente da temperatura ambiente (24ºC) até 5ºC antes do congelamento. As amostras foram descongeladas em banho-maria a 37ºC por 30seg. O mesmo protocolo de congelamento com resfriamento prévio foi realizado com as amostras envasadas em criotubos, sendo estas amostras descongeladas a 50ºC por 100seg em banho-maria. A eficiência in vivo do sêmen criopreservado, foi determinada através da inseminação artificial. O diagnóstico de prenhez foi realizado 20 dias após a inseminação artificial através de exame ultrassonográfico. Após a análise dos dados verificou-se que não houve diferença significativa entre os diluentes testados na motilidade progressiva e vigor dos espermatozóides. As médias da motilidade espermática após o aquecimento das amostras foram de: 43,32% e 26,66%, para o sêmen diluído com INRA82 submetido ao resfriamento ou não antes do congelamento, respectivamente, e para o sêmen diluído com Nagase revelou motilidade espermática de 41,08% e 24,44%, respectivamente. De acordo com esses resultados, os grupos experimentais submetidos ao resfriamento prévio apresentaram taxas de motilidade espermática superiores aos grupos que foram congelados diretamente. Não se verificou diferenças quanto ao vigor, motilidade e defeitos espermáticos entre os diluentes testados e os tipos de envase. As éguas inseminadas com criotubo apresentaram taxa de prenhez de 50% (3/6), já com as éguas do grupo controle (palheta) observou-se 16,66% (1/6), provando a viabilidade do congelamento do sêmen envasado em criotubo. / In the horse industry, unlike obtained with catle, the development of sperm cryopreservation techniques are very slow but despite the technical barriers the artificial insemination with frozen semen is growing. This experiment was divided into three steps. The first one compared the use of different diluents and freezing techniques. The other two stages were the use of cryogenic tubes for filling the semen and the determination of mare pregnancy rates that were artificially inseminated with frozen semen packaged in cryogenic tubes. Six stallions were submitted to semen collection and twelve mares were artificially inseminated at first estrus of the breeding season. The samples were diluted in INRA82 or Nagase, containing 5% glycerol, with a concentration of 200 x 106 sperm / ml. A fraction of the diluted semen was stored in straws (0.5 ml), some of those straws were immediately frozen. The remaining straws were cooled from room temperature (24ºC) to 5º C before freezing. The samples were thawed in a water bath at 37° C during 30sec. The same protocol with cooling prior to freezing was performed with samples filled into cryogenic tubes, and these samples were thawed in a water bath at 50° C during 100seg. The in vivo efficiency of cryopreserved semen was determined through artificial insemination. The diagnosis of pregnancy was performed after 20 days by ultrasound examination. After analyzing the data it was found that there was no significant difference in sperm motility and vigor among the tested diluents. Motility was INRA82: 43.32% / 26.66% and Nagase: 41.08% / 24.44%, when the semen was previously cooled or frozen directly, respectively. According to these results, the experimental groups subjected to cooling prior freezing showed better motility rates than the groups that were frozen directly. There were no differences regarding the vigor, motility and sperm defects among the diluents and the semen containers. The mares inseminated with cryotubes showed 50% (3/6) pregnancy rate, and 16.66% (1/6) pregnancy rate was observed in the group of mares inseminated with straws.