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Caracterização do perfil isotípico das imunoglobulinas G de indivíduos chagásicos frente aos antígenos recombinantes CRA e FRA de Trypanosoma cruzi / Characterization of the isotypic profile of immunoglobulin G of Chagas patients in face to the recombinant antigens CRA and FRA of Trypanosoma cruziVerçosa, Alinne Fernanda Amaral January 2006 (has links)
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Previous issue date: 2006 / (...) Sabe-se que a resposta de isotipos específicos tem sido associada às manifestações clínicas da doença de Chagas. Assim, nos propomos a pesquisar as subclasses de IgG no soro de indivíduos chagásicos frente a dois antígenos específicos do Trypanosoma cruzi, visando a obtenção de um perfil isotípico que seja capaz de discriminar as formas clínicas cardíaca (CARD), mista (MIS) e indeterminada (IND). Para isso, coletamos sangue para obtenção de soro de 60 pacientes chagásicos (CARD= 33, MIS= 7 e IND= 20), (...). Todos os pacientes foram avaliados clinicamente para caracterização das formas clínicas e realizaram exames confirmatórios para infecção pelo T. cruzi. Além disso, também coletamos sangue de 40 indivíduos sadios (indivíduos não-chagásicos= 20 e controles negativos para o cut-off= 20) que apresentaram sorologia negativa para infecção pelo T. cruzi. (...) Os antígenos recombinantes (Ags-Recs) Cytoplasmic Repetitive Antigen (CRA) e Flagellar Repetitive Antigen (FRA) foram analisados através de SDS-PAGE, seguido por colorações pela prata e pelo ácido periódico de Schiff, ficando comprovada a integridade dos Ags-Recs e ausência de contaminações bacterianas. As concentrações ideais dos Ags-Recs e dos anti-isotipos foram estabelecidas após titulação dos mesmos. Para detecção dos isotipos utilizamos a metodologia do ELISA indireto, onde as placas de ELISA foram sensibilizadas com os Ags-Recs CRA ou FRA. As amostras de soro foram depositadas em duplicata nos poços. A ligação dos anticorpos específicos foi detectada pela incubação dos anti-isotipos (anti-IgG1, anti-IgG2, anti-IgG3 e anti-IgG4) conjugados à biotina, seguida da incubação de estreptavidina conjugada à peroxidase. A quantificação da reação foi determinada através do leitor de ELISA a 490 nm. Os resultados foram analisados através de um índice de reatividade, onde as densidades ópticas das amostras foram divididas pelo cut-off (média dos controles negativos adicionada de dois desvios-padrão) de suas respectivas placas. Verificamos que a resposta imune humoral gerada pelos pacientes frente aos Ags-Recs foi bastante variada, com produção de quase todas as subclasses de IgG. Entretanto, apenas o isotipo IgG2 específico contra o Ag-Rec FRA foi capaz de diferenciar pacientes chagásicos portadores da forma CARD daqueles portadores da forma IND, podendo, após um estudo prospectivo, servir como marcador de evolução clínica para a forma cardíaca ....
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Estudo de determinantes antigênicos para respostas imunes de células humanas em KMP-11 (Kinetoplastid membrane protein – 11) de Leishmania AmazonensisSánchez Arcila, Juan Camilo January 2010 (has links)
Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-29T13:38:11Z
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Previous issue date: 2010 / CNPq e PEC-PG / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As leishmanioses formam um grupo de doenças antropozoonóticas, endêmicas em 88 países e
presentes em quase todos os estados brasileiros. O desenvolvimento de uma vacina contra das
leishmanioses é altamente desejável já que a terapia e as características biológicas e
ecoepidemiólogicas dos parasitos e seus vetores associados não facilitam o controle da
doença. Kinetoplastid Membrane Protein-11 (KMP-11) é uma molécula candidata a vacina
contra as leishmanioses. Utilizando ferramentas in vitro e in silico, foi avaliada a
antigenicidade de 13 peptídeos sintéticos abrangendo a sequência inteira de KMP-11. Para os
estudos in vitro foram usadas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de
pacientes com leishmaniose cutânea (LC) do estado do Rio de Janeiro. Estas células foram
empregadas para testar a antigenicidade dos 13 peptídeos individualmente e da proteína
integral KMP-11 recombinante, através de ensaios de ELISA e ELISPOT. Na dosagem de
citocinas por ELISA observamos que a proteína KMP-11 recombinante estimulou respostas
de citocinas quase sempre superiores às induzidas pelos peptídeos isolados. No que se refere a
IFN-, dois dos 13 peptídeos (P9 e P10) estimularam níveis desta citocina significativamente
(p<0,05) mais baixos do que os observados com a proteína inteira. Dez peptídeos (P4, P5, P6,
P7, P8, P9, P10, P11, P12 e P13) apresentaram níveis de IL-10 e TNF-α significativamente
inferiores aos observados com a proteína inteira. KMP-11 mostrou-se um potente indutor de IL-10 em PBMC de pacientes com LC, confirmando resultados anteriormente publicados,
mas também foi capaz de induzir a produção de IFN-γ e altos níveis de TNF-α, em níveis
superiores aos dos peptídeos estudados. Na avaliação da razão IFN-γ/IL-10 observou-se um
acentuado contraste entre a maioria dos peptídeos e a proteína KMP-11. As respostas a 11 dos
13 peptídeos mostraram um claro viés de resposta de tipo 1 (IFN-γ>IL-10), a exceção dos
peptídeos P1 e P10 (IFN-γ<IL-10). Na resposta à proteína recombinante KMP-11 houve um
forte predomínio da produção de IL-10 sobre a de IFN-γ. Observou-se uma grande variação
na produção de citocinas estimuladas pelos peptídeos entre os pacientes envolvidos nas
análises. Foi realizado um estudo in silico para predizer quais as sequências de KMP-11 que
teriam maior potencial antigênico através do algoritmo SYFPEITHI, que revelou que os
peptídeos estudados são promíscuos para a maioria dos alelos de HLA de classe I e II
analisados. Para HLA de classe II, P4 mostrou scores significativamente maiores em relação a
todos os outros peptídeos (p<0,05), exceto P10 e P12. Para HLA de classe I os valores de
score para o peptídeo P1 foram significativamente mais altos que os valores dos peptídeos P4,
P10 e P11 (p<0,05). Por outro lado, os valores de score para o peptídeo P11 foram
significativamente mais baixos que os dos peptídeos P1, P2, P5, P6, P12 e P13 (p<0,05). Os
peptídeos P3, P4 e P11 apresentaram valores negativos de score, indicando que eles contêm,
dentro das respectivas sequências, aminoácidos que interferem ou que desfavorecem a
interação e ligação com os diferentes alelos de HLA I. Adicionalmente, foram utilizadas as
ferramentas PAPROC, MAPP e NetChop que possibilitaram predizer que sequências contidas
em P1, P5 e P6 seriam produzidas naturalmente pela maquinaria proteolítica. O algoritmo
PHYRE predisse que KMP-11 apresentava uma conformação de “grampo” com hélices-α
ligadas por uma alça. Adicionalmente este programa predisse a estrutura tridimensional da
proteína. O algoritmo PROTSCALE mostrou que KMP-11 possui três regiões de alta
polaridade entre os aminoácidos 14-29, 34-36 e 44-71. o que estaria relacionado com a
estrutura tridimensional já mencionada. Finalmente, a análise de nível de conservação de
KMP-11 confirmou que esta molécula é bem conservada nos cinetoplastídeos, porém
possibilitou discriminar as sequências dos genes codificadores da proteína no gênero
Leishmania das existentes nos gênero Trypanosoma e Crithidia. Os resultados obtidos na
análise bioinformática estavam, em parte, de acordo com os obtidos na parte experimental
(imunológica) do presente estudo e em estudos anteriores sobre KMP-11. / Leishmaniases are a group of antropozoonotic diseases, endemic in 88 countries and present
in almost all Brazilian states. The development of vaccines against leishmaniasis is highly
desirable because neither the therapy nor the biological and ecoepidemiologic characteristics
of parasites and their associated vectors facilitate the disease control. Kinetoplastid Membrane
Protein-11 (KMP-11) is a vaccine candidate molecule against leishmaniasis. Using in vitro
and in silico tools, we evaluated the antigenicity of 13 synthetic overlapping peptides
covering the entire sequence of KMP-11. For the in vitro experiments we used peripheral
blood mononuclear cells (PBMC) from patients with cutaneous leishmaniasis (LC) from Rio
de Janeiro State. These cells were employed to test the antigenicity of the 13 peptides
individually, using ELISA and ELISPOT. By using ELISA we observed that recombinant
KMP-11 induced higher cytokine responses than most of the individual peptides. Concerning
IFN-γ two peptides (P9 and P10) induced cytokine levels significantly lower (p<0.05) than
the entire protein. Ten peptides (P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 e and P13) induced
significantly lower IL-10 and TNF-α levels than those observed with the entire protein. KMP-
11 was a potent inducer of IL-10 production in PBMC cultures from LC patients, confirming
previously published observations. It was also capable of inducing higher levels of IFN-γ and
TNF-α as compared to the studied peptides. In the evaluation of the IFN-γ/IL-10 ratio, we
observed a marked contrast between most of the peptides and KMP-11. The responses to 11
out of 13 peptides presented a clear type 1 bias (IFN-γ>IL-10), except P1 and P10, which showed a type 2 response (IFN-γ<IL-10). The response with the entire recombinant protein
IL-10 production predominated over that of IFN-γ. High variability in cytokine production
among the patients was observed. An in silico study was made to predict KMP-11 sequences
with antigenic potential with the SYFPEITHI algorithm. This analysis has revealed that the
studied peptides were promiscuous for most of the class I and class II HLA alleles analyzed.
For class II HLA, P4 showed scores significantly higher than the other peptides (p<0.05),
except those of P10 and P12. For class I HLA, the score values for P1 were significantly
higher than those for P4, P10 and P11 (p<0.05). On the other hand, the score values for the
P11 were significantly lower than those for P1, P2, P5, P6, P12 and P13 (p<0.05). The P3, P4
and P11 peptides showed negative score values, indicating that they contain amino acids that
interfere with the binding to HLA I molecules. In addition to this, we used the PAPROC,
MAPP and NetChop tools that have predicted that sequences contained in P1, P5 and P5
would be naturally produced by the proteolytic machinery. The PHYRE algorithm has
predicted that KMP-11 has a "hairpin" conformation with two alpha-helixes joined together
by a loop. Additionally this software has predicted the tridimensional structure of the protein.
The PROTSCALE algorithm revealed three regions of high polarity in the KMP-11 molecule
(at the positions 14-29, 34-36 and 44-71), what would be related to the tridimensional
structure already mentioned. Finally, the analysis of KMP-11 conservation confirmed that this
molecule is highly conserved in Kinetoplastidae, However, it was able to distinguish the
sequences of the KMP-11-coding genes in the genus Leishmania from those existent in
Trypanosoma and Crithidia. The results obtained in the bioinformatic analysis were partially
in agreement with those obtained in the experimental (immunologic) part of the present study
and in previous studies on KMP-11.
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Estudo da qualidade da resposta TH1 induzida por antígenos de promastigotas de L. Braziliensis e L. Amazonensis em células de pacientes com Leishmaniose Tegumentar AmericanaMacedo, Amanda Beatriz Rodrigues Barreto de January 2011 (has links)
Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T17:46:51Z
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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero
Leishmania, que afetam indivíduos em aproximadamente 88 países. Atualmente, a medida de
controle da doença mais aceita é o desenvolvimento de uma vacina profilática; porém, para
que uma vacina efetiva seja alcançada, torna-se necessário a compreensão dos fatores que
regulam e participam na proteção durante e após a infecção natural. São comuns trabalhos em
que a resposta imune do tipo Th1 é medida exclusivamente pela produção in vitro de IFN-γ,
porém a avaliação de um só parâmetro nem sempre é suficiente para predizer proteção. O
presente trabalho visou estudar a qualidade de resposta Th1 induzida por diferentes antígenos
de Leishmania em pacientes com a forma cutânea de leishmaniose tegumentar americana
(LTA) provenientes do RJ. Utilizando-se ensaios de citometria de fluxo multiparamétrica para
marcadores de superfície, e para as citocinas IL-2, TNF-α e IFN-γ, bem como ELISA para
IFN-γ, foram feitas comparações da resposta induzida pelos extratos totais de promastigotas
de fase estacionária de L. (V.) braziliensis (LbT) e L. (L.) amazonensis (PH8T), assim como
frações enriquecidas em componentes subcelulares de L. (L.) amazonensis, em células
mononucleares de sangue periférico de pacientes com LTA, antes e 140 dias após o
tratamento, e indivíduos controles sadios. A análise das subpopulações de linfócitos T por
citometria de fluxo não identificou alterações significativas nos percentuais de células CD8 +,
CD4+ e CD25+ induzidas pelos diferentes estímulos, dentro de um mesmo grupo, nem entre os
grupos de pacientes e controles. A avaliação individual da MFI integrada (frequência de
células produtoras de uma citocina multiplicada pela intensidade média de fluorescência) para
cada citocina estudada, não evidenciou nenhuma diferença marcante na resposta imune do
tipo Th1 induzida pelos diferentes estímulos; porém, através da avaliação da contribuição dos
fenótipos CD4+ produtores de 3, 2 ou 1 única citocina na resposta imune do tipo Th1 total,
observamos diferenças qualitativas bem distintas entre as respostas obtidas antes e após o
tratamento, e entre os antígenos estudados. Todos os estímulos apresentaram aumento da
porporção de células multifuncionais nos pacientes PT, em relação aos AT. Após o
tratamento, LbT foi o estímulo que induziu maior proporção de células multifuncionais
(produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ, simultaneamente; 28%), seguido da fração de membrana
de L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), enquanto que, PH8T induziu a menor proporção de
células multifuncionais (10%), e a maior proporção de células simples produtoras de IFN-γ
(38%). Corroborando alguns outros relatos da literatura, observamos que as células
multifuncionais são as que possuem a maior intensidade média de fluorescência para as 3
citocinas estudadas. A avaliação quantitativa da produção de IFN-γ por ELISA, demonstrou
que LbT foi o estímulo que induziu significativamente a maior produção desta citocina, em
comparação aos demais estímulos, tanto antes como após o tratamento. Este último resultado
parece se correlacionar com os dados de citometria já mencionados, em que este mesmo
estímulo foi capaz de induzir o maior percentual de células T multifuncionais, células essas
com a capacidade de produzir uma quantidade maior de citocinas, do que os outros fenótipos
estudados, como evidenciado nos resultados de MFI. Nossos resultados levam a discussão
sobre a importância da avaliação da qualidade de uma resposta imune do tipo Th1 medida por
mais de um parâmetro, a nível de uma única célula, e sugerem que a avaliação das células
multifuncionais é importante para correlacionar com a cura da doença. / Leishmaniasis is a group of disease caused by different species of protozoan parasites from
the genus Leishmania, that affects 88 countries around the world. Currently, the most
accepted approach to control the disease is a prophylactic vaccine. However, to develop such
a vaccine, it becomes necessary to understand the factors that regulate and participate in the
healing process as well as protection during and after natural infection. It is well established
that Th1-immune response is important for the protection against intracellular parasites.
Many studies evaluate this response only by the in vitro IFN-γ production, but the evaluation
of this single parameter not always is sufficient to predict protection. The present work
assessed the quality of the Th1-immune response induced by different Leishmania antigens in
patients affected with the cutaneous form of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL)
from Rio de Janeiro, Brazil. Using multiparametric flow cytometry to access surface markers
and cytokines, such as IL-2, TNF-α and IFN-γ, as well as ELISA to measure IFN-γ in culture
supernatants, we evaluated the immune responses induced by total antigens of stationary
phase promastigotes of L. (V.) braziliensis (LbT) and L. (L.) amazonensis (PH8T), as well as
subcellular components, composed of enriched fractions of L. (L.) amazonensis
promastigotes, in peripheral blood mononuclear cells of ATL patients, before and 140 days
after antimonial therapy, and healthy controls. Analysis of the T lymphocytes subpopulations
by flow cytometry did not show significant variations in the percentage of CD4+, CD8+ and
CD25+ cells induced by all different stimuli within the same group, or among the three
studied groups. The individual evaluation of integrated MFI (frequency x MFI) for each
cytokine assessed did not show any marked difference in the Th1-immune response induced
by the different stimuli; however, by assessing the contribution of the CD4+ phenotypes
producing 3, 2, or a single cytokine in the total Th1-immune response, we were able to
identify very interesting differences. In the group of patients analyzed after treatment, LbT
induced the highest proportion of multifunctional CD4+ T cells (producing IL-2, TNF-α and
IFN-γ, simultaneously; 28%), followed by the membrane fraction of L. (L.) amazonensis
(PH8M; 23%), whereas PH8T induced the lowest proportion of multifunctional CD4+ T cells
(10%) and the highest proportion of single positive-cells for IFN-γ (38%). Corroborating
previously published data, our results also showed that multifunctional CD4+T cells are those
with the highest mean fluorescence intensity for the three cytokines studied. The quantitative
evaluation of IFN-γ by ELISA showed that LbT significantly induced the higher production
of this cytokine, in comparison to the other stimuli, both before and after treatment. This last
result appears to show a relationship with our flow cytometry data, in which the same antigen
was able to induce the highest percentage of multifunctional T cells, coincidently the cells that
produced the larger amounts of cytokines, in comparison to the other CD4+ T cells
phenotypes, as observed by the MFI values. Our results support the actual discussion about
the importance of evaluating not only the quantity, but also the quality of a Th1-immune
response by more than one parameter at a single-cell level, and indicate the importance of
studying multifunctional CD4+ T cells in the cure of of ATL lesions.
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Caracterização do potencial diagnóstico de poliantígenos para detecção do Trypanosoma cruzi na fase crônica da doença de Chagas / Chracterization of the potencial diagnostic of polyantignes for detecting Trypanosoma cruzi in the chronic phase of Chagas diseaseSantos, Fred Luciano Neves January 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O diagnóstico da doença de Chagas crônica (DCC) baseia-se em metodologias que usam em
sua fase sólida antígenos brutos, semipurificados ou recombinantes, podendo resultar em
baixa sensibilidade ou reação cruzada. Uma forma para resolver este problema é o uso de
quimeras formadas por epítopos conservados e repetitivos de diferentes estruturas parasitárias
em uma única molécula. O nosso objetivo foi caracterizar e avaliar o uso de quimeras em
imunoensaios para o diagnóstico da DCC. As quimeras, IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e
IBMP-8.4 foram purificadas por meio de cromatografia e sua pureza avaliada por SDSPAGE.
Ensaios de dicroísmo circular (DC) e espalhamento dinâmico da luz (EDL) foram
usados para avaliação do raio hidrodinâmico das quimeras, avaliação de sua estabilidade e
escolha do sistema tampão que oferecesse o menor estado de agregação molecular. Ensaios
sorológicos para detecção de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi através de ELISA foram
realizados utilizando um painel de 857 amostras positivas para a DCC e 689 negativas. Para
avaliação de reação cruzada foram usadas 1079 amostras de diversas doenças endêmicas no
país. A purificação foi eficiente uma vez que o SDS-PAGE indicou ausência de degradação
das quimeras. As análises de DC e EDL mostraram que as quatro quimeras apresentaram
menor tendência de agregação em tampão carbonato pH 9,6, sendo, assim, este o sistema para
a sensibilização das placas. Os ensaios sorológicos revelaram valores elevados de
sensibilidade (Sen) e especificidade (Esp) para a molécula IBMP-8.4 (Sen-99,3%; Esp-
100%). O desempenho para as demais moléculas foi satisfatório, ficando os valores de Sen e
Esp acima de 94%. As moléculas IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4 apresentaram
respectivamente 0,46%, 0,85%, 0,46% e 0,37% de reação cruzada. Os resultados apontam que
as quimeras atingiram os critérios de proficiência do Ministério da Saúde podendo, dessa forma, ser utilizados em ensaios diagnósticos para a DCC. Chronic Chagas disease (CCD) diagnosis is based on serological methods employing crude,
semipurified or recombinant antigens, which eventually may result in low sensitivity or crossreactivity.
An alternative method for solving this problem is the use of chimeric molecules
composed by conserved and repetitive epitopes of distinct parasite structures. Our objective
was to evaluate the use of chimeras in immunoassays for the diagnosis of CCD. The chimeras
IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP-8.4 were purified by chromatography and their
purity assessed by SDS-PAGE. Circular dichroism (CD) and dynamic light scattering (DLS)
were used to assess the hydrodynamic radius of the chimeras, to evaluate their stability and to
select the buffering system that offers the lowest state of molecular aggregation. Serological
tests for detection of anti-Trypanosoma cruzi were performed by ELISA using a panel of 857
positive and 689 negative serum samples for CCD. Cross-reactivity was assessed by using
1079 serum samples from patients with unrelated diseases. The purification was efficient
since SDS-PAGE indicated the absence of degradation of chimeric proteins. Analyses of CD
and DLS showed that the four chimeras had low aggregation tendency in carbonate buffer, pH
9.6. Serological testing showed high values of sensitivity (Sen) and specificity (Spe) for
IBMP-8.4 (Sen-99.3%; Spe-100%). The performance of other molecules was satisfactory,
being the Sen and Spe values above 94%. Cross-reaction was observed in 0.46%, 0.85%,
0.46% and 0.37% of the samples tested against IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP- 8.4, respectively. The results indicate that the chimeras reached the Brazilian Ministry of Health proficiency criteria and may thus be used in diagnostic assays for CCD.
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