La résistance antimicrobienne est un problème de santé publique de plus en plus inquiétant. En effet, si ce problème n'est pas contrôlé dès maintenant, dans les prochaines années, nous pourrions arriver dans une ère post-antibiotique où de simples infections pourraient recommencer à tuer. Afin d'éviter de tels enjeux, il est primordial que de nouveaux antibiotiques soient développés pour remplacer les médicaments contre lesquels les bactéries se sont adaptées. De toutes nouvelles classes de médicaments seraient nécessaires et l'une d'entre elles est la classe des peptides antimicrobiens. Ces segments protéiques sont retrouvés dans une impressionnante variété d'organismes et sont utilisés comme première ligne de défense contre les infections bactériennes. Le fonctionnement de ces molécules n'est pas entièrement compris, mais il est présumé qu'elles créent des pores dans les membranes bactériennes, causant ainsi la mort des cellules attaquées. Ces molécules ont un énorme potentiel, mais de nombreux problèmes empêchent leur utilisation clinique. Dans le laboratoire du Professeur Voyer, un peptide modèle, analogue des peptides antimicrobiens, a été synthétisé. Ce peptide composé de 10 leucines et de quatre phénylalanines modifiées par des éthers-couronnes a été modifié de façon systématique pour tenter de comprendre les déterminants de l'activité et de la sélectivité des peptides antimicrobiens. Dans ce mémoire, la synthèse et la caractérisation des analogues dans lesquels trois leucines ont été substituées par des acides aminés cationiques seront discutées. Ces peptides ont été caractérisés par des études biophysiques comme le dichroïsme circulaire, l'infrarouge à transformée de Fourier et le relargage de la calcéine par fluorescence. De plus, des tests d'activité biologique comme l'activité antimicrobienne et l'activité hémolytique ont aussi été réalisés et sont présentés dans le présent mémoire.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / Ce mémoire porte sur l'étude des mécanismes d'action de peptides cationiques à visée antimicrobienne longs de 14 acides aminés. Des études antérieures ont montré que la substitution de résidus leucine par des résidus lysine pouvait, dans certains cas, diminuer considérablement le caractère hémolytique des peptides, augmentant ainsi leur sélectivité pour les membranes bactériennes. Nous avons procédé à des études par spectroscopic RMN et infrarouge, appuyées par des simulations informatiques, afin d'étudier les interactions entre des peptides sélectifs et non-sélectifs et des membranes modèles zwitterioniques et anioniques. Les résultats permirent de proposer deux mécanismes distincts qui peuvent expliquer le comportement de l'ensemble des analogues étudiés. Les peptides non-sélectifs se positionneraient à la surface des bicouches et y formeraient des pores via un mécanisme semblable au modèle "sinking-raft". Les peptides sélectifs s'agrégeraient plutôt en plaques à la surface des bicouches, y causant des défauts conduisant à la perméabilisation des membranes.

L’augmentation et la propagation alarmante de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes sont devenues un problème important de santé publique. Pour surmonter cette situation inquiétante, il y a un besoin croissant de nouveaux agents antimicrobiens avec des modes d’action innovants. La grande majorité des espèces bactériennes utilisent des peptides pour se défendre et se protéger contre d’autres microorganismes dans leur environnement. Ces peptides antimicrobiens possèdent des spectres d’activité et modes d’action très variés et représentent une source très intéressante pour découvrir et développer des agents antibactériens efficaces. L’objectif du projet consistait à faire le design et la synthèse d’analogues du peptide antimicrobien microcine J25 pour effectuer des études structure-activité et mieux comprendre les modes d’action. Comme la microcine J25 possède une structure particulière en lasso et extrêmement difficile à reproduire de façon synthétique, la stratégie était de faire le design par approche computationnelle d’analogues capables de mimer la structure de la microcine J25 sans passer par le lasso. Après leur synthèse, ces analogues ont été utilisés dans une étude structure-activité pour mieux comprendre l’impact de la structure sur le mode d’action et identifier les parties de la microcine J25 qui sont impliquées dans le transport et les interactions avec les cibles bactériennes. / The increasing and alarming spread of antibiotic resistance by pathogenic bacteria have become an important public health problem. To overcome this worrying situation, there is a growing need for new antimicrobial agents with innovative modes of action. The vast majority of bacterial species use peptides to defend and protect themselves against other microorganisms in their environment. These antimicrobial peptides possess a wide range of activity spectra and modes of action and are a very good source to discover and develop effective antimicrobial agents. The objective of this project was to design and synthesize analogues of the antimicrobial peptide microcin J25 to perform structure-activity studies for a better understanding of its modes of action. As the microcin J25 has a particular lasso structure that is extremely difficult to replicate synthetically, the strategy was to design by computational approach analogues capable of mimicking the microcin J25’s structure without the lasso topology. After synthesis, these analogs were used in a structure-activity study to better understand the impact of the structure on the mode of action and identify parts of the microcin J25 that are involved in the transport and interactions with bacterial targets.

L'intérêt porté à l'étude des peptides antimicrobiens est motivé par la résistance croissante des bactéries face aux antibiotiques traditionnels, un problème particulièrement présent en milieu hospitalier. Ayant en vue d’approfondir ce domaine d’expertise, notre attention s’est arrêtée sur la thanatine. Ce peptide naturel présent chez la punaise soldat (Podisus maculiventris) se démarque par sa structure secondaire en forme d’épingle à cheveux et par sa capacité à entraîner l’agglomération des bactéries. L’objectif du projet est d’étudier l’interaction de la thanatine avec des membranes lipidiques modélisant les cellules eucaryotes et procaryotes afin d’en déduire son mécanisme d’action. En spectroscopie IRTF et RMN en phase solide, la structure et l’organisation des systèmes modèles ont été étudiées. L’agrégation de vésicules modèles a quant à elle été étudiée par diffusion dynamique de la lumière et spectroscopie UV-vis. Des avancées ont été faites concernant la formulation des membranes modèles.

Dans le cadre d'un programme de recherche sur la mise au point de nanostructures peptidiques ayant une activité membranaire, des membres de l'équipe ont démontré que les peptides synthétiques, neutres et de 14 acides aminés avaient des propriétés cytolytiques comparables à celles des peptides cationiques. Le présent mémoire propose une étude sur le design, le développement et la caractérisation de nanostructures peptidiques à visée antimicrobienne. Diverses approches pour contrer le phénomène de résistance antimicrobienne ont été employées par plusieurs groupes de recherche. L'approche de notre laboratoire est présentée au chapitre 3. Les études de perméabilité membranaire de la banque de peptides synthétisés (chapitre 4) ainsi que les études conformationnelles (chapitre 5) ont permis d'en apprendre davantage sur les déterminants moléculaires responsables de l'activité antimicrobienne. La sélectivité du composé neutre de départ a été améliorée et nous savons que les peptides sélectifs adoptent une conformation de feuillet-P en milieu membranaire.

Les résultats de cette étude ont montré qu'un extrait enrichi en peptides anioniques (APEE), préparé par nanofiltration d'un hydrolysat trypsique de protéines du lactosérum, inhibait la croissance des bactéries pathogènes Listeria monocytogenes et Staphylococcus aureus sur milieu gélose. Le même extrait s'est aussi avéré efficace pour inhiber la croissance de L. monocytogenes dans un caillé modèle de type Cheddar. De plus, l'activité antimicrobienne de cet extrait était supérieure dans les caillés préparés avec un faible ratio sel/humidité (1.75% vs 3.75%). L'efficacité de cet extrait envers les bactéries Gram positif a été associée à sa richesse en peptides anioniques constitués de plus de 8 acides aminés et pouvant contenir des résidus cysteine et/ou un pont disulfure. Ces travaux suggèrent donc que l'APEE pourrait être utilisé comme agent de conservation naturel pour limiter la croissance de L. monocytogenes dans les aliments, notamment dans les fromages Cheddar à teneur réduite en sel.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / Cette thèse de doctorat présente la problématique de résistance aux antibiotiques parmi les pathogènes bactériens en émergence et en réémergence à travers le monde. En effet, le développement et la propagation des mécanismes de résistance compromet l’efficacité des traitements antibactériens disponibles et met en danger la vie des patients infectés. Cette thèse se concentre sur l’identification de nouvelles cibles antibactériennes et sur le développement de nouvelles classes d’agents antibactériens en utilisant le pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa en tan que modèle d’étude. Le premier chapitre aborde l’exploitation des protéines de division cellulaire FtsZ et FtsA en tant que cibles antibactériennes. Suite à une revue de la littérature détaillée, deux articles scientifiques décrivent la synthèse et la sélection d’inhibiteurs contre FtsZ et FtsA. Ces inhibiteurs représentent des candidats prometteurs en vue du développement d’une nouvelle classe d’agents antibactériens. Le deuxième chapitre du corps de la thèse porte sur l’utilisation des amides ligases MurC, MurD, MurE et MurF essentielles à la biosynthèse de la paroi bactérienne en tant que cibles antibactériennes. Suite à une revue de la littérature sur la biologie de ces enzymes, trois articles scientifiques relatent la sélection d’inhibiteurs peptidiques par présentation phagique contre les enzymes MurD, MurE et MurF. Le mode d’action innovateur de ces inhibiteurs permet d’envisager le développement de nouveaux agents antibactériens par peptidomimétisme. Le dernier chapitre expose le pouvoir antibactérien des endolysines de bactériophages. Une revue de la littérature résume le mode d’action et la biologie des endolysines en tant qu’agents antibactériens efficaces ciblant l’intégrité de la paroi bactérienne. Par la suite, un article décrit la capacité de l’endolysine du phage ΦKZ à hydrolyser la paroi bactérienne des bactéries à Gram-négatif et à outrepasser les membranes bactériennes. Ainsi, cette enzyme possède un potentiel antibactérien fort intéressant. En conclusion, cette thèse fournit plusieurs pistes attrayantes afin de développer de nouvelles stratégies antibactériennes pour contrer la problématique de résistance aux antibiotiques. / This thesis first presents the critical outcome of antibiotic resistance among emerging and re-emerging bacterial pathogens worldwide. The incessant increase and spread of antibiotic resistance mechanisms compromise the efficiency of available antibacterial therapies and increase the impact of bacterial infections on human mortality and morbidity. This thesis focuses efforts to identify new antibacterial targets in order to develop novel classes of antibacterial agents using the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa as a research model. The first chapter of this thesis reports the exploitation of the cell division proteins FtsZ and FtsA as antibacterial targets. A detailed scientific review is presented along with two articles reporting the synthesis and selection of inhibitors against FtsZ and FtsA. These inhibitors represent potent candidates to develop new classes of antibacterial agents targeting the bacterial cell division process. The second chapter describes the use of the essential bacterial cell wall biosynthesis enzymes MurC, MurD, MurE and MurF as antibacterial targets. A scientific review first summarises the biology of these amide ligase enzymes and three scientific articles report the selection of peptide inhibitors against MurD, MurE and MurF by phage display. The novel mode of action of these inhibitors against the unexploited Mur enzymes can be the basis for future development of antibacterial agents targeting the cell wall biosynthesis pathway by peptidomimetism. The last chapter exposes the antibacterial potential of the phage-encoded endolysin enzymes. A review describes the mode of action and the biology of endolysins as efficient antibacterial agents targeting the integrity of the bacterial cell wall layer. Finally, an article presents the peptidoglycan hydrolytic activity of the P. aeruginosa phage ΦKZ gp144 lytic transglycosylase. This endolysin is able to pass through the bacterial membranes and thus represents a strong candidate for developing new antibacterial therapies against Gram-negative bacteria. In conclusion, this thesis provides various attractive ways to develop new antibacterial strategies and face the problem of antibiotic resistance.

Les antibiotiques ont longtemps été utilisés dans les pratiques d'élevage comme additifs alimentaires pour améliorer la croissance des animaux, comme les porcelets en post-sevrage, ainsi que pour traiter les infections bactériennes, notamment celles causées par Escherichia coli et Salmonella. Cependant, cette pratique a largement contribué à l'émergence de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries commensales et pathogènes, ce qui a conduit à un réel problème de santé publique. Face à l’incidence accrue des infections causées par les bactéries pathogènes résistantes aux antibiotiques, la recherche de solutions alternatives est devenue une urgence et les peptides antimicrobiens naturels (AMPs) et plus particulièrement les bactériocines apparaissent parmi les alternatives prometteuses qui ont été proposées. La microcine J25 (MccJ25) est un peptide antimicrobien produit par Escherichia coli connu pour exercer une puissante activité inhibitrice contre les Enterobacteriaceae, y compris Salmonella. Grâce à sa structure en lasso, la MccJ25 présente une faible sensibilité aux protéases et aux conditions dénaturantes et pourrait ainsi avoir une plus grande stabilité durant un tractus gastrointestinal (GI). Toutes caractéristiques font de la MccJ25 une molécule à fort potentiel d’utilisation comme alternative aux antibiotiques dans le domaine vétérinaire. L’objectif général de cette thèse était d’évaluer le potentiel de MccJ25 comme alternative aux antibiotiques pour l’inhibition de Salmonella dans les conditions physiologiques du tube digestif du porc. Dans la première partie de cette étude, la stabilité et l’activité inhibitrice de la MccJ25 ont été évaluées dans les différents compartiments du tractus GI en utilisant le simulateur dynamique in vitro TIM-1. La MccJ25 a démontré une plus grande stabilité au niveau de l'estomac, tandis qu'une dégradation modérée a été observée dans le compartiment duodénal. Les formes de dégradation de la MccJ25 ont été analysées par LC-MS/MS et selon l’approche des réseaux moléculaires utilisant les outils de la plateforme GNPS, et en présence d'enzymes protéolytiques simulant les conditions duodénales. Les principales enzymes responsables de la dégradation de la MccJ25 ont ainsi pu être identifiées. Dans un deuxième temps, les concentrations minimales inhibitrices (CMI) et bactéricides (CMB) de la MccJ25 ont été déterminées in vitro contre Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport ATCC6962 dans le milieu LB ainsi que dans le milieu Macfarlane qui simule les conditions coliques du porc. Cette activité inhibitrice a été également comparée à celle de deux autres antimicrobiens, la réutérine et la rifampicine. Enfin, dans un troisième temps, l’activité de la MccJ25 contre Salmonella Newport et son impact sur la composition et l’activité métabolique du microbiote colique du porc ont été évalués en utilisant le modèle in vitro de fermentation en continu PolyFermS qui simule les conditions du côlon proximal porcin. L’activité inhibitrice contre Salmonella Newport a été évaluée par la méthode de de diffusion sur gélose, tandis que l’impact sur les différents groupes bactériens du microbiote colique porcin a été quantifié par la méthode de qPCR-PMA et par séquençage Illumina MiSeq. De façon remarquable, la MccJ25 n'a pas induit de modification significative de la composition du microbiote colique, alors qu'elle a fortement inhibé la croissance de Salmonella Newport, contrairement à la réutérine ou la rifampicine. Par ailleurs, l’analyse de l’activité métabolique du microbiote colique à l’aide du logiciel R et effectuée à partir des données de LC-MS, a démontré un effet significatif de la MccJ25 sur le métabolome intracellulaire alors qu’aucun effet significatif n’a été observé sur le métabolome extracellulaire. En conclusion, l’application d’approches microbiologiques, métagénomiques et métabolomiques très originales, variées et complémentaires nous a permis de confirmer le potentiel de la MccJ25 quant à la possibilité de son utilisation comme une alternative aux antibiotiques dans les pratiques d’élevage. Sa stabilité dans les premières étapes de digestion, sa spécificité à l'égard de Salmonella et le fait que son introduction dans le microbiote intestinal n'entraîne pas de dysbiose, la désignent comme un bon candidat dans la lutte contre la salmonellose. Des études complémentaires seront cependant nécessaires afin de confirmer ces résultats in vivo en conditions réelles d’élevage. / Antibiotics have long been used in animal husbandry practices as feed additives to improve animal growth as well as to treat bacterial infections, including those caused by Escherichia coli and Salmonella. However, this practice has largely contributed to the emergence of antibiotic resistance in commensal and pathogenic bacteria, which has led to a real public health problem. The increased incidence of infections caused by antibiotic-resistant pathogenic bacteria, has promoted the search for new alternatives and natural antimicrobial peptides (AMPs), including bacteriocins are among the promising alternatives that have been proposed. Microcin J25 (MccJ25) is an antimicrobial peptide produced by Escherichia coli and known to exert a potent inhibitory activity against Enterobacteriaceae, including Salmonella. Thanks to its lasso structure, MccJ25 has a low sensitivity to proteases and to denaturing conditions suggesting a higher stability in the gastrointestinal tract (GI) conditions. These characteristics make MccJ25 a molecule with high potential for use as an alternative to antibiotics in the veterinary field. The general objective of this thesis was to evaluate the potential of MccJ25 as an alternative to antibiotics for the inhibition of Salmonella in the physiological conditions of the digestive tract of piglet. In the first part of this study, the stability and the inhibitory activity of MccJ25 were evaluated in the different compartments of the GI tract using the dynamic simulator TIM-1. MccJ25 demonstrated higher stability in the stomach compartment; however, a moderate degradation was observed when the peptide entered the duodenum. Degradation products of MccJ25 in duodenal conditions and in the presence of different proteolytic enzymes were further analyzed using LC-MS/MS and subsequent molecular networking analysis using the Global Natural Product Social Molecular Networking platform (GNPS). Thus, the enzymes responsible for the degradation of MccJ25 have been identified. In the second part of the present study, the minimal inhibitory (MIC) and bactericidal (MBC) concentrations of MccJ25 were determined in vitro against Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport ATCC6962 in LB medium as well as in MacFarlane medium that simulates the swine colonic conditions. This inhibitory activity was also compared to that of two other antimicrobials namely reuterin and rifampicin. Finally, the activity of MccJ25 against Salmonella Newport and its impact on the composition and the metabolic activity of the swine colonic microbiota were evaluated using the in vitro continuous fermentation model PolyFermS that simulates the swine proximal colon conditions. The inhibitory activity against Salmonella Newport was evaluated using the agar diffusion assay, while the impact on the different bacterial groups of the swine colonic microbiota was quantified by qPCRPMA method and Illumina MiSeq sequencing. Interestly, MccJ25 did not induce any significant modification of the composition of the colonic microbiota, whereas it strongly inhibited the growth of Salmonella Newport, unlike reuterin and rifampicin. However, the analysis of the metabolic activity of the colonic microbiota using the R software and the LC-MS data, demonstrated a significant effect of MccJ25 on the intracellular metabolome. No significant effect was obtained with extracellular metabolome. In conclusion, the application of very original, varied and complementary microbiological, metagenomic and metabolomic approaches allowed us to confirm the potential of MccJ25 for use as an alternative to antibiotics in the veterinary sector. Its stability in the early stages of digestion, its specificity with regard to Salmonella and the fact that its addition into the intestinal microbiota does not cause any dysbiosis, suggested it as a good candidate as an anti-Salmonella. However, additional studies remain necessary to confirm these results in vivo under real animal use conditions.

Face à l'apparition grandissante de souches bactériennes multi-résistantes à l'arsenal d'antibiotiques actuels, les thiopeptides antibiotiques, bien que connus depuis plus de 60 ans, suscitent actuellement un fort regain d'intérêt. En effet, cette classe de molécules présente une forte activité antibiotique contre des souches bactériennes résistantes et multirésistantes, et met en œuvre deux modes d'inhibition originaux de la synthèse protéique encore inexploités en thérapie antibiotique humaine. Leur développement pharmacologique est en particulier freiné par la difficulté de préparation de ces molécules très complexes. L'élaboration d'une stratégie innovante de synthèse de la partie la plus complexe de ces molécules, le cœur hétérocyclique est étudiée dans ce travail. Cette approche repose sur l'étude et la valorisation de nouvelles méthodologies de fonctionnalisation directe des liaisons C-H et C-X de mono- et bis-thiazoles avec une large gamme d'hétéroaromatiques. Sa viabilité est démontrée par la préparation du cœur hétérocyclique commun aux amythiamicines.

Face à l’apparition grandissante de souches bactériennes multi-résistantes à l’arsenal d’antibiotiques actuels, les thiopeptides antibiotiques, bien que connus depuis plus de 60 ans, suscitent actuellement un fort regain d’intérêt. En effet, cette classe de molécules présente une forte activité antibiotique contre des souches bactériennes résistantes et multirésistantes, et met en œuvre deux modes d’inhibition originaux de la synthèse protéique encore inexploités en thérapie antibiotique humaine. Leur développement pharmacologique est en particulier freiné par la difficulté de préparation de ces molécules très complexes. L'élaboration d'une stratégie innovante de synthèse de la partie la plus complexe de ces molécules, le cœur hétérocyclique est étudiée dans ce travail. Cette approche repose sur l'étude et la valorisation de nouvelles méthodologies de fonctionnalisation directe des liaisons C-H et C-X de mono- et bis-thiazoles avec une large gamme d’hétéroaromatiques. Sa viabilité est démontrée par la préparation du cœur hétérocyclique commun aux amythiamicines. / Due to the emergence of multiresistant bacterial strains to standard antibacterial treatments, thiopeptides antibiotics are actually highly considered, though they are known for 60 years. They show an excellent antibiotic activity against multiresistant bacterial strains, and implement two originals inhibition mechanisms of protein synthesis, still unemployed in human therapy. However, the difficulty to prepare these complex macromolecules limits their pharmacological development. The development of a new strategy to synthetize the most complicated part of these macromolecules, their heterocyclic core, is studied here in. This approach is based on the study and the exploitation of novel direct C-H and C-X transition-metal-catalyzed couplings of mono- and bithiazoles units with a broad panel of heteroaromatics. Its viability is here demonstrated trough the multi-step synthesis of the common heterocyclic core of amythiamicins.