I established the phage antibody library platform for the identification of specific antibodies. In the first part of my study, I tried to identify antibody against SARS-CoV. Two fragments on the spike protein, which is responsible for inducing viral entry, was chosen as target for the selection of antibody. An antibody was identified which can selectively recognize the SARS-CoV infected cells, but not non-infected cells. Although this antibody was found to retain no neutralizing ability, this specific antibody may have potential to develop for diagnostic purpose. / I utilized the phage system-based cloning method as an attractive approach to screen and identify virus-specific antibodies that can be encoded by the human genome. Once a useful phage clone is identified, unlimited amounts of human monoclonal virus-specific antibodies can be manufactured, and potentially applied clinically for prophylactic and therapeutic uses. The study focuses on two of these new infections, both of which cause severe respiratory disease: SARS and avian influenza. / Identification of specific antibodies, either for diagnostic or therapeutic use, was successfully demonstrated in the two infectious disease models. The phage antibody platform offers a fast and cost-effective method to identify phage antibodies, which can easily be converted to human viral specific monoclonal antibodies for clinical use. / In the 21st century, a number of novel infectious diseases emerged suddenly and spread rapidly, endangering the lives and well-being of people around the world. Severe acute respiratory syndrome (SARS) is a life threatening form of atypical pneumonia that ravaged Hong Kong, Taiwan, China, Canada and many cities in 2003. In the same year, novel avian influenza viruses infected human beings on two continents. Both of these diseases originated in animals and crossed over into the human population. These emerging diseases pose significant public health threats while providing a chilling reminder that another influenza pandemic could occur at any time. Thus, the development of effective therapeutics to control the disease is of paramount importance. Although several vaccines against SARS and avian influenza are available nowadays, the poor clinical performance and frequent mutation of viral strains may limit the practical use and value of the vaccines. Moreover, there are no promising antiviral drugs available for the treatment. Therefore, I aimed to develop an immunotherapy as an alternative treatment option against these diseases. / In the second part of my study, the extracellular domain of matrix protein of avian influenza virus was chosen as target for the selection of antibody. I successfully identified an antibody which can neutralize the avian influenza virus infection. This promising result indicated this antibody has potential to develop for therapeutic use and these antibodies can be easily manufactured in unlimited amounts for clinical application. / Leung, Ka Man. / Adviser: Kwok Pui Fung. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 71-01, Section: B, page: 0212. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2009. / Includes bibliographical references (leaves 112-123). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. Ann Arbor, MI : ProQuest Information and Learning Company, [200-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.

INTRODUÇÃO: Indivíduos com asma possuem infiltração aumentada de células inflamatórias, produção de quimiocinas e hiperresponsividade de vias aéreas. Estes apresentam níveis aumentados de interleucina (IL)-17, importante na regulação da expressão de mediadores inflamatórios e recrutamento de células inflamatórias, outra característica é aumento da atividade da proteína Rho-quinase em suas vias aéreas. A modulação da IL-17 e da proteína Rho-quinase pode ser promissora para o tratamento desta doença. OBJETIVO: Estudar os efeitos dos tratamentos realizados com anticorpo neutralizador anti-IL17 e do inibidor da Rho-quinase, associados ou não, em camundongos com inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Foram utilizados 64 camundongos BALB/c, divididos em 8 grupos (8 animais por grupo): SAL (solução salina); OVA (ovoalbumina), SAL-RHOi (salina e inibidor de Rho-quinase), OVA - RHOi (ovoalbumina e inibidor de Rho-quinase), SAL - anti-IL17 (salina e anti-IL17), OVA - anti-IL17 (ovoalbumina e anti-IL17), SAL - RHOi - anti-IL17 (salina, anti-IL17 e inibidor de Rho-quinase), OVA - RHOi - anti-IL17 (ovoalbumina, anti-IL17 e inibidor de Rho-quinase). O protocolo de sensibilização e indução da inflamação pulmonar por ovoalbumina teve duração de 28 dias. O Anti-IL17A (clone 50104 - 7,5 ug por dose) foi administrado via intraperitoneal e inibidor de Rho-quinase (Y-27632) intranasal (10 mg/kg), 1h antes de cada desafio com ovoalbumina (22, 24, 26 e 28 dias). RESULTADOS: Houve um aumento na resistência do sistema respiratório e na elastância, nos marcadores inflamatórios CD4+, CD8+, ROCK1 e ROCK2, IL-1-beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNFalfa, em vias sinalizadoras NF-kappaB, FOXP-3 e células dendríticas, em marcadores de remodelamento MMP9, MMP12, TIMP1, iNOS, TGF-beta, no conteúdo de isoprostano, decorina, biglicano, fibronectina e fibras colágenas e na expressão gênica de VAChT, IL-17 e arginase, no grupo OVA em comparação com o grupo controle. O tratamento dos animais sensibilizados, de forma individualizada ou a associação dos dois, atenuou estas respostas quando comparados ao grupo sensibilizado com ovoalbumina e não tratado (p < 0,05). O tratamento do inibidor de Rho-quinase associado ao anti-IL17 gerou potencialização do controle da resposta de hiperresponsividade à metacolina, assim como nas vias aéreas a redução do número de células positivas TNF-alfa, IL-4, IL-5 e nos septos alveolares o número de células positivas IL-4, IL-5, TGF-beta, FOXP3, ROCK1 e ROCK2 (p < 0,05). CONCLUSÃO: O tratamento com anti-IL17 associado ao inibidor da Rho-quinase modula a hiperresponsividade das vias aéreas, inflamação, e remodelamento e estresse oxidativo em animais com inflamação pulmonar alérgica crónica / RATIONALE: Individuals with asthma have increased infiltration of inflammatory cells, chemokines production, and airway hyperresponsiveness. Asthmatics have elevated levels of interleukin (IL)-17, which plays an important role in regulating the expression of inflammatory mediators and recruitment of inflammatory cells, these individuals also have increased Rho-kinase protein activity in their airways. The modulation of IL-17 and Rho-kinase protein may be promising for the treatment of this disease. OBJECTIVE: To study the effects of anti-IL17 neutralizing antibody and Rho-kinase inhibitor treatments, associated or not, on mice with chronic allergic lung inflammation. METHODS: Were used 64 BALB/c mice, divided into eight groups (n=8 in each group): SAL (saline-instilled); OVA (exposed-ovalbumin); SAL-RHOi (saline and Rho-kinase inhibitor), OVA-RHOi (exposed-ovalbumin and Rho-kinase inhibitor); SAL - anti-IL17 (saline and anti-IL17), OVA - anti-IL17 (exposed-ovalbumin and anti-IL17); SAL - RHOi -anti-IL17(saline, Rho-kinase inhibitor and anti-IL17), OVA - RHOi - anti-IL17 (exposed-ovalbumin, anti-IL17 and Rho kinase inhibitor). The protocol for sensitization and induction of pulmonary inflammation by ovalbumin has the duration of 28 days. The Anti-IL17A neutralizing antibody (clone 50104-7.5 ug per dose) was administered via the intraperitoneal, and Rho-kinase inhibitor (Y-27632) intranasal (10 mg/kg), 1h before each ovalbumin challenge (22, 24, 26 and 28 day). RESULTS: There was an increase in respiratory system resistence and elastance, in the positive cells evaluated CD4+, CD8+, ROCK1 and ROCK2, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNFalpha, TGF-beta, MMP9, MMP12, TIMP1 and isoprostane, decorin, biglican, fibronectin, collagen fibers content, signaling pathways NF-kappaB, FOX-P3, dendrict cells and gene expression of VAChT, IL-17 and arginase in the OVA group compared to the control group. Treatment of the sensitized animals with the Rho-kinase inhibitor or with the anti-IL17 or with the combination of the two, attenuated these responses when compared to the ovalbumin-sensitized and untreated group (p < 0,05). The treatment of the anti-IL17 associated Rho-kinase inhibitor generated potentiation of the hyper responsiveness response to methacholine, as well as in the airways the reduction of the number of TNF-alpha, IL-4, IL-5 positive cells and in the alveolar septa the number of IL-4, IL-5, FOXP3, TGF-beta, ROCK1 and ROCK2 (p < 0.05). CONCLUSION: Anti-IL17 treatment associated with the Rho-kinase inhibitor modulates airway hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress in animals with chronic allergic pulmonary inflammation

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2010. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-25 / O Vírus Sincicial Respiratório (VSR) é o principal agente em infecções agudas do trato respiratório inferior (IATRI) antes de dois anos, com altas taxas de internação e óbito em crianças de alto risco para infecção grave pelo VSR. Objetivo: Identificar os vírus envolvidos nos quadros de infecções agudas de trato respiratório (IATR) e analisar taxas de internação e óbito em crianças submetidas à profilaxia com palivizumabe. Métodos: Coorte prospectiva com 198 crianças menores de um ano de idade nascidas antes de 29 semanas de idade gestacional e crianças menores de 2 anos de idade com cardiopatia hemodinamicamente instável ou doença pulmonar crônica que receberam palivizumabe para profilaxia contra infecções graves pelo VSR em 2008. Nesse período, em cada episódio de IATR foi coletado aspirado de nasofaringe (NPA) para identificação de VSR, adenovírus, parainfluenza 1, 2 e 3, influenza A e B por imunofluorescência direta, e rinovírus e metapneumovírus por RT-PCR. Foram monitoradas internações e óbitos nesse grupo. Resultados: Das 198 crianças acompanhadas, 117 (59,1%) apresentaram IATR, totalizando 175 episódios. Das 76 NAPs coletadas, 37 foram positivas, encontrando-se, rinovírus em 75,7% dessas amostras, VSR (18,9%), parainfluenza (28,1%), adenovírus (2,7%), metapneumovírus (2,7%) e co-infecção em três amostras. Das 48 internações, 18 ocorreram por causa respiratória, sendo apenas 1 por VSR. Em nenhuma das duas crianças que evoluíram para óbito detectou-se o VSR. Conclusão: Na vigência de profilaxia com palivizumabe, a frequência de isolamento de VSR em crianças de alto risco com IATR e naquelas que necessitaram de internação hospitalar foi baixa. / Respiratory Syncytial Virus (RSV) is the most important etiologic agent in acute lower respiratory tract infections (ALRTIs) in children under two years, with high rates of hospitalization and death in high risk children for severe RSV infection. Objective: To identify the virus present in acute respiratory tract infections (ARTIs) and to analyze rates of hospitalization and death in children who received palivizumab prophylaxis. Methods: Prospective cohort of 198 infants up to 1 year old born before 29 weeks gestation and infants less than two years of age with hemodynamically instable cardiopathy or chronic pulmonary disease, who received prophylactic palivizumab against severe RSV infections in 2008. During this period, a nasopharyngeal aspirate (NPA) was collected in each episode of ARTI for identification of RSV, adenovirus, parainfluenza 1, 2 and 3, influenza A and B by direct immunofluorescence, and rhinovirus and metapneumovirus for RT-PCR. Data regarding hospitalization and death were collected. Results: Of the 198 infants included, 117 (59,1%) presented ARTIs, with a total of 175 episodes. Of 76 NPAs collected, 35 were positive, being rhinovirus (75.7%), RSV (18.9%), parainfluenza (8.1%), adenovirus 2 (2.7%), metapneumovirus (2.7%) and 3 samples presented multiple agents. Of 48 hospitalizations, 18 presented respiratory causes, but in only one child was found RSV. None of the 2 children who died had RSV. Conclusion: During the palivizumab prophylaxis period, the frequency of RSV detected in high risk children with ARTIs and those who were hospitalized was low. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-21T11:40:46Z No. of bitstreams: 1 carina-cantelli-pacheco-de-oliveira.pdf: 4119562 bytes, checksum: e15daef4939ba93f9357a8bbf218d494 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-21T11:40:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carina-cantelli-pacheco-de-oliveira.pdf: 4119562 bytes, checksum: e15daef4939ba93f9357a8bbf218d494 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O interferon beta (IFN-β) é uma proteína globular consistindo de cinco cadeias α-helicais e como biofármaco é principalmente utilizado para o tratamento da esclerose múltipla (EM). A EM é uma doença até o momento sem cura e das terapias imunomodulatórias disponíveis para melhoria do quadro da EM, o IFN-βé o biofármaco disponível mais bem caracterizado. Duas formas do IFN-βhumano recombinante são clinicamente utilizadas: IFN-β-1a, produzida em células de ovários de hamster chinês (CHO), similar ao IFN-βnativo; e a forma IFN-β-1b, produzida em sistema de Escherichia coli, não possuindo moléculas de açúcar na cadeia polipeptídica expressa. Testes para detecção e quantificação dos IFNs são principalmente do tipo ELISA sendo cruciais nos processos de desenvolvimento, monitoramento e no controle de qualidade, devido principalmente a relação sensibilidade/especificidade necessária. Os anticorpos monoclonais (Mabs) de alta afinidade, produzidos para estes testes são extremamente sensíveis e específicos e representam uma forma adequada de padronização de um ELISA para detecção e quantificação do IFN-β. Neste estudo, quatorze MAbs anti-IFN-βforam obtidos através da imunização genética e parcialmente caracterizados. Todos reconheceram no ELISA o IFN-βhumano recombinante. Os MAbs anti-IFN-βidentificados como AE9, AG8, AE6, AH7, AA11, AB1 e AA4 foram os mais reativos. Todos os quatorze MAbs foram isotipados e apresentaram um perfil com simultânea expressão tanto de IgM quantode IgG2a. Este perfil não-usual foi confirmado pela reação em cadeia da polimerase precedida da transcrição reversa específica para IgG e IgM. Somente um MAb denominado AG8 reagiu em Western-blotcom a isoforma monomérica de 18 KDa do IFN-β. Este estudo representou o primeiro passo em direção ao propósito de obtenção do ELISA descrito acima. / Beta interferon (IFN-β) is a globular protein consisting of five α-helical chains. As biopharmaceutical product it is mainly used for treatment of multiple sclerosis (MS). MS is a health disorder with no cure available so far. Its symptoms can be alleviated with immunomodulatory drugs. IFN-βis the most well characterized biopharmaceutical product in terms of structure and side affects. Two forms of human recombinant IFN-βare used in the treatment of MS: IFN-β-1a, expressed in Chinese hamster ovary cells, is similar to native IFN-β; and IFN-β-1b expressed in the Escherichia coli expression system. IFN-β-1b does not present glycosilation and therefore differs from native IFN-β. Tests to detect and to quantify IFNs are mainly enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). These tests are reliable and can be used in biopharmaceutical product development processes. Monitoring and quality control of IFN-βare quite important, mainly because of the physical and chemical nature of IFN-βas well the necessary sensitivity and specificity that allow for a precise characterization of the final product. Monoclonal antibodies (MAbs) used in ELISA to detect and quantify IFN-βusually present high affinity and specificity. In this study, fourteen MAbs against human recombinant IFN-βwere obtained by genetic immunization and partially characterized. All antibodies recognized human IFN-β. The anti-IFN-βMAbs AE9, AG8, AE6, AH7, AA11, AB1 and AA4 were the most reactives. All fourteen MAbs were subjected to antibody isotype characterization and presented a simultaneous expression of both IgM and IgG2a. Thisunusual profile was confirmed by specific reverse transcription polymerase chain reaction for IgG and IgM messenger RNA. Only MAb AG8 recognized the 18 KDa isoform of IFN-β. This study represents the first step towards the development of the ELISA described above.

A doença de Crohn é uma inflamação crônica do trato gastrointestinal. O tratamento convencional é muitas vezes desapontador. Apesar da variedade de drogas disponíveis para o tratamento da doença inflamatória intestinal, tais como: salicilatos e seus derivados, corticosteróides, antibióticos e imunossupressores, nenhuma destas mostrou ser totalmente eficaz ou definitiva para o tratamento da doença e seus surtos de exacerbação. Pesquisas têm sido desenvolvidas com o objetivo de apresentar drogas mais efetivas. Dentre estas, destacam-se as drogas biológicas. O infliximabe é um anticorpo monoclonal quimérico anti-fator de necrose tumoral alfa e está indicado na doença de Crohn refratária e fistulizante. O objetivo deste estudo visa avaliar prospectivamente os resultados e efeitos colaterais precoces e tardios do uso do anti-TNF alfa no tratamento de 60 doentes com doença de Crohn, no período de julho de 1999 a dezembro de 2005. Os doentes foram tratados com anti-TNF alfa (infliximabe), na dose de 5mg/kg de peso, aplicado por via endovenosa em intervalos de dois meses. A avaliação foi realizada por protocolo clínico que classificava os quesitos: estado geral, sintomas intestinais e doença perianal em melhor, inalterado e pior, e pelo índice de atividade da doença de Cronh. Os doentes tratados com anti-TNF alfa apresentaram mediana de duração da doença de sete anos, variando de um a 28 anos entre a data do início dos sintomas e a data de início da pesquisa. 34 doentes (56,7%) já haviam sido submetidos a uma ou mais operações abdominais e 38 (63,3%) a operações orificiais. O software utilizado para a realização dos cálculos foi o SPSS® 9.0 for Windows, sendo estatisticamente significantes os testes com p<0,05. Foram aplicadas 225 doses de anti-TNF alfa, em média, 3,7 doses por paciente num período de aproximadamente cinco anos, variando de uma a 14 doses. No tratamento inicial 76% dos pacientes responderam a droga. As principais indicações para o emprego do anti-TNF alfa foram a presença de doença perianal em 36 casos (60%) e a intratabilidade clínica em 24 casos (40%). Observou-se que após a primeira dose da medicação, os doentes com mais de dez anos de doença e submetidos à operação abdominal tiveram resultado satisfatório semelhantemente aqueles doentes com menos de cinco anos de doença e não operados com p<0,05. O índice de atividade da doença de Crohn foi em média de 189,7 antes do início do tratamento e na primeira aplicação diminuiu em média para 135,4, e progressivamente ao longo das aplicações (115, 102, 109 e 88,4 até a quinta dose), sendo o resultado estatisticamente significativo. Houve efeito colateral em 40 aplicações (17,8%), sendo os efeitos principais: eritema cutâneo, dispnéia e dor abdominal. O tratamento com anti-fator de necrose tumoral alfa, obedecidas as indicações precisas, associou-se a baixo índice de efeitos colaterais graves tendo apresentado bons resultados na resolução da doença de Crohn perianal, na melhora da sintomatologia intestinal e no estado geral dos pacientes / Crohn´s disease is a chronic inflammatory disorder of the gastrointestinal tract. Conventional treatment is many times disappointing. Besides the great number of available medications to treat inflammatory bowel diseases, such as salicilates and derivatives, corticosteroids, antibiotics and immunosuppressive agents, none of them proved to be totally efficient or the ultimate treatment for inflammatory diseases and their exacerbation. Researches have been carried out to find more effective therapeutic drugs. Among these therapeutics, biologic treatments have been in evidence. Infliximab is a chimeric IgG1 monoclonal antibody against tumor necrosis factor-alpha, and is indicated for refractory luminal and fistulizing Crohns disease. The aim of this study is to prospectively evaluate the outcome, early and late adverse events, in 60 patients diagnosed with Crohn´s disease and treated with infliximab between July 1999 and December 2005. All patients were treated with anti-TNF-alpha (infliximab), 5mg/kg/dose, intravenously, each two months. Patients were clinically evaluated using a protocol that classified the evolution of the health status, intestinal symptoms and perianal disease, as better, worse or unchanged, during the treatment. Crohn´s disease activity index was also evaluated. Patients treated with anti-TNF-alpha presented a median disease duration of seven (range 1-28) years, between the beginning of the disease symptoms and the beginning of the research protocol. Thirty-four patients (56.7%) have been submitted to one or more abdominal surgeries before, and 38 (63.3%) to anal-rectum surgeries. All statistics tests were performed with computer software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS® 9.0) for WindowsTM, and p values of less than 0.05 were considered statistically significant. Totals of 225 anti-TNF-alpha doses were administered. The mean doses administered per patient, in a period of approximately five years, were 3.7 (range 1-14) doses. After the initial treatment, 76% of the patients achieved a response. The most frequent indications for anti-TNF-alpha was perianal disease, occurring in 36 patients (60%), and clinical failure to the conventional treatment, happening in 24 patients (40%). After the first dose of anti-TNF-alpha, patients with more than 10 years of treatment and previously submitted to abdominal surgery presented a satisfactory outcome, similar to those with less than 5 years of disease and not submitted to surgery, p<0.05. Crohn´s disease activity index showed a mean index of 189.7 before treatment, that decreased to 135.4 after the first dose, and progressively decreased with the subsequent doses (means: 115, 102, 109 and 88.4, until the fifth dose, p<0.05). Adverse events were reported in 40 administrations (17,8%) from the total. The most prevalent adverse events were: rash, dyspnoea and abdominal pain. The treatment with anti-TNF-alpha, following precise indications, was associated with a low incidence of severe adverse events and presented good outcomes in the resolution of perianal Crohn´s disease, improving intestinal symptomatology and patients´ health status

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