Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 11096.pdf: 7071913 bytes, checksum: f0395995edaa69e463b5e5407a40c10c (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:53:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 11920.pdf: 5864547 bytes, checksum: 5ef2e00923af82aba8772a4858fa873e (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:37:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:03:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 05175.pdf: 2805276 bytes, checksum: 2afc72fc3d3ca38375a373de3e5aa8cb (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:33:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:03:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Linfomas são cânceres provenientes da transformação de um linfócito no sistema linfático, sendo que, o mais comum é o Linfoma Não-Hodgkin (LNH). Avanços na imunologia e na biologia molecular têm auxiliado na detecção desses tumores e aberto caminhos para novas estratégias de tratamento, como a Radioimunoterapia. O rituximab é um anticorpo monoclonal quimérico anti-CD20 já utilizado como imunoterápico no tratamento de LNH refratários ou recidivos. O objetivo deste trabalho foi estudar a conjugação deste anticorpo ao quelante bifuncional DOTA-NHS-éster e radiomarcar este imunoconjugado com o radioisótopo 177Lu, com o objetivo de desenvolver um radioimunoterápico para tratamento de LNH. Estudos de imunoconjugação com diferentes razões molares rituximab:DOTA foram estudadas (1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:250, 1:500 e 1:1000) afim de avaliar qual condição conferia maior pureza radioquímica. A estabilidade dos imuconjugados foi analisada por cromatografia de alta eficiência por até 240 dias em diferentes condições de armazenamento. A estabilidade do imuconjugado radiomarcado foi avaliada após incubação a 2-8 °C e em soro humano a 37 °C e a ligação às proteínas séricas foi determinada. Estudos de biodistribuição foram realizados em camundongos Swiss sadios a fim de caracterizar biologicamente o imunoconjugado radiomarcado. Com o objetivo de analisar se os processos de conjugação e de radiomarcação não danificaram a capacidade de reconhecimento do antígeno (imunorreatividade) deste anticorpo, realizou-se estudos preliminares de ligação às células de LNH (Raji). Os imuconjugados de razão molar baixa (1:5, 1:10 e 1:20) mostraram-se estáveis quando armazenados por até 240 dias em diferentes condições. A análise em cromatografia em camada delgada e CLAE, revelou que o Acm conjugado na razão molar 1:50 foi radiomarcado com alta pureza radioquímica (superior a 95%) quando purificado em coluna PD-10. Este mesmo radioimunoconjugado apresentou razoável estabilidade a 2-8° C. A análise da estabilidade em soro humano não indicou grande metabolismo pelas enzimas do soro. O radioimuconjugado apresentou alta ligação às proteínas séricas indicando clareamento sanguíneo lento, o qual foi confirmado pelos estudos in vivo. O radioimunoconjugado apresentou alta captação no fígado o que é característico de anticorpos monoclonais. Os estudos preliminares de competição indicaram que o processo de obtenção do radioimunoconjugado não prejudicou sua ligação às células Raji sendo esta ligação específica. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A Medicina Nuclear é uma modalidade de particular importância em oncologia e a investigação de novos radiofármacos direcionados a tumores, seja para diagnóstico e/ou terapia, é uma área de interesse para os pesquisadores. Rituximab (RTX) é um anticorpo monoclonal (AcM) quimérico (IgG 1) que se liga especificamente ao antígeno CD20 com alta afinidade e tem sido usado com sucesso para tratar Linfoma Não-Hodgkin (LNH) de células-B. O antígeno CD20 é expresso sobre mais de 90% dos LNH de células-B. Tecnécio-99m (99mTc) e rênio-188 (188Re) representam um atrativo par de radionuclídeos para uso médico devido as favoráveis propriedades de decaimento para diagnóstico (99mTc: T1/2 = 6 h, radiação γ = 140 keV) e terapia (188Re: T1/2 = 17 h, radiação máxima = 2,12 MeV) e por causa de sua disponibilidade graças aos sistemas de geradores correspondentes 99Mo/99mTc e 188W/188Re. Estes dois radionuclídeos podem ser conjugados aos anticorpos usando métodos químicos similares. O objetivo geral deste trabalho foi estudar a marcação do AcM anti-CD20 (Rituximab) com o radioisótopo 188Re usando duas técnicas: método direto de marcação [188Re(V)] e método de marcação via núcleo carbonila [188Re(I)]. Além do controle de qualidade, o anticorpo radiomarcado foi submetido a estudo biológico in vivo, in vitro e ex vivo. Para a marcação direta, o RTX foi reduzido pela incubação com o agente redutor 2-mercaptoetanol para a geração de grupos sulfidrilas (-SH) e posteriormente marcado com 188Re(V), fazendo-se um amplo estudo de variáveis para se chegar a uma formulação otimizada. Para a marcação usando o núcleo carbonila foram usados os radioisótopos 99mTc e 188Re e dois procedimentos de radiomarcação: (1) RTX nativo marcado com 99mTc(I) e (2) RTX reduzido (RTXred) marcado com 99mTc(I)/188Re(I). Também foi feito um estudo de variáveis para se chegar a formulação otimizada. O método de controle de qualidade para avaliação da pureza radioquímica mostrou um bom rendimento de marcação (93%) para o método direto. Na marcação com o núcleo carbonila, os resultados mostraram que os grupos -SH do anticorpo reduzido são uma possível via de ligação. A formação do composto 99mTc(I)-RTXred foi mais rápida do que 188Re(I)- RTXred, que por sua vez mostrou melhor estabilidade em plasma humano e nenhuma transquelação no desafio a histidina ou cisteína. Os dois compostos mostraram boa afinidade de ligação e uma biodistribuição em camundongos portadores de tumor coerente com a biodistribuição normal do anticorpo e razoável captação no tumor provando a eficiência do método de marcação e potencial uso clínico. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

A imunodeficiência comum variável (CVID) é caracterizada por hipogamaglobulinemia. Anteriormente identificou-se uma paciente com CVID que apresenta nível aumentado de estresse de retículo endoplasmático (ER), secundário a desregulação da via UPR. No presente trabalho, estendemos esta análise para outros pacientes e avaliamos o perfil de maturação de seus linfócitos B. Métodos: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Citometria de Fluxo e cultura de células B ex vivo e imortalizadas. Resultados: A análise de 16 pacientes com CVID e 9 indivíduos saudáveis revelou três pacientes com porcentagens aumentadas de linfócitos B imaturos no sangue periférico. A análise da expressão de RNAm para BiP e XBP-1 em linfócitos B destes pacientes, após estímulo com LPS in vitro, identificou que os linfócitos B de um deles apresenta estresse de RE. Conclusão: Identificamos um subgrupo de pacientes com CVID que apresentam linfócitos B imaturos no sangue periférico. Um membro deste subgrupo apresenta estresse aumentado de ER. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is characterized by hypogammaglobulinemia. Previously a CVID patient was identified with increased levels of Endoplasmic Reticulum (ER) stress due to dysregulation of the UPR. In the present study these analyses were performed in other patients and healthy donors. Maturation markers of B lymphocytes were also characterized in these individuals. Methods: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Flow cytometry and culturing of ex vivo and immortalized B cells. Results: The analysis of 16 CVID patients and 9 healthy donors revealed three patients that present higher percentage of immature B cells in peripheral blood. Analysis of expression of BiP and XBP1 induced by LPS treatment of B lymphocytes from these patients revealed that one patient present increased levels of ER stress.

O transplante de órgãos é hoje uma opção de tratamento de várias doenças terminais. Apesar de todos os progressos no campo do transplante, o principal problema enfrentado ainda é a rejeição. As principais moléculas responsáveis pela resposta alogeneica e subsequente rejeição ao enxerto, são os antígenos leucocitários humanos (HLA, do inglês Human Leucocyte Antigens). Porém, existem evidências que anticorpos dirigidos a antígenos não-HLA estão associados com rejeição de transplantes. Neste estudo, foi investigada a presença de anticorpos anti-célula endotelial (AACE) em 11 pacientes que perderam seus rins transplantados devido à rejeição humoral irreversível e em 2 com perda por trombose de veia renal. A ausência de anticorpos anti-HLA contra o doador foi verificada antes do transplante, da rejeição e antes e depois da transplantectomia, através da realização de provas cruzadas usando as técnicas mais sensíveis. Anticorpos não-HLA presentes em nove eluatos reagiram com EAHy.926. Eluatos positivos e negativos contra linhagem EAHy.926 foram testados contra cortes histológicos de 6 rins sadios para detecção de quais estruturas renais são reconhecidas por esses anticorpos. A reação foi avaliada pelo método de imunofluorescência indireta. Dos 13 eluatos testados, 4 (isotipo IgG) e 5 (isotipo IgM) reagiram com forte fluorescência nos glomérulos e endotélio arterial, mas não foi verificada reação na cápsula de Bowman e no epitélio tubular. Não foi observado polimorfismo na reatividade dos eluatos. Em onclusão, verificamos que os anticorpos não-HLA têm um importante papel na rejeição humoral. Estes estão reconhecendo antígenos de um sistema provavelmente não-polimórfico nas células de endoteliais presentes, principalmente, nos capilares glomerulares. / The transplant of organs is today an option of treatment to several terminal diseases. In spite of all the progress in the field of the transplants, the rejection remains a problem to be solved. The main target molecules for the allogenic response and subsequent allograft rejection are the human leukocyte antigens (HLA). However, there are growing evidences that non-HLA antibodies are associated with transplant rejection. In this study it was investigated the presence of anti-endothelial cell antibodies (AECA) in 11 patients who had early lost their transplanted kidney by irreversible humoral rejection and in 2 ones from renal venal thrombosis. The absence of anti-HLA antibodies against the donor was verified by the negativity of crossmatches performed using the most sensitive assays, at the transplant, at the rejection, and before and after the transplantectomy Antibodies from 9 eluates bound to EAHy.926. Positive and negatives eluates were tested against frozen sections from 6 normal kidneys in order to define the structures to which they were reactive. The reactivity was identified by indirect immunofluorescence method. From 13 eluates evaluated, 4 (isotipe IgG) and 5 (isotipe IgM) reacted to the glomerulus and renal arterial endothelium with intense fluorescence but they did not react to the Bowmans capsule and tubular epithelium. No polymorphism was observed in eluates reactivity. In conclusion, we have shown that non-HLA antibodies may represent a cause of the humoral rejection. These antibodies are probably recognizing antigens of a nonpolymorphic system in endothelial cells present, mainly, in the glomerular capillaries.

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T13:28:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_Marcelode_M.pdf: 3101951 bytes, checksum: d4351a3ac8b227a606a71136547a3073 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Envenenamentos causados por picadas de serpentes peçonhentas, resultam em graves efeitos biológicos devido à complexidade das peçonhas, condições da vítima, fatores genéticos, entre outros. O tratamento mais eficaz em acidentes ofídicos se faz com uso da soroterapia, embora possa ocorrer reações de hipersensibilidade. A Bothrops lanceolatus endêmica da Ilha da Martinica no Caribe, possui atividades biológicas que se assemelham as das Bothrops brasileiras. Camundongos previamente tratados com 4,8µg/g da peçonha da Bothrops lanceolatus e após 72 horas imunizados com eritrócitos de carneiro (EC) apresentaram uma inibição na produção de anticorpos anti-EC, tanto na resposta primária, quanto na secundária (P<0,05). Esse resultado foi observado com a fração I (2,4µg/g) (P<0,05), obtida por cromatografia de exclusão em Sephadex G-100. Já a fração II (FII) (2,4µg/g) não apresentou essa inibição (P>0,05). Coelhos imunizados com 1mg da FII em adjuvante de Freund, produziram um imunesoro (Anti-FII) mais reativo ao veneno da Bothrops lanceolatus que o imunesoro comercial (Anti-BL) produzido em eqüinos demonstrado através de testes de Imunodifusão e ELISA. Ambos imunesoros neutralizaram as atividades hemorrágica, hemolítica, caseinolítica, esterásica e coagulante da peçonha da Bothrops lanceolatus. O Anti-FII foi mais eficiente em neutralizar as atividades hemolítica e caseinolítica e o Anti-BL, as atividades hemorrágica e coagulante. A esterásica foi igualmente neutralizada por ambos. Nossos resultados indicam que através da seleção do imunógeno, consegue-se produzir imunesoros mais potentes para neutralizarem os efeitos fisiopatológicos observados nos envenenamentos ofídicos. / Abstract: Poisonings caused by venom snakes bitten resulte in serious biological efects due to several factors, such as: the complexity of ofidic poison, victim conditions, genetic factors, and others. The most efficacious treatment of these ofidic accidents is made by serum therapy that may cause hypersensibility reactions. Endemic Bothrops lanceolatus (BL) from the Caribbean Island Martinica has some biological activities similar to the brazilian Bothrops. Mice previous treated with 4.8µg/g Bothrops lanceolatus poison and after 72 hours immunized with sheep erythrocytes (SE) showed inhibition in the production of antibodies Anti-SE in primary and secondary response (P<0.05). This effect was also noticed with the fraction I (2.4µg/g) (P<0.05) obtained by Sephadex G-100 exclusion chromatography. The fraction II (FII) (2.4µg/g) of Bothrops lanceolatus, which did not present significant inhibition of immune response (P>0.05), was used as antigen (in immunization). Rabbit's immunized with 1mg the fraction II in adjuvant of Freund produced immuneserum (Anti-FII) more reactive for Bothrops lanceolatus venom than the commercial (Anti-BL) one produced in equines demonstrated by tests of immunodifusion and ELISA. Both immuneserums neutralized the hemorrhagic, hemolytic, caseinolytic, esterolytic and coagulation activities of the Bothrops lanceolatus poison. The Anti-FII was more efficient in neutralization of hemolytic and caseinolytic activities and Anti-BL hemorrhagic and coagulation activities. The esterolytic activity was equaly neutralized in both immuneserums. Our results suggest that through the selection of antigen (immunogenic) it is possible to produce more potent immuneserum to neutralize the physiopathological effects observed in the ophidians poisonings. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

A lipoproteína de baixa densidade eletronegativa (LDL-) é um importante antígeno envolvido na patogênese da aterosclerose. A LDL(-) provoca resposta inflamatória e imunológica, levando à produção de autoanticorpos anti-LDL(-) e a formação subsequente de imunocomplexos (IC-LDL-), os quais também contribuem com o processo aterosclerótico. Diante disso, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de imunoensaios para quantificação plasmática de LDL(-), anti-LDL(-) e IC-LDL(-), assim como o desenvolvimento de ferramentas aplicáveis em um biossensor para LDL(-). Após a padronização de cada ELISA, foram avaliadas as características de desempenho dos métodos: limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), precisão intra e inter-ensaios, exatidão, linearidade de diluição e interferentes. Os LD e LQ do ELISA para LDL(-) foram 0,423 mg/L e 0,517 mg/L de LDL(-), respectivamente. As concentrações plasmáticas de LDL(-) apresentaram linearidade quando os plasmas foram diluídos 1:1000, 1:2000, 1:4000 e 1:8000. Os LD e LQ do ELISA para anti-LDL(-) foram 0,0028 mg/L e 0,0032 mg/L de anti-LDL(-), respectivamente. Os plasmas apresentaram linearidade na diluição quando diluídos 1:100, 1:200, 1:400 e 1:800. Os LD e LQ do ELISA para IC-LDL(-) foram 0,023 g/L e 0,034 g/L de IC-LDL(-), respectivamente. Os plasmas apresentaram linearidade quando diluídos 1:12,5, 1:25, 1:50 e 1:100. Os três ELISAs apresentaram precisão intra e inter-ensaios e recuperação dentro dos limites requeridos para imunoensaios. Para o desenvolvimento de um biossensor para LDL(-), uma proteína recombinante, denominada GFP5-scFv, foi expressa em bactérias Escherichia coli da linhagem BL21(DE3). Para obtenção dessa proteína foi realizada a inserção da sequência de DNA de um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LDL(-) em um vetor bacteriano com a sequência de DNA da proteína verde fluorescente (GFP5). Dessa forma, a GFP5-scFv é fluorescente e tem afinidade pela LDL(-). Também foram sintetizadas nanopartículas de ouro, as quais podem ser eficientemente utilizadas na supressão da emissão da fluorescência de GFP5-scFv. Portanto, os imunoensaios validados e os aplicativos desenvolvidos para o biossensor são ferramentas que tem potencial para serem utilizadas na avaliação da patogênese da aterosclerose. / The electronegative low-density lipoprotein (LDL) is an important antigen involved in the pathogenesis of atherosclerosis. The LDL(-) causes inflammatory and immune response, leading to production of autoantibodies anti-LDL(-) and the subsequent formation of immune complexes (IC-LDL), which also contribute to the atherosclerotic process. Thus, this study aimed to develop and validate immunoassays for quantification of plasma LDL(-), anti-LDL(-) and LDL-IC(-) as well as developing tools applicable to a biosensor for LDL(-). After the standardization of each ELISA, were evaluated the performance characteristics of methods: limits of detection (LD) and quantification (LQ), intra- and inter-assays precision, accuracy, linearity of dilution and interferences. The LD and LQ of LDL(-) ELISA were 0.423 mg/L and 0.517 mg/L of LDL(-), respectively. Plasmas showed linearity when diluted 1:1000, 1:2000, 1:4000 and 1:8000. The LD and LQ of anti-LDL(-) ELISA were 0.0028 mg/L and 0.0032 mg/L of anti-LDL(-), respectively. Plasmas showed linearity when diluted 1:100, 1:200, 1:400 and 1:800. The LD and LQ of IC-LDL(-) ELISA were 0.023 g/L and 0.034 g/L of LDL-IC(-), respectively. Plasma showed linearity when diluted 1:12.5, 1:25, 1:50 and 1:100. The three ELISAs showed good intra- and inter-assays precision and recovery within the limits required for immunoassays. To develop a biosensor for LDL(-), a recombinant protein, called GFP5-scFv was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) strain. The obtainment of this protein was performed inserting the DNA sequence of an anti-LDL(-) single chain variable fragment (scFv) in a bacterial vector with a DNA sequence of green fluorescent protein (GFP5). Thus, the scFv-GFP5 is fluorescent and has affinity for LDL(-). Were also synthesized gold nanoparticles, which can be efficiently used for quenching the fluorescence emission of GFP5-scFv. Therefore, immunoassays validated and developed applications for the biosensor are tools that have potential to be used in evaluating the pathogenesis of atherosclerosis.

This study was carried out to determine the phenotype of special dog mammary gland tumours that were grown in nude mice. 26 tumours were examined by the immunohistochemical ABC-Elite protocol. The tumour tissues were labelled with following anti-human antibodies: - AE1/AE3 (pankeratin antibody) labelled epithelial and myoepithelial cells - CD 31 labelled endothelial cells - desmin labelled cross-striated and smooth muscle cells - myosin labelled cross striated muscle cells - neurofilament (NF) labelled nerve cells - osteopontin labelled preosteoblasts, osteoblasts and osteocytes - p63 labelled nuclei of the myoepithelial cells - smooth muscle actin (SMA) labelled the cytoplasm of myoepithelial cells - type I collagen labelled the extracellular matrix in connective tissue and bone - type II collagen labelled the extracellular matrix in cartilage - vimentin labelled fibroblasts, fibrocytes, lipocytes, smooth muscle cells, endothelial cells, nerve cells, macrophages and myoepithelial cells The tumours were also submitted to a double immunolabelling study using p63 and SMA. The study could not give a final conclusion about the origin the tumours. There was still need for more research to answer that question. However, the immunohistochemical technique was analysed in detail, in order to obtain perfect labelings. Initially, all the antibodies were tested on normal dog tissue, to acquire the best working dilutions with the lowest background problems. In the tumours, good results were obtained with these dilutions for the antibodies p63, SMA, vimentin, desmin, NF, AE1/AE3 and CD 31. Except for type I collagen, type II collagen and osteopontin that gave too much unspecific labelling of the mouse connective tissue. Even, when using the Vector® M.O.M. blocking kit, the results were still very difficult to interpretate. The antigen retrieval methods were evaluated for all the antibodies. The antibodies p63, SMA, vimentin, desmin, AE1/AE3, myosin, neurofilament and CD 31 needed the antigen retrieval treatment. The antibodies type I collagen and type II collagen needed the treatment with the enzyme pepsin, while osteopontin did not need any pretreatment at all. The double immunolabelling with p63 and SMA gave excellent results. Different combinations were tried out with different substrates, namely Vector® Nova RED, Vector® DAB and Vector® SG. Vector® methyl green was used as counterstaining, but it interfered with the other substrates, and better results were obtained without this counterstaining.