The diversity of virus-specific antibodies and of B cells among different individuals is unknown. Using single-cell cloning of antibody genes, we generated recombinant human monoclonal antibodies from influenza nucleoprotein-specific memory B cells in four adult humans with and without preceding influenza vaccination. We examined the diversity of the antibody repertoires and found that NP-specific B cells used numerous immunoglobulin genes. The heavy chains (HCs) originated from 26 and the kappa light chains (LCs) from 19 different germ line genes. Matching HC and LC chains gave rise to 43 genetically distinct antibodies that bound influenza NP. The median lengths of the CDR3 of the HC, kappa and lambda LC were 14, 9 and 11 amino acids, respectively. We identified changes at 13.6% of the amino acid positions in the V gene of the antibody heavy chain, at 8.4 % in the kappa and at 10.6 % in the lambda V gene. We identified somatic insertions or deletions in 8.1% of the variable genes. We also found several small groups of clonal relatives that were highly diversified. Our findings demonstrate broadly diverse memory B cell repertoires for the influenza nucleoprotein. We found extensive variation within individuals with a high number of point mutations, insertions, and deletions, and extensive clonal diversification. Thus, structurally conserved proteins can elicit broadly diverse and highly mutated B-cell responses.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der antigenen Eigenschaften aktueller Isolate (PPV-143a und PPV-27a) des porzinen Parvovirus (PPV). Des Weiteren sollten die Virulenzeigenschaften dieser Isolate sowie zweier Virusstämme (PPV-NADL-2 und PPV-IDT [Master Seed Virus]), die zur Produktion von inaktivierten Vollvirus-Vakzinen genutzt werden, bestimmt werden. In der in vitro-Studie wurden die untersuchten PPV-Isolate sowie ein weiteres Isolat (PPV-Challenge [Engl.]) zur Herstellung von Hyperimmunseren im Kaninchen und - nach experimenteller Infektion von Sauen (s.u.) – zur Herstellung von Postinfektionsseren genutzt. Die Seren wurden im Neutralisationstest gegen die verschiedenen Isolate geprüft und eine Kreuzneutralisation bewertet. Das Serum-IDT (MSV) zeigte generell eine begrenzte Neutralisation gegen die heterologen PPV-Isolate. Des Weiteren ergab die Untersuchung, dass alle Seren gegen das Isolat PPV-27a als Testvirus einen geringeren Neutralisationstiter aufwiesen als gegen die anderen Isolate. Interessanterweise wurde PPV-27a durch homologe Antiseren deutlich schlechter neutralisiert als alle anderen getestete Viren. Dieser offensichtliche „Immune Escape“ wurde bei den Seren aller beiden Kaninchen und aller drei Sauen gesehen. Die experimentellen Infektionen erfolgten bei 12 tragenden Jungsauen am 40. Trächtigkeitstag (3 Tiere pro Isolat PPV-143a, PPV-27a, PPV-NADL-2, PPV-IDT [MSV]). Es konnten neben dem Serum der infizierten Sauen fetale Gewebeproben von Lunge und Niere sowie Nabelvenenblut von insgesamt 157 Feten aus diesen Trächtigkeiten untersucht werden. Zur Antikörperbestimmung wurde der HAH-Test angewendet. Spezifische Antikörper konnten bei den Feten jeder Infektionsgruppe (PPV-143a, PPV-27a, PPV-IDT [MSV]) und PPV-NADL-2) detektiert werden. Somit konnte eine transplazentare Übertragung für alle PPV-Isolate gezeigt werden. Der Antigennachweis erfolgte durch Untersuchung der Hämagglutination aus dem Gewebe beziehungsweise nach Anzucht des Erregers in Zellkultur durch Bewertung des cytopathischen Effekts und Bestätigung durch direkte Immunfluoreszenz. Der Virusnachweis gelang ausschließlich bei den Feten der Gruppe Sauen die mit PPV-27a infiziert wurden. Die fetale Mortalitätsrate der Feten der Infektionsgruppe PPV-27a lag bei 85 % und war signifikant höher im Vergleich zu den anderen Infektionsgruppen (5-18 %). Schlussfolgernd konnte in vivo lediglich für PPV-27a eine Virulenz nachgewiesen werden. In vitro zeigte sich nur für PPV-27a ein differenziertes Kreuzneutralisations-Verhalten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Isolat PPV-27a tasächlich eine neue antigene Variante des porzinen Parvovirus darstellt, gegen die derzeit verfügbare Impfstoffe möglicherweise nur unvollständig schützen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob humane Antikörper gegen ZIKV-Kapsid und ZIKV-Kapsid selbst geeignete Biomarker für den Nachweis einer ZIKV-Infektion sind. Sie kann damit als erste Phase einer Studie zur Entwicklung neuer ZIKV-Diagnostika angesehen werden. Der Aufbau, das klinische Erscheinungsbild, die Epidemiologie und der Nachweis von ZIKV, bzw. einer ZIKV-Infektion, wurden erörtert. Die Möglichkeiten und Limitationen aktueller ZIKV-Diagnostika wurden beschrieben, insbesondere hinsichtlich der Spezifität. Durch Analyse des Genoms von ZIKV und anderen Flaviviren wurde gezeigt, dass die Aminoäuresequenzidentität zwischen den einzelnen Flaviviren für flavivirales Kapsid geringer ist als für andere Bestandteile und potenzielle Antigene von Flaviviren. Relevant ist insbesondere die Abgrenzung zu DENV, da eine akute oder abgelaufene DENV-Infektion eine häufige Ursache von Kreuzreaktivität beim Nachweis einer ZIKV-Infektion darstellt. Mittels webserverbasierten In-silico-Analysen konnten immunogene Regionen innerhalb des ZIKV-Kapsid-Proteins kartiert und mit den immunogenen Regionen, welche für ZIKV-Kapsid anderer Flaviviren In-silico oder experimentell ermittelt wurden, verglichen werden. Auf Basis dieser Analysen war die Erwartung, dass bei einer ZIKV-Infektion humane Antikörper gegen ZIKV-Kapsid gebildet werden, welche sich in ihren Paratopen von Antikörpern, die gegen Kapsid-Proteine anderer Flaviviren gebildet werden, unterscheiden. Der Umfang der humanen Antikörperantwort auf ZIKV-Kapsid wurde in dieser Arbeit anschließend untersucht. Dazu wurde das Antigen ZIKV-Kapsid eines ZIKV-Stamms aus der afrikanischen Linie (hier: Stamm MR766) rekombinant hergestellt. Rekombinantes ZIKV-Kapsid eines Stammes der asiatischen Linie (hier: Stamm Z1106033) wurde erworben. In 11 humanen Seren und einem Pool-Serum (WHO-Referenzserum) wurde versucht Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper mittels ELISAs und Western Blots nachzuweisen. Es fanden sich keine bis schwache Hinweise auf das Vorhandensein von Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörpern in diesen Seren. Im direkten Vergleich mit 10 Seren von ZIKV-negativen Blutspendern zeigten sich für die Seren des ZIKV-Serumpanels keine höheren ELISA-Extinktionswerte. Dies galt sowohl für den Einsatz von ZIKV-Kapsid des Stammes der afrikanischen Linie als auch beim Einsatz von ZIKV-Kapsid des Stammes der asiatischen Linie. Im Sinn der Ermittlung der Paralleltestreliabilität fand sich für Anti-ZIKV-Kapsid-IgG in einer Regressionsanalyse ein schwacher linearer Zusammenhang zu Messwerten eines gut validierten Referenztests, dem ZIKV-NS1-ELISA der Firma Euroimmun. Dies ist ein schwacher Hinweis auf die postinfektiöse Bildung von humanen Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörpern. Obwohl der lineare Zusammenhang signifikant war, ist die Aussagekraft dieses Ergebnisses eingeschränkt. Es fanden sich Hinweise auf unspezifische, im Rahmen dieser Arbeit nicht vollständig identifizierte, Einflüsse auf die Testergebnisse der eigenen Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper-ELISAs. Es ist vorstellbar, dass der gefundene lineare Zusammenhang zum Referenztest teilweise durch diese unspezifischen Einflüsse, im Sinn von Kovariablen, verursacht wird. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper-ELISAs zeigten Hinweise für falsch-positive Messergebnisse bei der Testung von fünf DENV-positiven Seren. Mit Hilfe von Western Blots, welche verglichen mit ELISAs als spezifischer gelten, konnten in Seren des ZIKV-Serumpanels keine ZIKV-Kapsid-spezifischen Antikörper nachgewiesen werden. Auch Antikörper aus Seren von ZIKV-negativen Blutspendern und IgG-Antikörper aus gereinigten IgG-Antikörper-Lösungen verursachten positive und somit unspezifische Testergebnisse (Banden). Eine mögliche Erklärung dafür liegt in der hohen Hydrophobizität von ZIKV-Kapsid, was für die Anlagerung nichtspezifischer humaner Antikörper sorgen könnte. Es ist möglich diese Arbeit in zwei Teile zu unterteilen, wobei sich der erste Teil vor allem dem Nachweis von humanen Antikörpern gegen ZIKV-Kapsid widmet und der Nachweis von ZIKV-Kapsid in Serum von Infizierten den zweiten Teil darstellt. Für den Nachweis des Antigens wurden polyklonale und monoklonale Antikörper eingesetzt. Durch Immunisierung von Mäusen mit ZIKV-Kapsid und anschließendem Einsatz der Hybridomtechnik konnten durch Dr. Sven Reiche (Friedrich-Löffler-Institut) und Prof. Christian Jassoy vier monoklonale Antikörper gegen ZIKV-Kapsid gewonnen werden. Diese Antikörper wurden in dieser Arbeit weiter charakterisiert. Sie zeigten sich als geeignet und spezifisch beim Nachweis von ZIKV-infizierten Vero-Zellen durch Immunfluoreszenzfärbungen. Durch Kompetitionstests hatte sich zuvor bereits gezeigt, dass alle Antikörper an dasselbe, oder mindestens nahe beieinander liegende Epitope binden. Da sie sich somit bei Einsatz in einem Sandwich-ELISA zum Nachweis von ZIKV-Kapsid als Antigen verdrängen würden, wurden zwei polyklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper erworben. Ein Sandwich-ELISA, der polyklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper als Fängerantikörper und monoklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper als Detektionsantikörper nutzt, konnte erfolgreich zum Nachweis von ZIKV-Kapsid in verschiedenen Lösungen, u. a. nativem ZIKV-Kapsid in Zellkulturüberstand, eingesetzt werden. Der so aufgebaute Antigen-ELISA erreichte, abhängig von der Kombination an Antikörper und Antigen, eine untere Nachweisgrenze zwischen 2 bis 345 ng/ml. Um zum Nachweis von ZIKV-Kapsid in humanem Serum eines ZIKV-infizierten Patienten eingesetzt werden zu können, müsste seine Sensitivität um etwa zwei bis drei Logstufen steigen. Möglichkeiten dazu wurden diskutiert.:1 Inhaltsverzeichnis 2 2 Abkürzungsverzeichnis 7 3 Einführung 10 4 Aufgabenstellung 47 5 Materialien und Methoden 49 6 Ergebnisse 97 7 Diskussion 131 8 Zusammenfassung 156 9 Literaturverzeichnis 158 10 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 182 11 Anlagen 187

Chlamydien haben ein breites Wirtsspektrum und können vielfältige Krankheitssymptome hervorrufen. Obwohl übereinstimmend angenommen wird, dass Chlamydien Fruchtbarkeitsstörungen bei der Sau verursachen, sind zahlreiche Fragen ungeklärt. So ist bisher unbekannt, ob Chlamydien die Eileiter des Schweines besiedeln und krankhafte Veränderungen hervorrufen können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Eileiter reproduktionsgestörter Sauen auf Chlamydien zu untersuchen und deren mögliche Bedeutung als Infertilitätsursache zu eruieren. Zeitgleich wurden auch Uteri beprobt und diversen differenzialdiagnostisch relevanten Analysen unterzogen. Letztlich sollte durch die Bestimmung von Zearalenon in der Galle das differenzialdiagnostische Spektrum vervollständigt werden. Insgesamt wurden die Genitalorgane von 42 reproduktionsgestörten Sauen (Jungsauen: n=14; Altsauen: n=28; wiederholte Umrausche) aus drei Betrieben auf Chlamydien untersucht. Bei 20 Sauen (Gruppe 1) wurden ein Eileiter und der Uterus, bei weiteren 22 Sauen (Gruppe 2) Ampulle, Isthmus und uterotubale Verbindung beider Eileiter und der Uterus untersucht. Genitalien acht tragender Sauen dienten als Kontrollen. Zum Nachweis von Chlamydien kamen ein kommerzieller IFT (Chlamydia Direct IF Identification) und eine nested PCR (Nachweis des MOMP) mit anschließender Sequenzierung positiver PCR-Produkte zur Anwendung. Eileiter bzw. Eileitersegmente und Uteri wurden histologisch, Uteri fortpflanzungsgestörter Sauen zudem bakteriologisch untersucht. Bei 27 Sauen erfolgte eine Bestimmung von Gesamt-Zearalenon mittels HPLC in der Gallenflüssigkeit. Die IFT- und PCR-Ergebnisse differierten erheblich. Mit dem IFT wurden wesentlich mehr positive Ergebnisse als mit der PCR generiert. Bei 30 (60 %) der insgesamt 50 untersuchten Sauen wurden Chlamydien mittels PCR nachgewiesen. In Gruppe I waren 6 (30 %) der Uteri und 7 (35 %) der Eileiter Chlamydia-positiv, während in der Gruppe II 8 (36,4 %) der Uteri und 12 (54,5 %) der Eileiter als positiv befundet wurden. Tragende Tiere wiesen jeweils 3 (37,5 %) Chlamydia-positive Uteri und Eileiter auf. Nur in einem Fall (12,8 %) konnten Chlamydien ausschließlich im Eileiter detektiert werden. Chlamydien wurden uni- oder bilateral in einem oder mehreren Eileitersegmenten ohne oder mit zeitgleicher Besiedlung des Uterus nachgewiesen. Insgesamt wurden 41 spezifische PCR-Amplifikate aus Eileitersegmenten und Uteri von 26 reproduktionsgestörten Tieren der Gruppen I und II und 4 trächtigen Sauen sequenziert. Am häufigsten wurden Chlamydophila psittaci (n = 24) und Chlamydia suis (n = 10) detektiert. Seltener waren Chlamydophila abortus (n = 4) und Chlamydia trachomatis (n = 3) festzustellen. Insgesamt wiesen 34 (89,5 %) von 38 histologisch untersuchten Uteri entzündliche Veränderungen auf, die zu 94,1 % (n=32) chronisch waren. Entzündliche Infiltrationen mit Immunzellen wurden sowohl in Ampullen (47,9 %) als auch Isthmen (22,9 %) der Eileiter beobachtet. Die Uteri enthielten überwiegend zeitgleich mehrerer Bakterien, die als fakultativ bis obligat pathogen zu beurteilen waren. E. coli dominierte (78,0%). 21 (77,8 %) Sauen wiesen ≥ 50 ng/ml Gesamtzearalenon auf und wurden als positiv bewertet. Es bestanden keine Zusammenhänge zwischen den Chlamydienbefunden und Ergebnissen der übrigen Untersuchungen. Es ist zu schlussfolgern, dass Chlamydien unterschiedlichster Spezies Uterus und Eileiter kolonialisieren. Sie sind in der Schweinepopulation vermutlich weit verbreitet. Da auch tragende Sauen Chlamydien im Genitale enthielten, muss eine Infektion nicht zwangsläufig eine In- bzw. Subfertilität verursachen, noch für zu identifizierende Faktoren vermutlich prädisponierend wirken. Chronische Entzündungen der Uteri sind ähnlich häufig wie entzündlich veränderte Eileiter zu beobachten. Eine direkte Assoziation zwischen genitaler Entzündung und Infektion mit Chlamydien war nicht nachweisbar. Entzündungen von Eileiter und Uterus sind als Sterilitätsursache vermutlich bedeutend. Ob Chlamydien strukturelle und/oder funktionelle Eileiter- und Uterusveränderungen verursachen können, bleibt ebenso wie die Risiken für den Menschen abzuklären, die durch potenziell zoonotische Chlamydien wie Chlamydophila abortus entstehen können.

Trotz zahlreicher Fortschritte im Verständnis der Funktionsweise des kostimulatorischen Rezeptors CD28 in Mensch, Maus, Ratte und Makake ist nach wie vor wenig hierüber in Bezug auf das Tiermodell Schwein bekannt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Expression von CD28 in Schweine-T-Zellen sowie die Regulierbarkeit der T-Zellaktivierung durch anti-pCD28 mAb. Die Ergebnisse zeigen, dass hierbei vor allem CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert betrachtet werden müssen. Grundsätzlich unterscheiden sich die beiden T-Zellpopulationen in der CD28 mRNA Expression, im Expressionsverhältnis zwischen CD28 mRNA und Protein, sowie im proliferativen Ansprechen auf anti-pCD28mAb. So reagierten CD4+ im Vergleich zu CD8+ T-Zellen auf die kostimulatorische Inkubation mit anti-pCD28 mAb des Klons 3D11 sensibler. In direkt stimulatorischen Ansätzen zeigte sich, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche anti-pCD28 mAb differentiell angesprochen werden können. Eine superagonistische Funktion konnte für CD4+ T-Zell aktivierende anti-pCD28 mAb in den bisherigen Versuchen noch nicht beobachtet werden. Letzteres ist hierbei vor allem für den Transfer von vielversprechenden Therapiestrategien vom Kleintier- zum Großtiermodell auf dem Weg zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen mit starker proinflammatorischer Aktivität und dem Myokardinfarkt von Bedeutung. / Even though tremendous progress has been made in clarifying the function of the costimulatory receptor CD28 in human, mouse, rat, and macaques, concerning pigs, an important large animal model, only little is still known about CD28 expression and function. Therefore, our work aimed at investigating the function and expression of CD28 in porcine T cells as well as the applicability of anti-pCD28 mAb as a tool to regulate T cell activation, specifically. Our results indicate that the two major T cell groups, CD4+ and CD8+, have to be considered separately. These cell populations differ in their level of pCD28 mRNA expression, their ratio of CD28 mRNA and protein expression as well as their proliferative responsiveness towards anti-pCD28 mAb. In costimulatory assays, CD4+ compared to CD8+ T cells showed higher sensitivity toward low concentrations of the anti-pCD28 mAb 3D11. Additionally, in direct stimulatory assays, CD4+ and CD8+ T cells can be specifically targeted by different anti-pCD28 mAb. With these assays, a superagonistic anti-pCD28 mAb could not been detected so far. With anti-pCD28 superagonist, promising therapeutic strategies developed in rodents could be tested in pigs as a large animal model, representing the next step on the way towards new therapeutic options for autoim-mune diseases, diseases with strong proinflammatory activity and myocardial infarction.

Antikörper, die gegen eine klinisch relevante Gruppe von Rezeptoren innerhalb der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) gerichtet sind, darunter CD40 und CD95 (Fas/Apo-1), benötigen ebenfalls eine Bindung an Fc-Gamma-Rezeptoren (FcγRs), um eine starke agonistische Wirkung zu entfalten. Diese FcγR-Abhängigkeit beruht weitgehend auf der bloßen zellulären Verankerung durch die Fc-Domäne des Antikörpers und benötigt dabei kein FcγR-Signalling. Ziel dieser Doktorarbeit war es, das agonistische Potenzial von αCD40- und αCD95-Antikörpern unabhängig von der Bindung an FcγRs durch die Verankerung an Myelomzellen zu entfalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Antikörpervarianten (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) gegen die TNFRSF-Mitglieder CD40 und CD95 genetisch mit einem einzelkettig kodierten B-Zell-aktivierenden Faktor (scBaff) Trimer als C-terminale myelom-spezifische Verankerungsdomäne fusioniert, welche die Fc-Domäne-vermittelte FcγR-Bindung ersetzt. Diese bispezifischen Antikörper-scBaff-Fusionsproteine wurden in Bindungsstudien und funktionellen Assays mit Tumorzelllinien untersucht, die einen oder mehrere der drei Baff-Rezeptoren exprimieren: BaffR, Transmembran-Aktivator und CAML-Interaktor (TACI) und B-Zell-Reifungsantigen (BCMA). Zelluläre Bindungsstudien zeigten, dass die Bindungseigenschaften der verschiedenen Domänen innerhalb der Antikörper-scBaff-Fusionen gegenüber der Zielantigene vollständig intakt blieben. In Ko-Kulturversuchen von CD40- und CD95-responsiven Zellen mit BaffR-, BCMA- oder TACI-exprimierenden Verankerungszellen zeigten die Antikörper-Fusionsproteine einen starken Agonismus, während in Ko-Kulturen mit Zellen ohne Expression von Baff-interagierenden Rezeptoren nur eine geringe Rezeptorstimulation beobachtet wurde. Die hier vorgestellten αCD40- und αCD95-Antikörper-scBaff-Fusionsproteine zeigen also Myelom-spezifische Aktivität und versprechen im Vergleich zu herkömmlichen CD40- und CD95-Agonisten geringere systemische Nebenwirkungen. / Antibodies that target a clinically relevant group of receptors within the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF), including CD40 and CD95 (Fas/Apo-1), also require binding to Fc gamma receptors (FcγRs) to elicit a strong agonistic activity. This FcγR dependency largely relies on the mere cellular anchoring through the antibody's Fc domain and does not involve the engagement of FcγR signaling. The aim of this doctoral thesis was to elicit agonistic activity from αCD40 and αCD95 antibodies in a myeloma cell anchoring-controlled FcγR-independent manner. For this purpose, various antibody variants (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) against the TNFRSF members CD40 and CD95 were genetically fused to a single-chain-encoded B-cell activating factor (scBaff) trimer as a C-terminal myeloma-specific anchoring domain substituting for Fc domain-mediated FcγR binding. These bispecific antibody-scBaff fusion proteins were evaluated in binding studies and functional assays using tumor cell lines expressing one or more of the three receptors of Baff: BaffR, transmembrane activator and CAML interactor (TACI) and B-cell maturation antigen (BCMA). Cellular binding studies showed that the binding properties of the different domains within the fusion proteins remained fully intact in the antibody-scBaff fusion proteins. In co-culture assays of CD40- and CD95-responsive cells with BaffR, BCMA or TACI expressing anchoring cells, the antibody fusion proteins displayed strong agonism while only minor receptor stimulation was observed in co-cultures with cells without expression of Baff-interacting receptors. Thus, the herein presented αCD40 and αCD95 antibody fusion proteins display myeloma cell-dependent activity and promise reduced systemic side effects compared to conventional CD40 and CD95 agonists.

In this work, bispecific antibodies were produced by coupling TNFR-specific antibodies with checkpoint inhibitors, tested for their functionality and compared with each other. This combination should enable a targeted TNFR activation in tumor tissue, where a high PDL1 expression is frequent and therefore the formation of oligomeric transactivating (TNFSF3-TNFRSF3)2 complexes should only occur there by binding to PDL1-expressing cells. These receptor-ligand complexes are a prerequisite for the agonistic activity of the antibodies. / In dieser Arbeit wurden bispezifische Antikörper durch Kopplung von TNFR-spezifischen Antikörpern mit Checkpoint-Inhibitoren hergestellt, auf ihre Funktionalität getestet und miteinander verglichen. Diese Kombination sollte eine gezielte TNFR-Aktivierung im Tumorgewebe ermöglichen, wo eine hohe PDL1-Expression häufig ist und daher die Bildung oligomerer transaktivierender (TNFSF3-TNFRSF3)2-Komplexe nur dort durch Bindung an PDL1-exprimierende Zellen erfolgen sollte. Diese Rezeptor-Liganden-Komplexe sind eine Voraussetzung für die agonistische Aktivität der Antikörper.

Innerhalb der Juvenilen Idiopathischen Arthritis (JIA) bilden Patienten mit Antinukleären Antikörpern (ANA) Subgruppen-übergreifend eine klinisch homogene Erkrankungsgruppe. Ob diesen klinischen Gemeinsamkeiten jedoch auch eine einheitliche Pathogenese zugrunde liegt, ist bisher unbekannt. Sogenannte periphere T-Helferzellen (TPH) spielen im Kontext zahlreicher Autoimmunerkrankungen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung autoreaktiver B-Zellen. Ziel dieser Arbeit war daher die phänotypische und funktionelle Analyse von PD-1hiCXCR5-CD4+ TPH-Zellen, sowie deren Verteilung in der Synovialflüssigkeit von Patienten unterschiedlicher Subgruppen der JIA. Hierzu wurden Phänotyp und Zytokinprofil von PD-1hiCD4+ T-Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Der funktionelle Einfluss von PD-1hiCD4+ T-Zellen auf die B-Zell-Differenzierung wurde mittels in vitro Kokulturen FACS-sortierter TPH-Zellen der Synovialflüssigkeit untersucht. IL-21- und IL-17-produzierende T-Gedächtniszellen der Synovialflüssigkeit zeigten eine negative Korrelation zueinander. Die IL-21-Produktion ging besonders von PD-1hiCXCR5-HLA-DR+CD4+ T-Zellen aus, welche besonders in den Gelenken ANA-positiver JIA-Patienten akkumulierten. Diese Population zeigte phänotypische Ähnlichkeit mit TPH-Zellen und leistete in vitro effiziente B-Zell-Hilfe zu Plasmazelldifferenzierung und Immunglobulinsekretion, induzierte jedoch zudem einen CD21lo/-CD11c+T-bet+ Phänotyp in B-Zellen. Passend hierzu bestand auch ex vivo eine signifikante Korrelation zwischen TPH und CD21lo/-CD11c+T-bet+ doppelt-negativen B-Zellen (BDN). Es konnte also die Expansion einer spezifischen T-Zellpopulation mit phänotypischen und funktionellen Charakteristika von TPH-Zellen beobachtet und deren funktioneller Zusammenhang mit CD21lo/-CD11c+T-bet+ BDN in der Synovialflüssigkeit von JIA-Patienten aufgezeigt werden. Dies könnte die Autoimmunantwort auf ubiquitäre Autoantigene innerhalb betroffener Gelenke ANA-positiver JIA-Patienten widerspiegeln. / Within Juvenile Idiopathic Arthritis (JIA), patients with antinuclear antibodies (ANA) form a clinically homogeneous group across different subgroups. However, it is currently unknown whether ANA-positive patients also share a common pathogenesis. Peripheral T helper cells (TPH) play a crucial role in the activation of autoreactive B cells in the context of numerous autoimmune diseases. Therefore, the aim of this study was the phenotypic and functional analysis of PD-1hiCXCR5-CD4+ TPH cells, as well as their distribution in the synovial fluid of patients from different JIA subgroups. For this purpose, the phenotype and cytokine profile of PD-1hiCD4+ T cells were analyzed using flow cytometry. The functional influence of PD-1hiCD4+ T cells on B cell differentiation was examined using in vitro co-cultures of FACS-sorted TPH cells from the synovial fluid. IL-21 and IL-17 producing T memory cells in the synovial fluid showed a negative correlation with each other. IL-21 production primarily originated from PD-1hiCXCR5-HLA-DR+CD4+ T cells, which particularly accumulated in the joints of ANA-positive JIA patients. This population exhibited phenotypic similarity to TPH cells and efficiently provided B cell help in in vitro experiments for plasma cell differentiation and immunoglobulin secretion, but also induced a CD21lo/-CD11c+T-bet+ phenotype in B cells. Correspondingly, there was a significant ex vivo correlation between TPH and CD21lo/-CD11c+T-bet+ double-negative B cells (BDN). Thus, an expansion of a specific T cell population with phenotypic and functional characteristics of TPH cells was observed, and their functional association with CD21lo/-CD11c+T-bet+ BDN in the synovial fluid of JIA patients was demonstrated. This could reflect the autoimmune response to ubiquitous autoantigens within the affected joints of ANA-positive JIA patients.

Humane oder humanisierte monoklonale Antikörper haben sich in den letzten zehn Jahren als Arzneimittel etabliert. Sie sind hochspezifisch und zeigen in ihrer Anwendung im Vergleich zu konventionellen Therapeutika viel weniger Nebenwirkungen. In den 80er Jahren gelang es am Pathologischen Institut der Universität Würzburg eine Reihe von humanen Antikörpern aus Patienten zu isolieren, die hochspezifisch mit malignen Zellen reagieren und diese sowohl in vitro als auch im experimentellen Tiermodel selektiv durch Induktion von Apoptose töten. Um die Wirkungsweise von monoklonalen Antikörpern in der Krebstherapie zu erhöhen, werden die meisten in Kombination mit herkömmlichen Methoden, wie Chemotherapie, eingesetzt. Die ideale Therapieform sind hinsichtlich der Nebenwirkungen sog. Cocktails aus verschiedenen monoklonalen Antikörpern. Allerdings sind die Studien hierzu noch wenig fortgeschritten. Das Ziel dieser Arbeit war es, in präklinischen Versuchsreihen den Einsatz verschiedener tumorspezifischer humaner monoklonaler Antikörper als Cocktail und in Kombination mit Chemotherapie zu evaluieren. Hierzu wurden neun Antikörper in 32 verschiedenen Antikörperkombinationen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die in vitro Proliferation einer Pankreaskarzinom-Zellinie untersucht. In Immunfluoreszenz-Aufnahmen ließ sich zeigen, dass kombinierte Antikörper an unterschiedlichen Stellen an der Zelle binden, was eindeutig auf verschiedene Zielstrukturen hinweist. Einige werden dabei endozytiert, während andere auf der Zellmembran bleiben. Interessanterweise ließen sich Kombinationen identifizieren, deren antiproliferative Wirkung sowohl additiv als auch synergistisch ist, das heißt größer als die Summe ihrer Einzelaktivitäten. Wurden Antikörper mit Zytostatika (5-Flurouracil) kombiniert, so ließen sich ebenfalls synergistische Effekte beobachten. In FACS-Analysen zeigt sich ein gesteigertes Bindungsverhalten der Antikörper, wenn die Zellen mit 5-FU vorinkubiert wurden. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die Beobachtung, dass die Wirkung humaner monoklonaler Antikörper in Kombination mit Chemotherapie erhöht werden kann. Für die Zukunft humaner Antikörper als Therapiemittel gegen maligne Erkrankungen mag allerdings noch wichtiger sein, dass Antiköper in Cocktails tatsächlich synergistische Wirkung zeigen können. / Cancer patients receiving antibodies as mono-therapy have benefited from these treatments. However, significant improvements could be made if the antibodies were used in combination with conventional chemotherapy. Having learned from the natural oligoclonal antibody response that cancer patients mount to their own tumours, we suppose that cocktails of monoclonal antibodies could be even more active in treating cancer. We have isolated a series of human monoclonal IgM antibodies from cancer patients, which bind to different tumor-specific surface receptors and induce apoptosis in vitro and in vivo. To study the antibody-mediated effects in cocktails, the antibodies were applied in different combinations to pancreas carcinoma cells and analyzed in cytotoxic assays. Depending on their target, it was found that some combinations showed a significant additive or synergistic killing effect, when compared to mono-therapy. We also investigated a combinatorial treatment with chemotherapy on pancreas and colon cancer cells and found that a pretreatment with 5-FU sensitizes the cancer cells to antibody treatment. Based on our own results and data from other laboratories, it is likely that the next phase of antibody immunotherapy will include cocktails of monoclonal antibodies.

Humane Antikörper sind aufgrund ihrer spezifischen, zielgerichteten Eigenschaften die idealen therapeutischen Waffen unserer modernen Medizin. Schon im ausgehenden letzen Jahrhundert gelang es dem pathologischen Institut der Universität Würzburg einige rein humane monoklonale Antikörper aus Geweben sowohl gesunder, als auch an einem Tumorleiden erkrankter Patienten zu isolieren. Zwei dieser Antikörper galt es im Rahmen dieser Arbeit näher zu untersuchen: LM-1 und PAM-1 , beides rein humane monoklonale IgM-Antikörper. Mithilfe immunhistochemischer Färbungen auf Paraffinschnitten von Adenocarcinomen des Colons, Carcinomen des Pancreas und Adeno- und Plattenepithelcarcinomen der Lunge ließ sich eindeutig demonstrieren, daß bei beiden Antikörpern eine tumorspezifische Reaktivität ohne Kreuzreaktion mit den umgebenden gesunden Geweben auf fast allen der ausgewählten Fälle der begutachteten Tumorarten vorlag. Daraus lässt sich eine zuverlässige und selektive Expression der jeweiligen Antigene auf den maligne entarteten Zellen folgern, die sich auch bei Betrachtung der Stadien der Tumoren und des Gradings der Zellen konstant zeigte. Damit scheint soweit keinen Zusammenhang zwischen der Entdifferenzierung der tumorösen Zellen, als auch der Größe und des Fortschreiten des Tumors erkennbar. Die hier demonstrierten Ergebnisse lassen sowohl PAM-1 als auch LM-1 als verlässliche Marker für multiple epitheliale Tumoren und deren Vorstufen erscheinen und können somit als wertvolles diagnostisches und wahrscheinlich auch therapeutisches Mittel eingestuft werden, doch muss die Diskussion dieser Aspekte weiterführenden Untersuchungen überlassen werden. / Human antibodies are ideal therapeutic agents in modern medicine because of their specific and determined abilities. In the end of the last century, the institute of Pathology at the University of Wuerzburg had been successful in isolating several fully human monoclonal antibodies from different tissues of cancer patients as well as from healthy human beings. In this piece of work, two of these had been looked at more closely: PAM-1 and LM-1, both completely human monoclonal IgM antibodies. Immunohistochemical stainings on paraffin sections of tissues of adenocarcinoma of the colon, carcinomas of the pancreas and adeno- and squamous cell carcinomas of the lung clearly demonstrated the tumor specific reactivity of both antibodies without interaction with healthy tissues surrounding the malignant cells in nearly all of the selected cases. We have seen a constant and exclusive expression of the corresponding antigens on the neoplastic cells that appears to be a steady characteristic on all malign cells, no matter which stadium the tumor already reached or which state of grading had been shown by the cells. So far there seems to be any correlation between the de-differentiation of the tumor cells as well as the size and the progression of the tumor. The demonstrated results show PAM-1 and LM-1 as reliable markers on multiple epithelial tumors and their precursor lesions. With their exclusive tumor specific affinity to their corresponding antigens and their ability of initiating ADCC and CDC as well as inducing apoptosis, these antibodies have to be measured as precious diagnostic agents and perhaps as cancer immunotherapeutics. But these aspects of possible future cancer therapy have to be postponed on further discussions and investigations.