Humane oder humanisierte monoklonale Antikörper haben sich in den letzten zehn Jahren als Arzneimittel etabliert. Sie sind hochspezifisch und zeigen in ihrer Anwendung im Vergleich zu konventionellen Therapeutika viel weniger Nebenwirkungen. In den 80er Jahren gelang es am Pathologischen Institut der Universität Würzburg eine Reihe von humanen Antikörpern aus Patienten zu isolieren, die hochspezifisch mit malignen Zellen reagieren und diese sowohl in vitro als auch im experimentellen Tiermodel selektiv durch Induktion von Apoptose töten. Um die Wirkungsweise von monoklonalen Antikörpern in der Krebstherapie zu erhöhen, werden die meisten in Kombination mit herkömmlichen Methoden, wie Chemotherapie, eingesetzt. Die ideale Therapieform sind hinsichtlich der Nebenwirkungen sog. Cocktails aus verschiedenen monoklonalen Antikörpern. Allerdings sind die Studien hierzu noch wenig fortgeschritten. Das Ziel dieser Arbeit war es, in präklinischen Versuchsreihen den Einsatz verschiedener tumorspezifischer humaner monoklonaler Antikörper als Cocktail und in Kombination mit Chemotherapie zu evaluieren. Hierzu wurden neun Antikörper in 32 verschiedenen Antikörperkombinationen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die in vitro Proliferation einer Pankreaskarzinom-Zellinie untersucht. In Immunfluoreszenz-Aufnahmen ließ sich zeigen, dass kombinierte Antikörper an unterschiedlichen Stellen an der Zelle binden, was eindeutig auf verschiedene Zielstrukturen hinweist. Einige werden dabei endozytiert, während andere auf der Zellmembran bleiben. Interessanterweise ließen sich Kombinationen identifizieren, deren antiproliferative Wirkung sowohl additiv als auch synergistisch ist, das heißt größer als die Summe ihrer Einzelaktivitäten. Wurden Antikörper mit Zytostatika (5-Flurouracil) kombiniert, so ließen sich ebenfalls synergistische Effekte beobachten. In FACS-Analysen zeigt sich ein gesteigertes Bindungsverhalten der Antikörper, wenn die Zellen mit 5-FU vorinkubiert wurden. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die Beobachtung, dass die Wirkung humaner monoklonaler Antikörper in Kombination mit Chemotherapie erhöht werden kann. Für die Zukunft humaner Antikörper als Therapiemittel gegen maligne Erkrankungen mag allerdings noch wichtiger sein, dass Antiköper in Cocktails tatsächlich synergistische Wirkung zeigen können. / Cancer patients receiving antibodies as mono-therapy have benefited from these treatments. However, significant improvements could be made if the antibodies were used in combination with conventional chemotherapy. Having learned from the natural oligoclonal antibody response that cancer patients mount to their own tumours, we suppose that cocktails of monoclonal antibodies could be even more active in treating cancer. We have isolated a series of human monoclonal IgM antibodies from cancer patients, which bind to different tumor-specific surface receptors and induce apoptosis in vitro and in vivo. To study the antibody-mediated effects in cocktails, the antibodies were applied in different combinations to pancreas carcinoma cells and analyzed in cytotoxic assays. Depending on their target, it was found that some combinations showed a significant additive or synergistic killing effect, when compared to mono-therapy. We also investigated a combinatorial treatment with chemotherapy on pancreas and colon cancer cells and found that a pretreatment with 5-FU sensitizes the cancer cells to antibody treatment. Based on our own results and data from other laboratories, it is likely that the next phase of antibody immunotherapy will include cocktails of monoclonal antibodies.

Humane Antikörper sind aufgrund ihrer spezifischen, zielgerichteten Eigenschaften die idealen therapeutischen Waffen unserer modernen Medizin. Schon im ausgehenden letzen Jahrhundert gelang es dem pathologischen Institut der Universität Würzburg einige rein humane monoklonale Antikörper aus Geweben sowohl gesunder, als auch an einem Tumorleiden erkrankter Patienten zu isolieren. Zwei dieser Antikörper galt es im Rahmen dieser Arbeit näher zu untersuchen: LM-1 und PAM-1 , beides rein humane monoklonale IgM-Antikörper. Mithilfe immunhistochemischer Färbungen auf Paraffinschnitten von Adenocarcinomen des Colons, Carcinomen des Pancreas und Adeno- und Plattenepithelcarcinomen der Lunge ließ sich eindeutig demonstrieren, daß bei beiden Antikörpern eine tumorspezifische Reaktivität ohne Kreuzreaktion mit den umgebenden gesunden Geweben auf fast allen der ausgewählten Fälle der begutachteten Tumorarten vorlag. Daraus lässt sich eine zuverlässige und selektive Expression der jeweiligen Antigene auf den maligne entarteten Zellen folgern, die sich auch bei Betrachtung der Stadien der Tumoren und des Gradings der Zellen konstant zeigte. Damit scheint soweit keinen Zusammenhang zwischen der Entdifferenzierung der tumorösen Zellen, als auch der Größe und des Fortschreiten des Tumors erkennbar. Die hier demonstrierten Ergebnisse lassen sowohl PAM-1 als auch LM-1 als verlässliche Marker für multiple epitheliale Tumoren und deren Vorstufen erscheinen und können somit als wertvolles diagnostisches und wahrscheinlich auch therapeutisches Mittel eingestuft werden, doch muss die Diskussion dieser Aspekte weiterführenden Untersuchungen überlassen werden. / Human antibodies are ideal therapeutic agents in modern medicine because of their specific and determined abilities. In the end of the last century, the institute of Pathology at the University of Wuerzburg had been successful in isolating several fully human monoclonal antibodies from different tissues of cancer patients as well as from healthy human beings. In this piece of work, two of these had been looked at more closely: PAM-1 and LM-1, both completely human monoclonal IgM antibodies. Immunohistochemical stainings on paraffin sections of tissues of adenocarcinoma of the colon, carcinomas of the pancreas and adeno- and squamous cell carcinomas of the lung clearly demonstrated the tumor specific reactivity of both antibodies without interaction with healthy tissues surrounding the malignant cells in nearly all of the selected cases. We have seen a constant and exclusive expression of the corresponding antigens on the neoplastic cells that appears to be a steady characteristic on all malign cells, no matter which stadium the tumor already reached or which state of grading had been shown by the cells. So far there seems to be any correlation between the de-differentiation of the tumor cells as well as the size and the progression of the tumor. The demonstrated results show PAM-1 and LM-1 as reliable markers on multiple epithelial tumors and their precursor lesions. With their exclusive tumor specific affinity to their corresponding antigens and their ability of initiating ADCC and CDC as well as inducing apoptosis, these antibodies have to be measured as precious diagnostic agents and perhaps as cancer immunotherapeutics. But these aspects of possible future cancer therapy have to be postponed on further discussions and investigations.

Mitochondria are an attractive target for the design of cancer therapy. One of the mechanisms by which chemotherapeutics destroy cancer cells is by inducing apoptosis through extrinsic or intrinsic apoptotic pathways. Extrinsic pathways target cell surface receptors whilst intrinsic pathways target mitochondria. Several studies have shown cancer cell destruction through the extrinsic pathways, which target cancer-specific overexpressed growth factor receptors on the cell membrane. Although the mitochondria dependent apoptotic process is well understood, its application in cancer therapy is still not well developed. Therefore, to design an effective cancer therapy targeting mitochondria, a good understanding in mitochondria dependent apoptotic process is required. Recent developments in nanotechnology have enabled live cell investigations and non-destructive methods to obtain cellular information. The availability of such information would assist to design methods of targeted apoptosis induction. In view of this, I report on studies towards development of cancer therapy where nanoparticles (NPs) were targeted to human cell mitochondria for two purposes: (a) development of cell-imaging tools to investigate the fundamental cell biological pathways inside cells and (b) induction of apoptosis by targeting nanoparticles to mitochondria. Current medical and biological fluorescent imaging methods are mainly based on dye markers, which are limited in light emission per molecule, as well as photostability. Consequently, NPs are gaining prominence for molecular imaging because of their strong and stable fluorescence. Additionally, in order to get insight of mitochondrial molecular information, I investigated the use of optical properties of gold nanoparticles (Au NPs) for surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). In this study, two types of Au NPs - nanospheres (Au NS) and nanorods (Au NR) were investigated. Results from this study showed the enhancement effect of Au NPs in Raman spectra of mitochondria, especially in the region from 1500 to 1600 cm-1. In this region, normal Raman spectra of mitochondria showed the presence of some understated Raman peaks probably due to the excitation wavelength dependence. Au NRs showed a larger enhancement effect than Au NS with respect to the penetration depth of the plasmonic nearfield enhancement effect. Although, the details of the enhancement mechanism are beyond the current studies, Au NPs could be enhancing vibrations of aromatic residues in proteins. This study therefore showed that Au NPs could enhance Raman spectra of mitochondria and in addition the shape of the nanoparticles had a significant effect on SERS spectra. In living cells, I investigated some transfection methods and targeting of NPs to mitochondria or cytosolic actin subunits. I tested the performance of three transfection reagents to deliver nanodiamonds (NDs) into living cells. Antibody functionalized NDs were targeted to mitochondria or cytosolic actin subunits. Three transfection reagents were used: cationic liposomes PULSin™, the cell penetrating peptide protamine, and oligosaccharide modified polypropylene imine (PPI) dendrimers. Fluorescence imaging results revealed that dendrimers were the most efficient in delivering ND conjugates to targeted organelles. Protamine-mediated transfections appeared to target ND conjugates to intended organelles, although there was a tendency of unfunctionalized NDs to be directed to the nucleus. PULSin™-mediated transfection formed ND aggregates regardless of the functionalization moiety. This reflected the unsuitability of the cationic liposome to mediate ND transfections. Further, I investigated the potential use of Au NPs for cell imaging and photothermal lysis of mitochondria inside cells. Just as above, I also tested the performance of the three-transfection reagents mentioned above on transfection capacity of Au NPs into living cells. Using transmission electron microscopy (TEM), oligosaccharide modified dendrimers showed the best transfection of functionalized Au NPs. Further experiments explored the use of the nearfield enhancement effect of Au NPs in combination with low-level laser irradiation (LLLI) to induce apoptosis in living cells. Analysis of the apoptotic process using cytochrome c release showed that Au NPs induced apoptosis most probably through mechanical disruption of the outer mitochondrial membrane. However, apoptosis was significantly accelerated in cells with mitochondrially targeted Au NRs than in cells without Au NRs. This study showed successful targeting of Au NPs to mitochondria in living cells, and demonstrated the potential of using Au NPs in combination with laser irradiation to induce the mitochondria dependent apoptotic pathway. In conclusion, the potential use of Au NPs in SERS of mitochondria and the application of NDs for cell imaging of intracellular organelles were demonstrated. Lastly, Au NPs were targeted to mitochondria in living cells and could induce apoptosis due to mechanical disruption of the outer mitochondrial membrane. Consequently, application of low-level laser irradiation to Au NP transfected cells accelerated the apoptotic process.

No description available.

Molecular and functional analysis of small molecule binding to protein can provoke insights into cellular signaling and regulatory systems as well as facilitate pharmaceutical drug discovery. In label free small molecule detection the displacement assay format can be applied. This assay format comprises the displacement of receptor molecules bond to immobilized ligand by a competition reaction with ligand in solution. This is beneficial because displacement of high molecular receptors is detected compared to low molecular ligand as in classical binding analysis therefore potentially lowering the method detection limit. It was hypothesized that with choosing appropriate measuring methods and theoretical modeling reaction rate constants can be determined separately in every kinetic stage of the assay format. Herein elucidating the dominant valence of antibody antigen binding in the established assay was of great importance. Using the Influenza Hemagglutinin (HA) peptid binding to mono or bivalent Anti-Hemagglutinin peptide antibody displacement assay formats could be established. The exact time resolved analysis of binding and dissolution of ligand HA and Anti-Hemagglutinin peptide antibody was achieved with surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. Mathematical models could be developed from kinetic equations of ligand binding to mono or bivalent antibody. With this, an accurate simulation of the SPR results was reached. The simulation plot had to be exactly adjusted to the SPR results to determine all kinetic rate constants defining ligand and receptor binding kinetics. Large variations in receptor concentration gave almost identical rate constants in binding; this proves the quality of SPR measurements and demonstrates consistence between measurement, simulation, and binding model. Maximum decline of SPR response could be used to determine ligand concentrations in analyte. Displacement dependence from antigen concentration was found to be exponential and was explained by rebinding. Kinetic data and models could be transferred for the simulation of almost stationary displacement assay formats realized with impedance and fluorescence spectroscopy. With the obtained results it was possible to detect the displacement of the bacterial signaling autoinducer AI-2 by a displacement assay format using periplasmic binding protein LuxP as receptor. Concluding it can be said that the hypothesis could be proved and the obtained results can facilitate the use of displacement assay formats in biosensing. Displacement assay formats should be especially interesting in small molecule detection and in compact integrated mass sensitive sensor designs suitable as mobile sensors in outdoor screening. / Die Analyse des Bindungsverhaltens niedermolekularer Liganden an Proteine ist für die Aufklärung von biologischen Regulationssystemen oder bei der Suche neuer medizinischer Wirkstoffe von Wichtigkeit. Ein markierungsfreies Detektions¬prinzip zur Erfassung niedermolekularer Liganden ist die Displacement- oder Replacement-Methode. Bei dieser tritt die Bindung des Rezeptors an den immobilisierten Liganden mit der Bindung an freien Liganden in Konkurrenz, sodass anstelle der niedermolekularen Liganden die hochmolekularen Rezeptoren detektiert werden können. In dieser Arbeit wurde von der Hypothese ausgegangen, dass durch die Auswahl geeigneter Messverfahren und der zugeordneten Modellierung die einzelnen kinetischen Stadien des Displacements separat zur Bestimmung der kinetischen Konstanten der Displacementprozesse genutzt werden können. Dabei sollte unter anderem auch eine Aussage über die dominierende Valenz der Antigen-Antikörper-Bindung erreicht werden. Hierzu wurden auf der Basis des Modellsystems Hämagglutinin-Peptid/ Hämagglutinin-Antikörper Displacement-Assays mit mono- und bivalenten Anti-körpern entwickelt, anhand derer eine genaue zeitaufgelöste Analyse des Bindungs- und Ablösungsverhaltens vom Liganden HA an den Anti-HA-Antikörper (Rezeptor) mittels Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-Spektroskopie erzielt wurde. Ausgehend von den Reaktionsgleichungen zwischen Liganden und mono- und bivalenten Rezeptoren wurden mathematische Modelle entwickelt, die eine exakte Simulation der SPR-Ergebnisse ermöglichten. Durch genaues Anpassen der Simulationsplots an die Messplots konnten alle Ratenkonstanten, die die Kinetik der Reaktionen zwischen Liganden, Rezeptoren und ihren Komplexen bestimmen, ermittelt werden. Da auch für eine große Variation der Rezeptorkonzentrationen in der Analytlösung nahezu identische Werte für die Ratenkonstanten erhalten wurden, ergeben Messungen und Simulationen ein konsistentes Bild der Anbindungskinetik und bestätigen die Qualität der Messungen. Aus Messungen des maximalen Responsabfalles kann die Konzentration der freien Antigene beim Displacement ermittelt werden. Man findet eine exponentielle Abhängigkeit des Displacements von der Konzentration der freien Antigene, die sich durch den sogenannten „Rebindingeffekt“ erklären lässt. Die gewonnenen kinetischen Daten und entwickelten Modellierungsverfahren konnten zur Simulation quasistationärer Detektionsverfahren, die mit Fluoreszenz- und Impedanzspektroskopie durchgeführt wurden, erfolgreich angewandt werden. Die erzielten Erkenntnisse konnten auf ein wissenschaftlich herausforderndes biologisches System (LuxP/AI2) angewandt werden, bei dem das niedermolekulare Signalmolekül AI2 über ein Displacementassay detektiert wurde. Dieses System ermöglicht einen Einblick in die Intra- und Interspezieskommunikation bei Bakterien. Insgesamt zeigt sich, dass die hier formulierte Hypothese als bewiesen angesehen werden kann. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse eröffnen verschiedene Einsätze der Displacementmethode in der Biosensorik. Insbesondere lassen sich damit kleine Moleküle markierungsfrei quantitativ bestimmen, ohne hoch präzise Analysengeräte einsetzen zu müssen. Damit ergibt sich die Möglichkeit, sehr kompakte integrierte massensensitive Sensoren, die nicht die Empfindlichkeit hochempfindlicher SPR-Spektrometer erreichen, zur Detektion kleiner Moleküle einzusetzen. Dies ist besonders für mobile Anwendungen von Interesse.

Molecular and functional analysis of small molecule binding to protein can provoke insights into cellular signaling and regulatory systems as well as facilitate pharmaceutical drug discovery. In label free small molecule detection the displacement assay format can be applied. This assay format comprises the displacement of receptor molecules bond to immobilized ligand by a competition reaction with ligand in solution. This is beneficial because displacement of high molecular receptors is detected compared to low molecular ligand as in classical binding analysis therefore potentially lowering the method detection limit. It was hypothesized that with choosing appropriate measuring methods and theoretical modeling reaction rate constants can be determined separately in every kinetic stage of the assay format. Herein elucidating the dominant valence of antibody antigen binding in the established assay was of great importance. Using the Influenza Hemagglutinin (HA) peptid binding to mono or bivalent Anti-Hemagglutinin peptide antibody displacement assay formats could be established. The exact time resolved analysis of binding and dissolution of ligand HA and Anti-Hemagglutinin peptide antibody was achieved with surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. Mathematical models could be developed from kinetic equations of ligand binding to mono or bivalent antibody. With this, an accurate simulation of the SPR results was reached. The simulation plot had to be exactly adjusted to the SPR results to determine all kinetic rate constants defining ligand and receptor binding kinetics. Large variations in receptor concentration gave almost identical rate constants in binding; this proves the quality of SPR measurements and demonstrates consistence between measurement, simulation, and binding model. Maximum decline of SPR response could be used to determine ligand concentrations in analyte. Displacement dependence from antigen concentration was found to be exponential and was explained by rebinding. Kinetic data and models could be transferred for the simulation of almost stationary displacement assay formats realized with impedance and fluorescence spectroscopy. With the obtained results it was possible to detect the displacement of the bacterial signaling autoinducer AI-2 by a displacement assay format using periplasmic binding protein LuxP as receptor. Concluding it can be said that the hypothesis could be proved and the obtained results can facilitate the use of displacement assay formats in biosensing. Displacement assay formats should be especially interesting in small molecule detection and in compact integrated mass sensitive sensor designs suitable as mobile sensors in outdoor screening.:Zusammenfassung i Summery iii Inhaltsverzeichnis v 1. Problemstellung 1 2. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit monovalenten Antikörpern 5 2.1 Kinetisches Modell 6 2.1.1 Grundgleichungen 6 2.1.2 Analytische Näherungslösung 8 2.1.3 Numerische Lösung 10 2.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 18 2.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 18 2.2.2 Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 36 2.2.3 Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 52 3. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit bivalenten Antikörpern 70 3.1 Kinetisches Modell 70 3.1.1 Grundgleichungen 70 3.1.2 Numerische Lösung 72 3.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 80 3.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 80 3.2.2 Impedanzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 88 4. Konklusionen und Ausblick 92 5. Anhänge 98 A1: Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie 98 A2: Aufbau der Messschichten und Messreihen eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 105 A3: Schichtaufbau zur Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 119 A4: Aufbau zur Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 125 A5: Impedanzspektroskopie 128 A6: Transferratenkonstanten 139 A7: Abkürzungsverzeichnis 141 6. Literatur 146 7. Danksagung 155 8. Selbständigkeitserklärung 157 / Die Analyse des Bindungsverhaltens niedermolekularer Liganden an Proteine ist für die Aufklärung von biologischen Regulationssystemen oder bei der Suche neuer medizinischer Wirkstoffe von Wichtigkeit. Ein markierungsfreies Detektions¬prinzip zur Erfassung niedermolekularer Liganden ist die Displacement- oder Replacement-Methode. Bei dieser tritt die Bindung des Rezeptors an den immobilisierten Liganden mit der Bindung an freien Liganden in Konkurrenz, sodass anstelle der niedermolekularen Liganden die hochmolekularen Rezeptoren detektiert werden können. In dieser Arbeit wurde von der Hypothese ausgegangen, dass durch die Auswahl geeigneter Messverfahren und der zugeordneten Modellierung die einzelnen kinetischen Stadien des Displacements separat zur Bestimmung der kinetischen Konstanten der Displacementprozesse genutzt werden können. Dabei sollte unter anderem auch eine Aussage über die dominierende Valenz der Antigen-Antikörper-Bindung erreicht werden. Hierzu wurden auf der Basis des Modellsystems Hämagglutinin-Peptid/ Hämagglutinin-Antikörper Displacement-Assays mit mono- und bivalenten Anti-körpern entwickelt, anhand derer eine genaue zeitaufgelöste Analyse des Bindungs- und Ablösungsverhaltens vom Liganden HA an den Anti-HA-Antikörper (Rezeptor) mittels Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-Spektroskopie erzielt wurde. Ausgehend von den Reaktionsgleichungen zwischen Liganden und mono- und bivalenten Rezeptoren wurden mathematische Modelle entwickelt, die eine exakte Simulation der SPR-Ergebnisse ermöglichten. Durch genaues Anpassen der Simulationsplots an die Messplots konnten alle Ratenkonstanten, die die Kinetik der Reaktionen zwischen Liganden, Rezeptoren und ihren Komplexen bestimmen, ermittelt werden. Da auch für eine große Variation der Rezeptorkonzentrationen in der Analytlösung nahezu identische Werte für die Ratenkonstanten erhalten wurden, ergeben Messungen und Simulationen ein konsistentes Bild der Anbindungskinetik und bestätigen die Qualität der Messungen. Aus Messungen des maximalen Responsabfalles kann die Konzentration der freien Antigene beim Displacement ermittelt werden. Man findet eine exponentielle Abhängigkeit des Displacements von der Konzentration der freien Antigene, die sich durch den sogenannten „Rebindingeffekt“ erklären lässt. Die gewonnenen kinetischen Daten und entwickelten Modellierungsverfahren konnten zur Simulation quasistationärer Detektionsverfahren, die mit Fluoreszenz- und Impedanzspektroskopie durchgeführt wurden, erfolgreich angewandt werden. Die erzielten Erkenntnisse konnten auf ein wissenschaftlich herausforderndes biologisches System (LuxP/AI2) angewandt werden, bei dem das niedermolekulare Signalmolekül AI2 über ein Displacementassay detektiert wurde. Dieses System ermöglicht einen Einblick in die Intra- und Interspezieskommunikation bei Bakterien. Insgesamt zeigt sich, dass die hier formulierte Hypothese als bewiesen angesehen werden kann. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse eröffnen verschiedene Einsätze der Displacementmethode in der Biosensorik. Insbesondere lassen sich damit kleine Moleküle markierungsfrei quantitativ bestimmen, ohne hoch präzise Analysengeräte einsetzen zu müssen. Damit ergibt sich die Möglichkeit, sehr kompakte integrierte massensensitive Sensoren, die nicht die Empfindlichkeit hochempfindlicher SPR-Spektrometer erreichen, zur Detektion kleiner Moleküle einzusetzen. Dies ist besonders für mobile Anwendungen von Interesse.:Zusammenfassung i Summery iii Inhaltsverzeichnis v 1. Problemstellung 1 2. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit monovalenten Antikörpern 5 2.1 Kinetisches Modell 6 2.1.1 Grundgleichungen 6 2.1.2 Analytische Näherungslösung 8 2.1.3 Numerische Lösung 10 2.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 18 2.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 18 2.2.2 Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 36 2.2.3 Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 52 3. Kinetisches Modell für Displacement-Assays mit bivalenten Antikörpern 70 3.1 Kinetisches Modell 70 3.1.1 Grundgleichungen 70 3.1.2 Numerische Lösung 72 3.2 Vergleich mit experimentellen Beispielen 80 3.2.1 Surface-Plasmonen-Resonanzspektroskopie eines Hämagglutinin- Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 80 3.2.2 Impedanzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 88 4. Konklusionen und Ausblick 92 5. Anhänge 98 A1: Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie 98 A2: Aufbau der Messschichten und Messreihen eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 105 A3: Schichtaufbau zur Analyse eines LuxP/AI2-Displacementassays mittels SPR-Spektroskopie 119 A4: Aufbau zur Fluoreszenzspektroskopie eines Hämagglutinin-Peptid/Hämagglutinin-Antikörper-Displacement-Assays 125 A5: Impedanzspektroskopie 128 A6: Transferratenkonstanten 139 A7: Abkürzungsverzeichnis 141 6. Literatur 146 7. Danksagung 155 8. Selbständigkeitserklärung 157

Mitochondria are an attractive target for the design of cancer therapy. One of the mechanisms by which chemotherapeutics destroy cancer cells is by inducing apoptosis through extrinsic or intrinsic apoptotic pathways. Extrinsic pathways target cell surface receptors whilst intrinsic pathways target mitochondria. Several studies have shown cancer cell destruction through the extrinsic pathways, which target cancer-specific overexpressed growth factor receptors on the cell membrane. Although the mitochondria dependent apoptotic process is well understood, its application in cancer therapy is still not well developed. Therefore, to design an effective cancer therapy targeting mitochondria, a good understanding in mitochondria dependent apoptotic process is required. Recent developments in nanotechnology have enabled live cell investigations and non-destructive methods to obtain cellular information. The availability of such information would assist to design methods of targeted apoptosis induction. In view of this, I report on studies towards development of cancer therapy where nanoparticles (NPs) were targeted to human cell mitochondria for two purposes: (a) development of cell-imaging tools to investigate the fundamental cell biological pathways inside cells and (b) induction of apoptosis by targeting nanoparticles to mitochondria. Current medical and biological fluorescent imaging methods are mainly based on dye markers, which are limited in light emission per molecule, as well as photostability. Consequently, NPs are gaining prominence for molecular imaging because of their strong and stable fluorescence. Additionally, in order to get insight of mitochondrial molecular information, I investigated the use of optical properties of gold nanoparticles (Au NPs) for surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). In this study, two types of Au NPs - nanospheres (Au NS) and nanorods (Au NR) were investigated. Results from this study showed the enhancement effect of Au NPs in Raman spectra of mitochondria, especially in the region from 1500 to 1600 cm-1. In this region, normal Raman spectra of mitochondria showed the presence of some understated Raman peaks probably due to the excitation wavelength dependence. Au NRs showed a larger enhancement effect than Au NS with respect to the penetration depth of the plasmonic nearfield enhancement effect. Although, the details of the enhancement mechanism are beyond the current studies, Au NPs could be enhancing vibrations of aromatic residues in proteins. This study therefore showed that Au NPs could enhance Raman spectra of mitochondria and in addition the shape of the nanoparticles had a significant effect on SERS spectra. In living cells, I investigated some transfection methods and targeting of NPs to mitochondria or cytosolic actin subunits. I tested the performance of three transfection reagents to deliver nanodiamonds (NDs) into living cells. Antibody functionalized NDs were targeted to mitochondria or cytosolic actin subunits. Three transfection reagents were used: cationic liposomes PULSin™, the cell penetrating peptide protamine, and oligosaccharide modified polypropylene imine (PPI) dendrimers. Fluorescence imaging results revealed that dendrimers were the most efficient in delivering ND conjugates to targeted organelles. Protamine-mediated transfections appeared to target ND conjugates to intended organelles, although there was a tendency of unfunctionalized NDs to be directed to the nucleus. PULSin™-mediated transfection formed ND aggregates regardless of the functionalization moiety. This reflected the unsuitability of the cationic liposome to mediate ND transfections. Further, I investigated the potential use of Au NPs for cell imaging and photothermal lysis of mitochondria inside cells. Just as above, I also tested the performance of the three-transfection reagents mentioned above on transfection capacity of Au NPs into living cells. Using transmission electron microscopy (TEM), oligosaccharide modified dendrimers showed the best transfection of functionalized Au NPs. Further experiments explored the use of the nearfield enhancement effect of Au NPs in combination with low-level laser irradiation (LLLI) to induce apoptosis in living cells. Analysis of the apoptotic process using cytochrome c release showed that Au NPs induced apoptosis most probably through mechanical disruption of the outer mitochondrial membrane. However, apoptosis was significantly accelerated in cells with mitochondrially targeted Au NRs than in cells without Au NRs. This study showed successful targeting of Au NPs to mitochondria in living cells, and demonstrated the potential of using Au NPs in combination with laser irradiation to induce the mitochondria dependent apoptotic pathway. In conclusion, the potential use of Au NPs in SERS of mitochondria and the application of NDs for cell imaging of intracellular organelles were demonstrated. Lastly, Au NPs were targeted to mitochondria in living cells and could induce apoptosis due to mechanical disruption of the outer mitochondrial membrane. Consequently, application of low-level laser irradiation to Au NP transfected cells accelerated the apoptotic process.

Die akute Graft-versus-Host-Krankheit (GvHD) ist eine der Hauptkomplikationen nach einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation, die die Effizienz der Therapie und deren Einsatz limitiert. Aktuelle Präventionsstrategien und Therapien beinhalten systemisch wirkende Immunsuppressiva. Diese haben oft zahlreiche Nebenwirkungen und erhöhen die Rate von Tumorrezidiven und schweren Infektionen. Therapierefraktäre Verläufe der GvHD sind häufig und können mit einer schlechten Prognose vergesellschaftet sein. Neuartige Präventions- und Behandlungsansätze sind daher Gegenstand intensiver Forschung. Eine zentrale Rolle in der Pathogenese der akuten GvHD spielen CD4+ T Zellen. Alloreaktive T Zellen vermitteln eine proinflammatorische Immunantwort, produzieren entsprechende Zytokine und aktivieren weitere Effektorzellen. Diese Immunkaskade induziert eine systemische Entzündungsreaktion und führt zu Organ- und Gewebsschädigung. Der spezifischen Modulation dieser alloreaktiven CD4+ T Zellen hin zu einer Toleranzentwicklung gegenüber dem Empfängergewebe wird eine große Bedeutung in der Entwicklung innovativer GvHD-Präventionsstrategien beigemessen. Es konnte in murinen Modellen gezeigt werden, dass die ex vivo-Behandlung eines allogenen bzw. xenogenen Transplantats mit dem CD4-gerichteten nicht-depletierenden Antikörper MAX.16H5 zu einer verminderten GvH-Reaktion führte. Eine Beeinträchtigung des Graft-versus-Leukämie-Effekts war nicht nachweisbar. Toleranzinduktionen durch monoklonale Antikörper gegen Oberflächenrezeptoren von Immunzellen im Rahmen von Autoimmunerkrankungen und GvHD werden in zahlreichen Studien untersucht. Darüber hinaus ist bekannt, dass in der GvHD-Pathogenese bestimmte microRNAs, 17 bis 25 Nukleotide lange, nicht kodierende, einzelsträngige RNA-Moleküle, eine Schlüsselrolle spielen. Die molekularen Mechanismen, die der Toleranzentwicklung des MAX.16H5 Antikörpers zugrunde liegen, sind jedoch nicht abschließend geklärt. Daher war es Ziel der vorliegenden Doktorarbeit (i) ein in vitro Stimulationsmodell für weitergehende Untersuchungen am MAX.16H5 Antikörper zu etablieren und (ii) durch Quantifizierung der microRNA-Expression unter T Zellstimulierung zur Aufklärung von molekularen Mechanismen der Toleranzinduktion des Antikörpers beizutragen. Das etablierte in vitro Stimulationsmodell diente zur Analyse und Phänotypisierung von CD4+ T Zellen nach Antikörperinkubation und Stimulation. Es konnte gezeigt werden, dass eine MAX.16H5-Behandlung zu einer verminderten Aktivierung (CD25-Expression) von T Zellen nach 24 h und 72 h in Kokultur mit murinen Milzzellen bei einem 10:1 bzw. 8,2:1 Verhältnis (humane CD4+ T Zellen zu murinen Milzzellen) führte. Dieses Modell kann als Grundlage für weitere in vitro Studien dienen, um Prozesse der Toleranzinduktion durch monoklonale Antikörper zu untersuchen, und liefert einen wichtigen Beitrag für die präklinische Analyse des MAX.16H5 Antikörpers im Hinblick auf die Entwicklung funktioneller Tests. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Expression von microRNAs in CD4+ T Zellen nach Bindung des MAX.16H5 Antikörpers untersucht. Hierzu wurden humane CD4+ T Zellen mit dem MAX.16H5 Antikörper behandelt und (i) ohne Stimulation, (ii) mit murinen Milzzellen bzw. (iii) mit Phytohämagglutinin inkubiert. Das microRNA-Expressionsprofil wurde mit Next Generation Sequencing bestimmt. In dieser Screeninganalyse wurden zahlreiche microRNAs gefunden, die unter den verschiedenen Stimulationsbedingungen nach MAX.16H5-Inkubation differentiell exprimiert waren. Die Expression der miR-18a-3p und miR-598-3p wurde anschließend mit qPCR näher untersucht. Eine statistisch signifikante Regulation konnte für miR-598-3p nach 72 h Inkubation nachgewiesen werden. Es ist der bisher einzige Hinweis auf einen molekularen Effekt der MAX.16H5-Behandlung auf CD4+ T Zellen. Ob dieser Unterschied funktioneller Natur, im Sinne eines Toleranz-induzierenden Phänotyps ist, werden zukünftige Studien zeigen. Zudem wird aktuell die miR-598-3p als potenzieller Biomarker für den Nachweis einer erfolgreichen Inkubation mit MAX.16H5 untersucht, was für zukünftige klinische Studien von großer Wichtigkeit ist.:1. Einleitung 1 1.1 Literaturübersicht 1 1.1.1 Die hämatopoetische Stammzelltransplantation 1 1.1.2 Die allogene Stammzelltransplantation 2 1.1.3 Die Graft-versus-Host-Krankheit 5 1.1.4 Die Prävention und Behandlung der akuten GvHD 8 1.1.5 Neue Strategien zur GvHD-Behandlung und -Prävention 10 1.1.6 Der Graft-versus-Leukämie-Effekt 13 1.1.7 Der CD4-gerichtete MAX.16H5 Antikörper zur Prävention der GvHD 14 1.1.8 Die Toleranzinduktion durch monoklonale Antikörper 16 1.1.9 Die microRNA 19 1.1.10 Die Rolle von miRNAs in der GvHD 20 1.1.11 Die Rationale für die Untersuchung von miR-18a-3p 21 1.1.12 Die Rationale für die Untersuchung von miR-598-3p 22 2 Fragestellung und Experimentdesign 23 3 Material und Methoden 25 3.1 Materialien 25 3.1.1 Verwendete Zellen 25 3.1.2 Geräte 25 3.1.3 Chemikalien, Medien und Reagenzien 26 3.1.4 Verbrauchsmaterialien 27 3.1.5 Oligonukleotide 28 3.1.6 Antikörper 28 3.1.6.1 Antikörper für Durchflusszytometrie 28 3.1.6.2 Antikörper für Zellinkubation 29 3.2 Methoden 29 3.2.1 Schematische Darstellung der methodischen Arbeitsschritte 29 3.2.2 Zellkulturarbeiten 31 3.2.2.1 Auftauen von Zellen 31 3.2.2.2 Konservierung von Zellen 31 3.2.2.3 Bestimmung der Zellzahl von PBMCs und Splenozyten 32 3.2.3 Isolation humaner PBMCs aus Spenderblut 32 3.2.4 Isolation muriner Milzzellen 33 3.2.5 Isolation humaner CD4+ T Zellen und MACS-Separation humaner und muriner Zellen 33 3.2.6 Inkubation mit dem murinem MAX.16H5 IgG1 Antikörper 35 3.2.7 Inkubation humaner CD4+ T Zellen 35 3.2.8 Durchflusszytometrie 36 3.2.9 RNA-Isolation 37 3.2.10 RNA-Fällung 38 3.2.11 Next Generation Sequencing von miRNAs 38 3.2.12 Next Generation Sequencing – Analyseschema 41 3.2.13 Reverse Transkription und qPCR 41 3.2.13.1 Reverse Transkription 42 3.2.13.2 qPCR 43 3.2.14 Statistische Analyse, Tabellen und Abbildungen 44 4. Ergebnisse 46 4.1 Etablierung eines in vitro Stimulationsmodells zur Analyse humaner CD4+ T Zellen nach Antikörperinkubation 46 4.2 Next Generation Sequencing zur miRNA-Expressionsanalyse in CD4+ T Zellen nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation 50 4.2.1 FACS-Analyse isolierter CD4+ T Zellen vor und nach Antikörperinkubation 50 4.2.2 Separation muriner Milzzellen von humanen CD4+ T Zellen 53 4.2.3 NGS-miRNA-Expressionsanalyse in stimulierten und unstimulierten CD4+ T Zellen nach 72 h Inkubation 55 4.2.3.1 MiRNA-Expression nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation und PHA-Stimulation 57 4.2.3.2 MiRNA-Expression nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation und Stimulation mit murinen Milzzellen 59 4.2.3.3 MiRNA-Expression nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation und ohne Stimulation 61 4.2.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der NGS-Analyse 63 4.3 FACS-Analyse von CD4+ T Zellen nach 24 h und 72 h Inkubation 64 4.3.1 FACS-Analyse von CD4+ T Zellen nach 24 h Inkubation 64 4.3.2 FACS-Analyse von CD4+ T Zellen nach 72 h Inkubation 67 4.4 Validierung der Kandidaten-miRNA mittels qPCR 72 4.4.1 Expression von miR-18a-3p und miR-598-3p nach MAX.16H5 IgG1-Inkubation in CD4+ T Zellen nach 72 h 72 4.4.1.1 FACS-Analyse isolierter CD4+ T Zellen vor und nach Antikörperinkubation 72 4.4.1.2 FACS-Analyse der CD4+ T Zellen nach 72 h Inkubation 74 4.4.1.3 Separation muriner Milzzellen von humanen CD4+ T Zellen 78 4.4.1.4 Expression von miR-18a-3p und miR-598-3p 80 5. Diskussion 85 5.1 Die Expression von miR-18a-3p und der miR-17–92 Cluster 86 5.2 Die Expression von miR-598-3p 88 5.3 Die Differentielle Expression weiterer miRNAs 90 5.3.1 miR-223 90 5.3.2 Let-7d 91 5.3.3 miR-21 91 5.3.4 miR-181c 91 5.3.5 miR-10a 92 5.3.6 miR-150 92 5.3.7 miR-199a 92 5.3.8 miR-155 93 5.4 Die miRNA-Expressionsanalyse mit Next Generation Sequencing 93 5.5 Die Etablierung eines in vitro Stimulationsmodells 96 5.6 Verminderte T Zell-Aktivierung durch MAX.16H5 IgG1 98 6 Zusammenfassung der Arbeit 101 7 Literaturverzeichnis 104 A Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 129 B Erklärung über die Vorbehaltlichkeit der Verfahrenseröffnung zur Verleihung des Titels Dr. med. 130 C Darstellung des wissenschaftlichen Werdegangs 131 D Danksagung 133

The second meeting for the International Consensus on Antinuclear antibody (ANA) Pattern (ICAP) was held on 22 September 2015, one day prior to the opening of the 12th Dresden Symposium on Autoantibodies in Dresden, Germany. The ultimate goal of ICAP is to promote harmonization and understanding of autoantibody nomenclature, and thereby optimizing ANA usage in patient care. The newly developed ICAP website www.ANApatterns.org was introduced to the more than 50 participants. This was followed by several presentations and discussions focusing on key issues including the two-tier classification of ANA patterns into competent-level versus expert-level, the consideration of how to report composite versus mixed ANA patterns, and the necessity for developing a consensus on how ANA results should be reported. The need to establish on-line training modules to help users gain competency in identifying ANA patterns was discussed as a future addition to the website. To advance the ICAP goal of promoting wider international participation, it was agreed that there should be a consolidated plan to translate consensus documents into other languages by recruiting help from members of the respective communities.

Leishmaniosen gehören zu den tropischen Krankheiten und bedrohen geschätzte 350 Millionen Menschen in 88 Ländern weltweit. Die schwerste Form, viszerale Leishmaniose, betrifft die ärmsten Bevölkerungsschichten und ist die Ursache für circa 50 000 Todesfälle pro Jahr. Es wird angenommen, dass die Entwicklung eines Impfstoffs möglich ist, aber trotz aller Bemühungen, steht derzeit noch kein Impfstoff zur Verfügung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Impfstoff gegen viszerale Leishmaniose entwickelt und in vivo auf pre-klinischer Ebene getestet. Des Weiteren wurden rekombinante Membranvesikel konstruiert, um ein Boostreagenz zu erhalten. Die Herstellung sowohl des rekombinanten Salmonellenimpfstoffs als auch der Membranvesikel sollte, trotz des geringen Handelspreis, ökonomisch praktikabel sein, was besonders wichtig ist für Menschen in den betroffenen Entwicklungsländern. Der erste Schritt war die Auswahl neuartiger Antigenkandidaten aus einem Proteomics Datensatz, in dem beide Leishmania Lebensformen verglichen wurden. Der Schwerpunkt wurde auf abundante, hypothetische Proteine gelegt, die sowohl in Pro- als auch Amastigoten identifiziert wurden, in Leishmanienarten hochkonserviert sind aber gleichzeitig keine Sequenzhomologien zu humanen und murinen Proteinen besitzen. Diese Antigene wurden in unterschiedlicher Menge auf der Oberfläche und im Cytoplasma von S. typhimurium SL3261 und auch auf Membranvesikeln exprimiert. Impfstämme wurden selektiert in Hinsicht auf ihre bakterielle Fitness und Antigenexpression. Es konnte gezeigt werden, dass LinJ08.1140-, LinJ23.0410-exprimierende Impfstämme oder eine Mischung dieser in der Lage waren besonders anfällige BALB/c Mäuse vor L. major und wichtiger L. donovani Infektion zu schützen. Analyse der humoralen Immunantwort deutet darauf hin, dass der Impfschutz das Ergbnis einer TH1 Antwort war. Erste Schritte zur Aufklärung struktureller und funktioneller Eigenschaften von LinJ08.1140 wurden unternommen. Es wird allgemein angenommen, dass antigenspezifische CD4+ und CD8+ T-Zellen am Schutz beteiligt sind. Daher wurde für LinJ08.1140 potentielle MHC-I Epitope mit Hilfe von bioinformatischen Programmen vorhergesagt. Zusätzlich deuten Fluoreszenz-färbungen mit antigenspezifischen Antikörpern in L. major Promastigoten darauf hin, dass LinJ08.1140 eine Rolle bei der Zellteilung spielt. / Leishmaniasis is a neglected tropical disease and currently an estimated 350 million people in 88 countries around the world are at risk. Its most severe form, visceral leishmaniasis, affects the poorest people in a population and causes an estimated 50 000 deaths every year. Vaccination is thought to be feasible but despite all efforts, no vaccine is yet available. Vaccines will mainly be targeted for people in developing countries such as India, thus focus has to be placed on affordability. In this thesis a vaccine against visceral leishmaniasis was designed and evaluated in vivo at pre-clinical level. Furthermore, recombinant outer membrane vesicles were developed in an attempt to create a booster reagent. Both, the recombinant salmonella vaccine and the preparation of outer membrane vesicles should be commercially viable, and can still be sold at low prices, which is crucial for people in developing countries. First, novel antigen candidates were selected using proteomics data comparing leishmania life stages. Abundant and hypothetic proteins, which have been identified in both parasite life stages and have high sequence homology throughout Leishmania species while lacking homologues in human and mouse, were selected. These antigens were differentially expressed on the surface or in the cytosol of S. typhimurium SL3261 and in the form of outer membrane vesicles. A two step procedure was developed to select optimised vaccine strains based on bacterial fitness and antigen expression. Selected salmonella strains expressing LinJ08.1140, LinJ23.0410 or an admixture of these strains are shown to protect susceptible BALB/c mice by reducing visceralisation of L. major and more importantly L. donovani infections. Analysis of vaccine specific antibody responses suggests that protection resulted from induction of a TH1 response. First steps were undertaken towards resolving functional and structural properties of the most protective antigen LinJ08.1140. Putative MHC-I epitopes of antigen LinJ08.1140 were predicted using bioinformatics since antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells are believed to be required. In addition, immunofluorescent staining of LinJ08.1140 in L. major promastigotes suggested a functional role for this antigen in parasite cell division, since especially dividing cells emmited a strong fluorescence signal.