A água é um recurso essencial para manutenção da vida. Entretanto, a ingestão de água de baixa qualidade está associada com um dos maiores problemas de saúde pública no mundo: doenças de veiculação hídrica. O Arroio Dilúvio é um dos principais córregos de Porto Alegre-RS e recebe grandes volumes de terra, lixo e águas residuais, o que contribui para deterioração das suas águas. Staphylococcus podem causar intoxicação alimentar devido à ingestão de Enterotoxinas Estafilocócicas (SEs). Enterotoxinas são proteínas termoestáveis com atividade de superantígeno. Esses microrganismos também estão envolvidos em diversas outras patologias e sua multirresistência a antimicrobianos é motivo de preocupação. Staphylococcus são capazes de formar biofilme, o que confere lhes proteção tanto no ambiente quanto no hospedeiro. Esse estudo objetivou identificar 88 isolados de Staphylococcus provenientes da água de cinco pontos do Arroio Dilúvio e analisar alguns de seus fatores de virulência. Os isolados foram identificados em nível de espécie através de testes bioquímicos e o perfil de resistência a antimicrobianos foi determinado pelo teste de disco-difusão. Foram também submetidos à Reação em Cadeia da Polimerase para detecção dos genes das enterotoxinas clássicas (sea, seb, sec, sed e see) e ao teste de formação de biofilme em microplaca. 94,32% dos isolados foram classificados como Estafilococos Coagulase Negativa e as espécies mais frequentemente identificadas foram S. cohnii, S. haemolyticus e S. saprophyticus. 43,18% dos isolados apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano testado, sendo resistência a penicilina, eritromicina e oxacilina os fenótipos mais observados. A maior ocorrência de isolados resistentes foi no ponto C de coleta. 36,36% dos isolados apresentaram um ou mais genes de enterotoxinas, sendo sec o mais prevalente. No ponto B foi encontrado o maior número de isolados carregando genes de SEs. Dez isolados mostraram capacidade de formar biofilme in vitro, sendo dois fortes formadores. Conclui-se que as águas do Arroio Dilúvio estão contaminadas com estafilococos potencialmente virulentos, os quais apresentam resistência a antimicrobianos, genes de enterotoxinas e formam biofilme, o que confere risco à população do município. / Water is an essential resource for life maintenance. However, intake of low quality water is associated with one of the biggest public health problems in the world: the waterborne diseases. Arroio Dilúvio is a major stream of water in Porto Alegre-RS, which receives large volumes of earth, rubbish and waste water, contributing to water deterioration. Staphylococcus can cause food poisoning due to ingestion of Staphylococcal Enterotoxins (SEs). Enterotoxins are thermostable proteins with superantigen activity. These microorganisms are also involved in several other pathologies and their multidrug resistance to antibiotics is a concern. Staphylococci are able to form biofilm, which provide protection on both environmental and host. This study aimed to identify 88 Staphylococcus isolated from five points of Arroio Dilúvio water and analyze some of their virulence factors. Isolates were identified to species level by biochemical tests and antimicrobial resistance profile was determined by disk diffusion test. They were also submitted to Polymerase Chain Reaction to detect genes of classical enterotoxins (sea, seb, sec, sed and see) and to biofilm formation test. 94.32% of the isolates were classified as Coagulase Negative Staphylococci and the most frequent species were S. cohnii, S. haemolyticus and S. saprophyticus. 43,18% of isolates were resistant to at least one antimicrobial tested, and resistance to penicillin, erythromycin, and oxacillin was the phenotype most observed. The increased occurrence of resistant isolates was at point C. 36,36% of the isolates had one or more enterotoxin genes, sec being the most prevalent. At point B was found the largest number of isolates carrying genes SEs. Ten isolates showed ability to form biofilm in vitro, being two strong formers. We conclude that the water of the Arroio Dilúvio are contaminated with potentially virulent staphylococci, which are resistant to antibiotics, had enterotoxin genes and form biofilms, which confers risk for the city population.

Salmonella enterica subsp. enterica (S.) é considerada umas das causas mais comuns de doenças transmitidas por alimentos e a carne suína é responsável por um número significativo de casos de salmonelose humana. Além do risco apresentado por Salmonella como patógeno transmitido por alimentos, existe a preocupação mundial com a emergência de cepas resistentes a múltiplos agentes antimicrobianos. Esta tese compreende três estudos que visam determinar as bases fenotípicas e genotípicas da resistência aos agentes antimicrobianos entre isolados de Salmonella obtidos em diferentes etapas da cadeia produtiva de suínos. Um total de 225 isolados obtidos de fábricas de ração, ambiente, carcaças e conteúdo intestinal de suínos foram submetidos ao teste de suscetibilidade frente a doze agentes antimicrobianos através da técnica de disco difusão. A concentração inibitória mínima (MIC) para a ciprofloxacina foi avaliada através da técnica de diluição em ágar e genes de resistência a antimicrobianos foram investigados através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) [Capítulo 2]. Resistência a, pelo menos, um agente antimicrobiano foi observada em 76 % dos isolados testados e multi-resistência foi encontrada em 40,4 % dos isolados. A resistência ocorreu mais frequentemente à tetraciclina (54,5 %), sulfonamidas (39,6 %) e estreptomicina (33,7 %). A reduzida suscetibilidade à ciprofloxacina foi observada em 94,1 % dos isolados resistentes ao ácido nalidíxico. Foi possível observar que isolados de ambiente, conteúdo intestinal e carcaças apresentaram perfis genotípicos comuns. Vinte e sete isolados multi-resistentes de S. Derby foram investigados quanto a sua relação genética através da técnica de macro-restrição do DNA total, genes de resistência e presença de integrons de classe 1 e 2 através da PCR [Capítulo 3]. Mesmo sendo provenientes de diferentes abatedouros, os isolados foram indistinguíveis em seus perfis fenotípicos e genotípicos de resistência e perfil de macro-restrição. Eles carreavam cassetes gênicos associados a integrons de classe 1 com uma nova variante do gene aadA, denominada aadA26, conferindo resistência à estreptomicina e espectinomicina. Os integrons de classe 1 foram identificados supostamente no cromossomo de S. Derby, uma vez que a hibridização não revelou sinal quando DNA plasmidial foi utilizado como alvo. A análise das sequências que flanqueiam o cassete gênico e a amplificação do gene merA sugerem a localização em elementos transponíveis da família Tn21. Quarenta e cinco isolados multi-resistentes de S. Typhimurium foram analisados quanto a sua relação genética através da técnica de macro-restrição do DNA total. Genes de resistência, integrons e genes plasmidiais mediando resistência adquirida às quinolonas (PMQR) foram investigados por PCR. Os amplicons da região variável dos integrons e da região determinante de resistência às quinolonas (QRDR) foram sequenciados. Os plasmídeos foram caracterizados por lise alcalina, conjugação e identificação dos grupos de incompatibilidade [Capítulo 4]. Isolados multi-resistentes de S. Typhimurium apresentaram variabilidade em sua estrutura genômica e perfis fenotípicos e genotípicos de resistência. Apenas substituições únicas foram observadas em QRDR do gene gyrA e PMQR não foram encontrados. Integron de classe 1 abrigando o cassete gênico aadA ou um integron de classe 1 atípico com o cassete gênico dfrA12-orfF-aadA27 foram caracterizados. Ambos foram localizados em grandes plasmídeos conjugativos. Os genes de virulência plasmidiais de Salmonella spvR, spvA, spvB, rck e pefA foram identificados em um plasmídeo de resistência IncFIB. Os estudos realizados permitem concluir que cepas originárias de animais e carcaças apresentaram maior frequência de resistência quando comparadas com cepas de fábrica de ração, demonstrando que cepas resistentes selecionadas na granja podem chegar ao produto final e suínos podem servir como reservatórios de cepas multi-resistentes de Salmonella para humanos. Nesse sentido, a localização de genes de resistência em elementos genéticos móveis contribui para a manutenção e disseminação da resistência em isolados de Salmonella provenientes da cadeia produtiva de suínos. / Salmonella enterica subsp. enterica (S.) is considered one of the most common causes of food-borne diseases and pork has been associated with a significant number of human cases of salmonellosis. Additionally to the risk presented by Salmonella as a food-borne pathogen, there is a global concern about the emergence of antimicrobial multi-resistant isolates. This thesis comprises three studies that aimed to determine the phenotypic and genotypic basis of antimicrobial resistance among Salmonella isolates from different steps of the swine production system. A total of 225 Salmonella isolates from feed mills, lairage environment, carcasses and intestinal content of the pigs were tested for antimicrobial susceptibility against twelve different antimicrobial agents by agar disc diffusion. The minimum inhibitory concentration (MIC) for ciprofloxacin was screened by agar dilution and antimicrobial resistance genes were investigated by Polymerase Chain Reaction (PCR) assays [Chapter 2]. Among tested isolates, 76 % showed resistance to at least one antimicrobial agent and 40.4 % were multi-resistant. Resistance occurred most frequently to tetracycline (54.5 %), sulphonamides (39.6 %) and streptomycin (33.7 %). Thirty-two (94.1 %) nalidixic acid-resistant isolates exhibited decreased susceptibility to ciprofloxacin. It was observed that strains from lairage, carcasses and intestinal contents displayed common resistance gene profiles. Twenty-seven multi-resistant S. Derby were investigated for their molecular relationships by macrorestriction analysis, genotypic resistance and presence of the class 1 and 2 integrons by PCR assays [Chapter 3]. The isolates from different slaughterhouses displayed the same phenotypic and genotypic resistance, as well as indistinguishable macrorestriction pattern. They carried class 1 integron-associated gene cassette with a new aadA variant, designated aadA26, encoding for streptomycin and spectinomycin resistance. Since the hybridization experiments did not yield signals when using plasmid DNA as targets, the class 1 integrons are supposed to be located in the chromosomal DNA of S. Derby. The sequence of the flanking regions of this gene cassette and the amplification of the merA gene may indicate the location of the class 1 integron into a Tn21-related transposon. Forty-five multi-resistant S. Typhimurium isolates were analysed for their molecular relationships by macrorestriction analysis. Resistance genes, integrons and plasmid-mediated quinolone resistance genes (PMQR) were identified by PCR. Amplicons for the variable part of class 1 integrons and from the quinolone resistance-determining regions (QRDR) were sequenced. Plasmids were characterized by alkaline lysis, conjugation and replicon typing [Chapter 4]. Multiresistant S. Typhimurium isolates showed high variability in their genomic structure and resistance properties. Only single substitutions were found in the QRDR of gyrA and no PMQR were found. Class 1 integron with aadA23 gene cassette or an unusual integron carrying dfrA12-orfF-aadA27 gene cassette were characterized. Both located on large and conjugative plasmids. Salmonella plasmid-located virulence genes spvR, spvA, spvB, rck and pefA were found on a multi-resistance IncFIB plasmid. The studies conducted demonstrate that strains from pigs and carcasses displayed higher resistance frequency to most antimicrobial tested compared with isolates from feed mills, demonstrating that resistance genes selected on farm can be found in pork and pigs may serve as reservoirs of multi-resistant Salmonella strains. In this sense, the location of resistance genes on mobile genetic elements contributes to the maintenance and spread of antimicrobial resistance among Salmonella isolates from swine production systems.

Os compostos antimicrobianos naturais são um tema de grande interesse devido ao aumento da demanda por alimentos seguros e de alta qualidade. A utilização de lipossomas é uma alternativa interessante para proteger antimicrobianos nos alimentos, além de fornecer compostos naturais de liberação controlada. Os lipossomas revestidos com polissacarídeos apresentam melhor estabilidade, representando uma alternativa aos lipossomas convencionais. Inicialmente, os nanolipossomas que encapsulam a nisina foram preparados com fosfatidilcolina de soja (PC) e pectina ou ácido poligalacturônico. Os lipossomas desenvolvidos apresentaram alta eficiência de encapsulação, baixo índice de polidispersão e foram estáveis durante 21 dias a 7 °C e 25 °C. A atividade antimicrobiana foi observada contra cinco cepas diferentes de Listeria em placas de ágar de leite, com uma melhor eficiência contra L. innocua 6a. Em um segundo momento, as características estruturais dos lipossomas foram estudadas por dispersão de raios-X de pequeno ângulo (SAXS) e as amostras foram submetidas a ciclos de temperatura (20-60 °C). Para isso, os lipossomas foram desenvolvidos contendo pectina ou ácido poligalacturônico pelos métodos de hidratação de filme e evaporação em fase reversa, para encapsular nisina. A análise de SAXS confirmou a presença de estruturas lamelares em todas as amostras. Além disso, parte da estrutura multilamelar tornou-se cúbica, provavelmente devido à presença de nisina nos lipossomas. A adição de polissacarídeos mostrou diferenças entre as fases cúbicas formadas. Em última análise, a mistura de lisozima e nisina foi encapsulada em lipossomas contendo polissacarídeos. O diâmetro médio dos lipossomas foi de 85,6 e variou para 77,3 e 79,9 nm com a incorporação de pectina ou ácido poligalacturônico, respectivamente. O potencial zeta dos lipossomas com polissacarídeos foi de cerca de -30 mV, mostrando alta eficiência de encapsulação. A atividade antimicrobiana foi avaliada a 37 °C, mostrando que a PC-pectina reduziu a população de L. monocytogenes em 2 log UFC/mL e 5 log UFC/mL em leite integral e desnatado, respectivamente. Em refrigeração, a PC-pectina reduziu a população de L. monocytogenes para quase zero por até 25 dias em leite desnatado. Portanto, pode dizer-se que os lipossomas que contêm polissacarídeos podem ser uma tecnologia promissora para o encapsulamento da lisozima e nisina. Além disso, a existência de estrutura cúbica nos lipossomas pode proporcionar liberação controlada de antimicrobianos. / Natural antimicrobial compounds are a topic of utmost interest due to the increased demand for safe and high-quality foods. The use of liposomes is an interesting alternative to protect antimicrobials in food, also providing controlled release natural compounds. Polysaccharides coated liposomes present better stability, representing an alternative to conventional liposomes. Initially, nanoliposomes encapsulating nisin were prepared with soy phosphatidylcholine (PC) and pectin or polygalacturonic acid. The liposomes developed presented high encapsulation efficiency, low polydispersity index, and were stable for 21 days at 7°C and 25°C. The antimicrobial activity was observed against five different strains of Listeria in milk-agar plates, with a better efficiency against L. innocua 6a. In a second moment, structural characteristics of liposomes were studied by small angle X-ray scattering (SAXS) and the samples were submitted to temperature cycles (20-60°C). For this, liposomes were developed containing pectin or polygalacturonic acid by the thin-film hydration method and reverse phase evaporation method for nisin encapsulation. The analysis of SAXS confirmed the presence of lamellar structures in all the samples. In addition, part of the multilamellar structure became cubic, probably due to the presence of nisin in the liposomes. The addition of polysaccharides showed differences between the cubic phases formed. Ultimately, the mixture of lysozyme and nisin were encapsulated in liposomes containing polysaccharides. The mean diameter of the liposomes was 85.6 and varied to 77.3 and 79.9 nm with the incorporation of pectin or polygalacturonic acid, respectively. The zeta potential of liposomes with polysaccharides were around -30 mV, showing high encapsulation efficiency. The antimicrobial activity was assessed at 37 °C, showing that PC-pectin reduced the population of L. monocytogenes to 2 log CFU/mL and 5 log CFU/mL in whole and skim milk, respectively. At under refrigeration, PC-pectin reduced the population of L. monocytogenes to almost zero for up to 25 days in skim milk. Therefore, it can say that the liposomes containing polysaccharides can be a promising technology for the encapsulation of lysozyme and nisin. In addition, the existence of cubic structure in the liposomes can provide controlled release of antimicrobials.

As bactérias Gram-negativas das famílias Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae são os patógenos mais comumente isolados de infecções. Devido ao crescente aparecimento de micro-organismos resistentes aos antimicrobianos disponíveis para terapêutica, a busca de novos compostos tornou-se eminente, principalmente oriundos de fontes naturais cultiváveis. Os actinomicetos são uma das principais fontes de metabólitos secundários com atividade antibacteriana. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial do actinomiceto endofítico R18(6) em produzir metabólitos ativos contra bactérias Gram-negativas multirresistentes. Para isto, utilizou-se o teste de dupla camada para avaliar a capacidade de produção de metabólitos ativos pelo actinomiceto. As condições de cultivo, como fontes de carbono, temperatura, pH, modo de incubação e tempo de incubação do isolado, sob cultura submersa, foram otimizadas. A atividade antimicrobiana do isolado foi avaliada a cada 24 horas durante 10 dias utilizando a técnica de difusão em poço, na qual foram medidos os halos de inibição. O actinomiceto mostrou melhor atividade contra as bactérias Gram-negativas testadas quando cultivado em meio base contendo glicose como fonte de carbono, pH ajustado para 6.5, incubação a 30ºC sob agitação constante durante 96 horas. No ensaio de concentração inibitória mínima do extrato bruto, esta variou entre 1/32 e 1/256, e mostrou atividade bactericida ou bacteriostática de acordo com o isolado Gram-negativo. O extrato ativo foi avaliado quando à sua estabilidade térmica e enzimática, o qual se apresentou estável a altas temperaturas e instável às enzimas proteolíticas. O extrato bruto foi submetido à extração com solventes e a acetona mostrou-se eficiente como solvente extrator. A micromorfologia do isolado foi observada em microscopia óptica e de varredura, nos quais apresentou características semelhantes ao gênero Streptomyces. O actinomiceto endofítico R18(6) mostrou ser uma nova fonte promissora para a produção de compostos ativos contra bactérias Gram-negativas multirresistentes. / Gram-negative bacteria of the Enterobacteriaceae and Pseudomonadacea family are the most common pathogens isolated from infections. Due to the increase of microorganisms resistant to antimicrobial agents available for treatment, the search for new compounds, mainly from natural and culturable sources, has become an important issue. The actinomycetes are a major source of secondary metabolites with antibacterial activity. The aim of this work was to evaluate the potential production of active metabolites by the endophytic actinomycete R18(6) against Gram-negative bacteria multiresistant. For this, the double layer method was used to assess the ability of production of active metabolites by the isolate. Based on this assay the culture condition growth of the isolate in submerged culture was optimized. For that as carbon source, temperature, pH, incubation way and incubation time were tested looking for a better metabolite production. The antimicrobial activity of the isolate was evaluated every 24 hours for 10 days by the well diffusion assay, where the inhibition halo was measured. The actinomycete showed the best activity against Gram-negative bacteria when cultured in base medium supplemented with glucose, adjusted in pH 6,5, incubation temperature of 30ºC for 96 hours with agitation. In the microdilution assay the concentration of crude extract varied from 1/32 to 1/256, and it showed bactericidal or bacteriostatic activity according to Gram-negative tested isolate. The thermal and enzymatic stability of crude extract were evaluated, where it exhibited thermal stability in high temperature and it was unstable to proteolytic enzymes. The crude extract was subjected to solvent extraction and acetone was efficient as extractor solvent. The isolate showed similar characteristics of the genus Streptomyces when evaluated by optical and scanning microscopy. The endophytic actinomycete R18(6) showed to be a new and a promising source of active metabolites production against Gram-negative bacteria multidrug resistant.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / The reactive oxygen species (ROS) are generated during normal cellular metabolism and can produce several oxidative damage in the DNA, such as lesion nitrogen bases or apurinic/apirimidinic (AP) sites. These lesions may lead to the accumulation of mutations site, if such damages are not repaired. However, the bacteria have several mechanisms of protection against the ROS which play an important role in the maintenance of physiology. The objective of this study was to assess whether enzymatic systems, such as base excision repair (BER), SoxRS and SOS systems are capable to interfere with bacterial response to environmental signals such as susceptibility to antibiotics, and microbial adherence to biotic (HEp-2 cells) and abiotic surfaces (biofilm formation). The mutant strains used in this study were derivatives of Escherichia coli K-12. It was observed that the sole mutant presenting differences in antimicrobial susceptibility in relation to the parental wild type strain (AB1157) was BW9091 (xthA- -deficient in exonuclease III). Nevertheless, 11 strains with deficiency in different protective mechanisms to oxidative stress, presented differences in adherence patterns to HEp-2 cells, demonstrating an aggregative-like adherence in relation to the parental strain AB1157 (without a typical adherence pattern). Presence of mannose (a carbohydrate capable to block type I-mediated fimbriae adherence) was capable to interfere with both quantitative adherence and filamentation of bacterial cells. Filamentation is an important SOS response observed in genome repair during bacterial cell division. Furthermore, with respect to the formation of biofilms, 8 strains showed a strong biofilm formation where this response was not accompanied by increased in intensity of filamentation. Our results suggest the involvement of oxidative stress in the definition of parameters such as sensitivity to antimicrobials, pattern and intensity of adhesion, and filamentous formation of biofilms in the samples of E. coli K-12 assessed in this study. We suggest that adherence generates oxidative stress causing damage to the DNA, which leads to induction of the SOS system resulting in the filamentation. / As espécies reativas de oxigênio (ERO) são geradas durante o metabolismo celular normal e podem produzir vários danos oxidativos no DNA, tais como lesões nas bases nitrogenadas ou sítios apurínico/apirimidínico (AP). Essas lesões podem acarretar acúmulo de sítios de mutações, caso esses danos não sejam reparados. Entretanto, as bactérias possuem vários mecanismos de defesa contra as ERO que desempenham um importante papel na manutenção da fisiologia. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar se sistemas enzimáticos, como o reparo por excisão de bases (BER), sistema SOS e SoxRS, interferem em respostas como a sensibilidade aos antibióticos, aderência das células bacterianas a superfícies bióticas ou abióticas e formação de biofilme. Os mutantes utilizados no presente estudo são todos derivados de Escherichia coli K-12 e os resultados obtidos mostraram que, dos mutantes BER testados, o único que apresentou diferença no perfil de sensibilidade aos antimicrobiamos em relação à cepa selvagem (AB1157) foi o mutante xthA- (BW9091), deficiente em exonuclease III. No teste de aderência qualitativo realizado com linhagem de células HEp-2 (originária de carcinoma de laringe humana) foi observado que onze cepas da nossa coleção, apresentaram um padrão denominando like-AA, contrastando com o que era esperado para as cepas de E. coli utilizadas como controle negativo, que apresentam aderência discreta sem padrão típico. A aderência manose-sensível via fímbria do tipo I avaliada nesse estudo mostrou que essa fimbria, possui um papel relevante na intensidade da aderência e filamentação nessas cepas estudas. A filamentação é uma resposta SOS importante para que o genoma seja reparado antes de ser partilhado pelas células filhas. Além disso, com relação à formação de biofilme, oito cepas apresentaram um biofilme forte sendo que essa resposta não foi acompanhada pelo aumento da intensidade de filamentação. Nossos resultados em conjunto sugerem o envolvimento de estresse oxidativo na definição de parâmetros como sensibilidade a antimicrobianos, padrão e intensidade de aderência, filamentação e formação de biofilme nas amostras de E. coli K-12 avaliadas neste trabalho. Sugerimos que a aderência gera estresse oxidativo causando danos no DNA, o que leva a indução do sistema SOS resultando na resposta de filamentação observada.

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:30:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-16. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:34:25Z : No. of bitstreams: 1 000858031_20170806.pdf: 108222 bytes, checksum: d30d53d86f7661757a061670f3b2cb98 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-08-07T14:09:13Z: 000858031_20170806.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-08-07T14:10:16Z : No. of bitstreams: 1 000858031.pdf: 980973 bytes, checksum: b395a844998ca8066d04420b0f82824a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A cárie precoce da infância (CPI) é ainda um grave problema de saúde pública no mundo, principalmente em países em desenvolvimento. Estudos têm sugerido a associação da ingestão frequente de carboidratos fermentáveis como a sacarose, altas contagens de microrganismos cariogênicos e maior vulnerabilidade imunológica da criança na etiologia da CPI. O objetivo deste estudo foi avaliar os aspectos microbiológicos e imunológicos associados ao desenvolvimento da cárie precoce da infância. Crianças com idade entre 36 e 60 meses foram selecionadas e divididas em três grupos: LC - livres de cárie, CPI e CPI-S (CPI-severa). Questionário sobre os aspectos socioeconômico-culturais, hábitos de higiene bucal e diários de dieta foram respondidos pelos responsáveis. Foram coletadas amostras de saliva e biofilme dental das crianças e processadas para subsequentes avaliações laboratoriais. Em seguida, os níveis de IgA salivar total e contra GbpB de S. mutans foram determinados por ELISA e Western blot, respectivamente, as concentrações salivares dos peptídeos catiônicos antimicrobianos (PCAM): defensinas hBD-2 e hBD-3, catelicidina LL-37 e histatina 5 (HTN-5) por ELISA e a presença e os níveis salivares de Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. e Scardovia wiggsiae por qRT-PCR, sendo que estes dados foram correlacionados com os níveis salivares e no biofilme dental de estreptococos mutans (SM) e Lactobacillus spp. por meio de cultivo em meios específicos. Os resultados mostraram que as crianças com CPI-S apresentaram menor renda familiar quando comparadas às crianças LC ou CPI. Contudo, a ingestão de açúcar não diferiu entre os grupos. O grupo CPI-S apresentou maior contagem de SM na saliva/biofilme em relação aos grupos LC e CPI. Houve uma correlação positiva... / Early childhood caries (ECC) is still a serious public health problem worldwide, especially in developing countries. Studies have been suggested the association among frequent intake of fermentable carbohydrates such as sucrose, high cariogenic microorganism's counts and child's immune vulnerability in the etiology of ECC. The objective of this study was to evaluate the microbiological and immunological factors for the development of early childhood caries. 36 to 60 monthold children were selected and distributed into three groups: caries free (CF), ECC and S-ECC (severe-ECC). Questionnaires about socio-economic-cultural data, oral hygiene habits and food-frequency diary were completed by the parents. Saliva and dental biofilm were collected from children and processed for subsequent laboratorial tests. The following analyses were determined: total IgA and IgA response against S. mutans GbpB by ELISA and Western blot, respectively; salivary concentrations of antimicrobial peptides (AMPs): defensins hBD-2 and hBD-3, cathelicidin LL-37 and histatin 5 (HTN-5) by ELISA; salivary detection and quantification of Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. and Scardovia wiggsiae by qRT-PCR, and these data were correlated with mutans streptococci (MS) and Lactobacillus spp. levels by culture in specific medium. Results showed that S-ECC children had reduced family income compared to ECC and CF. However, sugar intake did not differ among the groups. S-ECC group had higher MS count than CF/ECC groups. Positive correlations between salivary IgA response against GbpB and MS counts were found when the entire population was evaluated. When children with high mutans streptococci counts were compared, S-ECC group showed a significant decrease in IgA antibody levels against GbpB compared... / FAPESP: 12/19235-5

Made available in DSpace on 2016-03-07T19:20:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-17. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T19:24:21Z : No. of bitstreams: 1 000857883_20170806.pdf: 769729 bytes, checksum: 1dcde090f604e4d1d41fd32296602f3d (MD5) Bitstreams deleted on 2017-08-07T14:09:12Z: 000857883_20170806.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-08-07T14:10:16Z : No. of bitstreams: 1 000857883.pdf: 2232120 bytes, checksum: 69fcec972871be7dbe70a720530b6d84 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / FAPESP: 13/24606-5

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-18T19:22:50Z No. of bitstreams: 1 2018_PriscilaPeresDuarteNogueira.pdf: 2026785 bytes, checksum: 7642632a0be351dfb8af86af1fba45b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-29T16:41:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_PriscilaPeresDuarteNogueira.pdf: 2026785 bytes, checksum: 7642632a0be351dfb8af86af1fba45b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-29T16:41:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_PriscilaPeresDuarteNogueira.pdf: 2026785 bytes, checksum: 7642632a0be351dfb8af86af1fba45b7 (MD5) Previous issue date: 2018-05-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O Brasil é o segundo maior produtor mundial de etanol, utilizando cana-deaçúcar como matéria-prima. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o principal microrganismo utilizado em escala industrial tanto para produção de bioetanol quanto para produção de bebidas fermentáveis, como a cerveja. Tipicamente, nas dornas de fermentação, a levedura hidrolisa açúcares produzindo etanol, dióxido de carbono e biomassa. Como essas fermentações não são mantidas estéreis, contaminantes bacterianos são originados de diversas fontes e proliferam nos tanques de fermentação, causando diversos prejuízos como a redução da produtividade e do rendimento de etanol. Bactérias do gênero Lactobacillus são as mais frequentes dentro das dornas industriais. Essas competem pelo substrato e produzem ácidos orgânicos que limitam o crescimento das leveduras e reduzem o rendimento de etanol. Dessa forma, estratégias de controle microbiano de baixo custo são requeridas, uma vez que as tecnologias existentes afetam o metabolismo das leveduras, não são economicamente viáveis ou representam uma ameaça ao meio ambiente. Nesse contexto, o presente trabalho propõe o uso de peptídeos antimicrobianos (PAMs) para o controle de contaminações bacterianas em processos fermentativos. Para isso, os peptídeos antimicrobianos PR-39, PMAP-23 e Cecropin P1 foram adicionados em cultivos de diferentes cepas de leveduras industriais para avaliar qualquer interferência nos seus perfis de crescimento. Dos PAMs testados, PR-39 apresentou a menor interação, sendo escolhido para produção heteróloga em cepa recombinante de S. cerevisiae, porém nenhuma atividade antimicrobiana foi detectada no sobrenadante do cultivo dessa cepa. Dessa forma, outros dois PAMs, X e Y, foram selecionados pela sua alta atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas. Assim, esses foram utilizados em cocultivos de espécies de Lactobacillus e cepas industriais de S. cerevisiae. Observou-se total inibição do crescimento das bactérias com 5 µg/mL desses peptídeos no meio de cultivo, além de terem apresentado pouca interferência no crescimento das leveduras. Dessa forma, eles são potenciais candidatos para serem aplicados contra contaminações bacterianas, sendo o presente trabalho a etapa inicial para o estabelecimento de uma nova tecnologia de controle bacteriano em dornas industriais de fermentação alcóolica. / Brazil is the world's second largest producer of ethanol, using sugarcane as its raw material. The Saccharomyces cerevisiae yeast is the main microorganism used on industrial scale for bioethanol and fermentable beverages production, such as beer. Typically, in industrial fermenters, yeast hydrolyses sugars producing ethanol, carbon dioxide, and biomass. As these fermentations are not kept sterile, bacterial contaminants come from a variety of sources and proliferate in the fermentation tank, causing several losses, like the ethanol yield and productivity reduction. Bacteria of the genus Lactobacillus are the most common in industrial fermenters. They compete for the substrate and produce organic acids that limit the yeast growth and reduce the ethanol yield. Thus, low-cost microbial control strategies are required, since existing technologies affect yeast metabolism, are not economically feasible or pose a threat to the environment. In this context, the present work proposes the use of antimicrobial peptides (AMPs) for the control of bacterial contaminations in fermentative processes. For this, the antimicrobial peptides PR-39, PMAP-23 and Cecropin P1 were added in cultures of different industrial strains of yeasts to evaluate any interference in their growth profiles. From the AMPs tested, PR-39 presented the lowest interaction, being chosen for heterologous production in a recombinant strain of S. cerevisiae, however no antimicrobial activity was detected in the supernatant of the culture of this strain. In this way, two other AMPs, X e Y, were selected for their high antimicrobial activity against gram-positive bacteria. Thus, they were used in cocultures of Lactobacillus species and industrial strains of S. cerevisiae. Complete inhibition of bacterial growth was observed with 5 μg/ml of these peptides in the culture medium, presenting little interference in the yeast growth. In this way, they are potential candidates against bacterial contaminations and the present work is the initial stage for the establishment of a new bacterial control technology in industrial alcoholic fermentation.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-04-26T16:08:11Z No. of bitstreams: 1 2017_LuzElenaTrianaVidal.pdf: 2903643 bytes, checksum: f3ab54636d42cbaaf15629d3af2ceef1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-26T21:42:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_LuzElenaTrianaVidal.pdf: 2903643 bytes, checksum: f3ab54636d42cbaaf15629d3af2ceef1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-26T21:42:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_LuzElenaTrianaVidal.pdf: 2903643 bytes, checksum: f3ab54636d42cbaaf15629d3af2ceef1 (MD5) / A pele dos anfíbios é um tecido especializado na produção de diversas moléculas como peptídeos antimicrobianos, imunomoduladores, aminas biogênicas e hormônios. Esses compostos bioativos podem ser considerados de interesse biotecnológico e alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi identificar e caracterizar peptídeos e proteínas presentes na secreção cutânea do anfíbio Dendropsophus columbianus (Boettger, 1892), relacionados aos mecanismos de defesa contra patógenos. A primeira abordagem consistiu no fracionamento clássico da secreção cutânea por RP-HPLC. Todas as frações cromatográficas obtidas foram avaliadas quanto à capacidade de inibir a proliferação bacteriana e analisadas por MALDI-TOF/TOF. Um único e novo (sem similaridade de sequência com peptídeos anotados) peptídeo antimicrobiano neutro foi assim isolado e denominado Dendropsofina 1 (Dc 1). Posteriormente, foram desenhados dois análogos catiônicos (Dc 1.1 e Dc 1.2) que mantiveram a estrutura anfipática de Dc 1. Dc 1 e seus dois análogos exibiram atividades antibacterianas moderadas e sem efeitos hemolíticos e citotóxicos em células de mamífero. O Análogo Dc 1.2 exibiu uma maior atividade antibacteriana, o que pode estar relacionado ao seu maior teor de α-hélice e estabilidade térmica em condição experimental hidrofóbica, comparando com Dc 1 e Dc 1.1. O peptídeo nativo Dc1 poderia ser usado como um modelo alternativo para desenvolver novos AMPs. Numa segunda abordagem, mais moderna e de alta acurácia, foi realizado o primeiro estudo proteômico e peptidômico abrangente da secreção cutânea utilizando nanoLC-MS/MS do tipo Orbitrap Elite™. Os dados foram processados através dos softwares PEAKS e Blast2GO. Foram identificadas 1248 proteínas presentes na secreção cutânea de D. columbianus, 127 proteínas foram categorizadas como associadas ao sistema de defesa e 19 relacionadas à resposta contra microrganismos. Mediante zimografia foram detectadas e posteriormente identificadas três hidrolases ativas na secreção total, as quais podem estar relacionadas com o processamento de peptídeos de defesa. Os resultados do peptidoma permitiram determinar um novo grupo de peptídeos endógenos a D. columbianus, com alta similaridade de sequência com Dc 1, que foram nomeados como dendropsofinas. As dendropsofinas Dc2, Dc7, DC13, Dc 17, Dc 18 e Dc 19 não apresentaram atividade contra bactérias nem fungos. No entanto, Dc 2 e Dc 18 foram capazes de ativar neutrófilos humanos. Essa atividade poderia estar associada a uma modulação do sistema imune em D. columbianus. Esta via de defesa altamente conservada em vertebrados, abre perspectivas quanto ao uso dessas novas moléculas na terapia de doenças infecciosas. / Amphibian skin is a tissue specialized in the production of various molecules such as antimicrobial peptides, immunomodulators, biogenic amines and hormones. These bioactives compounds could be considered of biotechnological interest and new therapeutic alternatives. The aim of the present study was to identify and characterize peptides and proteins present in the cutaneous secretion of the amphibian Dendropsophus columbianus (Boettger, 1892), related to pathogen defense mechanisms. The first approach consisted of the classical fractionation of cutaneous secretion by RP-HPLC. All chromatographic fractions obtained were evaluated for their ability to inhibit bacterial proliferation and analyzed by MALDI-TOF / TOF. A single new antimicrobial neutral peptide was thus isolated and named Dendropsophin 1 (Dc 1), with no sequence similarity with annotated peptides. Subsequently, two cationic analogues (Dc 1.1 and Dc 1.2) keeping the amphipathic structure of Dc 1 were designed. Dc 1 and its two analogues exhibited moderate antibacterial activities and no hemolytic and cytotoxic effects in mammalian cells. Dc 1.2 exhibited slightly improved antibacterial properties that could be related to the higher content of α-helix and thermal stability compared to Dc 1 and Dc 1.1 in hydrophobic experimental condition. The native peptide Dc 1 could be used as an alternative model to develop new AMPs. In a second modern high-throughput approach, the first comprehensive proteomic and peptidomic study of cutaneous secretion was performed by nanoLC-MS/MS using Orbitrap Elite™ mass spectrometer. Data were processed using PEAKS and Blast2GO programs. 1248 proteins present in the cutaneous secretion of D. columbianus were identified, 127 proteins were categorized associated with the defense system and 19 related to the response against microorganisms. Three hydrolases from the total secretion were detected by zymography and subsequently identified, which could be related to the processing of peptides of defense. The peptidome results allowed determining a new group of peptides endogenous to D. columbianus, with high sequence similarity with Dc 1, which were named as Dendropsophins. The dendropsophins Dc 2, Dc 7, Dc 13, Dc 17, Dc 18 and Dc 19 showed no activity against bacteria or fungi. However, Dc 2 and Dc 18 are able to activate human neutrophils. This activity could be associated to a modulation of the immune system in D. columbianus. This pathway of defense, highly conserved in vertebrates, opens further perspectives regarding the use of these new molecules in the therapy of infectious diseases.

Muitos estudos epidemiológicos têm indicado uma associação inversa entre o consumo de frutas e vegetais com altos níveis de compostos fenólicos e o risco de doenças crônicas relacionadas com estresse oxidativo. Pimentas ou pimentões (Capsicum sp) são popularmente usadas como temperos ou vegetais, e são uma fonte significativa de compostos antioxidantes, mas os níveis destes fitoquímicos podem variar devido ao genótipo e maturação. Capsicum baccatum (pimenta cambuci) é amplamente utilizada no sul do Brasil e que possui poucos estudos na literatura sobre sua composição química e suas propriedades biológicas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antioxidante e antimicrobiana de extratos hidroalcoólicos de diferentes partes dos frutos de Capsicum baccatum var. pendulum L.. Os extratos hidroalcoólicos foram obtidos de três diferentes partes (pericarpo, placenta, sementes) dos frutos frescos de C. baccatum, que foram divididos de acordo com o estádio de maturação (imaturos-verde e maduros-vermelho). A quantidade de compostos fenólicos totais dos extratos foi determinada pelo método de Folin-Ciocalteu e o resultado foi expresso como mg/100g equivalentes de ácido clorogênico (EAC). A atividade antioxidante in vitro foi analisada pelo ensaio do potencial antioxidante reativo total (TRAP) e índice da reatividade antioxidante total (TAR) e em um modelo ex vivo. A atividade antimicrobiana dos extratos foi investigada pelo método de difusão em disco. Os teores de fenólicos totais dos extratos variaram de 1523,9 a 7688,1 mg de EAC/100g. Os EAC foi maior nos respectivos extratos: placenta imatura e sementes maduras quando comparados com as outras as partes. Os resultados dos ensaios in vitro e ex vivo demonstram que os extratos testados apresentam atividade antioxidante, sendo que esta atividade poderia estar relacionada com o teor de fenólicos presentes nos extratos. Os resultados obtidos demonstram que ocorreu uma modificação na composição química e na atividade antioxidante nos frutos de C. baccatum provavelmente relacionada com o processo de maturação. Os extratos apresentaram fraca ou nenhuma atividade antimicrobiana. / Many epidemiological studies have indicated an inverse association between dietary intake of fruits and vegetables rich in phenolic compounds and the risk of chronic diseases related to oxidative stress. Peppers (Capsicum sp) are popularly used as spices and vegetable foods, and are a remarkable source of antioxidants compounds, but levels of these phytochemicals may vary by genotype and maturity. Capsicum baccatum (cambuci) is widely used in the South of Brazil and there are few studies in literature concerning its chemical composition and biological properties. The objective of this study was evaluated the antioxidant and antimicrobial properties of hydroethanolic extracts of different parts from Capsicum baccatum var. pendulum L. fruits. The hydroethanolic extracts were obtained from three different parts (pericarp, placenta and seeds) of the C.baccatum fresh fruits, divided in accordance with their maturity stage (immature - green and mature - red). The amounts of total phenolic compounds were determined by Folin-Ciocalteu method and the results were expressed as mg/100g clorogenic acid equivalent (CAE). The antioxidant activity of extracts was evaluated in vitro by the antioxidant potential reactive total (TRAP) assay and TAR index and ex vivo model. The antimicrobial activity of extracts was investigated by disk diffusion method. The total phenolic levels ranged 1523.9 at 7688.1 mg de CAE/100g. The CAE found was higher in the respective extracts: placenta from immature fruits and seeds from mature fruits as compared to extracts from other structures. The results of in vitro e ex vivo assays demonstrated that the extracts tested have antioxidant activity, this could be related with the total phenolic content in extracts. The results obtained suggest that a modification occurs in the chemical composition and antioxidant properties of C. baccatum fruits probably related with their maturation process. The extracts showed weak or no antimicrobial activity.