A mudança de função idade-dependente é um dos traços mais característicos da sociedade da abelha melífera, Apis mellifera L. A expectativa de vida de uma abelha operária é de aproximadamente 30-40 dias. Uma das mudanças fisiológicas relacionadas ao envelhecimento das operárias é a atrofia da glândula hipofaríngea (GH). O ciclo secretor das GH está intimamente relacionado à função de nutridora, desempenhada pelas operárias entre 5 e 20 dias de vida adulta; em operárias forrageiras, estas glândulas regridem e aparentemente passam para um estado pós-secretor. Desta maneira, esta glândula representa um modelo experimental para o estudo de divisão de trabalho e envelhecimento. Objetivou-se neste trabalho ampliar o conhecimento sobre genes diferencialmente expressos na GH nestas duas fases distintas da vida adulta. Uma vez descobertos, estes candidatos foram utilizados para se tentar esclarecer a relação idade-comportamento em operárias mantidas em uma colônia single-cohort. Para tais fins, diferentes técnicas foram utilizadas, dentre elas destacam-se: Biblioteca Subtrativa Supressiva (BSS), Real Time PCR e Cromatografia Gasosa por Espectometria de Massa . Nas BSS das GHs de operárias nutrizes e forrageiras foram identificados quatro genes diferencialmente expressos: buffy, alfa-glicosidase, amilase proximal e major royal jelly-4. As análises de expressão nas amostras da single-cohort evidenciaram o gene buffy mais expresso em operárias nutrizes e os demais em forrageiras. Inclui-se também os genes superóxido dismutase,relacionado ao stress, sendo mais expresso em forrageiras e o gene para a vitelogenina, expresso sem diferença entre as fases. Os resultados até aqui obtidos ampliam os conhecimentos sobre a expressão gênica diferencial, especialmente nas glândulas hipofaríngeas, trazendo novos candidatos a marcadores de envelhecimento. A composição de hidrocarbonetos cuticulares cefálicos, investivada por cromatografia gasosa, consistiu em alcanos, alquenos, alcadienos e alcanos ramificados, variando entre 21 e 35 átomos de carbono. O perfil de operárias forrageiras foi identificado principalmente por alcanos, enquanto o de nutrizes por alquenos. Mostra-se aqui que em operárias de A. mellifera os perfis de hidrocarbonetos cefálicos cuticulares está dinamicamente ligado ao comportamento em detrimento da idade. Esses resultados suportam a idéia de que a interação operária-operária pode influenciar a taxa de desenvolvimento comportamental, influenciada por comunicação química. / Age-dependent change in functions in division of labor is a characteristic trait in colonies of the honey bees, Apis mellifera L. Life expectancy of a worker bee is about 30-40 days. One of the physiological changes related to aging in workers is the atrophy of the hypopharyngeal gland (HG). The secretory cycle of the HG is closely related to the role as a nurse, played by workers when they are between 5 to 20 days old. In foragers, these glands regress and apparently pass to a post-secretory state. Thus, this gland is an experimental model for the study of division of labor and aging. This study aimed to study differential gene expression in HGs in two distinct phases of adult life. Candidate genes coming out of these screens were then used to investigate the link between gland function and behavior in worker kept as single-cohort colony. For this purpose, different techniques were used, such as: Suppression Substractive Hybridization (RDA), Real Time PCR, and Gas Chromatography/Mass Spectrometry (GC/MS). In the RDA analyses of HGs from nurses and foragers workers we identified four differentially expressed genes: buffy, alpha-glucosidase, amylase proximal and major royal jelly-4. The analysis of their expression in samples of single-cohort workers showed that buffy is higher expressed in nurses, whereas the others had higher transcript levels in foragers. We also studied the expression of the stress-related superoxide dismutase gene, which turned out to be more expressed in foragers, and of the gene coding for vitellogenin, for which we found no difference in expression between the two life stages. These results extend our knowledge on differential gene expression in honey bees, especially for the HGs, adding new candidates to the list of markers of aging. The composition of cephalic cuticular hydrocarbons was investigated by GC/MS. It consisted of alkanes, alkenes, alkadienes and branched alkanes, ranging between 21 and 35 carbon atoms. The profile of foragers was mainly represented by alkanes, while the nurses had more alkenes, showing that the cephalic cuticular hydrocarbon profile in A. mellifera workers is dynamically linked to behavior rather than age. These results lend support to the idea that worker-worker interaction can influence the rate of behavioral development through chemical communication.

Apis mellifera est un insecte pollinisateur jouant un rôle économique et écologique majeur. Depuis plus d’une vingtaine d’années, d’importantes pertes de colonies d’abeilles ont été recensées à l’échelle mondiale. L’origine de ce phénomène impliquerait de nombreux facteurs de stress qui pourraient en outre interagir entre eux. Ce travail de thèse a eu pour but d’évaluer l’impact sur la santé de l’abeille de l’association entre un facteur biotique, le parasite microsporidien Nosema ceranae, et un facteur abiotique, des insecticides neurotoxiques à faibles doses. Des études en laboratoire ont montré que l’association N. ceranae-insecticide entraine une surmortalité significative, et plus précisément un effet synergique sur la mortalité des abeilles. Cet effet synergique semble indépendant de l’ordre d’exposition des abeilles aux deux facteurs de stress. De plus, lorsqu’ils ont été appliqués dès l’émergence des abeilles, ces facteurs ont eu un impact plus fort sur la mortalité. La réponse de l’abeille à N. ceranae et aux insecticides a ensuite été analysée à l’échelle transcriptomique. L’analyse du transcriptome de l’intestin a été réalisée en combinant une approche globale de séquençage à haut débit (RNA-Seq) et un suivi de l’expression d’une sélection de gènes par qRT-PCR. L’exposition à N. ceranae et aux insecticides a entraîné des modifications de l’expression de gènes impliqués dans les défenses de l’abeille (immunité, détoxication) et dans les métabolismes du tréhalose et de la chitine. De nombreuses perspectives à ce travail sont envisageables dans le but de mieux appréhender la réponse de l’abeille à différents facteurs de stress, notamment en combinant des expérimentations en laboratoire avec des études de terrain. / Apis mellifera is a pollinator insect playing of major economical and ecological importance. For more than two decades, severe honeybee colony losses have been reported worldwide. The origin of this phenomenon is thought to involve numerous stressors that could interact with each other. The objective of this work was to evaluate the impact on honeybee health of the association between a biotic stressor, namely the microsporidian parasite Nosema ceranae, and an abiotic stressor, here low doses of neurotoxic insecticides. Laboratory studies showed that the N. ceranae-insecticide association leads to a higher mortality in honeybees, and more precisely to a synergistic effect. This effect seemed to be independent of the exposure sequence to stressors. Moreover, when applied at the emergence of honeybees, these stressors had a higher impact on individuals’ mortality. The honeybee response to N. ceranae and to insecticides has also been analysed at a transcriptional level. A midgut transcriptome analysis has been performed combining a global approach, using high-throughput sequencing (RNA-Seq), and a quantitative RT-PCR monitoring of the expression of selected genes. The exposure to N. ceranae and to insecticides led to modifications in the expression of genes involved in honeybee defenses (immunity, detoxification) and in trehalose and chitin metabolisms. Following this work, several prospects can be initiated in order to improve our understanding regarding the honeybee response to various stressors, combining laboratory experiments with field studies.

A produção de pólen apícola vem experimentando uma rápida e empolgante expansão desde o final da década de 1990. Tal crescimento pode ser explicado pelo aumento do interesse popular em alimentos de alto valor nutricional, bem como outras inúmeras aplicações desse produto na produção animal. Atualmente em torno de 1.500 toneladas de pólen são produzidas anualmente em todo o mundo. Apesar da importância econômica, social e ecológica assumida por esse setor da cadeia produtiva apícola, poucos estudos vêm abordando o tema, desde o fim da década de 1960. Tal desinteresse científico fez com que diversos aspectos relacionados às técnicas de manejo mais adequadas permanecessem pouco entendidos ou até mesmo nunca validados. Como agravante, um acentuado declínio populacional vem sendo percebido nas espécies de polinizadores, em especial A. mellifera. Apesar da gravidade e recorrência, tal fenômeno ainda é pouco entendido. Inúmeros agentes parecem exercer algum tipo de influencia negativa na biologia e fisiologia das abelhas melíferas (pesticidas, patógenos, ectoparasitas e perda de habitat), porém nenhum desses fatores foi comprovadamente identificado como desencadeador. Hoje a hipótese emergente, mais aceita entre os pesquisadores da área, trata do possível efeito sinergístico desses fatores como possível desencadeador dessa síndrome. É nesse contexto que estudos relativos à sanidade dessas abelhas se tornaram essenciais para a conservação da espécie e de seus serviços ecológicos. O pólen como imunoefetor e mitigador do estresse oxidativo se tornou, portanto, uma das mais proeminentes alternativas para proteção das abelhas A. mellifera. A pesquisa teve como principal objetivo a obtenção de informações que propiciassem o melhoramento das práticas vigentes de produção de pólen apícola, além do melhor entendimento do efeito do pólen no sistema imunológico de abelhas melíferas (analisado através do estudo da prevalência de patógenos) e no sistema de defesa antioxidante desses insetos. Este estudo traz informações importantes sobre o desenvolvimento de um sistema produtivo de pólen apícola mais eficaz. A utilização de populações coloniais de tamanhos médios (entre 19.000 e 30.000 indivíduos), combinada com suplementação de carboidrato, foi capaz de produzir resultados produtivos vantajosos. Também concluímos que apiários de produção devem ser prioritariamente instalados em regiões de temperaturas tropicais (com menores amplitudes térmicas), cujo ponto de orvalho também é elevado (alta umidade média) e com períodos moderados de precipitação (porém com frequência regular). Também concluimos que o uso de rainhas inseminadas deve ser considerado pelos apicultores com o objetivo de melhorar a suas produções, uma vez que tal técnica é capaz de produzir resultados mais rápidos e potencialmente mais duradouros do que as técnicas de seleção unilaterais mais comumente usadas nos sistemas produtivos de pólen no Brasil. Os dados obtidos nessa pesquisa também nos mostram indícios de que a expressão relativa dos genes PRX5, SOD2 e GSTS4 respondem significativamente à exposição ao herbicida Paraquat. Por este motivo, novos estudos são necessários para elucidar a real possibilidade dos mesmos serem utilizados como marcadores biológicos para a intoxicação causada por esse herbicida. Modificações significativas também foram observadas na prevalência de patógenos como Nosema, DWV e SBV (quando abelhas foram expostas ao Paraquat). Essa pesquisa destaca os efeitos mitigativos do pólen na redução do estresse oxidativo causado pela exposição ao Paraquat. As taxas de sobrevivência, promovidas por dietas ricas em pólen, parecem também estar ligadas à regulação positiva de genes antioxidantes como os CYPs, SODs, VG e GSTs assim como a menores cargas de IAPV, Nosema sp, e espécies tripanosomatídeas. Este é um indicativo da eficácia do pólen como antioxidante e imunoefetor, assim como uma possível alternativa para a manutenção da saúde das abelhas no mundo todo. / The demand for bee pollen has significantly increased in the last two decades. This growing consuption can be explained by the increasing incorporation of this product into human diets, as well as the efficiency of this product in improving livestock production. Currently around 1,500 tonnes of pollen are produced annually worldwide. Despite the economic, social and ecological importance assumed by this sector of the beekeeping industry chain, few studies have approached the subject since 1960. As a consequence of such scientific negligency, several aspects related to productive management remain poorly understood or even never validated. To make matters worse, a sharp population decline has been noticed in pollinator species, especially A. mellifera, since 2006. No single cause has been identified for these dramatic losses, but rather multiple interacting factors are likely responsible (such as pesticides, malnutrition, habitat loss, and pathogens). In this context, studies addressing the health of honey bees have become essential for the conservation of this pollinator as well as its ecological services. Thus, Pollen as imunoefetor and potencial source of antioxidants has became one of the most prominent alternatives for honey bees protection. This research aimed to obtain information able to foster the improvement of pollen production. We also tested the effects of a widely used herbicide on the physiology of honey bees, specifically focusing the effects of Paraquat on the expression of antioxidant-related genes. In doing so, we simultaneously identify the dynamics of pathogen prevalence when bees are exposed to different concentrations of Paraquat. Finally, we investigate the effect of pollen (added to the diet of tested bees) on both oxidative stress and pathogen loads. This study provides important information for the development of a more eficiente pollen productive system. The use of mid-sized swarms (e.g. 19,000 to 30,000 individuals) combined with carbohydrate supplementation is able to provide advantageous productive results. We also concluded that apiaries should prioritarily be settled in regions which present tropical weather (narrow temperature range), the humidity is high and the precipitation is frequent. We were able to conclude that the use of inseminated queens must be considered by beekeepers in order to improve their production, once this technique is able to produce result improvement faster than other unilateral breeding techniques. The data obtained in this study also showed us evidences that the relative expression of genes such PRX5, SOD2 and GSTS4 respond to exposure to the herbicide Paraquat. Therefore, further studies are required to better elucidate the real possibility of those antioxidante related genes to be applied as biological markers for intoxication produced by this herbicide. Significant changes were also observed in the found levels of pathogens such as Nosema, DWV and SBV (when bees were exposed to Paraquat). This research highlights the mitigating effects of pollen on reducing the oxidative stress caused by Paraquat exposure. Survival rates promoted by pollen-rich diets also seems to be linked to upregulation of genes such as CYPs, SODs, VG and GSTs, as well as reduced prevalence of IAPV, Nosema sp and tripanosomatyd species. This research sheds light into the antioxidant and imunoefetor effects of pollen as well as the promising use of those pollerich diets as alternative for improving honey bee\'s health.

SILVA, I. C. Efeito tóxico de Stryphnodendron polyphyllum (Fabaceae) para as abelhas Apis mellifera, Tetragonisca angustula, Scaptotrigona aff. depilis e Nannotrigona testaceicornis (Apidae). 2012. 101 f. Tese de Doutorado - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. No Brasil, estudos realizados sobre o pólen de Stryphnodendron polyphyllum (barbatimão) mostraram um efeito tóxico quando incorporado em dietas oferecidas para larvas de abelhas africanizadas. Esse pólen é o agente causador da Cria Ensacada Brasileira (CEB), caracterizada por mortalidade de pré-pupas. Doenças em Apis mellifera tem sido amplamente estudadas. Entretanto, há poucos relatos sobre a sua ocorrência em abelhas sem ferrão. Portanto, este trabalho teve por objetivos gerais: avaliar se abelhas africanizadas apresentam diferenças na sobrevivência, na quantidade de pólen de barbatimão coletado e se existem diferenças na coleta desse pólen entre as colônias de apiários diferentes; verificar se as abelhas Scaptotrigona aff. depilis, Tetragonisca angustula e Nannotrigona testaceicornis coletam esse pólen e se ele causa mortalidade de crias; subsequentemente realizar a criação in vitro de larvas de A. mellifera, S. aff. depilis, T. angustula e N. testaceicornis para avaliar a toxicidade desse pólen para as crias. Para isso, colônias de A. mellifera, S. aff. depilis, T. angustula e N. testaceicornis foram transportadas para apiários localizados em Altinópolis/SP, durante o período de florescimento do barbatimão (outubro a dezembro). Nas colônias de abelhas africanizadas foi coletado o pólen do favo e avaliado a sobrevivência das crias com idade controlada. Nas abelhas sem ferrão foi coletado o pólen da corbícula e do interior das colméias. As amostras de pólen foram preparadas pelo método padrão européu, sendo contados 300 grãos de pólen em três lâminas diferentes para verificar a porcentagem de grãos de pólen de barbatimão. As abelhas africanizadas apresentam diferenças na coleta de pólen dentro e entre apiários; apenas três colônias não coletaram e uma coletou pouco pólen de barbatimão, entre 92 colônias analisadas. As crias dessas colônias não apresentaram sintomas da CEB. As rainhas filhas dessas colônias foram inseminadas instrumentalmente e fecundadas naturalmente. As colônias contendo essas rainhas foram analisadas em 2011 juntamente com as matrizes; houve diferenças nas sobrevivências, dependendo da localização do apiário. Foram encontradas diferenças na preferência de coleta do pólen de barbatimão. Os resultados obtidos poderão contribuir para que novas pesquisas sejam realizadas com o objetivo de compreender o mecanismo de baixa preferência para a coleta do pólen e para que programas de seleção sejam realizados visando reduzir os problemas causados por este pólen tóxico. Nas abelhas sem ferrão encontramos o pólen de barbatimão nos potes de alimento e nas corbículas. Algumas crias mortas foram encontradas nas células dos favos durante o mesmo período em que foi observado a mortalidade em abelhas africanizadas com sintomas da CEB. Os resultados sugerem que a mortalidade observada pode ser devida ao consumo desse pólen. As larvas das abelhas sem ferrão foram criadas in vitro e alimentadas com o alimento larval contendo diferentes quantidades de pólen de barbatimão. A sobrevivência de S. aff. depilis e N. testaceicornis não foi afetada quando ingeriram o alimento contendo o pólen de barbatimão, porém para T. angustula a sobrevivência foi significativamente maior quando as larvas receberam apenas o alimento larval (controle) em comparação com aquelas alimentadas com o alimento contendo 1% do pólen de barbatimão. As larvas de A. mellifera também foram criadas in vitro e alimentadas com dietas contendo 1, 2 e 3% do pólen de barbatimão. Todas as larvas alimentadas com o polen de barbatimão morreram com os sintomas semelhantes aos observados em condições naturais. De acordo com os resultados obtidos concluímos que essas abelhas sem ferrão são fisiologicamente mais resistentes a este pólen tóxico. / In Brazil, studies conducted on the Stryphnodendron polyphyllum (barbatimão) pollen have shown its toxic effect when it is incorporated into diets offered to Africanized bees larvae. This pollen is the causative agent of Brazilian Sac Brood (BSB), characterized by pre-pupae mortality. Diseases in Apis mellifera haves been extensively studied. However, there are a few reports on their occurrence in stingless bees. Thus, the main objective of this work was to evaluate whether Africanized bees present differences in survival, amount of barbatimão pollen collected and whether there are differences in the collections of this pollen between colonies of different apiaries; to verify whether Scaptotrigona aff. depilis, Tetragonisca angustula and Nannotrigona testaceicornis bees collect this pollen and whether it leads to brood mortality; and subsequently to evaluate the toxicity of this pollen to bees brood by rearing A. mellifera, S. aff. depilis, T. angustula and N. testaceicornis larvae in vitro. For this A. mellifera, S.aff. depilis, T. angustula and N. testaceicornis colonies were taken to apiaries located in Altinópolis/SP, during babartimão flowering period (October to December). In the Africanized bee colonies pollen was collected from the comb and the survival of the brood with controlled age was evaluated. In the stingless bee colonies pollen was collected from the corbicula of the bees and also from the interior of the hive. The pollen samples were prepared by the standard European method, counting 300 pollen grains in three different slides to check the percentage of barbatimão pollen grains. Africanized bees presented differences in pollen collections within and among apiaries; only three colonies did not collect and one collected little barbatimão pollen, among 92 colonies analyzed. The brood of these colonies did not present symptoms of BSB. The daughter queens of these colonies were instrumentally inseminated or naturally fecundated. These colonies were analyzed in 2011, together with their parental colonies; there were differences in survival depending on the apiary location. We found differences in the collection preference of barbatimão pollen. These results will contribute to the planning of new studies with the aim of understanding the low preference mechanism for pollen collection and selection programs aimed at reducing problems with this toxic pollen. In the stingless bees, we found barbatimão pollen in the food pots and in the corbiculae. Some dead brood was found in the brood cells, during the same period in which mortality was observed in Africanized bees with BSB symptoms. The results suggest that the mortality observed may be due to the consumption of this pollen. Larvae of stingless bees were reared in vitro and fed larval food containing different amounts of barbatimão pollen. The survival of S. aff. depilis and N. testaceicornis was not affected when ingesting food containing barbatimão pollen, but survival of T. angustula was significantly higher when the larvae received only larval food (control) compared to those fed larval food containing 1% barbatimão pollen. The larvae of A. mellifera were also reared in vitro and fed diets containing 1, 2 and 3% barbatimão pollen. All larvae fed barbatimão pollen died with symptoms similar to the ones observed under natural conditions. We conclude that these stingless bees are physiologically more resistant to this toxic pollen.

Em sua distribuição autóctone, as abelhas Apis mellifera apresentam diversas diferenciações morfológicas, comportamentais e ecológicas, que as possibilitam habitar os mais variados ambientes, apresentando grande diversidade de subespécies adaptadas a cada região. Com a introdução das abelhas africanas Apis mellifera scutellata no Brasil, em 1956, surgiram populações polí-hibridas denominadas Africanizadas, sendo que essas abelhas se tornaram interessantes para várias atividades econômicas e essenciais para a apicultura no Brasil. Um local que se apresenta como um bom candidato para o entendimento da dinâmica populacional das abelhas Africanizadas é o Nordeste brasileiro, que, recentemente, tem apresentado grandes avanços na área da apicultura. A análise do DNA mitocondrial tem se mostrado muito útil por permitir a obtenção de polimorfismos genéticos diretamente do DNA, resultando em um rápido e preciso estudo da variabilidade existente. Evidências morfométricas também têm sido utilizadas para estimar a composição genética destas abelhas. Neste contexto, este trabalho tem como objetivo avaliar a variabilidade de abelhas Africanizadas em diferentes localidades do Nordeste brasileiro. Foram coletadas 10 operárias por colônia em várias localidades dentro dos Estados do Rio Grande do Norte, Piauí, Alagoas, Paraíba e Sergipe. Foram feitas análises de DNA Mitocondrial do gene COI e análises do padrão de venação da asa através de Morfometria Tradicional e Geométrica utilizando as localidades e os climas das regiões amostradas como marcadores. Para as análises de morfometria foram utilizadas cinco abelhas por colônia epara a análise molecular, foi utilizada uma abelha por colônia. Foram obtidos fragmentos de 624 pb e identificados 11 diferentes haplótipos, correspondentes a 9 sítios variáveis. Os resultados das análises morfométricas e moleculares quando classificados por localidade corroboram entre si, indicando ausência de estruturação populacional na área amostrada. Essa falta de estruturação populacional provavelmente está relacionada ao alto fluxo gênico entre as populações, que tem como principal fator as altas taxas de enxameação durante os períodos de seca no Nordeste. Outros fatores que provavelmente também estão envolvidos são a apicultura migratória existente na região e, em menor escala, o comercio de compra e venda de rainhas e enxames. Os resultados da análise morfométrica usando como classificador o clima da região amostrada, mostra certa estruturação entre os três climas amostrados (Tropical, Litorâneo Úmido e Semiárido), sugerindo grupos relativamente adaptados a estas condições ambientais, apesar de haver fluxo gênico entre eles. Outra explicação para tal fato pode ser a influência do ambiente na formação das características das asas. / In its native distribution, Apis mellifera exhibit various morphological, behavioral and ecological differences that allow them to inhabit various environments and show great diversity of subspecies adapted to each region. With the introduction of African bees Apis mellifera scutellata to Brazil in 1956, emerged hybrid populations called Africanized honey bees, and, overtime, these bees have become important for various economic activities and essential for beekeeping in Brazil. A good candidate for the understanding of population dynamics on Africanized bees is the Brazilian Northeast, which recently has made great advances in the field of beekeeping. The analysis of mitochondrial DNA has proved to be very useful for allowing obtaining genetic polymorphisms directly from DNA, resulting in a fast and accurate method to studies of variability. Morphometric evidence has also been used to estimate the genetic profile of these bees. In this context, this work aims to evaluate the variability of Africanized bees in different localities of Brazilian Northeast. Ten workers per colony were collected at various locations in the states of Rio Grande do Norte, Piauí, Alagoas, Sergipe and Paraiba. Mitochondrial DNA analysis of the COI gene and analysis of the venation pattern of the wing were made through Traditional and Geometric Morphometrics using as markers the localities and climates of the sampled regions. For the analyzes of morphometry were used five bees per colony and for molecular analysis one bee colony was used. Fragments of 624 bp were obtained and 11 different haplotypes were identified, corresponding to 9 variable sites. The results of morphometric and molecular analyzes by location corroborate each other, indicating the absence of population structuration in the sampled area. This is probably related to high gene flow among populations, whose main factor is probably the high rate of swarming during periods of drought in the Northeast. Other factors are probably also involved are migratory beekeeping existing in the region and, to a lesser extent, the trade of buying and selling queens and swarms. The results of morphometric analysis using classifier as the climate of the survey area, showing some structure between the three sampled climates (Tropical, Coastal Humid and Semiarid), suggesting relatively groups adapted to these environmental conditions, although there is gene flow between them. The influence of the environment in shaping the characteristics of the wings is also a possible explanation.

Através da coleta de pólen, néctar e água as abelhas sociais conseguem suprir as exigências nutricionais para a manutenção da colônia e crescimento das crias. Esses insetos necessitam de reservas de alimento suficientes para atender a seu próprio sustento e das crias em desenvolvimento. Se tiver falta de alimento disponível na natureza, as colmeias enfraquecem. A carência de pólen no campo tem se tornado um grande problema para os apicultores. Uma alimentação artificial que suplemente essa carência ajuda a diminuir as perdas em épocas críticas. Porém, para que essa alimentação seja eficaz tanto quanto a alimentação natural, essas dietas artificiais devem suprir as necessidades nutricionais, e serem palatáveis a essas abelhas. O objetivo do nosso trabalho foi desenvolver e testar, uma dieta que seja o mais próximo possível da realidade dessas abelhas, ou seja, próximo ao Beebread - pão da abelha, em relação à palatabilidade e ao valor nutricional. Os experimentos foram realizados no Apiário Experimental do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP com colmeias de abelhas Africanizadas (Apis mellifera). Foi produzido um inóculo fermentado à base dos microrganismos que ocorrem naturalmente no Beebread para que posteriormente pudesse ser usado para fermentar a dieta proteica artificial. Para tal, foram adicionamos 10 gramas de Beebread recém-coletado dos favos de uma colmeia, a 300 mL de xarope de sacarose 50% (v/v) em frasco de vidro, com tampa solta para permitir saída de gás da fermentação. Após 28 dias de armazenamento em estufa (35ºC), notou-se o surgimento de várias bolhas na superfície, indicando a produção do gás carbônico. Para os testes em laboratório, 100 abelhas recém-emergidas foram coletadas e introduzidas em gaiolas de confinamento, onde foram alimentadas por um período de sete dias com as dietas D1, (controle positivo - mistura de 5 g de Beebread e 4 mL de água), dieta D2 (controle negativo - xarope de sacarose 70%), dieta D3 (Dieta proteica) ou Dieta D4 (Dieta proteica fermentada). A dieta proteica consistiu de 20 g de levedura de cana, 16,7 g de farinha de soja, 43,3 g de farelo de arroz, e 20 g de sacarose. Foram feitas oito repetições desse experimento. Verificamos as taxas de consumo e preferência das dietas D3 e D4, através de medições dos pesos das sobras de cada dieta. A taxa de sobrevivência foi analisada contando-se as abelhas sobreviventes durante o período de 28 dias. Foi retirada amostras de hemolinfa de 20 abelhas confinadas nas gaiolas, para a análise da concentração proteica utilizou-se o método descrito por Bradford e leitura em um espectrofotômetro. Realizamos testes qualitativos através de gel SDS-PAGE corado com Coomassie Brilliant Blue, onde detectamos as bandas das principais proteínas, como a Vitelogenina (Vg) e Lipoforina (Lp). Para testes no campo, foram utilizados seis núcleos padronizados e dispostos em balanças digitais. Dois núcleos foram alimentados durante 60 dias com a dieta D3 e dois núcleos com D4 (100 g por semana); os dois núcleos restantes não receberam alimentação suplementar. Avaliamos mudanças no peso dessas colônias, a área de cria aberta (CA), a área de cria operculada (CO) e o consumo de cada dieta. Para os testes de preferência, foram escolhidos três núcleos, onde as dietas D3 e D4 foram oferecidas simultaneamente (50 g de cada dieta). O peso da sobra dessas dietas foi medido de dois em dois dias e anotado para análises posteriores. Após três dias de alimentação, não havia diferença estatística entre as dietas proteicas comparado ao controle positivo, p=0,809 e p=0,437, respectivamente no parâmetro quantidade de proteína na hemolinfa. Em relação ao controle negativo as duas dietas (D3 e D4) e o controle positivo foram significativamente superiores (p=0,007). Já com sete dias de alimentação, verificou-se que tanto a dieta D3 quanto a dieta D4, foram significativamente inferiores ao controle positivo (p0,001 e p=0,007, respectivamente). A dieta D4 foi significativamente superior à dieta D3 (p=0,021) no parâmetro proteína na hemolinfa. Através da análise da densitometria das bandas do gel, observamos que a Dieta D4 resultou em significativamente mais proteína em relação à Dieta D3 (p=0,0027). Ao observarmos a densitometria das bandas de Lp, verificamos que não houve diferença estatística entre estas duas dietas (p=0,927). A taxa de sobrevivência das abelhas que se alimentaram das dietas D1, D3 e D4 foi significativamente superior à sobrevivência das abelhas alimentadas somente com sacarose (D2), (p0,001). Para este parâmetro não houve diferença significativa entre as dietas artificiais (D3 e D4) e o controle positivo (D1) (p=0,188). O consumo da dieta D4 foi significativamente superior em relação ao consumo da dieta D3 (p=0,002). Em relação à preferência, houve a mesma tendência observada para o consumo (p 0,001). No campo, a dieta D4 foi mais consumida do que à dieta D3 (p0,001). Não encontramos diferenças na preferência para as duas dietas (p=0,850). Verificamos que o núcleo 1, (alimentado com a dieta D3), obteve um aumento não significante em relação a área de CA e CO, p = 0,100. Em relação ao núcleo 2, (alimentado com a dieta D3), notamos um pequeno aumento, porém não significativo (p=0,12) na área total de cria depois dos primeiros 15 dias. Porém mesmo com a alimentação artificial (Dieta D3), houve uma enxameação por abandono. No núcleo 3, (alimentado com a dieta D4), houve um aumento significante, de CA. O núcleo 4, alimentado com a dieta D4, aumentou de peso, sendo necessário passar de núcleo para ninho. No núcleo 5 (grupo controle), houve uma queda brusca de CO no 45º dia para o 60º dia, sendo que esta colônia no final do mapeamento continuou com a mesma quantidade de CO que no início. No núcleo 6 (grupo controle), podemos observar que essa colônia sofreu várias oscilações referente as áreas de cria, porém não houve diferenças no final do experimento. Concluímos que em épocas de escassez alimentar, dietas artificiais proteicas fermentadas, além de serem mais palatáveis as abelhas, aumentam a quantidade de proteína no hemolinfa e a quantidade cria na colmeia. / By collecting pollen, nectar and water, social bees are able to take care of their nutritional needs for colony growth and maintenance. Adult bees need sufficient food reserves for their own sustenance and to produce brood. If there is a lack of food in nature, the colonies weaken rapidly. Pollen is their only source of protein, lipids, minerals and vitamins. A lack of pollen in the field is becoming a major problem for beekeepers. An artificial diet supplement can overcome this lack of natural food and help reduce losses during critical periods. However, in order for this type of diet to be as effective as natural food sources, these artificial diets need to supply all nutritional necessities and also be palatable for the bees. Our objective was to develop and test a diet that is as close as possible to the natural food of the bees (beebread) in terms of palatability and nutritional value. It also needed to be of low cost so that the beekeeper could afford to use it in his apiaries. The experiments were conducted with Africanized honey bees (Apis mellifera). An inoculum was prepared from beebread. We added 10 g of recently harvest beebread to 300 mL of 50% (v/v) sucrose syrup in a sterilized glass bottle, that was loosely capped in order to allow the fermentation gasses to escape. After 28 days in an incubator (35ºC), we noted that bubbles had formed on the surface of the diet, indicating CO2 production. The diets were tested in the laboratory in small cages filled with 100 recently emerged adult worker bees. The cages were maintained in a dark incubator at 34ºC during seven days and fed with beebread, sucrose syrup, protein diet, or fermented protein diet. The protein diet consisted of 20 g of cane sugar alcohol yeast, 16.7 g soy flour, 43.3 g rice meal, and 20 g sucrose. Eight repetitions were made for each of these diets. We examined the consumption and preference for the fermented and unfermented protein diets by weighing the unconsumed diet. The survival rate was determined during 28 days in the cages. Hemolymph was collected from 20 bees from each cage for the protein content analysis, using the Bradford assay, with a spectrophotometer. Qualitative analyses were made of the proteins in the hemolymph with an SDS-PAGE gel stained with Coomassie Brilliant Blue; the main comparison was of the storage proteins vitellogenin and lipophorin. Field tests of the diets were made with five frame nucleus colonies maintained on digital scales. The colonies were fed for 60 days on fermented or unfermented protein diet (100 g/week), or no supplement (control). The colony weight, open brood area, sealed brood area and diet consumption were measured. Two colonies were tested for each diet condition. Preference tests were run with the fermented and unfermented protein diets (50 g each) in three nucleus colonies. After feeding for three days, the caged-bee hemolymph protein levels were similar in the comparison between the two protein diets and the beebread diet (p=0.809 and p=0.437). Both artificial diets were superior to sucrose alone (p=0.007). After feeding for seven days, both protein diets were inferior to beebread (p0.001 and p=0.007). However, the fermented diet was superior to the unfermented protein diet (p=0.021). In the analysis of proteins in the protein separation gel, the fermented diet gave more protein than the unfermented protein diet (p=0.0027). The lipophorin levels did not differ in bees fed with the fermented versus unfermented diet (p=0.927). However, the vitellogenin levels were significantly higher in the bees fed the fermented diet. Survival rates were higher for bees fed beebread or either of the protein diets, compared with bees fed only sucrose (p0.001). There was no significant difference in survival for bees fed one of the protein diets compared to beebread (p=0.188). The fermented diet was consumed at a significantly greater rate, compared to the unfermented diet (p=0.002). Preference for these diets followed the same trend (p 0.001). In the field, the fermented diet was consumed at a greater rate (p0.001). However, when side by side comparisons were made in the same colony, the consumption did not differ (p=0.850). One of the colonies fed with the unfermented protein diet had a small, non-significant, increase in open and sealed brood areas (p = 0.100). A second colony fed with the same diet absconded after 15 days. One of the colonies fed with the fermented diet had a significant increase in open brood area. A second colony fed on the same diet grew considerably and had to be transferred to a larger hive. One of the control colonies had a strong reduction in sealed brood from day 45 to 60, ending up with about the same amount as at day 0. The other control colony (no protein supplement) varied considerably in brood area and had about the same amount as at the beginning of the experiment. We conclude that fermented protein diets are more palatable, increase protein levels in the hemolymph and the amount of brood in the colonies.

A cutícula dos insetos é composta principalmente por uma variedade de proteínas que interagem com filamentos de quitina, um polímero de N-acetilglicosamina, para formar um envoltório rígido que protege e dá forma ao organismo. O crescimento dos insetos depende da renovação periódica da cutícula, que se desprende durante a apólise e é digerida enquanto a epiderme sintetiza uma nova cutícula substituta. Tal renovação caracteriza a muda e metamorfose e é coordenada por hormônios, com destaque para os ecdisteróides. O atual trabalho objetivou caracterizar a expressão diferencial de genes do tegumento (cutícula e epiderme subjacente), além de elucidar aspectos de regulação e função no contexto da muda e metamorfose, com foco nos genes codificadores de proteínas estruturais e enzimas cuticulares. Para este fim, utilizamos o tegumento de fases específicas da muda pupal-adulta, isto é, de pupas (Pw), de pupas em apólise (Pp) e de adultas faratas (Pbl) para análises de microarrays de cDNA. As análises dos microarrays mostraram 761 e 1173 genes diferencialmente expressos nos tegumentos de adultas faratas (Pbl) em comparação com pupas (Pw) ou pupas em apólise (Pp), respectivamente. A categorização destes genes, segundo os critérios do Gene Ontology, distinguiu totalmente o tegumento de adultas faratas (Pbl) dos tegumentos de pupas (Pw) ou pupas em apólise (Pp) tanto em relação ao critério Processo Biológico quanto em relação à Função molecular, evidenciando grande mudança na expressão gênica durante a construção do exoesqueleto definitivo nas adultas faratas (Pbl). Os microarrays mostraram aumento estatisticamente significante da expressão de 24 genes cuticulares no tegumento de adultas faratas. Este resultado foi validado por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) para 23 destes genes (AmelCPR3, AmelCPR4, AmelCPR6, AmelCPR14, AmelCPR15, AmelCPR17, AmelCPR23, AmelCPR24, AmelCPR25, AmelCPR28, AmelCPR29, AmelCPR30, apd-1, apd-2, apd-3, CPLCP1, Am-C, Am-D, AmelTwdl1, AmelTwdl2, GB12449, GB12811 e GB11550), e por RT-PCR semiquantitativa para o gene Amlac2. Além disto, a maior expressão de outros 2 genes cuticulares (AmelCPR1 e AmelCPR2) em adultas faratas foi demonstrada por qRT-PCR. Estes genes cuticulares positivamente regulados no tegumento de adultas faratas (Pbl) devem estar envolvidos com a formação e diferenciação do exoesqueleto definitivo. O aumento da expressão gênica neste período da muda (Pbl) é regulado pela variação do título de ecdisteróides e ocorre enquanto o título deste hormônio decai, após ter atingido o pico indutor da apólise na fase de desenvolvimento precedente (Pp). Ao contrário, as análises por qRT-PCR mostraram que 2 outros genes cuticulares (AmelCPF1 e AmelCPR1) são negativamente regulados no tegumento de adultas faratas em comparação com pupas, sugerindo que são específicos de cutícula pupal. Estes genes foram inibidos pelo aumento dos níveis de ecdisteróides, que induz a apólise. Vinte e um entre os 24 genes cuticulares diferencialmente expressos nos microarrays codificam proteínas pertencentes às famílias CPF, CPR, Apidermina, CPLCP, Análoga a peritrofina e Tweedle. Os outros 3 genes diferencialmente expressos (GB12449, GB12811, GB11550) não tinham sido ainda caracterizados como genes cuticulares. Dois deles, GB12449 e GB12811, foram sequenciados para validação da predição e para a caracterização das respectivas estruturas genômicas. Experimentos de hibridação in situ com sonda fluorescente (FISH) nos permitiram localizar altos níveis de transcritos destes genes no citoplasma de células da epiderme de adultas faratas, sugerindo fortemente sua natureza cuticular e envolvimento na construção do exoesqueleto definitivo. O presente estudo consiste na primeira análise global de expressão de genes do tegumento de uma espécie de himenóptero social. Os resultados apresentados levaram à identificação de genes com expressão associada à muda pupal-adulta e formação do exoesqueleto definitivo. Este trabalho contribui com novos dados moleculares para o aprofundamento do conhecimento da metamorfose de A. mellifera. / The insect cuticle is mainly composed of proteins that interact with chitin filaments to form a rigid structure that protects and shapes the organism. Insects grow through the periodic renewal of the cuticle, which is shed at each apolysis episode, and subsequently digested while the epidermis synthesizes the cuticle of the next stage. These molting events are coordinated by hormones, mainly ecdysteroids. The current work aimed to characterize differential gene expression in the integument (cuticle and underlying epidermis) during the ecdysteroid-regulated pupal-to-adult molt. Special attention was given to the structure and expression of genes encoding proteins and enzymes involved in cuticle formation and differentiation. To achieve these goals, we used thoracic integument of newly-ecdysed pupae (Pw), pupae in apolysis (Pp) and pharate adults (Pbl) in cDNA microarray analyses. The microarray analysis showed 761 and 1173 differentially expressed genes in the pharate adult integument (Pbl) in comparison to pupae (Pw) or pupae in apolysis (Pp), respectively. Gene Ontology terms for Biological Process and Molecular Function completely distinguished the integument of pharate adults (Pbl) from the integument of pupae (Pw) or pupae in apolysis (Pp). The microarray analysis discriminated 24 cuticular genes with a significant expression increase in the pharate adult integument. This was validated by real time RT-PCR analysis (qRT-PCR) for 23 of these genes (AmelCPR3, AmelCPR4, AmelCPR6, AmelCPR14, AmelCPR15, AmelCPR17, AmelCPR23, AmelCPR24, AmelCPR25, AmelCPR28, AmelCPR29, AmelCPR30, apd-1, apd-2, apd-3, CPLCP1, Am-C, Am-D, AmelTwdl1, AmelTwdl2, GB12449, GB12811 and GB11550), and by semiquantitative RT-PCR for Amlac2. In addition, the increased expression of other two cuticular genes (AmelCPR1 and AmelCPR2) was confirmed by qRT-PCR. These up-regulated cuticular genes in pharate adult integument apparently are involved in adult cuticle formation and differentiation, which occurs while the ecdysteroids titers decay, after reaching the peak that induces apolysis in the preceding phase (Pp). In contrast, two cuticular genes (AmelCPF1 e AmelCPR1) were confirmed by qRT-PCR analysis as negatively regulated in the integument of pharate adults compared to pupae, suggesting that they are specific to pupal cuticle. Therefore, these genes were inhibited by the increasing ecdysteroid levels that induce apolysis. Twenty one of the 24 cuticular genes differentially expressed in the microarrays encode proteins belonging to the CPF, CPR, Apidermin, CPLCP, Analogous to peritrofins and Tweedle families. The other three differentially expressed genes (GB12449, GB12811, GB11550) had not yet been assigned as cuticular genes. Two of them (GB12449 and GB12811) were sequenced, thus allowing prediction validation and gene structure characterization. In situ hybridization experiments using fluorescent probe (FISH) localized high expression of these genes in the pharate adult epidermis, strongly suggesting their involvement in the construction of the adult exoskeleton. This study is the first global gene expression analysis of the integument from a social hymenopteran species. The expression of genes in the integument was associated to the molting process and to the adult exoskeleton formation. This work contributes with new molecular data for a deeper understanding of A. mellifera metamorphosis.

O Hormônio Juvenil (HJ) é um sesquiterpenóide que participa de diversas funções do ciclo de vida de insetos. Em Apis mellifera o HJ está envolvido também com o processo de diferenciação de castas e polietismo etário. Neste trabalho, genes participantes da degradação e das vias de síntese do HJ nos corpora allata (CA) foram identificados a partir das seqüências disponibilizadas pelo sequenciamento do genoma de A. mellifera. A identificação destes genes baseou-se em análises funcionais, como interferência por RNA fita dupla, similaridade entre seqüências, expressão tecido-específica e busca por motivos conservados. Análises de quantificação dos transcritos destes genes revelaram padrões condizentes com os títulos de HJ e mostraram que o balanço entre as vias de síntese e degradação deste hormônio age em conjunto para regular os títulos de HJ. Uma importante associação entre a degradação do HJ pelas enzimas esterase do HJ e epóxido hidrolase do HJ com o processo de diferenciação dos ovários, que ocorre durante o estágio larval, foi estabelecida. Estas enzimas parecem atuar ativamente na manutenção dos níveis de HJ durante o processo de diferenciação de castas. A alimentação mostrou ser um processo de suma importância sobre o metabolismo do HJ durante a vida adulta de operárias, em adição ao controle exercido pela alimentação já descrito durante o período larval, que leva à diferenciação de castas distintas. A execução deste trabalho contribuiu de maneira significativa para o conhecimento deste sistema instigante que controla toda a homeostasia em uma colônia do inseto social, Apis mellifera. / The sequisterpenoid, Juvenile Hormone (JH), is a key regulator in many aspects of insect life. In the Honey bee, Apis mellifera¸ JH is additionally involved in caste differentiation and also in age task performance during adult worker life. Herein, we identified genes coding to JH synthesis enzymes pathway in corpora allata and degradation in hemolymph and tissues based on sequences from Genome Sequencing Consortium. The identification of those genes involved functional assays as RNA interference, expression levels in specific tissues, search for functional motifs and also similarity among sequences. The results showed that a balance between synthesis and degradation occurs to the maintenance of hemolymph JH titers. An association between JH degradation by the enzymes, JH esterase and JH epoxide hydrolase, and ovary differentiation during larval stage was established. JH degradation showed to act together with the JH synthesis process to maintain the cast-specific titers of JH, which is essential to females development into castes. The nutrition status in Honey bee adult workers is an important mechanism controlling JH metabolism, in the same way it was observed previously for larvae development. The progress of this work contributed significantly to the knowledge of this amazing social insect life, A. mellifera.

The dissertation on the influence of temperature and humidity of the environment on the reproduction of the honey bee (Apis mellifera) describes the effect of the observed physical quantities on the entire bee during the growing season. Three habitats were monitored under different conditions. The measuring devices were always located inside and outside one colony of each habitat. In cooperation with colleagues from the Faculty of Electrical Engineering, ČVUT in Prague, the physical parameters monitoring was extended by monitoring the sound and weight of the hives - hive assemblies at the site located at the Agricultural Faculty of the University of South Bohemia. The data collection system in beehives was designed as a fully autonomous modular system. Measured data was processed and evaluated by statistical programs. The results showed that the hives observed differ in the number of bee queens found in the growing season and also in the number of frames found. Near-fetal temperatures were measured for correct development of the bee (32 °C to 36 °C). Colonies in the observed periods of 2014, 2015 and 2016 had to actively increase the relative humidity inside the hive in spring and summer. The colony reacts to changes in air temperature by varying intensity of sound. The results revealed the differences between the intensity of bee sounds in different temperature conditions. The highest sound intensity was detected at temperatures below 10 ° C (36.71 W.m-2), the lowest being at temperatures above 29.4 °C (26.25 W.m-2). The correlation coefficients were very low (r = 0.180) to medium (r = 0.463) and the correlation coefficient (r = 0.555) changed with a change in the temperature group. In order to evaluate the optimal conditions for honeybee rearing, the temperature and humidity monitoring can be used. The most suitable temperatures were in the range (29.5-34.3 °C) and temperatures above 34.4 °C. In terms of humidity, the temperature range (20-29.4 °C) and (29.5-34.3 °C) are the most appropriate. Changes in the observed values also affect the queen's bee in the colony. The data obtained from the long-term monitoring of these variables can help us to construct a THI index for bees, which would be a suitable tool to evaluate the optimal conditions for bees.

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-05-18T14:24:19Z No. of bitstreams: 1 CharleSP_DISSERT.pdf: 910690 bytes, checksum: 59c5e27b94cfbdfc815497c189471131 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-18T14:24:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CharleSP_DISSERT.pdf: 910690 bytes, checksum: 59c5e27b94cfbdfc815497c189471131 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Nosemosis is today one of the major threats to profitable beekeeping, just after varroa. Since it is a disease which has only recently become aware of the scientific community, the lack of knowledge and often a carelessness among beekeepers. Therefore this study aimed to detect the pathogen Nosema spp. and the V. destructor mite in non-fed and fed beehives " pollen dust" during the period of low rainfall. The experiment was conducted from June to December 2013, in the city of Jaguaruana, Ceará, where the installation of beehives and collecting bees occurred since the second stage was performed in city of Mossoró RN, which took place in the laboratory mite count and detection of Nosema spp. The data gathered from Nosema spp. and Varroa destructor infestation were statistically analyzed by using the program "R software version 2.3.0." The results showed that when comparing between beehives fed and not fed to the presence of Nosema spp. in honeybees collected inside and outside the beehives, there was no difference between treatments. As well as showed no statistics regarding the collection site differences of the bees. It was also found that the level of infestation of the mite Varroa destructor did not influence the level of presence of Nosema spp., when compared to beehives fed and not fed. However, we can not affirm that the "pollen dust" under the experimental conditions, is not a source of contamination, since the Nosema spp. can develop at higher temperatures / A Nosemose é hoje uma das principais ameaças à apicultura rentável, logo depois da varroose. Dado ser uma doença da qual se tem um conhecimento recente entre a comunidade científica, a falta de conhecimento e por vezes uma displicência entre os apicultores. Portanto objetivou-se neste trabalho a detecção do patógeno Nosema spp. e do ácaro Varroa destructor em colmeias não alimentadas e alimentadas com “pó de pólen” durante o período de escassez de chuva. O experimento foi desenvolvido de junho a dezembro de 2013, no Município de Jaguaruana – Estado do Ceará, onde ocorreu a instalação das colmeias e coleta das abelhas, já a segunda etapa foi realizada no Município de Mossoró - RN, onde se realizou em laboratório a contagem de ácaro e detecção da Nosema spp. Os dados coletados de Nosema spp. e infestação por Varroa destructor foram analisados estatisticamente mediante o uso do programa “software R versão 2.3.0”. Os resultados obtidos mostraram que quando foi comparado entre colmeias alimentadas e não alimentadas à presença de Nosema spp em abelhas Apis mellifera coletadas dentro e fora das colmeias, não houve diferença entre os tratamentos. Bem como não apresentaram diferenças estatísticas quanto ao local de coleta das abelhas. Também se constatou que o nível de infestação de ácaro Varroa destructor não influenciou o nível de presença de Nosema spp., quando comparado a colmeias alimentadas e não alimentadas. No entanto, não podemos afirmar que o “pó de pólen” nas condições do experimento, não seja uma fonte de contaminação, uma vez que a Nosema spp. pode se desenvolver em temperaturas mais elevadas / 2017-05-18