Introdução: A anemia aguda tem sido associada com distúrbios neurofisiológicos e cognitivos em pacientes saudáveis. Evidências experimentais sugerem que a hemodiluição pode aumentar lesões cerebrais, limitando o suprimento de oxigênio ao tecido cerebral. No entanto, o mecanismo exato pelo qual as lesões cerebrais ocorrem em pacientes anêmicos ainda não está claramente definido. O objetivo desse estudo foi avaliar os precursores da apoptose neuronal Bax, Bcl-x no córtex frontal, atividade das caspases 3 e 9 na fração citosólica do hipocampo e na fração mitocondrial do córtex frontal, assim como a fragmentação do DNA na fração nuclear e mitocondrial do córtex frontal, após hemodiluição normovolêmica aguda. Métodos: Vinte e quatro porcos foram anestesiados e randomizados em 4 grupos de 6 animais: Controle, hemodiluição normovolêmica aguda (HNA) com hematócrito alvo de 15% (Ht 15%), HNA com hematócrito alvo de 10% (Ht 10%) e hipóxia-hipóxica (HH). A HNA foi realizada com 1ml de hidroxetil amido (130/0,4) por ml de sangue retirado, até o hematócrito alvo desejado (10 ou 15%). O HH consistiu de ventilação com baixa fração expirada de O2 (FiO2), sendo de 6% por 60 minutos, servindo como grupo controle positivo. Os animais do grupo controle não sofreram nenhuma dessas intervenções. As proteínas pró-apoptótica Bax e anti-apoptótica Bcl-x foram avaliadas por Western blotting nas frações nucleares e mitocondriais do córtex frontal. A atividade das caspases 3 e 9 foi avaliada nas frações mitocondrial e citosólica do hipocampo por espectrofluorometria. A fragmentação do DNA foi avaliada por eletroforese nas frações nuclear e mitocondrial do córtex frontal. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por teste de Tukey (p<0,05). Resultados: Não foi observada diferença significativa entre os grupos controle, Ht 15% e Ht 10% em relação à proteína pró-apoptótica Bax nas frações nuclear e mitocondrial. Entretanto, o grupo HH foi significativamente diferente dos grupos controle e Ht 15% na fração nuclear e de todos os grupos na fração mitocondrial. Não foi encontrada diferença significativa em relação à Bcl-x. A atividade das caspases 3 e 9 nas frações mitocondrial e nuclear foi diferente no grupo HH quando comparado com os demais grupos. Não foi observada diferença significativa em relação à fragmentação do DNA entre os grupos controle, Ht 15% e Ht 10%. Conclusão: A avaliação dos precursores da apoptose demonstrou que a hemodiluição normovolêmica aguda com hematócrito alvo de 15% e 10% não induziu apoptose, sugerindo que a oxigenação cerebral foi preservada / Background: Acute anemia has been associated with neurophysiologic and cognitive dysfunctions in healthy patients. Experimental evidences suggest that hemodilution may increase cerebral lesions, limiting oxygen supply to the brain tissue. Nevertheless, the exact mechanisms through which cerebral lesions occur in anemic patients havent been clearly defined. Therefore, the objective of the present study was to evaluate neuronal apoptosis precursors Bax, Bcl-x in the frontal cortex, caspase 3 and 9 activity in the mitochondrial and cytosolic fractions of the hippocampus, even as DNA fragmentation in the mitochondrial and nuclear fractions of the frontal cortex after acute normovolemic hemodilution. Methods: Twenty four pigs were anesthetized and randomized into 4 groups of 6 animals: sham, acute normovolemic hemodilution (ANH) to reach a hematocrit of 15% (Ht 15%), ANH to reach a hematocrit of 10% (Ht 10%) and hypoxic-hipoxia (HH). ANH was performed with 1ml hydroxyethyl starch 130/0.4 (HES) per ml of blood withdrawn to the desired target hematocrit (10 or 15%). HH consisted of ventilation with low fraction of inspired oxygen (FiO2) of 6% for 60 minutes, serving as a positive control group. Sham animals were not involved in any of these interventions. Pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-x proteins were evaluated by Western blotting in nuclear and mitochondrial fractions of the frontal cortex and activities of caspases-3 and-9 were evaluated in the mitochondrial and cytosolic fractions of the hippocampus by spectrofluorometry. DNA fragmentation was evaluated by electrophoresis in the mitochondrial and nuclear fraction. Data were compared by analysis of variance (ANOVA) followed by Tukeys test (p<0.05). Results: No statistical significance was found among sham, Ht 15% or Ht 10% groups regarding pro-apoptotic protein Bax, in nuclear or mitochondrial fractions. However, group HH presented significant difference from sham and Ht 15% groups in the nuclear fraction and from all groups in the mitochondrial fraction. No statistical significance was found with Bcl-x. The activities of caspases-3 and-9 in cytosolic and mitochondrial fractions were statisticaly different in group HH when compared with all other groups. No statistical significance was found in relation to DNA fragmentation among sham, Ht 15% or Ht 10%. Conclusion: The evaluation of apoptosis precursors demonstrated that ANH with target hematocrit 15% and 10% did not induce neuronal lesion, suggesting that cerebral oxygenation was preserved

A doença renal crônica (DRC) é um problema de saúde pública caracterizado por alta morbidade e mortalidade e com enorme impacto social e econômico no sistema de saúde. Uma das consequências mais graves da progressão da DRC é a albuminúria, que se deve principalmente a lesões no epitélio tubular proximal e na membrana basal glomerular. O aumento da permeabilidade da barreira de ultrafiltração glomerular à albumina está diretamente relacionado à lesão podocitária, principalmente devido à perda de processos podais, estresse oxidativo, estresse de reticulo endoplasmático e eventos apoptóticos. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos em tais processos ainda não foram elucidados. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os mecanismos pelos quais a albumina participa na lesão de podócitos, considerando a contribuição da caveolina-1, IRE-1 fosforilado, PKC fosforilada, p38 MAPK fosforilada e caspase-12 clivada. Para isso, utilizamos podócitos de camundongos diferenciados, os quais foram distribuídos em quatro grupos experimentais: controle e tratados com albumina nas concentrações de 1, 5 e 10 mg/mL, em RPMI 1640 sem soro, durante 24 horas. Após o tratamento, a apoptose foi avaliada por citometria de fluxo. Para os experimentos de imunofluorescência, as células foram tratadas com albumina fluorescente conjugada à isotiocianato de fluoresceína (FITC) 1 mg/mL durante 30 min, 1h, 3h e 24h. As imagens foram obtidas por microscopia confocal, objetivo de 63x. A expressão de proteínas foi analisada por western blotting; GRP78, PKC , p38 MAPK e caspase-12 clivada foram avaliados 30 min, 1h, 3h e 24h após o tratamento das células com albumina 1 mg/mL. GAPDH foi usado como controle endógeno. A análise estatística foi avaliada pela ANOVA one-way seguida do pós teste de Bonferroni. Valores de p<0,05 foram considerados significativos. Nossos resultados mostram que o tratamento das culturas celulares de podócitos com albumina, na concentração de 1 mg/mL, durante 24h resultou em um aumento significativo na taxa de apoptose total em comparação com o controle. Com relação à imunofluorescência, colocalizações entre albumina FITC e caveolina-1 foram observadas no período de 30 min, 1h, 3h e 24h. Em relação à expressão proteica, observou-se um aumento significativo na expressão da proteína GRP78 no período de 1 hora após o tratamento com albumina, o que indica um possível estresse de retículo endoplasmático. No caso da proteína IRE-1 fosforilada houve aumento da expressão em 30 min, 1h, 3h e 24h em relação ao grupo controle. Além disso, um aumento significativo na expressão das proteínas PKC fosforilada, p38 MAPK fosforilada e caspase-12 clivada foi observado nos períodos de 1h, 3h e 24h após o tratamento com albumina. Estes dois últimos parâmetros foram reduzidos pelo co-tratamento das células com SB203580 (10-6 M), um inibidor específico da p38 MAPK. Estes resultados sugerem que a proteína caveolina-1 tem um papel importante na internalização da albumina nos podócitos. Além disso, a albumina induz a apoptose por ativação do estresse de retículo nessas células, principalmente através da via PKC /p38MAPK/caspase-12 clivada. / Chronic kidney disease (CKD) is a public health problem characterized by high morbidity and mortality and with enormous social and economic impact on the health system. One of the most serious consequences of CKD progression is albuminuria, which is mainly due to lesions in the proximal tubular epithelium and the glomerular basement membrane. Increased permeability of the glomerular ultrafiltration barrier to albumin is directly related to podocyte lesion, mainly due to loss of foot processes, oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and apoptotic events. However, the cellular mechanisms involved in such processes have not yet been elucidated. Thus, the objective of this study was to investigate the mechanisms by which albumin participates in podocyte injury, considering the contribution of caveolin-1, phosphorylated IRE-1, phosphorylated PKC, phosphorylated p38 MAPK, and cleaved caspase-12. For this, we used mice differentiated podocytes, which were distributed in four experimental groups: control and treated with serum concentrations of 1, 5 and 10 mg/mL in serum-free RPMI 1640 for 24 hours. After treatment, apoptosis was assessed by flow cytometry. For the immunofluorescence experiments, the cells were treated with 1 mg/mL fluorescein isothiocyanate-conjugated (FITC) albumin for 30 min, 1h, 3h, and 24h. The images were obtained by confocal microscopy, 63x objective. Protein expression was analyzed by western blotting; GRP78, PKC , p38 MAPK and cleaved caspase-12 were evaluated 30 min, 1h, 3h and 24h after treatment of the cells with 1 mg/mL albumin. GAPDH was used as an endogenous control. Statistical analysis was assessed by one-way ANOVA followed by Bonferroni post-test. Values of p<0.05 were considered significant. Our results show that the treatment of cell cultures of podocytes with albumin at a concentration of 1 mg/mL for 24h resulted in a significant increase in the total apoptosis rate compared to the control. Regarding immunofluorescence, colocalizations between FITC albumin and caveolin-1 were observed in the period of 30 min, 1h, 3h and 24h. Regarding protein expression, a significant increase in GRP78 protein expression was observed within 1 hour of albumin treatment, indicating potential endoplasmic reticulum stress. In the case of the phosphorylated IRE-1 protein, expression increased in 30 min, 1h, 3h and 24h in relation to the control group. In addition, a significant increase in the expression of phosphorylated PKC, phosphorylated p38 MAPK and cleaved caspase-12 proteins was observed at 1h, 3h and 24h after albumin treatment. These latter two parameters were reduced by co-treatment of the cells with SB203580 (10-6 M), a specific inhibitor of p38 MAPK. These results suggest that caveolin-1 protein plays an important role in the internalization of albumin in podocytes. In addition, albumin induces apoptosis by activating the reticulum stress in these cells, mainly through the PKC / p38MAPK / caspase-12 pathway.

O objetivo do presente trabalho foi comparar os efeitos dos distintos ambientes endócrinos peri-ovulatórios na proliferação celular, no metabolismo das poliaminas e no ambiente redox do útero bovino durante o diestro inicial. Para isso, controlou-se farmacologicamente o crescimento do folículo objetivando induzir a ovulação de folículos de maior diâmetro (grupo folículo grande-CL grande, FG-CLG) ou de menor diâmetro (grupo folículo pequeno-CL pequeno, FP-CLP). Trinta vacas multíparas Nelore, foram pré-sincronizadas, metade destes animais foram destinados para o grupo FG-CLG e receberam uma dose de prostaglandina F2&#945; (PGF) e um dispositivo de progesterona, juntamente com benzoato de estradiol no D10. No momento da retirada dos dispositivos de progesterona (entre D1,75 e D2,5) todos os animas receberam uma dose de PGF. A ovulação foi induzida com acetato de buserelina (D0). O que diferiu entre os tratamentos foi que os animais do grupo FP-CLP não receberam uma dose de PGF no D10 e o momento da retirada dos dispositivos foi entre D1,25 e o D1,5. No D7 um subgrupo dos animais foi abatido e amostras de endométrio e lavado uterino foram coletadas para as análises laboratoriais. Os animais do grupo FG-CLG apresentaram no D0 um folículo 1,2 vezes maior e estradiol 2,3 vezes maior em relação ao FP-CLP. Consequentemente, as vacas do FG-CLG desenvolveram CL maiores (1,6 vezes) e mais pesados (1,4 vezes) o que proporcionou no D7 concentrações de P4 1,5 vezes maior em relação ao FP-CLP. Primeiramente, uma análise do transcriptoma endometrial foi realizada e indicou que processos celulares como proliferação, composição de matrix extracelular, processos metabólicos e processos de oxirredução foram afetados pelo modelo experimental. Para avaliar a condição proliferativa e/ou apoptótica endometrial análises de imunomarcação foram realizadas (Ki-67, marcador de proliferação e caspase 3 ativada, marcador de apoptose). O número de células positivas para Ki-67 no epitélio luminal foi 4,1 vezes maior no FP-CLP, porém não houve diferença na marcação da caspase 3 ativada. No epitélio glandular tanto o ki-67 (1,4 vezes) como a caspase 3 ativada (2,6) estavam aumentados no grupo FG-CLG. Em relação à síntese das poliaminas não houve diferença entre os grupos nas concentrações das poliaminas e abundância dos transcritos e proteína das enzimas de síntese. Por outro lado, foi detectada uma forte associação entre a expressão do gene SAT1 com o gene ODC1 (r2: 0,73; P<0,01) e também entre os genes AZIN1 e AMD1 (r2: 0,61; P<0,01). Quanto ao ambiente redox não houve diferença entre os tratamentos no lavado uterino mas no endométrio, no grupo FP-CLP, houve redução da atividade das enzimas Catalase (0,5 vs 0,79 U/mg proteína; P<0,01), glutationa peroxidase (2,0 vs 2,43 nmol NADPH/min/mg proteína; P<0,01), aumento da atividade da Superóxido dismutase (44,77 vs 37,76 U; P=0,04) e da peroxidação lipídica (28,5 vs 17,43 nmol/MDA/mg proteína; P<0,001), mas sem alterar as quantidades da espécies reativas. De acordo com os resultados obtidos, pode-se concluir que o ambiente endócrino peri-ovulatório regula a proliferação endometrial mas sem alterar a via de síntese das poliaminas e modula também o ambiente redox uterino / This work aimed to compare the effects of the different periovulatory endocrine milieu on the several molecular pathways: as cellular proliferation, polyamine metabolism and redox environment of the bovine uterus during the early diestrus. For this, we controlled pharmacologically the follicular growth to induce the ovulation of larger follicle (Large Follicle-Large Corpus lutem group LF-LCL) or smaller follicle (Small follicle-Small Corpus luteum group SF-SCL). Thirty multiparous Nelore cows were synchronized. Fifteen cows were assigned for each group. On the LF-LCL, the cows received a dose of prostaglandin F2&#945; (PGF), a progesterone device and an estradiol benzoate on D10. On the time of progesterone device was withdraw (between D1.75 e D2.5) all the animals received a dose of PGF. The ovulation was induced with buserelin acetate (D0). The unique difference between the groups was that animals of SF-SCL did not received a dose of PGF on D10 and the progesterone device withdraw was between D1.25 e o D1.5. On D7 a subset of animals was slaughtered and the endometrial and uterine washings samples were collected for laboratorial analyses. On D0 the animals of LF-LCL had a 1.2 times larger follicles and 2.3 times higher levels of estradiol than animals of SF-SCL. Firstly, an endometrial transcriptome analyses was realized and suggested that several cellular processes as proliferation, metabolic processes and oxi-reduction processes were affected by experimental model. To evaluate the proliferative and/or apoptotic condition, endometrial immunohistochemistry analyses were realized (ki-67, proliferation marker and caspase 3 activated, apoptose marker). The number of Ki-67 positive cells in the luminal epithelium was 4.1 times higher on SF-SCL. However, there was no difference in caspase 3 activated analyses. On the glandular epithelium both ki-67 (1.4) and caspase 3 activated (2.6) were increased on LF-LCL. About polyamine synthesis pathway there was no difference in polyamines levels and gene and protein expression of synthesis enzymes between the groups. In other hand, it was detected a strong association between SAT1 gene expression and ODC1 gene expression (r2: 0.73; P<0.01) and also between AZIN1 and AMD1 gene expression (r2: 0.61; P<0.01). On the redox environment analysis there was no difference between the groups on the uterine washings but the SF-SCL group had lower endometrial catalase (0.5 vs. 0.79 U/mg protein, P<0.001) and glutathione peroxidase (GPx; 2.0 vs. 2.43 nmol NADPH/min/mg protein, P=0.04) activity, as well as higher lipid peroxidation (28.5 vs. 17.43 nmol MDA/mg of protein, P < 0.001) and superoxide dismutase (SOD) activity (44.77 vs. 37.76 U; P=0.04). There were no differences in the endometrial reactive species (RS) between the groups. In conclusion, the periovulatory endocrine milieu regulates the endometrial proliferation but without alterations in polyamine metabolism and also modulates the uterine redox environment in beef cattle

A desnutrição pode induzir lesão celular, comprometendo os mecanismos envolvidos de proliferação, diferenciação e morte celular. Estudos de nosso laboratório tem demonstrado, em modelo murino de desnutrição protéica e protéico-energética, hipoplasia medular com evidências histológicas de alteração da matriz extra celular. Nosso objetivo foi avaliar a eventual participação dos processos de apoptose, necrose e autofagia no desenvolvimento da hipoplasia medular observada nesse modelo. Para isso foram utilizados dois grupos de camundongos C57BL/6J machos, adultos, mantidos em gaioleiros metabólicos. O grupo controle (C) recebeu ração normoproteíca contendo 12% de proteína e o grupo desnutrido (D), alimentado com ração hipoprotéica contendo 2% de proteína. A fonte protéica utilizada foi a caseína. O período de indução da desnutrição foi cerca de cinco semanas, definido pela perda de 20 a 25 % de peso corpóreo por parte dos animais do grupo desnutrido. Após esse período, os animais de ambos os grupos foram anestesiados e realizada a coleta das amostras biológicas para avaliação nutricional e hematológica e coletadas células da medula óssea para avaliação da apoptose, necrose e autofagia. Para avaliação da apoptose e necrose as células foram duplamente marcadas com Annexina V, PI e caspase 3 que foram analisadas por citometria de fluxo . A expressão da protéina BCL-2 foi quantificada pela técnica de Western Blotting. A análise não demonstrou diferença estatística entre os grupos para esses parâmetros. Para avaliação da autofagia extraiu-se proteínas das células da medula óssea e avaliou-se a expressão das proteínas Akt e mTOR total e fosforilado , os complexos de mTor (Raptor, Rictor e G&#946;l) , Beclin-1 e LC3II. Os resultados demonstraram aumento significativo de mTOR total ,Raptor , Beclin-1 e LC3II e diminuição na fosforilação de mTOR nas células oriundas de animais desnutridos em relação ao grupo controle. A desnutrição não modificou a expressão de Akt total, porém houve diminuição da fosforilação de Akt e diminuição na expressão das proteínas Rictor e G&#946;l nas células analisadas. Como os processos apoptóticos e autofágicos podem ser de difícil detecção in vivo, também refizemos os experimentos in vitro, estimulando as células com compostos pró-apoptóticos (campotecina) e pró-autofágicos (tamoxifeno). Nesses experimentos observamos que, apenas quando estimulamos as células de animais desnutridos com camptotecina, as mesmas, no período de 12 horas apresentaram maior percentagem de apoptose inicial em relação a 0 horas , sugerindo que há um período em que as células desnutridas são sinalizadas para via apoptótica sendo mais susceptível ao estimulo. As células de animal desnutrido estimulado apresentaram após 12 horas aumento significativo da apoptose tardia em relação ao controle estimulado , indicando que nesse período há um aumento da apoptose tanto em processo inicial , tanto em processo tardio. Avaliamos a autofagia em uma cinética de 0, 2, 6, 18 e 24 horas in vitro e observamos aumento significativo da autofagia em células da medula óssea de animais desnutridos em 0 horas e após 18 horas de estímulo com tamoxifeno (20 &#181;M) em relação ao respectivo controle, demonstrando que nesse período a autofagia começa a ser induzida através do estimulo mais facilmente do que o controle. Autofagia é um dos principais contribuintes para o metabolismo celular, fornecendo nutrientes quando os mesmos estão indisponíveis, e, portanto, no nosso modelo de desnutrição protéica a hipoplasia medular estaria em processo autofágico como mecanismo de reparo e sobrevivência. / Malnutrition can induce cell damage, compromising the mechanisms involved in proliferation, differentiation and cell death. Studies from our laboratory have demonstrated, in a murine model of protein malnutrition and protein-energy, marrow hypoplasia with histologic evidence of alteration of the extracellular matrix. Our objective was to evaluate the possible involvement of the processes of apoptosis, necrosis and autophagy in the development of bone marrow hypoplasia observed in this model. For this we used two groups of C57BL/6J adult male kept in metabolic gaioleiro. The control group (C) received normal protein diet containing 12% protein and undernourished group (D), fed low protein diet containing 2% protein. The protein source used was casein. The induction period of undernutrition was approximately five weeks, as defined by loss of 20 to 25% of body weight per part of group malnourished. After this period, the animals of both groups were anesthetized and held the collection of biological samples for nutritional assessment and hematology and bone marrow cells collected for evaluation of apoptosis, necrosis and autophagy. For assessment of apoptosis and necrosis of the cells were double labeled with Annexina V and PI caspase 3 were analyzed by flow cytometry. The expression of Bcl-2 was quantified by Western Blotting technique. The analysis revealed no statistical difference between the groups for these parameters. For evaluation of autophagy proteins extracted from bone marrow cells and evaluated the expression of proteins Akt and phosphorylated and total mTOR, complexes of mTOR (Raptor, and Rictor G&#946;l), Beclin-1 and LC3II. The results showed significant increase in overall mTOR, Raptor, and LC3II Beclin-1 and decreased phosphorylation of mTOR in cells derived from malnourished animals compared to the control group. Malnutrition did not modify the expression of Akt total, but decreased phosphorylation of Akt and decreased expression of the protein Rictor and G&#946;l cells analyzed. As apoptotic and autophagic processes can be difficult to detect in vivo, also redid the experiments in vitro, stimulating the cells with pro-apoptotic compounds (campotecina) and pro-autophagic (tamoxifen). In these experiments we observed that, when only stimulate cells with camptothecin malnourished, the same at 12 hours had a higher percentage of initial apoptosis compared to 0 hours, suggesting that there is a period in which cells are signaled to via malnourished being more susceptible to apoptotic stimuli. The animals starved cells stimulated after 12 h showed significant increase in apoptosis compared to control late stimulated, indicating that at that time there is an increase in apoptosis both in the initial process, both late process. Autophagy evaluated in kinetics of 0, 2, 6, 18 and 24 hours in vitro and observed a significant increase in autophagy in bone marrow cells of malnourished at 0 hours and after 18 hours stimulation with tamoxifen (20 microM) than the respective control, demonstrating that this period autophagy begins to be induced by stimulating more easily than the control. Autophagy is a major contributor to cellular metabolism, providing nutrients when they are unavailable, and therefore in our model of protein malnutrition in the marrow hypoplasia would autophagic process as a mechanism for survival and repair.

A produção comercial de bovinos produzidos por transferência nuclear de célula somática permitiu o desenvolvimento de novo modelo no estudo da placenta. A necessidade da cesariana para o nascimento do bezerro favorece a coleta das membranas fetais. Alterações como número total de placentônios, tamanho, formato, árvores vilosas, cordão umbilical, assim como alterações no recém nascido já foram mostradas anteriormente. Gestações produzidas por transferência de núcleo freqüentemente apresentam retenção de placenta. Durante a palpação retal após dois dias da cesariana notou-se placentônios sem diminuição no tamanho e sem alteração na consistência. A observação da ausência de regressão levaram à formulação da hipótese de placentônios provenientes de gestações produzidas por transferência de núcleo apresentam menor freqüência de apoptose quando comparados com placentônios provenientes de gestações produzidas por monta natural. Para testar essa hipótese 15 placentônios provenientes de clones e 3 placentônios provenientes de monta natural foram coletados e congelados em nitrogênio líquido. A extração de RNA foi realizada mediante protocolo Trizol (Invitrogen, Brasil) e a reação de trascriptase reversa feita com Kit Impron II (Promega, Brasil), usando 1&micro;g de RNA total. A quantificação relativa foi desenvolvida no &quot;7500 Real Time PCR System&quot; (Applied Biosystems, EUA), em reação de 25&micro;L contendo 1X &quot;Power SYBR Green PCR Master Mix&quot; (Applied Biosystems, EUA), 1&micro;g de cDNA e 0,6&micro;M de cada primer (BAX, BCL2, e GAPDH). Para a quantificação dos genes ITM2B e PI3K, também se utilizou o gene GAPDH como gene endógeno e reação contendo 1x &quot;Taqman Universal Master Mix&quot; (Applied Biosystems, EUA), 40ng de cDNA, 0,72&micro;M de cada primers (ITM2B, PI3K e GAPDH) e 0,2&micro;M de cada sonda. O programa &quot;LinRegPCR&quot; (RAMAKERS et al., 2003) foi usado para o cálculo da eficiência individual de cada reação e para o cálculo estatístico usou-se o programa &quot;REST2005&quot; (PFAFFL et al., 2002). Os resultados mostraram que o gene BAX possui redução da expressão relativa no grupo transferência de núcleo (P=0,04), enquanto os genes BCL2, ITM2B e PI3K foram iguais entre grupo transferência de núcleo e monta natural. A relação BAX/BCL2 foi maior que 1 em 12 dos indivíduos analisados 12/15 (80%). Nenhuma diferença significativa foi encontrada quando comparadas variáveis como sexo, sobrevivência e peso ao nascimento para todos os genes estudados. A redução da expressão do BAX no grupo transferência de núcleo sugere que a apoptose é menor neste grupo e a relação BAX/BCL2 indica que a redução na taxa de morte celular programada pode ser responsável pela redução na taxa de regressão dos placentônios. / The study of placenta from somatic cell nuclear transfer pregnancy originated a new model of study after the commercial production of bovine nuclear transfer clones, this technique requires caesarean section, that allows collection of fetal membranes. Alterations as differences in the placentomes total number, size, villous trees, umbilical cord and new born alterations were already described in NT placenta. These nuclear transfer gestations frequently have placental retention and during rectal palpation two days after caesarean section, we observed placentomes with normal characteristics as before section, suggesting an absence of recending. This information about the receding absence lead us to hypothesize that placentomes produced from nuclear transfer pregnancies show lower frequency of apoptosis thus produced from natural. For testing this hypothesis we collected 15 fragments of placentomes from nuclear transfer fetus and 3 of natural mating. The RNA extraction was performed with Trizol (Invitrogen, Brazil) protocol and the reverse transcriptase by Impon II (Promega, Brazil), using 1µg of total RNA. We performed the real time relative quantification technique in the &quot;7500 SDS System&quot; (Applied Biosystems, USA) to investigate the mRNA expression of BAX, BCL2 as apoptosis genes and GAPDH as endogenous gene, with concentrations of 1X Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA), 1&micro;g of cDNA and 0.6&micro;M of each primer (BAX, BCL2, and GAPDH) in 25&micro;L of total reaction. The ITM2b and PI3K as apoptosis genes and GAPDH as endogenous gene with concentrations of 1x Taqman Universal Master Mix (Applied Biosystems, USA), 40ng of cDNA, 0.72&micro;M of primers (ITM2B, PI3K and GAPDH) and 0.2&micro;M of each probe. The &quot;LinRegPCR&quot; software (RAMAKERS et al., 2003) was used for individual efficiency calculation and the &quot;REST2005&quot; (PFAFFL et all, 2002) software for statistical analysis, using the standard efficiency. The results show that BAX gene is down regulated in the nuclear transfer group (P=0.04), while the BCL2, ITM2B and PI3K are equal in nuclear transfer and natural mating groups. The relation BAX/BCL2 was greater than 1 in 12 nuclear transfer samples 12/15 (80%). No significant difference was found when evaluated variables such as survival, calv sex, birth weight for all studied genes. The lower expression of BAX gene in nuclear transfer groups suggests that apoptosis is lower in this group and the relation BAX/BCL2 is indicative that a lower rate of apoptosis may be responsible for the lower rate of placentome receding.

Anormalidades citogenéticas recorrentes são encontradas nas células tumorais de portadores de mieloma múltiplo. No momento do diagnóstico a t(4;14)(p16;q32) e a del(17p13) ocorrem em 10-20% e 5-10% dos casos, respectivamente, e são associadas à evolução clínica desfavorável. A del(13q14), por sua vez, ocorre em cerca de metade dos pacientes, porém não apresenta valor prognóstico importante. Entretanto, há evidências na literatura de que a del(13q14) seja um pré requisito para a expansão tumoral. O objetivo deste trabalho foi determinar a prevalência destas anormalidades cromossômicas em portadores de mieloma múltiplo recém diagnosticado e correlacioná-las com as taxas de proliferação e apoptose celular na medula óssea e a quantificação de plasmócitos em sangue. Amostras de aspirado de medula óssea provenientes de 84 portadores de mieloma múltiplo recém diagnosticado foram avaliadas quanto à presença de del(13q14), t(4;14)(p16;q32) e del(17p13) pela técnica de marcação fluorescente dos plasmócitos seguida pela hibridação in situ por fluorescência (cIg-FISH). Desta forma, foi realizada a correlação entre estas alterações e a quantificação de plasmócitos em sangue periférico, a proporção de plasmócitos positivos para o marcador de proliferação celular Ki-67 e para o marcador de apoptose anexina V, obtidos pela técnica de citometria de fluxo. Concomitantemente, foram avaliados parâmetros clínicos e laboratoriais e realizada a análise de sobrevida global (SG) e sobrevida livre de eventos (SLE). Os pacientes foram divididos em quatro grupos de acordo com a anormalidade citogenética presente: (1) grupo com t(4;14)(p16;q32), (2) grupo com del(17p13), (3) grupo com del(13q14) e sem nenhuma das outras alterações e (4) grupo sem nenhuma das anormalidades pesquisadas. Foi possível realizar a pesquisa de todas as anormalidades cromossômicas em 76 pacientes dos quais: vinte nove (38,1%) possuíam somente del(13q14), seis (7,89%) possuíam t(4;14)(p16;q32) e seis (7,89%) possuíam del(17p13). Não foi observada diferença estatisticamente significante entre os diferentes grupos de anormalidades citogenéticas quanto à mediana de expressão de Ki-67 em plasmócitos (p=0,7), a mediana de marcação dos plasmócitos com anexina V (p=0,94), a razão entre expressão de Ki-67 e marcação com anexina V (p=0,57) e a quantidade de plasmócitos em sangue periférico (p=0,07). Entretanto, observou-se tendência à correlação entre porcentagem de células acometidas pela del(13q14) e expressão de Ki-67 (p=0,06). A maior expressão de Ki-67 e a maior quantidade de plasmócitos circulantes se associaram a características clínicas e laboratoriais de mau prognóstico. Em análise multivariada somente níveis séricos elevados de desidrogenase lática (DHL) (p=0,002) se associaram à SLE e DHL elevado (p=0,013), a não realização de quimioterapia em altas doses com resgate de células tronco hematopoéticas (p=0,016), sistema de estadiamento internacional (ISS) III (p=0,001) e t(4;14)(p16;q32) (p=0,04) se associaram à pior SG / Recurrent cytogenetic abnormalities are found in multiple myeloma tumour cells. Among them, t(4;14)(p16;q32) e a del(17p13) occur respectively in 10-20% and 5-10% cases in the moment of diagnosis, and are associated with unfavorable clinical outcome. Del(13q14) occurs in half of patients, although, it has no important prognostic value. However, there are evidence in literature that del(13q14) is a pre requisite for tumour expansion. The purpose of this work was to determine the prevalence of chromosomal abnormalities in newly diagnosed multiple myeloma patients and correlate these abnormalities with the quantification of plasmocytes in blood and the rates of cellular proliferation and apoptosis. Bone marrow samples from eighty four newly diagnosed multiple myeloma patients were evaluated for the presence of del(13q14), t(4;14)(p16;q32) and del(17p13) by fluorescent in situ hybridization coupled to cytoplasmic staining of specific imunoglobulin (clg-FISH). Therefore, a correlation between these alterations and the proportion of plasmocytes positive for the proliferation antigen Ki-67 and for the apoptosis marker annexin V, measured by flow cytometry, was done. The quantification of plasmocytes in peripheral blood by flow cytometry was also made. Concurrently, clinical and laboratorial parameters, overall survival (OS) and event free survival (EFS) were also evaluated. Patients were divided in four groups accordingly to the cytogenetical abnormality present (1) t(4;14)(p16;q32), (2) del(17p13), (3) del(13q14) and none of the other alterations and (4) group with no researched abnormality. The research of all chromosomal abnormalities was possible in 76 patients: 29 (38,1%) had only del(13q14), six (7,89%) had t(4;14)(p16;q32) and six (7,89%) had del(17p13). No significant statistical difference was observed between different groups comparing the median expression of Ki-67 in plasmocytes (p=0,7), the median plasmocytes positive for annexin V (0,94), the ratio between Ki-67 and annexin V (p=0,57), and the quantity of plasmocytes in peripheral blood (p=0,07). However, there was a tendency for a correlation between proportion of cells with del(13q14) and Ki-67 expression (p=0,06). Higher Ki-67 expression and higher number of blood plasmocytes correlated to clinical and laboratorial features associated with unfavorable outcome. In multivariate analyses, only elevated lactate dehydrogenase (p=0,002) was associated to inferior EFS, and elevated lactate dehydrogenase (p=0,013), treatment without high dose chemotherapy with stem cell support (p=0,016), International Staging System III (p=0,001) and presence of t(4;14)(p16;q32) (p=0,04) were associated to inferior OS

Introdução: A ereção peniana é um processo neurovascular complexo dependente do relaxamento da musculatura lisa dos corpos cavernosos. O etanol exerce diversos efeitos na atividade sexual masculina e a disfunção sexual induzida pelo etanol é causada pelo seu efeito no sistema nervoso central, principalmente pela sua ingestão aguda e crônica. Foi demonstrado que o etanol afeta significativamente tanto a contração quanto o relaxamento da musculatura lisa dos corpos cavernosos. Os relatos da ocorrência do mecanismo de apoptose nos corpos cavernosos estão associados à denervação, à castração e a doenças crônicas como o diabetes. Poucos são os estudos morfológicos sobre o efeito do etanol no tecido cavernoso; porém, não são descritos trabalhos relacionando as alterações morfológicas causadas pelo etanol no tecido cavernoso, a eventos moleculares e sua relação com o mecanismo de apoptose celular. Objetivos: avaliar e comparar o efeito do alcoolismo na morfometria e no mecanismo de apoptose dos corpos cavernosos de ratos submetidos a modelo de alcoolismo crônico. Material e métodos: Foram utilizados 24 ratos Wistar divididos em dois grupos: controle (C) e tratado com etanol (A) a 20% durante sete semanas. As amostras dos corpos cavernosos foram preparadas para o estudo morfométrico pela coloração de tricrômico de Masson, para o estudo da expressão protéica de CASPASE 3 (pró-apoptótica) por imunohistoquímica e para o estudo da expressão gênica sérica e no tecido cavernoso do miRNA-21 (anti-apoptótico). Resultados: O estudo morfométrico mostrou principalmente diminuição de fibras musculares lisas dos corpos cavernosos nos animais do grupo A. Também foi observado aumento significativo na expressão de CASPASE 3 nos animais do grupo A e baixa expressão gênica sérica e no tecido cavernoso do miRNA-21 nos grupos C e A. Conclusões: A análise morfométrica correspondente à área ocupada pelas fibras musculares lisas dos corpos cavernosos nos animais do grupo A mostrou correlação com os locais de maior expressão protéica de CASPASE 3 e, portanto, de apoptose. Neste estudo, a morte celular por apoptose não foi suprimida pela expressão do miRNA-21. / Introduction: Penile erection is a complex neurovascular process dependent smooth muscle relaxation in the corpus cavernosum. Ethanol exerts different effects on male sexual activity and sexual dysfunction induced by ethanol is caused by its effect on the central nervous system, primarily for its acute and chronic ingestion. Ethanol has been shown to significantly affect both the contraction and the relaxation of smooth muscle of the corpus cavernosum. The reports of the occurrence of the apoptosis mechanism in the corpus cavernosum are associated with denervation, castration and chronic diseases like diabetes. There are few morphological studies on the effect of ethanol in the cavernous tissue, but are not described studies correlating morphological changes caused by ethanol in the cavernous tissue, the molecular events and their relation to the mechanism of apoptosis. Objectives: To evaluate and compare the effect of alcoholism in the morphometry and mechanism of apoptosis in the corpus cavernosum of rats subjected to chronic alcoholism model. Material and methods: 24 Wistar rats were divided into two groups: Control (C) and treated with ethanol (A) diluted 20% for seven weeks. Samples of the corpus cavernosum were prepared for morphometric study by Masson\'s trichrome stain, study for protein expression of CASPASE 3 (pro-apoptotic) by immunohistochemistry and study for gene expression of miRNA-21 (anti-apoptotic) in serum and the cavernous tissue. Results: The morphometric study primarily showed a decrease in smooth muscle cells of the corpus cavernosum in group A. Significant increase for expression of CASPASE 3 in group A and low gene expression of miRNA-21 was also observed in serum and the cavernous tissue in groups C and A. Conclusions: The morphometric analysis corresponding to the area occupied by smooth muscle cells of the corpus cavernosum in group A showed correlation with the sites of increased protein expression of CASPASE 3 and thus apoptosis. In this study, cell death by apoptosis was not suppressed by the expression of miRNA-21.

A desidroepierosterona (DHEA) é um hormônio esteroide produzido pelas glândula adrenal e gônadas em humanos. Diversas evidencias do efeitos anti-obesidade, antiinflamatórios e antioxidativos, além de ser precursor dos esteroides sexuais. No presente trabalho foi avaliando o efeito do DHEA sobre a citotoxicidade induzida 0,5mM de palmitato em miotubos L6, usando 2 concentrações distintas para o esteroide, uma próxima à fisiológica (10nM) e outra supra-fisiológica (100nM) por 12h. Foram avaliados parâmetros: viabilidade celular, apoptose, vias intracelulares envolvidas na apoptose, no estresse de retículo endoplasmatico e estado de estresse oxidativo. Os resultados obtidos foram, para ambas as concentrações de DHEA a redução do estresse de reticulo induzido por palmitato via Perk/eif2&#945;/CHOP. Além disso o DHEA impediu o aumento da expressão de iNOS e de proteína nitradas induzidas por palmitato. A partir dos resultados concluímos que o DHEA, tem efeitos anti-apoptótico e regulador da UPR. Alem do DHEA ter sido eficaz na redução do estresse oxidativo. / Dehydroepierosterone (DHEA) is a steroid hormone produced by the adrenal gland and gonads in humans. Several evidences of the antiobesity, anti-inflammatory and antioxidative effects, besides being precursor of the sexual steroids. In the present study, the effect of DHEA on the 0.5mM induced cytotoxicity of palmitate in L6 myotubes was evaluated, using 2 different concentrations for the steroid, one physiological (10nM) and one supra-physiological (100nM) for 12h. The following parameters were evaluated: cell viability, apoptosis, intracellular pathways involved in apoptosis, endoplasmic reticulum stress and oxidative stress state. The results obtained were, for both concentrations of DHEA, reduction of the stress of reticulo induced by palmitato via Perk / eif2&#945; / CHOP. In addition, DHEA prevented increased expression of iNOS and nitrite protein induced by palmitate. From the results we conclude that DHEA has anti-apoptotic and UPR regulatory effects. In addition to DHEA, it has been effective in reducing oxidative stress.

L'apoptose joue un rôle de protection contre la formation de cellules tumorales. Ce phénomène peut être régulé par la voie extrinsèque qui consiste en partie en l'activation du récepteur de mort DR5 (Death Receptor 5) par le ligand TRAIL (Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Induction Ligand), dont l'intérêt majeur est d'induire l’apoptose des cellules tumorales uniquement. Nous nous sommes intéressés à des ligands peptidomimétiques de TRAIL : ces peptides de 16 acides aminés existent sous formes monomériques ou multimériques, et présentent des affinités pour la protéine DR5 jusqu’à 5 fois supérieures à celle de TRAIL. Des études fonctionnelles ont montré que ces ligands induisent l’apoptose des cellules tumorales in vitro, et ce de manière spécifique. Ils agissent également in vivo par réduction du volume de tumeurs de souris. Le but de ce projet est de caractériser les mécanismes d’interaction de ces peptides avec le récepteur DR5, par Résonance Magnétique Nucléaire et Cristallographie aux Rayons X. Nous avons produit le domaine extracellulaire de DR5 par voie recombinante en fusion avec la protéine NusA pour un meilleur repliement des protéines cibles, et un protocole de 4 étapes de purification a permis d’isoler la protéine DR5. Nous avons attribué 89 % des résonances du squelette peptidique de DR5 par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), et le calcul de structure secondaire a montré que la protéine adoptait en solution le même repliement secondaire en brins β que celui des structures de DR5 déposées dans la PDB (Protein Data Bank). Les titrations par RMN de DR5 avec les ligands monomériques et multimériques ont permis non seulement d’identifier la région d’interaction peptide-protéine dans le premier domaine riche en cystéines (CRD1) du récepteur, mais aussi de montrer que la liaison avec les oligomères entraînait des contacts protéine-protéine au niveau du CRD2, suggérant une dimérisation du récepteur. Cette hypothèse a été confirmée par des études de chromatographie d’exclusion de taille, qui ont montré une oligomérisation du récepteur en présence des dimères et trimères. Des études par cristallographie sont en cours afin de déterminer la structure atomique des complexes oligomériques avec DR5. Nos résultats montrent que ces ligands adoptent un mécanisme différent de celui de TRAIL dans l’activation de l’apoptose. / Apoptosis plays a protective role against the formation of tumor cells. This phenomenon can be regulated by the death receptor pathway, among which the Death Receptor 5 that can be activated by the TRAIL ligand (Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Induction Ligand), whose major interest is to induce tumor cell apoptosis, specifically. Our work focuses on peptidomimetic ligands of TRAIL: those 16 amino acid peptides exist as monomers or multimers and show affinity for DR5 protein as up to 5-fold the affinity of TRAIL. Functional assays have shown that not only those ligands induce in vitro apoptosis of tumor cells, but also show selectivity for cancer cells, and can reduce mice tumor volume in vivo. The purpose of this project is to characterize the mechanisms by which those ligands interact with DR5, by using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and X-Ray Crystallography. We have produced the recombinant extracellular domain of DR5 in fusion with the NusA protein, in order to increase the folding of the protein, and we have purified the receptor through a 4-step protocol. We assigned the backbone resonances of 89 % of the protein residues with NMR, and secondary structure calculations showed that DR5 adopts the same β strand folding in solution as from the DR5 crystal structures from the PDB (Protein Data Bank). NMR titrations of DR5 with monomeric and multimeric ligands have allowed us to identify the peptide-protein binding area within the first Cystein Rich Domain (CRD1) of the receptor, but also that the binding with oligomeric peptides lead to protein-protein interactions at the level of the CRD2, suggesting the dimerization of the receptor. This was confirmed par Size Exclusion Chromatography assays that showed an oligomerization of the receptor in the presence of dimeric and trimeric peptides. Ongoing crystallography assays are conducted in order to determine the 3D structure at the atomic level of oligomeric complexes with DR5. Our results show that peptidomimetic ligands of TRAIL display a different mechanism from TRAIL in the activation of apoptosis.

O chá ayahuasca é uma bebida psicotrópica que tem provocado polêmica devido ao uso indiscriminado por alguns grupos de pessoas e pela facilidade de compra pela internet. A bebida é feita por meio da decocção conjunta das plantas Banisteriopsis Caapi e Psychotria Viridis. Contém alcaloides beta-carbolínicos (?-carbolínicos) como harmina (HRM), harmalina (HRL) e harmalol, que possuem efeitos inibidores da monoaminooxidase A (MAO-A), sendo considerados protetores contra o dano oxidativo neuronal, além de ter ações anticonvulsivantes e efeitos ansiolíticos. Por outro lado, esses alcaloides, conjuntamente com a N,N-dimetiltriptamina, principal componente alucinógeno da P. Viridis, também têm sido descritos como neurotoxinas endógenas que podem participar no início de doenças neurodegenerativas. No presente estudo, a neurotoxicidade do chá ayahuasca foi estudada por meio da determinação da ocorrência de apoptose neuronal pelo método de fluorescência da Caspase-3 e pelo ensaio do TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay). Foram administrados, diariamente, durante vinte e um dias, por meio de gavagem gástrica, 2 ml de água a um grupo de ratos Wistar machos, controle (n=12) e 2 ml do chá ayahuasca 50% a outro grupo similar (n=12). Foram realizadas análises de glutationa (GSH), malonaldeído (MDA) e vitamina E séricas e hepáticas para avaliar a peroxidação lipídica (LPO), assim como análises urinárias de creatinina e ureia para avaliar o funcionamento renal dos animais. Os resultados nas análises do TUNEL mostraram significância estatística no grupo ayahuasca em relação ao grupo controle. A análise de Caspase-3 não mostrou diferenças entre os dois grupos. Os valores de MDA e GSH sérica, assim como da vitamina E hepática, apresentaram redução estatisticamente significativa no grupo tratado com o chá ayahuasca. Os resultados desta investigação apontam para a presença de um processo de estresse oxidativo nos ratos tratados com este chá, com achados estatisticamente significativos de apoptose neuronal com o ensaio do TUNEL. É recomendável a realização de outros estudos para elucidar os mecanismos neurotóxicos do chá ayahuasca. / Ayahuasca tea is a psychotropic beverage that has caused controversy due to the fact of being used indiscriminately by some group of people and the ease of purchase in the worldweb. The tea is derived by boiling the bark of the liana Banisteriopsis Caapi (B. Caapi) together with the leaves of Psychotria Viridis (P.Viridis). B. Caapi contains alkaloids as harmine, harmaline and harmalol, highly active reversible inhibitors of monoamine oxidase A and MAO-B. These compounds have been described as protecting neuronal mitochondria against oxidative damage, besides having anticonvulsivant and anxiolytic actions. On the other hand, these alkaloids, together with dimethyltryptamine (DMT), the main hallucinogenic component of P. Viridis, also had been described as endogenous neurotoxins that could participate in neurodegenerative diseases. In this work, the neurotoxicity of ayahuasca was studied by the method of fluorescence of Caspase-3 and the TUNEL assay. By gastric gavage, was administered in a daily regime during twenty-one days, 2 ml of water to a group of rats (control n=12) and 2 ml of 50% ayahuasca tea to another similar group (n=12). Analysis of reduced glutathione (GSH), malonaldehyde (MDA) and vitamin E was made, to assess lipid peroxidation and also analysis of urinary urea and creatinine, to assess kidney function of animals. The results of the TUNEL assay, showed statistical significant values in the ayahuasca group. No differences were found in Caspase-3 analysis. The values of serum MDA and GSH as well as hepatic vitamin E, showed a statistically significant reduction in the group treated with ayahuasca. The results of this investigation indicate the presence of oxidative stress in rats treated with ayahuasca tea, with statistical significant values of neuronal apoptosis measured by TUNEL assay. It is advisable to conduct further studies to elucidate the neurotoxic effects of ayahuasca tea.