A fragmentação do DNA espermático é uma das principais causas de infertilidade nos machos. Alterações na integridade do DNA podem ser decorrentes da ação de espécies reativas de oxigênio (EROS), de defeitos na protaminação e da apoptose. A sensibilidade do espermatozoide ovino frente as biotecnologias reprodutivas pode ser resultado de uma alta suscetibilidade a ação de EROS ou alterações na protaminação espermática desencadeadas por estresse oxidativo induzido por estresse térmico, tornando o espermatozoide mais suscetível a fragmentação de DNA. Com o objetivo de entender mais este processo, foi realizado um primeiro experimento para avaliar o status oxidativo, os atributos espermáticos e a expressão gênica de proteínas envolvidas nos processos de protaminação em diferentes níveis de suscetibilidade a peroxidação lipídica (baixo, médio, alto e altíssimo) em sêmen ovino. Foi observado um aumento da atividade enzimática da glutationa peroxidase e uma diminuição da atividade enzimática da glutationa redutase no plasma seminal no grupo com suscetibilidade a peroxidação lipídica alta e altíssima. Com relação a catalase, não foi verificado esse aumento, no entanto houve maior imunodetecção desta enzima. Em relação a condição espermática, observou-se um aumento na porcentagem de defeitos totais e lesões nas membranas acrossomal e plasmática, além de porcentagens menores de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial no grupo com maior suscetibilidade a peroxidação lipídica. Este mesmo grupo também apresentou alta suscetibilidade ao dano da cromatina e aumento do número de cópias do gene da protamina 1 (PRM1) em espermatozoides. O segundo experimento avaliou os atributos de espermatozoides provenientes do ejaculado e do epidídimo frente ao estresse térmico induzido por insulação testicular (tratado), assim como as relações com o status antioxidante. Observou-se diminuição da motilidade, vigor, turbilhonamento e aumento na porcentagem de defeitos maiores e menores, e de lesões na membrana acrossomal e plasmática em espermatozoides ejaculados no grupo tratado. Essas diferenças não foram observadas em espermatozoides epididimais. Uma maior atividade enzimática da glutationa peroxidase e da glutationa redutase foi observada no plasma seminal do grupo tratado. Foi verificado uma diminuição de espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado, indicando que o metabolismo mitocondrial parece estar envolvido no quadro de estresse oxidativo. Um terceiro estudo foi conduzido para verificar o efeito do estresse térmico na integridade da cromatina espermática, na protaminação do DNA espermático e na ativação de vias apoptóticas em testículo ovino. Em espermatozoides provenientes do ejaculado, houve um aumento da porcentagem de células com suscetibilidade a fragmentação da cromatina no grupo tratado; não observado em espermatozoides epididimais. Uma alta porcentagem de espermatozoides com fragmentação de DNA grau III (ensaio COMETA) e aumento do número de cópias de mRNA da proteína de transição 1 (TNP1) em espermatozoides provenientes do ejaculado, foi observada no grupo tratado. Já em espermatozoides provenientes do epidídimo, a PRM1 apresentou maior expressão no 30ο dia do ciclo espermático comparado a 7ο dia, enquanto que a TNP1 comportou-se de maneira contrária. Em relação a ativação de vias apoptóticas em testículo ovino, a proteína anti-apoptótica Bax foi imuno-identificada em espermatócitos e a Blc-2 em espermátides, sem diferença entre os grupos. Em conclusão, a alta susceptibidade dos espermatozoides ovinos a peroxidação lipídica altera o status oxidativo ocasionando um quadro de estresse oxidativo, principal causador de dano a cromatina. Adicionalmente, o estresse oxidativo induzido por estresse térmico prejudica os atributos espermáticos e aumenta a suscetibilidade dos espermatozoides a fragmentação de DNA. / Sperm DNA fragmentation is referred as one of the main causes of male\'s infertility. Among the etiologies of abnormalities on DNA integrity the action of reactive oxygen species (ROS), protamination failures and apoptosis are considered the most important. The known sensitivity of ram´s sperm to reproductive biotechnologies could be a result of a higher susceptibility to the action of ROS or changes in sperm protamination triggered by oxidative stress induced by heat stress. This would increase the susceptibility of sperm DNA to fragmentation. Initially, the ram sperm quality, seminal protamine gene expression and oxidative status were evaluated in semen samples of different levels of susceptibility to lipid peroxidation (low, medium, high and very high). There was an increase on glutathione peroxidase and decreased glutathione reductase enzymes' activity in groups with high and very high susceptibility to lipid peroxidation. However, only catalase showed increased immunodetection. An increase on total defects and damaged acrosomal and plasmatic membranes were observed in the group showing the highest susceptibility to lipid peroxidation. Also, the percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential, the percentage of sperm susceptible to chromatin damage and the number of copies of protamine 1 (PRM1) mRNA were increased in the group showing higher susceptibility to lipid peroxidation. The second study evaluated sperm\'s attributes from the epididymis and ejaculated sperm subjected to heat stress induced by testicular insulation (treated group), as well as correlations with the antioxidant status. We observed decrease on motility, vigor, and mass motility and increase on the percentages of sperm showing major and minor defects, and damaged plasma and acrosome membranes in the treated group. These differences were not observed in epididymal sperm. Increased enzymatic activities of glutathione peroxidase and glutathione reductase were observed in the treated group. Mitochondrial metabolism appeared to be involved in the oxidative homeostasis imbalance. This was effectively observed by a decrease on the percentage of sperm with high mitochondrial membrane potential in the treated group. A third study was conducted to determine the effect of heat stress induced by testicular insulation on the integrity of chromatin, protamination and apoptotic activation pathway in ram testis. An increase on the percentage of sperm with susceptibility to chromatin fragmentation in the treated group was observed. However, the previous findings were not observed in epididymal sperm. A higher percentage of sperm showing DNA fragmentation level III (Comet assay) and an increase on the number of copies of transition protein 1(TNP1) mRNA were observed in the treated group. In epididymal sperm, a higher expression of the PMR1 gene was observed on the 30th day of the espermatogenic cycle, while TNP1 behaved contrarily. In the testicular samples, the anti-apoptotic protein Bax was detected only in spermatocytes while Bcl-2 was observed singularly in spermatids, with no difference between groups. In conclusion, the disruption of oxidative homeostasis may be exacerbated by the higher susceptibility of ram\'s sperm to lipid peroxidation, which could be the main etiology of chromatin damage. In addition, oxidative stress induced by heat stress impairs sperm attributes and DNA integrity.

In dieser Arbeit wurde die zelluläre Pharmakokinetik mit den Teilaspekten Invasion, Evasion und intrazellulärer Verteilung sowie die Apoptoseinduktion als Parameter der Pharmakodyna- mik von zwei Anthrazyklinen, dem freien und liposomal verkapseltem Daunorubicin unter- sucht. Die Versuche wurden anhand einer T-lymfatischen Zelllinie, den CEM-Zellen, durchgeführt. Mittels Durchflußzytometer und konfokaler Lasermikroskop wurde die intrazelluläre Fluoreszenz gemessen, die der intrazellulären Konzentration entsprach. Es zeigte sich, dass freies Daunorubicin anfangs deutlich schneller in die Zellen einströmte als liposomal verkapseltes Daunorubicin und früher die maximale Konzentration erreichte. Über eine längere Versuchszeit kam es aber zu einer Angleichung der maximal erreichten Konzen- trationen. Der Invasionsverlauf von Daunoxome verlief sigmoidförmig, während Daunorubi- cin einer Sättigungskinetik folgte. Der Invasionsverlauf beider Anthrazykline war sowohl zeit- als auch konzentrationsabhängig. Die Versuche zur intrazellulären Verteilung zeigten, dass sich beide Stoffe nach drei Stunden Inkubationszeit vom Zytoplasma in den Kern verteilten. Daunorubicin erreichte sehr schnell seine maximale Fluoreszenz im Kern. Bei Daunoxome ließ sich auch nach sechs Stunden Inkubation eine weitere Zunahme der Fluoreszenz messen. Die Untersuchungen zur Apoptoseinduktion unterstützten die Aussagen zur Invasion. Dauno- rubicin induzierte zu Anfang deutlich schneller Apoptose als Daunoxome. Über den gemessenen Versuchszeitraum kam es aber zu einer Angleichung aller Apoptoseraten. Auch hier zeigte sich eine Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit. Die Ergebnisse der Evasionsversuche zeigten, dass Daunorubicin biphasisch und Daunoxome monophasisch ausströmte. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass freies Daunorubicin initial eine bessere zelluläre Pharmakokinetik und damit eine höhere Zytotoxizität aufweist als liposomal verkapseltes Daunorubicin. Über die Zeit kommt es allerdings zu einer Angleichung der Zytotoxizität. Damit ist Daunoxome auf zellulärer Ebene mindestens genauso wirksam wie Daunorubicin. / We studied the cellular pharmacokinetics, including uptake, intracellular distribution and efflux, and the induction of apoptosis as a parameter of pharmacodynamics of the two anthracyclines, free and liposomal encapsulated daunorubicin. We used a flowcytometer and a confocal lasermicroscope to measure the intracellular fluorescence in CEM-cells, corresponding to the intracellular concentration of the drugs. Free daunorubicin invaded initially the cells much quicker than liposomal encapsulated daunorubicin and attained earlier the maximum concentration. After the examined time daunoxome achieved the same maximum concentration as daunorubicin. The invasion of liposomal encapsulated daunorubicin followed a sigmoid course, while free daunorubicin followed a saturation kinetic. It was shown that the uptake of both anthracyclines was time- and concentration-dependent. The examinations about the intracellular distribution showed, that both drugs accumulated in the nucleus after three hours of incubation. Daunorubicin attained quickly the maximum fluorescence there, while daunoxome increased slowly for the next six hours. The results of the apoptosis induction correlated to the results of the uptake experiments. Free daunorubicin induced initially quicker apoptosis than liposomal encapsulated daunorubicin. At the end of the measured time all the apoptosis rates of both drugs appeared to be equal. It was determined that the induction of apoptosis also is time- and concentration-dependent. The efflux of daunoxome was monophasic in contrast to a biphasic decline of daunorubicin. These results indicate that free daunorubicin has improved initial cellular pharmacokinetics and therefore enhanced cytotoxicity compared with liposomal encapsulated daunorubicin. But over the examined period both got equal cytotoxicity. Therefore daunoxome is on the cellular basis at least as effective as daunorubicin.

BIM é uma proteína pro-apoptótica membro da família Bcl-2. No sistema imunológico, BIM foi descrita como reguladora da homeostase de linfócitos. Porém, ainda não foi estudado o papel do BIM no estabelecimento da resposta imune de linfócitos T CD8+. Sendo que os vetores adenovirais fortes ativadores da resposta, neste trabalho investigamos o papel de BIM na qualidade e frequência de linfócitos T CD8+ estimulados com Ad.cOVA. Camundongos C57Bl/6 selvagens, bim+/- e bim-/- foram imunizados com 2x106 PFU/100μl. Assim, observou-se uma redução da lise especifica e menor freqüência de linfócitos CD8+ produtores de IFNγ em camundongos bim-/-. Em paralelo, foi avaliada a resposta imune anti-tumoral destes camundongos sem encontrar diferencias significativas. A cinética da resposta efetora de linfócitos T CD8+ de camundongos bim-/- mostrou escassa perda das capacidades efetoras destes linfócitos, sendo o possível mecanismo para controlar a progressão tumoral. Em conclusão camundongos bim-/- apresentam uma menor freqüência de células efetoras, sugerindo um importante papel de BIM na produção de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos trás a vacinação com Ad.cOVA. / BIM is a pro-apoptotic member of the Bcl-2 protein family. In the immune system, BIM has been described as lymphocyte homeostasis regulator. However, the role of BIM in the establishment of the immune response of CD8+ T lymphocytes has not yet been studied. As the strong adenoviral vectors activating the response, we investigated the role of BIM in the quality and frequency of Ad.cOVA-stimulated CD8+ T lymphocytes. Wild C57Bl/6 mice, bim+/- and bim-/- were immunized with 2x106 PFU/100μl. Thus, a reduction of the specific lysis and decreased frequency of IFNγ producing CD8+ lymphocytes in bim-/- mice was observed. In parallel, the anti-tumor immune response of these mice was evaluated without finding significant differences. The kinetics of the effector response of CD8+ T lymphocytes from bim-/- mice showed little loss of the effector capacities of these lymphocytes, being the possible mechanism to control tumor progression. In conclusion, bim-/- mice show a lower frequency of effector cells, suggesting an important role of BIM in the production of antigen-specific CD8+ T lymphocytes after vaccination with Ad.cOVA.

O melanoma é a forma mais mortal de câncer de pele, origina-se de células produtoras de pigmentos, os melanócitos. Esses podem ser cutâneos ou não-cutâneos (encontrados no revestimento da membrana coróide do olho, nas meninges, e nos tratos gastrintestinal e geniturinário). O aumento da incidência de melanomas malignos nas últimas décadas, e sua alta taxa de mortalidade e grande resistência a maior parte das terapias, tem sido um enorme desafio para a comunidade científica. Particularmente, a falta de habilidade de indução à morte por apoptose em resposta à quimioterapia e outros estímulos externos permitem uma vantagem seletiva para progressão tumoral, formação de metástase e resistência à terapia em melanomas. O estresse oxidativo e espécies reativas de oxigênio (EROs) vêm sendo, há muito tempo, reconhecidos como importantes desencadeadores e moduladores da apoptose. Porém o exato papel do estresse oxidativo no processo apoptótico ainda é uma questão de debate. Antioxidantes tendem a possuir propriedades regulatórias de tradução de sinais que devem ou não estar ligadas as suas capacidades de inativar oxidantes. Porém em certas condições, um forte ambiente oxidante onde há falta de suporte para regenerar (reduzir) antioxidantes oxidados, permite que alguns antioxidantes assumam características de um pró-oxidante. Foi demonstrada a capacidade citotóxica de um potente antioxidante, 4-nerolidilcatecol (4-NC), extraído da planta Pothomorphe umbellata L. Miq, sobre linhagens tumorais de melanoma e sobre fibroblastos humanos normais. Esse composto foi capaz de induzir a parada do ciclo celular em G1, bem como diminuir a atividade de MMPs e em outras linhagens de melanoma foi capaz de induzir a morte celular por apoptose. Estudos subseqüentes mostraram que o mecanismo de ação deste composto inicia-se com a formação e acúmulo de EROs, além da inibição da enzima catalase. O 4-NC foi capaz de induzir a morte por apoptose via mitocondrial, aumentando os níveis das proteínas p53, Noxa, Mcl-1, clivando Bax e Bid e induzindo a clivagem das caspases 3 e 9. Além disso, em modelo de pele artificial contendo melanoma, o 4-NC foi capaz de conter a invasão do melanoma para a estrutura dérmica da pele reconstituída. Foram utilizadas como controle de diferenciação as proteínas Queratina 10 e 14, Involucrina e, como marcador do melanoma, a proteína S100. Parte desta invasão é contida devido à inibição da ativação das MMP-2 e -9 e ativação de TIMP-2 pelo 4-NC. Sendo assim, esse composto se mostra como um potencial quimioterápico no tratamento do melanoma humano. / Melanoma is the most agressive form of skin cancer, it arises from the pigment-producing cells, melanocytes. These may be cutaneous or non-cutaneous (found in the lining membrane of the eye choroid, the meninges, and gastrointestinal and genitourinary tracts). The increased incidence of malignant melanomas in recent decades, its high mortality rate and high resistance to most therapies has been a major challenge to the scientific community. It\'s particularly difficult to induce cell death by apoptosis in response to chemotherapy and other external stimuli, which may provide a selective advantage for tumor progression, metastasis formation and resistance to therapy in melanoma. Oxidative stress and reactive oxygen species (ROS) have been recognized for a long time as important triggers and modulators of apoptosis, but the exact role of oxidative stress in the apoptotic process is still a matter of discussion. Antioxidants tend to possess properties to regulate transduction signals that may not be related to their ability to inactivate oxidants. Under certain conditions, in a strong oxidizing environment where there is lack of support to regenerate (reduce) oxidized antioxidants, some antioxidants can assume characteristics of pro-oxidant. The 4-nerolidylcatechol (4-NC) is a potent antioxidant that is extracted from the plant Pothomorphe umbellata L. Miq. Its citotoxic potential has been demonstrated on melanoma tumor cell lines and on normal human fibroblasts. This compound was able to induce cell cycle arrest in G1, decrease the activity of MMPs and cell death by apoptosis. Subsequent studies showed that the mechanism of action of this compound starts with the formation and accumulation of ROS, and inhibition of the enzyme catalase. The 4-NC was able to induce apoptosis via mitochondria, increasing the levels of p53, Noxa, Mcl1, cleaving Bax and Bid and inducing cleavage of caspases 3 and 9. Furthermore, in a model of artificial skin containing melanoma 4-NC was able to contain the invasion of melanoma to the dermal part of the skin. Proteins keratin 10 and 14, involucrin and S100 were used as control of differentiation. Part of this invasion is restrained due to TIMP-2 activation and the inhibition of MMP-2 and -9 activation by 4-NC. Concluding, this compound can be used as a potential chemotherapeutic agent in the treatment of human melanoma.

Durante o ciclo de vida da Leishmania, amastigotas vivem no interior de fagolisossomas de células fagocíticas de hospedeiros vertebrados, enquanto promastigotas vivem no interior do vetor invertebrado. Proteases intracelulares como as caspases são as principais efetoras no processo apoptótico. Metacaspases (MCAs) são formas evolutivas distantes das caspases de metazoários, presentes em protozoários, plantas e fungos, e vistas como potenciais alvos para combate dos parasitas sem prejuízo do hospedeiro. Ligantes e moduladores das metacaspases são até hoje desconhecidos. O Phage Display é uma técnica baseada na expressão de proteínas sintéticas nos capsidíos de fagos, usada com o propósito de selecionar ligantes de proteínas, células ou tecidos. Produzimos a metacaspase recombinante de Leishmania L. amazonensis e aplicamos Phage Display para buscar peptídeos ligantes dessa enzima. Esses peptídeos permitiram identificar potenciais proteínas ligantes da MCA, como quinases e cinesinas, que fornecem informações sobre a regulação e controle de sua atividade. Futuramente testaremos se peptídeos ativadores da MCA poderão induzir apoptose do parasita e serem usados como drogas para o tratamento da leishmaniose. / During its life cycle, Leishmania amastigotes live inside phagolysosomes of phagocytic cells of vertebrate hosts, while promastigotes live inside the invertebrate vector. Intracellular proteases such as caspases are key effectors in the apoptotic process. Metacaspases (MCAs) are distant evolutionary forms of metazoan caspases found in protozoa, plants and fungi, and seen as potential targets to destroy the parasites without damage to the host. Ligands and modulators of metacaspases are so far unknown. Phage Display is a technique based on the expression of synthetic proteins in the phage capsid, and is used for selecting ligands of proteins, cells or tissues. We have produced the recombinant metacaspase of Leishmania (L.) amazonensis and employed Phage Display to find peptide ligands of this enzyme. These peptides led to the identification of potential binding proteins of the MCA, such as kinases and kinesin, which provide information about the regulation and control of MCA´s activity. In the future we will test whether peptide activators of MCA nduce apoptosis of the parasite and can be used as drugs for the treatment of leishmaniasis.

Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2017-07-25T18:53:17Z No. of bitstreams: 1 PRISCYLLA_ANDRADE_VOLKART_DIS.pdf: 1703523 bytes, checksum: 625ed4371e92d211496ba44a5d264d21 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-07-26T14:20:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PRISCYLLA_ANDRADE_VOLKART_DIS.pdf: 1703523 bytes, checksum: 625ed4371e92d211496ba44a5d264d21 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T14:27:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PRISCYLLA_ANDRADE_VOLKART_DIS.pdf: 1703523 bytes, checksum: 625ed4371e92d211496ba44a5d264d21 (MD5) Previous issue date: 2017-03-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The redox-active chemical properties of trace element copper make it an essential cofactor for several cellular mechanisms, as for ROS production. Polyphenols have been used in the pro-oxidant mechanism of action of interaction with endogenous Cu (II) ions for the production of reactive oxygen species in excess as a treatment for malignancies, leading to apoptosis. This work studied Cu (II) ions in the complex formation mechanism with Resveratrol in MCF-7 cells model. We analyzed the selectivity of Resveratrol in relation to the cupric metal ion using HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) and the formation of the compound Resveratrol-Copper through UV-VIS (Ultra-Violet Visible Spectrophotometry). We analyzed the cellular morphology and location of the metal ion by MET-EDS (Electronic Transmission microscopy with Dispersive X-ray Spectroscopy). Cell death by apoptosis and quantification of ROS in said cell line with copper enrichment and treated with Resveratrol was made by flow cytometry. The results show the selectivity of the polyphenol compound by copper ion as well as the formation of the complex Resveratrol-Copper in extracellular conditions, however even with verification of endogenous copper accumulation in physiological conditions in vitro, the formation of that complex did not occur because there was no production of ROS and therefore, no cell death. In short, our research reveals that for in vitro conditions for the MCF-7 line, there's no Resveratrol-Copper complex formation as observed in sub-lethal quantities of chemically enriched cells with CuSO4 and treated with Resveratrol. / As propriedades qu?micas redox-ativas do oligoelemento cobre o tornam cofator essencial para diversos mecanismos celulares como o de produ??o de ROS. Polifen?is v?m sendo utilizados no mecanismo de a??o pr?-oxidante de intera??o com ?ons Cu (II) end?geno para a produ??o dessas esp?cies oxig?nio reativas em excesso como tratamento de malignidades, levando a apoptose. O presente trabalho estudou os ?ons Cu (II) no mecanismo de forma??o do complexo com Resveratrol em modelo de c?lulas MCF-7. Analisamos a seletividade do Resveratrol frente ao ?on met?lico c?prico utilizando CLAE (Cromatografia L?quida de Alta Efici?ncia) e verificou-se a forma??o do complexo Resveratrol-Cobre por meio de UV-VIS (Espectrofotometria de Ultra-Violeta Vis?vel). Analisou-se a morfologia celular e localiza??o do ?on met?lico por MET-EDS (Microscopia de Transmiss?o Eletr?nica com Espectroscopia Dispersiva de Raios-X). Morte celular por apoptose e quantifica??o de ROS na linhagem enriquecida com cobre e tratadas com Resveratrol foi feita por Citometria de Fluxo. Os resultados mostram a seletividade do composto polifen?lico pelo ?on cobre bem como a forma??o do complexo Resveratrol-Cobre em condi??es extracelulares, por?m mesmo com a verifica??o de ac?mulo de cobre end?geno, em condi??es fisiol?gicas in vitro n?o foi constatada a forma??o do referido, pois n?o houve forma??o de ROS e morte celular conseguinte. Em suma, Nossa pesquisa revela que em condi??es in vitro para a linhagem MCF-7, n?o h? forma??o de complexo Resveratrol-Cobre como observado quimicamente em quantidades sub-letais de c?lulas enriquecidas com CuSO4 e tratadas com Resveratrol.

Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2018-04-06T17:32:47Z No. of bitstreams: 1 VANESSA_KAPPEL_DASILVA_TES.pdf: 5900313 bytes, checksum: 98206f797d5710ed04b0cd1d6529092e (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2018-04-16T19:58:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VANESSA_KAPPEL_DASILVA_TES.pdf: 5900313 bytes, checksum: 98206f797d5710ed04b0cd1d6529092e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-16T20:04:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VANESSA_KAPPEL_DASILVA_TES.pdf: 5900313 bytes, checksum: 98206f797d5710ed04b0cd1d6529092e (MD5) Previous issue date: 2018-03-07 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Brain iron accumulation has been observed both in normal aging and in many neurodegenerative diseases. In previous studies, we have described that brain iron overload results in persistent memory deficits, accompanied by oxidative stress. The high metabolic rate of the nervous system makes mitochondria essential for nerve cells. These organelles control iron homeostasis in its interior and the management of reactive oxygen species. When deregulation in these activities occurs, mitochondrial functioning is compromised, resulting in failures in the energy supply mainly for the synapses. Inadequate functioning of neural circuits may culminate in the activation of cell death pathways, a feature strongly associated with neurodegenerative diseases. In the present study we analyzed the effects of neonatal iron overload on complex I deletions in the mitochondrial DNA ; on methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA; on mitochondrial proteins involved on iron homeostasis, on the enzymatic activity of Succinate Dehydrogenase and Creatine Kinase, enzymes involved in the cells energy supply; and on proteins involved in apoptotic pathways, such as Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Cytochrome c, APAF1, and PARP in the hippocampus of adult rats. In addition, we investigated the effects of cannabidiol (CBD), the main non-psychotropic component of Cannabis sativa, in reversing iron-induced effects on all parameters analyzed. Male rats received vehicle or iron carbonyl (30 mg / kg) from the 12th to the 14th postnatal day and were treated with vehicle or CBD (10mg / kg) for 14 days in adulthood. Iron treatment induced increased deletions of mitochondrial DNA and expression of proteins involved in apoptosis, while induced reductions of methylation and hydroxymethylation, enzymatic activity and mitochondrial ferritin, an iron storage protein. CBD reversed iron-induced effects, recovering hydroxymethylation levels, mitochondrial ferritin, Succinate dehydrogenase activity, apoptotic proteins Caspase 3, Caspase 9, PARP and APAF1 at levels comparable to controls. These results suggest that iron can affect mechanisms of mitochondrial functioning and trigger cell death pathways by apoptosis. The reversal of some of these effects by CBD indicates its neuroprotective potential. / O ac?mulo de ferro no c?rebro tem sido observado tanto no envelhecimento normal quanto em muitas doen?as neurodegenerativas. Nossos estudos anteriores mostraram que a sobrecarga de ferro cerebral resulta em d?ficits de mem?ria persistentes, acompanhados por estresse oxidativo. A elevada taxa metab?lica do sistema nervoso torna as mitoc?ndrias essenciais para c?lulas nervosas. Essas organelas t?m como fun??o o controle da homeostasia do ferro em seu interior e o gerenciamento das esp?cies reativas de oxig?nio. Uma vez que ocorre desregula??o nessas atividades, o funcionamento das mitoc?ndrias fica comprometido, resultando em falhas no aporte energ?tico principalmente para as sinapses. O funcionamento inadequado de circuitos neurais pode culminar na ativa??o de vias de morte celular, uma caracter?stica bastante associada ?s doen?as neurodegenerativas. No presente trabalho analisamos os efeitos da sobrecarga de ferro neonatal sobre as dele??es no complexo I do DNA mitocondrial; sobre os mecanismos de metila??o e hidroximetila??o do DNA mitocondrial; sobre prote?nas envolvidas no metabolismo de ferro mitocondrial (Ferritina mitocondrial e Mitoferrina 2), sobre a atividade enzim?tica da Succinato desidrogenase e Creatina quinase, envolvidas no aporte energ?tico para as c?lulas; e sobre prote?nas envolvidas nas vias apopt?ticas, como a Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Citocromo c, APAF1 e PARP em hipocampos de ratos adultos. Al?m disso, investigamos os efeitos do canabidiol (CBD), principal componente n?o psicotr?pico da Cannabis sativa, na revers?o dos efeitos induzidos pelo ferro sobre todos os par?metros analisados. Ratos machos receberam ve?culo ou ferro carbonila (30 mg/kg) do 12? ao 14? dia p?s-natal e na idade adulta foram tratados com ve?culo ou CBD (10 mg/kg) durante 14 dias. O tratamento com ferro induziu o aumento das dele??es do DNA mitocondrial e das prote?nas envolvidas na via intr?nseca da apoptose, enquanto induziu a redu??o de metila??o e hidroximetila??o no DNA mitocondrial, bem como da atividade enzim?tica e da ferritina mitocondrial, prote?na de armazenamento de ferro. O CBD reverteu os efeitos induzidos pelo ferro, recuperando os n?veis de hidroximetila??o, de ferritina mitocondrial, da atividade da Succinato dehidrogenase, e das prote?nas apopt?ticas Caspase 3, Caspase 9, PARP e APAF1 a n?veis compar?veis com o controle. Os resultados sugerem que o ferro pode afetar mecanismos de funcionamento mitocondrial e desencadear vias de morte celular por apoptose. A revers?o de alguns desses efeitos pelo CBD indica o seu potencial neuroprotetor.

Submitted by PPG Medicina e Ci?ncias da Sa?de (medicina-pg@pucrs.br) on 2018-06-22T19:59:08Z No. of bitstreams: 1 CLARICE_MARTINS_FEYH_BIRNFELD.pdf: 3318155 bytes, checksum: aa5476b4fe73fb5e7e0b2678aef02e4b (MD5) / Approved for entry into archive by Sheila Dias (sheila.dias@pucrs.br) on 2018-06-29T12:31:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CLARICE_MARTINS_FEYH_BIRNFELD.pdf: 3318155 bytes, checksum: aa5476b4fe73fb5e7e0b2678aef02e4b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-29T12:38:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CLARICE_MARTINS_FEYH_BIRNFELD.pdf: 3318155 bytes, checksum: aa5476b4fe73fb5e7e0b2678aef02e4b (MD5) Previous issue date: 2014-10-31 / Objectives: To evaluate the expression of Hsp27 by immunohistochemistry in tissue samples of invasive ductal carcinoma in women with and without the presence of metastasis in sentinel axillary lymph node compared to samples from patients diagnosed with fibrocystic changes in breast tissue. In addition, to study the relationship between the rate of cell proliferation and apoptosis by evaluating the expression of Ki-67 protein and caspase-3 by immunohistochemistry. Material and Methods: A cross- sectional study was designed to select patients treated at Hospital S?o Lucas of PUCRS between September 2001 and October 2009. The patients were divided in three groups: 25 patients diagnosed with invasive ductal carcinoma of breast with axillary lymph node metastasis, 25 patients with invasive ductal carcinoma of breast without axillary lymph node metastasis and a control group composed by tissue samples of 25 patients diagnosed with fibrocystic change of the breast. The expression of Hsp27, Ki-67 and caspase 3 expression was evaluated by image analysis and the rate of proliferation (Ki-67) and apoptosis (caspase 3) was calculated for the three groups. Results: The present study showed an increased expression of Hsp27 in the group of invasive ductal carcinomas without metastasis as compared to the control group. There was no significant difference of expression of Hsp27 between the group of ductal carcinoma with axillary metastasis and the control group. The expression of Hsp27 was significantly higher in the group without axillary metastasis as compared to the group with metastasis in both the primary tumor (<0.001) and the respective lymph node tissue samples (=0.003). The expression of Ki-67 and the rate of proliferation (ki-67) and apoptosis (caspase 3) were significantly higher in the groups with invasive ductal carcinoma as compared to the control group. There was no difference in the expression of Ki-67 and the rate of proliferation and apoptosis between the two groups of invasive ductal carcinoma. There was no significant difference in the expression of caspase 3 among the three groups. Conclusion: The quantitative analysis of Hsp27 demonstrated increased expression of this protein in carcinomas without axillary metastases, with a significantly higher expression in the primary tumor and lymph node tissue samples of this group as compared to the group without axillary metastasis. Although the methodology employed and the number of cases evaluated in this work do not allow one to conclude that such behavior in metastatic ductal carcinomas of breast is constant, such finding warrants further investigation. / Objetivos: Avaliar a express?o de Hsp27 (HspB1) em amostras teciduais de carcinomas ductais invasores em mulheres com e sem presen?a de met?stase em linfonodo sentinela axilar e estudar a rela??o da taxa de prolifera??o celular e apoptose, atrav?s da avalia??o imunoistoqu?mica da express?o das prote?nas Hsp27, Ki-67 e caspase 3 em carcinomas ductais invasores de mulheres com e sem presen?a de met?stase linfonodal, tratadas em um hospital de ensino, comparado com amostras de pacientes diagnosticadas com altera??o fibroc?stica no tecido mam?rio. Material e M?todos: Foi realizado um estudo do tipo transversal, sendo selecionadas para este trabalho pacientes tratadas no Hospital S?o Lucas da PUCRS no per?odo entre setembro de 2001 e outubro de 2009 cujas bi?psias foram divididas em tr?s grupos: 25 pacientes com diagn?stico de carcinoma ductal invasor de mama com presen?a de met?stase linfonodal; e 25 pacientes com carcinoma ductal invasor de mama sem presen?a de met?stase linfonodal. Para constitui??o do grupo controle foi realizada a sele??o aleat?ria de 25 pacientes com diagn?stico de altera??o fibroc?stica da mama. Atrav?s da t?cnica de imunoistoqu?mica, tamb?m foram avaliadas as express?es de Hsp27, caspase 3 e Ki67 por an?lise de imagem digital e calculada a raz?o entre a taxa de prolifera??o (Ki-67) e apoptose (caspase 3) dos grupos estudados. Resultados: O presente estudo evidenciou a express?o aumentada da Hsp27 em carcinomas ductais invasores sem met?stase axilar, quando comparados ao grupo dos carcinomas ductais invasores com met?tase axilar e grupo controle. A express?o de Hsp 27 foi maior no grupo com carcinoma invasor sem met?stase axilar tanto no tecido da neoplasia prim?ria (p<0,001) quanto no respectivo tecido linfonodal comparado ao grupo com carcinoma com met?stase axilar (=0,003). Houve diferen?a na express?o da prote?na Ki-67 e raz?o entre prolifera??o celular e apoptose entre os grupos de pacientes com carcinoma ductal invasor com e sem met?stases quando comparados ao grupo controle, por?m n?o houve diferen?a significativa da express?o de Ki-67 e da raz?o entre prolifera??o e apoptose entre os grupos com carcinoma invasor com e sem met?stase, ou entre a express?o de caspase 3 nos tr?s grupos quando comparados entre si. Conclus?o: A an?lise quantitativa da Hsp27 demonstrou maior express?o da prote?na nos tecidos da neoplasia prim?ria e nos linfonodos em carcinomas sem met?stase em linfonodo sentinela axilar. Embora a metodologia empregada e o n?mero de casos estudados nesse trabalho n?o permitam concluir que esse comportamento na doen?a metast?tica seja um achado constante, esse resultado justifica a necessidade de avaliar esse achado em estudos futuros.

Nenhuma / O efeito bystander induzido por radiação ionizante designa uma série de respostas tais como: trocas entre cromátides irmãs, aberrações cromossômicas, apoptose, formação de micronúcleos, transformação, mutação e instabilidade gênica que ocorrem em células não irradiadas em consequência da exposição de outras células à radiação. O efeito bystander ocorre por meio de dois mecanismos distintos: gapjunctions ou junções gap e fatores sinalizadores secretados no meio de cultura pelas células irradiadas, e posteriormente, recolhidos pelas células não irradiadas. Conhece-se até o momento duas maneiras de se identificar o efeito bystander: através da transferência do meio de cultura de células irradiadas para células não irradiadas e utilizando um micro-feixe de partículas alfa, com o qual se tem absoluto controle em relação à célula ou à organela que recebeu a radiação. Neste trabalho os experimentos foram realizados através da troca do meio de cultura, utilizando-se a princípio quatro linhagens celulares: duas comerciais, a MDA-MB-231, de câncer de mama e a HEK-293 derivada de células de rim embrionário humano e duas estabelecidas por pesquisadores da UFMG, a MGSO-3 e a MACL-1, ambas de câncer de mama. No presente estudo demonstrou-se a ocorrência do efeito bystander através de análise de morte celular por apoptose nas quatro linhagens com variações de densidade. Optou-se por dar maior importância às novas linhagens estabelecidas, pelo fato delas não terem sido ainda investigadas em relação à ocorrência ou não de efeito bystander. Confirmou-se neste trabalho que para as novas linhagens, o efeito bystander varia em relação às doses de radiação, à densidade celular e o tempo em que células não irradiadas ficam em contato com o meio irrad / The bystander effect induced by ionizing radiation refers to a series of responses such as sister chromatid exchanges, chromosomal aberrations, apoptosis, micronuclei formation, transformation, mutation and genetic instability that occur in non-irradiated cells as a result of exposure from other cells to radiation. The bystander effect occurs through two distinct mechanisms: gap-junctions and signaling factors secreted into the culture medium from irradiated cells, and collected by non-irradiated cells. Nowadays two ways to identify the bystander effect are known: through medium transfer from irradiated cells to non-irradiated cells and using an alpha particle microbeam facility, which has total control over the cells or the organelles that receive radiation. In this study, experiments were performed by replacing the culture medium, using four cell lines: two commercial, MDA-MB-231, of breast cancer and HEK-293 derived from human embryonic kidney cells and two established by researchers from UFMG, the MACL-1 and MGSO-3, both from breast cancer. In the present study the occurrence of bystander effect was demonstrated by apoptotic cells analysis for all cell lines with density variations. We have chosen to give greater importance to the new cell lines established by the fact that they have not yet been investigated in relation to the occurrence or not of bystander effect. It was confirmed by this work that, for the new cell lines, the bystander effect varies in relation to the radiation doses, cell density and time in which non-irradiated cells are kept in contact with the irradiated medium.

O presente trabalho teve como objetivo investigar o tipo de morte induzida nas linhagens de carcinoma mamário humano MCF-7 (ER+) e MDA-MB-435 (ER-), pela fração isolada do extrato de folhas de barbatimão. As folhas de Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville (Fabaceae) foram coletadas, secas e utilizadas para o preparo do extrato acetônico, que foi particionado com acetato de etila. A fração aquosa remanescente foi liofilizada e fracionada por cromatografia em Sephadex LH 20. As frações coletadas foram submetidas à cromatografia em camada delgada e a fração eluída com metanol a 100% foi utilizada nos experimentos, por apresentar o maior conteúdo de proantocianidinas. A análise por HPLC permitiu verificar que a fração isolada contem procianidina dimérica B1, epigalocatequina-3-O-galato e ácido gálico. As células de adenocarcinoma mamário MCF-7 (ER+) e MDA-MB-435 (ER-) foram tratadas por 24 h com diferentes concentrações da fração (5 – 160 μg/mL) e com ciclofosfamida a 550 μg/mL. O tratamento das células com a fração isolada induziu redução da viabilidade celular e alterações morfológicas nas duas linhagens, incluindo perda da morfologia celular típica, condensação da cromatina e diminuição da área das colônias e das células. A DE50 para células MCF-7 foi de 12,35 μg/mL e para as células MDA-MB-435 foi de 34,43 μg/mL, sendo as células MCF-7 mais sensíveis ao tratamento. A análise por Western blotting mostrou que tratamento o com a fração induziu aumento da expressão de Bax e diminuição de Bcl-2 nas células, indicando apoptose. Houve ainda aumento da expressão de caspase-9, caspase-3-ativa e caspase-8, além da diminuição da expressão da caspase-3 e pró-caspase-8. Estas proteínas estão envolvidas na via intrínseca de indução da apoptose. Foi observado também aumento de proteínas marcadoras da autofagia, LC-3 nas duas linhagens e beclin-1 nas células MDA-MB-435. Assim, os resultados do presente trabalho permitem concluir que a fração isolada do extrato de folhas de barbatimão induziu a morte por apoptose com autofagia nas células MCF-7 e MDA-MB-435. Estes resultados são importantes, pois foram demonstradas a citotoxicidade e indução de morte das células MDA-MB-435, que são ER-, além das células MCF-7 (ER+). Tendo em vista que não há tratamento curativo para tumor mamário ER-, bem como para ER+ em estágio avançado, a fração isolada parece ser candidata promissora para o desenvolvimento de fármaco para o tratamento e prevenção do câncer de mama. / The aim of the present work was to investigate the type of cell death induced in the MCF-7 (ER+) and MDA-MB-435 (ER-) human mammary carcinoma cell lineages by the fraction isolated from the barbatimão leaf extract. Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville (Fabaceae) leaves were collected, dried and the acetone extract was prepared. It was partitioned with ethyl acetate and the remaining aqueous solution was lyophilized and fractioned by Sephadex LH 20 chromatography. The collected fractions were analyzed by thin layer chromatography and the fraction eluted with 100 % methanol was used in the experiments, because it showed the highest proanthocyanidin content. The HPLC analysis showed that the isolated fraction is composed by procyanidin dimmer B1, epigallocatechin-3-O-gallate and gallic acid. The MCF-7 (ER+) and MDA-MB-435 (ER-) cells were treated for 24 h with different concentrations of the fraction (5 – 160 μg/mL) and with 550 μg/mL cyclophosphamide. The cell treatment with the isolated fraction induced cell viability reduction and morphologic alterations in both cell lines, including cell typical shape loss, chromatin condensation and a decrease in the colony and cell area. The ED50 dose for MCF-7 cells was 12.35 μg/mL and the ED50 dose for MDA-MB-435 cells was 34.43 μg/mL, being the MCF-7 cells more sensitive to the fraction treatment. The Western blotting analysis showed that the fraction treatment induced an increase in the Bax and a decrease in the Bcl-2 cell expression that is indicative of apoptosis. There were also an increase in the caspase-9, caspase-3-active and caspase-8 expression and a decrease in the caspase-3 and pro-caspase-8 expression. These proteins are involved in induction of the intrinsic apoptosis pathway. It was also observed an increase in the expression of autophagy protein markers: LC-3 expression increased in both cell lines and beclin-1 expression increased only in the treated MDA-MB-435. The results of the present work allowed the conclusion that the isolated fraction from barbatimão leaf extract induced apoptotic death with autophagy in both cell lines, MCF-7 and MDA-MB-435. These results are important because it was demonstrated the cytotoxic effect and the ER- MDA-MB-435 cell death induction, besides the cytotoxicity to ER+ MCF-7 cells. As there is no a curative treatment for ER- mammary tumors as well as ER+ tumors in an advanced stage, the isolated fraction seems to be a promising candidate to a drug development for breast cancer treatment and prevention. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES