O presente trabalho teve como objetivo investigar o tipo de morte induzida nas linhagens de carcinoma mamário humano MCF-7 (ER+) e MDA-MB-435 (ER-), pela fração isolada do extrato de folhas de barbatimão. As folhas de Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville (Fabaceae) foram coletadas, secas e utilizadas para o preparo do extrato acetônico, que foi particionado com acetato de etila. A fração aquosa remanescente foi liofilizada e fracionada por cromatografia em Sephadex LH 20. As frações coletadas foram submetidas à cromatografia em camada delgada e a fração eluída com metanol a 100% foi utilizada nos experimentos, por apresentar o maior conteúdo de proantocianidinas. A análise por HPLC permitiu verificar que a fração isolada contem procianidina dimérica B1, epigalocatequina-3-O-galato e ácido gálico. As células de adenocarcinoma mamário MCF-7 (ER+) e MDA-MB-435 (ER-) foram tratadas por 24 h com diferentes concentrações da fração (5 – 160 μg/mL) e com ciclofosfamida a 550 μg/mL. O tratamento das células com a fração isolada induziu redução da viabilidade celular e alterações morfológicas nas duas linhagens, incluindo perda da morfologia celular típica, condensação da cromatina e diminuição da área das colônias e das células. A DE50 para células MCF-7 foi de 12,35 μg/mL e para as células MDA-MB-435 foi de 34,43 μg/mL, sendo as células MCF-7 mais sensíveis ao tratamento. A análise por Western blotting mostrou que tratamento o com a fração induziu aumento da expressão de Bax e diminuição de Bcl-2 nas células, indicando apoptose. Houve ainda aumento da expressão de caspase-9, caspase-3-ativa e caspase-8, além da diminuição da expressão da caspase-3 e pró-caspase-8. Estas proteínas estão envolvidas na via intrínseca de indução da apoptose. Foi observado também aumento de proteínas marcadoras da autofagia, LC-3 nas duas linhagens e beclin-1 nas células MDA-MB-435. Assim, os resultados do presente trabalho permitem concluir que a fração isolada do extrato de folhas de barbatimão induziu a morte por apoptose com autofagia nas células MCF-7 e MDA-MB-435. Estes resultados são importantes, pois foram demonstradas a citotoxicidade e indução de morte das células MDA-MB-435, que são ER-, além das células MCF-7 (ER+). Tendo em vista que não há tratamento curativo para tumor mamário ER-, bem como para ER+ em estágio avançado, a fração isolada parece ser candidata promissora para o desenvolvimento de fármaco para o tratamento e prevenção do câncer de mama. / The aim of the present work was to investigate the type of cell death induced in the MCF-7 (ER+) and MDA-MB-435 (ER-) human mammary carcinoma cell lineages by the fraction isolated from the barbatimão leaf extract. Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville (Fabaceae) leaves were collected, dried and the acetone extract was prepared. It was partitioned with ethyl acetate and the remaining aqueous solution was lyophilized and fractioned by Sephadex LH 20 chromatography. The collected fractions were analyzed by thin layer chromatography and the fraction eluted with 100 % methanol was used in the experiments, because it showed the highest proanthocyanidin content. The HPLC analysis showed that the isolated fraction is composed by procyanidin dimmer B1, epigallocatechin-3-O-gallate and gallic acid. The MCF-7 (ER+) and MDA-MB-435 (ER-) cells were treated for 24 h with different concentrations of the fraction (5 – 160 μg/mL) and with 550 μg/mL cyclophosphamide. The cell treatment with the isolated fraction induced cell viability reduction and morphologic alterations in both cell lines, including cell typical shape loss, chromatin condensation and a decrease in the colony and cell area. The ED50 dose for MCF-7 cells was 12.35 μg/mL and the ED50 dose for MDA-MB-435 cells was 34.43 μg/mL, being the MCF-7 cells more sensitive to the fraction treatment. The Western blotting analysis showed that the fraction treatment induced an increase in the Bax and a decrease in the Bcl-2 cell expression that is indicative of apoptosis. There were also an increase in the caspase-9, caspase-3-active and caspase-8 expression and a decrease in the caspase-3 and pro-caspase-8 expression. These proteins are involved in induction of the intrinsic apoptosis pathway. It was also observed an increase in the expression of autophagy protein markers: LC-3 expression increased in both cell lines and beclin-1 expression increased only in the treated MDA-MB-435. The results of the present work allowed the conclusion that the isolated fraction from barbatimão leaf extract induced apoptotic death with autophagy in both cell lines, MCF-7 and MDA-MB-435. These results are important because it was demonstrated the cytotoxic effect and the ER- MDA-MB-435 cell death induction, besides the cytotoxicity to ER+ MCF-7 cells. As there is no a curative treatment for ER- mammary tumors as well as ER+ tumors in an advanced stage, the isolated fraction seems to be a promising candidate to a drug development for breast cancer treatment and prevention. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Orientador: Aparecido Antonio Camacho / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Andrigo Barboza De Nardi / Banca: Fábio Nelson Gava / Banca: Renata Maria Lataro / Resumo: A doxorrubicina é um dos mais eficazes agentes quimioterápicos atualmente disponíveis. No entanto, seu emprego tem sido limitado por sua ação cardiotóxica principalmente quando de seu uso por período prolongado, podendo induzir cardiomiopatia iatrogênica relacionada à dose cumulativa administrada. No presente estudo, avaliou-se a ação de três fármacos (carvedilol, ciclosporina-A e sildenafil) sobre os efeitos cardiotóxicos exercidos pela doxorrubicina. Foram utilizados 45 coelhos, alocados em cinco grupos: controle, doxorrubicina (DOX), DOX + carvedilol, DOX + ciclosporina-A, DOX + sildenafil. A antraciclina foi administrada por seis semanas, e exames seriados de hematologia, bioquímica sérica, eletrocardiografia e ecocardiografia foram realizados. Ao término de oito semanas, os animais foram submetidos a eutanásia e fragmentos de miocárdio foram utilizados para realização de exames de histopatologia, imunoistoquímica e microscopia eletrônica de transmissão. Os tratamentos testados não evitaram a ocorrência de disfunção sistólica, cardiomegalia e insuficiência cardíaca congestiva nem reduziram a mortalidade ocasionada pelo tratamento com doxorrubicina. No entanto, o tratamento concomitante com carvedilol reduziu o número de animais com disfunção diastólica do ventrículo esquerdo, reduziu o número de fibras apoptóticas e a ocorrência de fibrose intersticial nos ventrículos direito e esquerdo. Os dados obtidos permitem inferir que o tratamento com carvedilol resultou em melhora... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Doxorubicin is one of the most effective chemotherapeutic agents currently available. However, its use has been limited by its cardiotoxic effect, especially when used for a long time, leading to iatrogenic cardiomyopathy, related to the cumulative dose administered. In the present study, the effects of three drugs (carvedilol, cyclosporin-A and sildenafil) on doxorubicin-induced cardiomyopathy were analyzed. Fourty five rabbits were allocated in four groups: control, doxorubicin (DOX), DOX + carvedilol, DOX + cyclosporin-A, DOX + sildenafil. Animals received doxorubicin for six weeks and were monitored for eight weeks by hematological and biochemical evaluations, electrocardiography and echocardiography. At week eight, animals were killed and myocardium was analyzed by histopathology, immunohistochemistry and transmission electron microscopy. Any treatment prevented the development of systolic dysfunction, cardiomegaly and heart failure or reduced mortality induced by doxorubicin. However, treatment with carvedilol reduced the number of rabbits with left ventricle diastolic dysfunction, reduced the number of apoptotic cells and the occurrence of interstitial fibrosis in both ventricles. The results showed that treatment with carvedilol improved some of the evaluated parameters, suggesting that this drug has some cardioprotective effect on doxorubicin-induced cardiomyopathy in rabbits. / Doutor

As fosfolipases são bastante estudadas e podem ser encontradas de forma abundante nas peçonhas. Algumas fosfolipases que sofrem modificação no resíduo 49 com a substituição do aminoácido Asp por Lys, o que provoca perda do seu sítio catalítico, são classificadas como miotoxinas. A miotoxina BthTX-I foi isolada da peçonha de Bothrops jararacussu, possui 121 resíduos de aminoácidos, pI 8,2 e massa molecular de 13kDa. O objetivo do presente projeto foi avaliar a ação da BthTX-I, quanto à sua ação citotóxica, indutora de morte celular, interferência na cinética celular e expressão de genes responsáveis pela morte celular em quatro linhagens tumorais, HL-60 (leucemia promielocítica), HepG-2 (hepatocarcinoma humano), PC-12 (feocromacitoma murino) e B16F10 (melanoma murino). Também foi analisada a indução de citocinas inflamatórias IL-8 e TNF-? em linhagens humanas HL-60 e HepG2. A citotoxicidade, avaliada pela metodologia do MTT, apresentou valores citotóxicos em torno de 62, 53, 53 e 63%, respectivamente para HepG2, HL-60, PC12 e B16F10. A toxina mostrou ação moduladora do ciclo celular na fase S em células HepG2; na fase G2/M em células HL-60. Nas linhagens B16F10 e PC-12 a toxina provocou atraso na fase G0/G1 e redução de células na fase S e G2/M. O perfil eletroforético em gel de agarose a 1,5% mostrou fragmentação do conteúdo do DNA, indicando possível apoptose, que foi confirmada pelo ensaio de morte celular por citometria de fluxo. O ensaio revelou que a linhagem B16F10 tem maior índice apoptótico (~40%), seguido da HepG2 (~35%), PC-12 (~25%) e HL-60 (~4%). A indução de citocinas pela metodologia de ELISA apresentou valores elevados de IL-8 para linhagem HL-60 (~400 pg/mL) e HepG2 (~400 pg/mL), sugerindo uma possível quimiotaxia/migração de células de defesa. TNF- ? também apresentou alteração em seus níveis representando cerca de 150 pg/mL na linhagem HepG2. A expressão dos genes Bax, Bcl-2 e p53 demonstrou que o gene p53 se altera somente na linhagem HepG2, todavia a expressão dos genes Bax e Bcl-2 mostrou ser diferente para cada linhagem. Em células B16F10 a toxina aumentou os níveis de Bax e diminuiu os níveis de Bcl-2 enquanto que, as células PC-12 exibiram aumento nos níveis de ambos. Em HepG2 houve redução da expressão do gene antiapoptótico Bcl-2 e valor inalterado de Bax, ao passo que a linhagem HL-60 apresentou resultado contrário ao de células HepG2, com aumento na expressão de Bax e valores inalterados de Bcl-2. Assim a toxina mostra diferente ação na expressão dos genes responsáveis pela apoptose em diferentes linhagens celulares, mostrando que a BthTX-I influencia a expressão desses genes, ou promove apenas a alteração de dessses, levando assim à apoptose celular das linhagens tratadas com a miotoxina. Diante dos dados obtidos ficou evidenciado o potencial antitumoral da BThTX-I levando a busca de outros mecanismos de atuação da toxina, abrindo perspectivas de sua aplicação biotecnológica para a produção de novo fármaco antitumoral e tornando-se uma terapia alternativa a essa enfermidade. / Phospholipases are widely studied and can be found in abundance in several animal venoms. Some phospholipases, classified as myotoxins, present a modification at residue 49, with replacement of the amino acid Asp by Lys, causing loss of their catalytic site. BthTX-I was isolated from the venom of Bothrops jararacussu and is a myotoxin with 121 amino acid residues, pI 8.2 and a molecular mass of 13kDa. The aim of this study was to evaluate BthTX-I regarding its cytotoxic action, induction of cell death, interference with cell kinetics and expression of genes responsible for cell death in four tumor cell lines: HL-60 (promyelocytic leukemia), HepG2 (human hepatocellular carcinoma), PC-12 (murine pheochromocytoma) and B16F10 (murine melanoma). The induction of inflammatory cytokines (IL-8 and TNF-?) in the human cell lines HepG2 and HL-60 was also analyzed. Cytotoxicity, as assessed by the MTT methodology, showed values around 62, 53, 53 and 63% for HepG2, HL-60, PC12 and B16F10, respectively. The toxin showed modulating action of the cell cycle in the S phase in HepG2 cells, in the G2/M phase in HL-60 cells and delay in the G0/G1 phase. The toxin also caused a delay in the G0/G1 phase and reduced the number of cells in the S and G2/M phases in B16F10 and PC-12 cell lines. The electrophoretic profile on 1,5% agarose gel showed fragmentation of DNA content, possibly indicating apoptosis, which was confirmed by flow cytometry cell death assays. This assay revealed that B16F10 cells presented a higher apoptotic rate (~40%), followed by HepG2 (~35%), PC-12 (~25%) and HL-60 (~4%) cells. Induction of cytokines analyzed by ELISA showed high levels of IL-8 in HL-60 (~400 pg/mL) and HepG2 (~400 pg/mL) cells, suggesting a possible chemotaxis and migration of immune cells. The levels of TNF-? also showed changes, representing about 150 pg/mL in HepG2 cells and 14 pg/mL in HL-60 cells. Gene expression of Bax, Bcl-2 and p53 showed that the p53 gene did not change only in HepG2 cells, with the gene expression of Bax and Bcl-2 being different for each cell line. The toxin increased the levels of Bax and decreased the levels of Bcl-2 in B16F10 cells, while PC-12 cells showed increased levels of both genes. Regarding HepG2 cells, a decrease in the expression of the antiapoptotic gene Bcl-2 was observed, with unchanged values for Bax, while opposite results were observed for HL-60 cells, with increased expression of Bax and unchanged values of Bcl-2. Thus, the toxin showed different actions on the expression of genes responsible for apoptosis in different cell lines, showing that BthTX-I influences the expression of both genes, promoting changes in one or another apoptotic gene, thus leading the tumor cell lines treated with this myotoxin to apoptosis. The obtained data evidenced the antitumor potential of BthTX-I, leading to the search for other mechanisms of action of this toxin and opening prospects for its biotechnological applications for the production of new anti-cancer drugs.

O sistema de expressão de proteínas que utiliza baculovírus como vetor tem sido intensamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes, pois ele permite a formação de modificações pós-traducionais e conta com um forte promotor, a poliedrina. Porém, em alguns casos, esse sistema não é tão eficaz, pois a infecção das células pelo vírus induz morte por apoptose, limitando a produção industrial de várias proteínas recombinantes de interesse. Reportamos a ocorrência de apoptose em cultivos de células de insetos e de mamíferos com depleção de nutrientes ou induzidos por agentes químicos e virais, e a suplementação dessas culturas com hemolinfa de Lonomia obliqua é capaz de estender a viabilidade da cultura evitando a morte por apoptose. Como objetivo, verificamos previamente o mecanismo de ação antiapoptótica de um isolado protéico da hemolinfa de L. obliqua. A identificação deste mecanismo poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias para controlar a apoptose nos cultivos permitindo a otimização da produtividade viral e de proteínas recombinantes. / The protein expression system using baculovirus as a vector has been intensively used for the production of recombinant proteins because it allows the formation of post-translational modifications and has a strong promoter, polyhedrin. However, in some cases, this expression system is not as effective because the infection of cells by baculovirus induces death by apoptosis, thereby limiting the industrial production of various recombinant proteins of interest. We report the occurrence of apoptosis in cultured insect cells and mammalian depleted of nutrients or induced by chemical and viral agents, and supplementation of these cultures with hemolymph of Lonomia obliqua is able to extend the viability of the culture avoiding death by apoptosis. This study aimed to determine in advance the anti-apoptotic mechanism of action of a protein isolated from hemolymph of L. obliqua. The identification of this mechanism may help develop strategies for controlling apoptosis in cell culture allowing the optimization of productivity of viral and recombinant proteins.

A miosina Va é uma proteína motora envolvida no transporte e posicionamento de vesículas, organelas e mRNA. Além disso, postulou-se que a miosina-Va atua no seqüestro do fator pró-apoptótico, Bmf, no citoesqueleto de actina. Pesquisas realizadas em nosso laboratório demonstraram que um fragmento da miosina Va (MVaf), que corresponde ao sítio ligante de DLC2-Bmf, é capaz de induzir intensa apoptose em células de melanoma e de carcinoma in vitro. O presente trabalho teve por objetivo principal avaliar o potencial do MVaf como agente antitumoral, através de abordagens de terapia gênica em modelo animal. Foram geradas linhagens estabilizadas e com expressão controlada pelo sistema Tet-ON onde a expressão de EGFP ou EGFP-MVaf é induzida com a adição de doxiciclina. Essas linhagens foram testadas quanto à porcentagem de morte por apoptose e ativação de caspases. Tumores foram induzidos em camundongos C57BL/6 por inoculação subcutânea de células tumorigênicas positivas ou não para a expressão de EGFP-MVaf. Também foram utilizadas linhagens de fibroblasto embrionário murino selvagem (MEFs WT) e nocautes para os fatores Bim/Bmf e Bax/Bak (MEFsBim-/-,Bmf-/-; MEFsBax-/-,Bak-/-) para estudos do mecanismo de ação do fragmento da miosina Va. Observou-se que a adição de butirato de sódio potencializa a expressão de EGFP-MVaf e, conseqüentemente, o efeito pró-apoptótico desse fragmento e que essas células são mais sensíveis aos quimioterápicos etoposídeo e taxol, apresentando maior susceptibilidade à apoptose. Verificou-se que a expressão de EGFP-MVaf em células de tumores de melanoma induzidos em camundongos C57BL/6J dificulta o crescimento desses tumores. Quanto ao estudo com MEFs, observou-se que células nocautes para os fatores pró-apoptóticos Bim/Bmf e Bax/Bak são menos susceptíveis à morte induzida pelo fragmento da miosina Va. Indução da expressão de MVaf desencadeia a liberação da proteína proapoptótica Smac (fusionada ao repórter fluorescente Cherry) do espaço intermembranas da mitocôndria para o citoplasma sugerindo que a morte apoptótica induzida por MVaf requer a permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP). Concluindo, os dados apresentados aqui nos permitem propor o MVaf como uma molécula promissora para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra o câncer. / Myosin Va is a motor protein involved in the transport and positioning of vesicles, organelles and mRNA. Additionally, myosin-Va has been implicated in the sequestering of a proapoptotic factor, Bmf, to the actin cytoskeleton. Research in our laboratory demonstrated that a fragment of myosin Va (MVaf), which corresponds to the binding site of DLC2-Bmf, is capable to induce intense apoptosis in melanoma and carcinoma cells in vitro. Here, our goal was to assess the potential of MVaf as antitumor agent, through gene therapy approaches in animal models. We generated Tet-ON controlled B16-F10 melanoma cells whose expression of EGFP or EGFP-MVaf is induced with the addition of doxycycline. These cells were tested for apoptotic death and activation of caspases, and were used to induce tumors in C57BL/6J mice by subcutaneous inoculation. We also used cell lines of murine embryonic fibroblasts, wild-type (MEFs WT) and knockouts for the proapoptotic proteins Bim/Bmf or Bax/Bak (MEFsBim-/-,Bmf-/-, MEFsBax-/-,Bak-/-), to study the mechanism by which MVaf induces apoptosis. We observed that addition of sodium butyrate to the cultures enhances the EGFP-MVaf expression and, consequently, the pro-apoptotic effect of this fragment. Treated cells were more sensitive to the chemotherapeutic drugs etoposide and taxol, showing a higher susceptibility to apoptosis. Moreover, in vivo induction of EGFP-MVaf expression retards growth of B16-F10 melanoma tumors in mouse model. As for the study with MEFs, we observed that cells knockout for the proapoptotic factors Bim/Bmf or Bax/Bak are less susceptible to death induced by MVaf than wild-type MEFs. Accordingly, we showed that MVaf expression triggers release of the proapoptotic protein Smac (tagged with the fluorescent protein Cherry) supporting the involvement of the mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) in the MVaf-induced apoptotic death response. In conclusion, these data lead us to propose MVaf as a promising molecule for the development of new therapeutic approaches against cancer.

Estudos realizados com zigotos bovinos submetidos a uma diminuição de cerca de 50% do conteúdo mitocondrial não apresentaram efeito deletério ao desenvolvimento embrionário in vitro. Este modelo foi desenvolvido pela centrifugação de zigotos após a fecundação in vitro (FIV), retirada do extrato citoplasmático rico em mitocôndrias (ECRM) e posterior introdução de 20-30% de ooplasto (FERREIRA, 2006). Sabendo-se que esse modelo biológico permite o desenvolvimento embrionário em condição de depleção mitocondrial, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da remoção e da suplementação mitocondrial em estádio de zigoto visando compreender a importância da organela no processo de desenvolvimento e morte celular programada (MCP). Este trabalho descreve a transferência de mitocôndrias entre zigotos bovinos. Para tanto, foi desenvolvido um sistema de reconstrução de embriões bovinos capaz de gerar indivíduos depletados e suplementados de mitocôndrias. O extrato citoplasmático rico em mitocôndrias (ECRM) dos zigotos centrifugados foi retirado do oócito doador, para gerar um zigoto depletado (D). Posteriormente, foi retirado um volume citoplasmático de aproximadamente 7,1% para gerar um embrião receptor. Com a quantidade retirada do zigoto depletado (doadores), foi realizada a suplementação de zigotos biopsados (receptores), formando assim, o grupo suplementado (S). A depleção mitocondrial causou uma diminuição na quantidade de DNAmt que foi recuperada antes das 72 horas de cultivo possivelmente, devido a um aumento na expressão de mtTFA. Os genes anti-apoptóticos BCL2 e PI3K tiveram sua expressão aumentada nos embriões depletados. A suplementação e depleção mitocondrial resultaram em uma diminuição na taxa de desenvolvimento embrionário até o estádio de 8 células e na formação de blastocistos. A técnica suplementação mitocondrial por meio de micromanipulação não apresentou efeito sobre a quantidade de DNAmt e atividade mitocondrial estimada pelo potencial de membrana interna mitocondrial (Ψmm), apresentando um aumento no Ψmm apenas às 168 horas em conseqüência do aumento da expressão de COXI e mtTFA. A suplementação e a depleção geraram efeitos negativos na quantidade de núcleos totais e os embriões suplementados apresentaram uma maior taxa de fragmentação de núcleos provavelmente, por um desbalanço de fatores pró e anti-apoptóticos. / Studies developed with bovine zygotes submitted to a decrease of about 50% of the mitochondrial content did not present a deleterious effect on in vitro embryonic development. This model was developed by the centrifugation of zygotes after in vitro fertilization (IVF), removal of the mitochondria enriched cytoplast fraction (MECF) and posterior introduction of 20-30% ooplast (FERREIRA, 2006). Knowing that this biological model allows the development of embryos with mitochondrial depletion, the objective of this study was to evaluate the effect of the mitochondrial removal and supplementation in zygotes aiming to understand the organelle importance in the development and programmed cellular death process (PCD). Therefore, we developed a reconstruction model capable to generate mitochondrial depleted and supplemented embryos. The MECF of the centrifuged zygotes was removed from the donor\'s oocyte (depleted group-D). To prepare the supplemented group (S), a biopsy of approximately 7.1% of the cytoplasm was removed from the recipient zygote for the supplementation with MECF derived from the donor. Mitochondrial depletion caused a decrease of DNAmt amount that was replenished before 72 hours possibly due to an increase of mtTFA, BCL2 and PI3K expression and no effects in Ψmm. The technique of mitochondrial supplementation by micromanipulation showed no effect on the mitochondria DNA amount and activity estimated by mitochondrial membrane potential (Ψmm). The Ψmm increased at 168ha in consequence of an increase in COXI and mtTFA expression. Mitochondrial depletion and supplementation caused a decrease in embryonic development in the 8-cells stage, on blastocyst production and total cell number. The supplementation resulted in increased rates of fragmented nuclei possibly due to an imbalance between pro- and anti-apoptotic factors.

A utilização de fatores hepatotróficos (FH) tem trazido importantes avanços no tratamento de algumas doenças hepáticas. A avaliação dos efeitos dessas substâncias pode ser feita com o uso de modelos in vivo, como a regeneração hepática após a hepatectomia parcial ou in vitro, como a cultura de hepatócitos, células estreladas ou outros tipos celulares do fígado. O modelo de cultura demonstra ser útil por possibilitar a análise individualizada de determinadas substâncias ou soluções diretamente nas células-alvo, facilitando o delineamento de seu mecanismo de ação. Dessa forma, o presente trabalho estudou in vitro os efeitos da administração de fatores hepatotróficos (FH) em hepatócitos isolados de fígados de ratos, avaliando seu metabolismo e proliferação celular. Trinta ratos Wistar fêmeas foram utilizados, o fígado retirado e, por digestão enzimática in situ, suas células foram dissociadas e os hepatócitos separados em gradiente de Percoll 45%; cultivados em meio DMEM/F12, tratadas com diferentes concentrações dos FH (1X, 5X e 10X) e analisadas em intervalos de 24, 48 e 72 horas. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas pelo método colorimétrico MTT, a toxicidade pelo iodeto de propídeo, o potencial elétrico da membrana mitocondrial pela Rodamina 123 e a expressão da citoqueratina 8, 18 e desmina como marcadores do citoesqueleto. O metabolismo hepático foi avaliado pela depuração do verde de indocianina (VIC), pela quantificação de colágeno tipo I e pela formação de radicais lipídicos poliinsaturados peroxidados. A técnica utilizada para a obtenção de hepatócitos mostrou-se eficaz com viabilidade superior a 90%, sem apresentar toxicidade, com manutenção do potencial mitocondrial e com marcação positiva para citoqueratinas 8, 18 e desmina. A adição dos FH aumentou a proliferação dos hepatócitos nos três períodos analisados em relação ao grupo controle. Os FH não demonstraram toxicidade em cultura primária de hepatócitos em nenhuma das concentrações avaliadas ao longo de todos os períodos experimentais. A adição dos FH na concentração de 10X evitou a formação de radicais livres, protegendo os hepatócitos da lipoperoxidação. Por outro lado, a avaliação funcional das culturas primárias pelo teste VIC mostrou-se eficaz na determinação do metabolismo dos hepatócitos, como a manutenção dos níveis das transaminases e amilase. Os hepatócitos mantidos em cultura primária após a adição dos FH em todos os períodos analisados aumentaram a produção de colágeno, e também foram capazes de modificar a distribuição da população de células nas fases quiescentes, aumentando sua capacidade de síntese. A adição dos FH nas concentrações estudadas nas culturas de hepatócitos mostrou-se eficaz na manutenção dessas células, mantendo-se funcionalmente ativos, com a expressão dos marcadores de seu metabolismo e diferenciação. / The use of hepatrotophic hic factors (HF) has provided important advances in the treatment of several hepatic disorders. The evaluation of this treatment may be carried out by in vivo models, as experiments on hepatic regeneration after partial hepatectomy; or in vitro models as culture of hepatocytes, stellate cells or any other hepatic cell. This last model allows an individual analysis of the studied substances on their target cells, providing the possibility of further investigation on the mechanisms involved. Therefore, the present study evaluated the in vitro effects of the hepatotrophic factors administration on the metabolism and proliferation of cultured hepatocytes from normal rat liver. Liver from 30 Wistar rats were used, and after in situ enzimatic dissociation, hepatocytes were collected and separated by 45% Percoll density gradient, cultivated in DMEN/F12 media supplemented with different HF concentrations (1×, 5× and 10×) and finally analyzed at 24, 48 and 72hs intervals. Cell viability and proliferation were assessed by MTT colorimetric assay, cell toxicity by propidium iodide, mitochondrial membrane electrical potential by 123 rodamine test and cytokeratin 8, 18 and desmin as cytoskeleton markers. Hepatic metabolism was evaluated by infusion of indocianine green (ICG), by type I collagen quantification and by peroxided polyunsaturated lipid radicals production. The techniques used in order to collect hepatocytes proved to be efficient, with a viability higher than 90%, no toxicity, and the maintenance of the mitochondrial membrane potential and positive labeling for cytokeratins (CK) 8, 18 and desmin. The HF addition increased the proliferation of hepatocytes in the three periods analyzed, when compared to the control group. The HF did not show any toxicity in primary hepatocytes culture regardless of the concentration evaluated along the experimental periods. The HF addition impaired the production of free radicals, protecting the hepatocytes from the lipid peroxidation. On the other hand, the functional evaluation of primary hepatocytes cultures using the ICG test proved to be efficient in the determination of the hepatocytes metabolism, as the maintenance of the transaminase and amylase levels. The hepatocytes kept in primary culture after HF addition in all the analyzed periods increased the collagen production and were also able to shift the distribution of quiescent cells population of, thus increasing their synthesis capacity. The HF addition in the studied concentrations in hepatocytes cultures proved to be efficient in the maintenance of these cells, that remain functionally active and expressing their metabolism and differentiation characteristic markers.

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCRABL1, incluindo Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas clonais e estão frequentemente associadas à mutação JAK2V617F. Apesar dos avanços no conhecimento da fisiopatologia após a descoberta da mutação JAK2V617F e do desenvolvimento de inibidores da JAK2, o tratamento permanece não curativo. Sabe-se que as célulastronco mais primitivas nas NMPs são responsáveis pela iniciação da doença e que a expansão dos precursores mieloeritróides contribui para o fenótipo clínico. Dados recentes obtidos com ensaios in vitro mostram que as proteínas da família BCL2, reguladoras da apoptose mitocondrial, desempenham um papel relevante na patogênese das NMPs. Acreditamos que a expressão anômala de BCL2 nas células progenitoras hematopoéticas (CPH) das NMPs pode contribuir para a patogênese desse grupo de doenças. Avaliamos a expressão gênica, por meio de PCR em Tempo Real, da família BCL2 (genes antiapoptóticos BCL-xL e BCL2 e o pró-apoptótico BIM) nas diferentes subpopulações de progenitores hematopoéticos murinos (de um modelo condicional knockin de expressão heterozigótica condicional da Jak2V617F) e de pacientes portadores de NMPs bem como sua contribuição para o fenótipo da doença e resposta ao inibidores da JAK2 (com a droga ruxolitinibe) e/ou inibição da família BCL2 (com o inibidor de BCL2 obatoclax). Não encontramos diferença de expressão basal dos genes BCL2, BCL-xL e BIM nas células CD34+ bem como nas subpopulações de células CD34+38-/+ de pacientes com NMPs, independente da presença da mutação JAK2V617F, em relação às células CD34+ e subpopulações CD34+38-/+ dos controles (p>0.05). Nas células CD34+ de pacientes com TE encontramos aumento de expressão de BCL2 em relação às células CD34+ pacientes com MFP (p=0.03). No modelo transgênico de camundongos Jak2 wt/VF (que apresentam uma NMP semelhante à PV) e Jak2 wt/wt (controles), comparamos a expressão diferencial dos genes da família Bcl2 em precursores hematopoéticos imaturos (LSKs) e progenitores mieloides mais maduros (MPs). A expressão do BclxL em MPs de camundongos wt/VF foi maior em relação à subpopulação de células LSKs e em relação as duas subpopulações de células dos controles (p=0.0011). Não houve diferença significativa de expressão do Bcl2 nas subpopulações de células LSKs e MPs de animais wt/VF e wt/wt (p=0.12). Observou-se menor expressão de Bim em LSKs em relação às células MPs dos animais mutados (p=0.026), diferença essa não observada entre os controles Jak2 wt/wt. O tratamento isolado com inibidor de JAK2 ou de BCL2 resultou em aumento de expressão do Bim nas CPH (LSKs e MPs) de camungongos Jak2 wt/VF em relação aos animais Jak2 wt/wt. Este aumento da expressão de Bim foi ainda mais evidente após o tratamento das células com a combinação das duas drogas quando comparadas às células não tratadas ou tratadas com um dos dois inibidores, sendo maior em animais doentes do que em animais controles (p<0.0001). A análise do efeito do tratamento com os inibidores de JAK2 e BCL2 na indução de apoptose por meio de citometria de fluxo (marcação com anexina/7-AAD) revelou que as células LSKs foram mais resistentes à apoptose tardia do que as células MPs independentemente da mutação da JAK2 (p<0.05). O tratamento com obatoclax resultou em indução de apoptose diferentemente do que foi observado com o tratamento com ruxolitinibe (p=0.594) nas células MPs de animais Jak2 wt/VF. Ademais, o tratamento combinado com ruxolitinibe e obatoclax resultou no aumento da apoptose nas células MPs dos animais com fenótipo de PV (Jak2 wt/VF) em relação aos animais Jak2 wt/wt (p=0.05). Em conclusão, demonstramos que a resistência à apoptose nas NMPs ocorre desde as CPH iniciadoras da doença. Nossos resultados sugerem que a modulação da apoptose mitocondrial pode ser uma nova estratégia terapêutica para pacientes com NMP em combinação aos inibidores de JAK2, na medida em que atua tanto nas CPH que iniciam a doença como nos MPs, responsáveis pelos sinais e sintomas de mieloproliferação. / Myeloproliferative Neoplasms (MPNs) negative for t(9;22)/BCR-ABL1 rearrangement, including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are clonal hematopoietic diseases and are often associated with the JAK2V617F mutation. Despite advances in the pathophysiology knowledge after the discovery of the JAK2V617F mutation and the development of JAK2 inhibitors, treatment remains non-curative. It is known that MPN primitive stem cells are essential for the initiation of the disease and that the expansion of the myeloeritroid precursors contributes to the clinical phenotype. Recent data, obtained with in vitro assays, showed that BCL2 family proteins, regulators of mitochondrial apoptosis, play a relevant role in the pathogenesis of MPNs. We believe that the anomalous expression of BCL2 in hematopoietic progenitor cells (HPCs) of MPNs may contribute to their pathogenesis. We evaluated BCL2 family (antiapoptotic genes BCL-xL and BCL2 and the pro-apoptotic BIM) gene expression by real-time PCR in different subpopulations of hematopoietic progenitors from a conditional Jak2V617F knockin murine model and from patients with MPNs as well as their contribution to the disease phenotype and response to JAK2 inhibitors (with ruxolitinib) and/or to the inhibition of the BCL2 family (with the BH3-mimetic obatoclax). We found no difference in the basal expression of the BCL2, BCL-xL and BIM in CD34+ cells as well as in subpopulations of CD34+ 38-/+ cells from patients with MPNs, regardless of the presence of the JAK2V617F mutation. In CD34+ cells obtained from patients with ET, we found an increase of BCL2 expression when compared to CD34+ cells with PMF (p=0.03). In the Jak2 wt/VF transgenic mice (that develop a MPN similar to PV) and Jak2 wt/wt controls, we compared the differential expression of Bcl2 family genes in immature hematopoietic precursors (LSKs) and more mature myeloid progenitors (MPs). Expression of Bcl-xL in MPs of wt/VF mice was greater when compared to LSKs and to the two progenitor subpopulations of control cells (p=0.0011). There was no significant difference in Bcl2 expression between the subpopulations of LSKs and MPs from wt/VF and wt/wt animals (p=0.12). Lower Bim expression in LSKs than in MPs was observed in samples from JAK2-mutated animals (p=0.026). Such difference was not observed between the Jak2 wt/wt subpopulations. Treatment with JAK2 or BCL2 inhibitors alone resulted in increased Bim expression in LSKs and MPs of the Jak2 wt/VF mice when compared to Jak2 wt/wt animals. This increase in Bim expression was even more evident when these cells were treated with the combination of the two drugs as compared to single treatment with one of the two inhibitors, being higher in mutaded than control animals (p<0.0001). The analysis of apoptosis by flow cytometry (annexin / 7-AAD labeling) revealed that LSK cells were more resistant to late apoptosis than MP cells regardless of the JAK2 mutation (p<0.05). Treatment with obatoclax resulted in greater apoptosis induction than it was observed with ruxolitinib treatment (p=0.594) on MP cells of Jak2 wt/VF animals. In addition, the combined treatment with ruxolitinib and obatoclax resulted in increased apoptosis in MP cells of animals with the PV phenotype (Jak2 wt/VF) as compared to the Jak2 wt/wt animals (p=0.05). In conclusion, we demonstrated that resistance to apoptosis in MPNs occurs at the level of the hematopoietic progenitors that initiate the disease. Our results suggest that modulation of mitochondrial apoptosis may be a new therapeutic strategy for MPN patients in combination with JAK2 inhibitors, as it acts on both the disease initiating and more mature progenitors, responsible for the clinical findings of myeloproliferation.

Os herbicidas são destinados ao controle das ervas daninhas e seu uso torna o fornecimento de alimentos abundante e livre de pragas, porém a exposição ocupacional e ambiental a esses compostos pode trazer riscos à saúde. O Brasil é o maior consumidor de praguicidas desde 2008, e os herbicidas correspondem por 45% do volume dessas substâncias. O tebutiurom e a trifluralina são herbicidas muito utilizados em culturas de cana-de-açúcar, e apesar de serem descritos como seletivos em seu mecanismo de ação, seus efeitos em organismos não alvo, como células humanas, são pouco conhecidos. O objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos dos herbicidas tebutiuron e trifluralina em organismos não alvo. Para isso, utilizou-se a linhagem celular HepG2, e as concentrações testadas dos herbicidas foram de 1 a 100 ?mol/L e o tempo de exposição variou de 4 h à 14 dias de acordo com o ensaio. Utilizou-se também as linhagens TA98 TA100, TA97a e TA1535 da bactéria S typhimurium. Neste caso, as concentrações testadas dos herbicidas variaram de 0,1 à 5000 ?g/placa e o tempo de exposição foi de 66 h. As análises indicaram que o tebutiurom não apresenta potencial citotóxico, genotóxico, ou mutagênico nas condições testadas, evidenciando sua seletividade. Testes com a trifluralina, no entanto, mostraram que HepG2 apresentaram uma diminuição da capacidade em formar clones quando expostas à 100 ?mol/L por 14 dias, e uma redução na densidade celular quando expostas à 50 e 100 ?mol/L por 24, 48 e 72h. Tais efeitos ocorreram devido a uma diminuição da viabilidade celular, observada em 50 e 100 ?mol/L pelo ensaio MTT, e devido a um bloqueio no ciclo celular na fase S, evidenciado em 100 ?mol/L, ambos nos tempos de 24, 48 e 72h. O tipo de morte celular inicialmente observada foi a apoptose, através da marcação por anexina V em 100 ?mol/L após 48 e 72 h de exposição, e através da condensação e fragmentação nuclear em 100 ?mol/L após 24 e 48 h de exposição. Em 72 h, observou-se também necrose em 100 ?mol/L, por meio dos testes anexina V/PI e liberação de LDH. A morte celular pode estar relacionada à diminuição do potencial de membrana mitocondrial, observada em 50 e 100 ?mol/L após 24, 48 e 72h, e a um aumento na produção de espécies reativas, efeito observado em células expostas à 100 ?mol/L de trifluralina por 24 e 48 h. No entanto, observou-se que a via de resposta ao estresse oxidativo Keap1/Nrf2-ARE não foi ativada no tempo analisado de 24 h. Além disso, os testes de cometa e micronúcleo não indicaram potencial da trifluralina em provocar danos no material genético de HepG2. Complementarmente, o teste de Ames em linhagens de S typhimurium também não evidenciaram potencial mutagênico do herbicida. As análises com a trifluralina mostraram que o herbicida, apesar de não induzir genotoxicidade e mutagenicidade, possui potencial citotóxico em HepG2, indicando que pode afetar organismos não alvo, como células humanas / Herbicides are used to control weeds in agriculture. The use of these chemicals makes possible an abundant and pest free supply of food. However, occupational and environmental exposure to these compounds can lead to health risks. Brazil is the largest consumer of pesticides since 2008, and herbicides match for 45% of the volume of these substances. The tebutiurom and trifluralin herbicides are widely used in sugarcane crops, and although they are described as selective in its mechanism of action, effects on non-target organisms, such as human cells, are are poorly known. The aim of this work was to evaluate the effects of tebuthiuron and trifluralin herbicides on non-target organisms. To this end, we used the cell line HepG2, and herbicides were tested at concentrations of 1 to 100 ?M and the exposure time ranged from 4 h to 14 days in accordance with the assay. We also used the strains TA100 TA98, TA97a and TA1535 of the bacterium S. typhimurium. In this case, the herbicide concentrations tested ranged from 0.1 to 5000 ?g / plate and the exposure time was 66 h. Analyzes indicated that the tebutiurom has no cytotoxic, genotoxic or mutagenic potential at tested conditions, highlighting its selectivity. Tests with the Trifluralin, however, showed that HepG2 had a decreased ability in forming clones when exposed to 100 ?M for 14 days, and a reduction in cell density when exposed to 50 and 100 ?M of the herbicide for 24, 48 and 72h. These effects occurred due a decrease in cell viability observed at 50 and 100 ?M by MTT assay, and due to a block in the cell cycle into S phase, as evidenced in 100 ?M, both at 24, 48 and 72h. The type of cell death detected first was apoptosis. It was observed by staining with annexin V in cells exposed to 100 ?M of trifluralin during 48 and 72 h, and through the nuclear condensation and fragmentation in exposure with 100 ?M during 24 and 48 h of exposure. At 72 h, necrosis was also observed in 100 ?M through the annexin V / PI and LDH assays. Cell death occurrence may be associated with decreased mitochondrial membrane potential observed in 50 and 100 ?M after 24, 48 and 72h of exposure, and also may be associated with incresed production of reactive species, observed in cells exposed to 100 ?M of trifluralin for 24 and 48 h. However, it was observed that the oxidative stress response pathway Keap1 / Nrf2-ARE was not activated within 24 hours. Furthermore, comet assay and micronucleus test indicated no potential of trifluralin in causing DNA damage of HepG2. In addition, the Ames test using S. typhimurium strains also showed no mutagenic potential of the herbicide. The analyzes showed that the trifluralin, despite not induce genotoxicity and mutagenicity, have cytotoxic potential in HepG2, indicating that can affect non-target organisms, such as human cells.

Isquemia e reperfusão (I/R) de vasos mesentéricos que acarretam insuficiência vascular aguda são acompanhadas de insuficiência em múltiplos órgãos e estão associados a altas morbidade e mortalidade. Os benefícios da solução hipertônica e da pentoxifilina foram testados isoladamente e em conjunto para melhorar o fluxo sanguíneo e o estado de oxigenação dos tecidos com redução da reação inflamatória e de apoptose, tanto no intestino quanto no pulmão enquanto órgão alvo. Foram utilizados 24 ratos Wistar machos pesando entre 200 e 250g distribuídos em 4 grupos (n=6). Foram submetidos à laparotomia e período de isquemia por clampeamento dos vasos mesentéricos por 40 minutos. O período de reperfusão foi de 80 minutos. A cada 40 minutos foram realizadas coletas de sangue arterial para gasometria. Os animais foram alocados nos grupos: grupo I/R (IR) onde I/R foi realizada e os animais receberam 4ml/kg de solução salina isotônica. O grupo solução salina hipertônica (SH) recebeu 4ml/kg de solução hipertônica a 7,5% e o grupo pentoxifilina (PTX) recebeu 30mg/kg de pentoxifilina diluída em NaCl 0,9% em um volume total de 4ml/kg ao final da isquemia intestinal. O grupo solução salina hipertônica+pentoxifilina (SH+PTX) recebeu ambas as soluções com volume total de 4m/kg no mesmo momento. As biopsias de intestino e pulmão foram colhidas ao final do experimento e foram submetidas à coloração em HE e à imuno-histoquímica para COX 2, caspase-3 clivada e Bcl-2. Os valores de sO2 revelaram diferença estatisticamente significante aos 40 (p=0,0099) e 80 (p=0,0074) minutos de reperfusão na comparação do grupo IR com os grupos SH e SH+PTX. Os valores de lactato foram estatisticamente significantes aos 40 minutos (p=0,0069) e 80 minutos (p=0,0098) de reperfusão, entre os grupos IR e os grupos SH e SH+PTX. A avaliação histológica em HE no tecido intestinal evidenciou diferença estatisticamente significantes na comparação dos grupos SH (p=0,0200), PTX (p=0,0200) e HS+PTX (p=0,0412) com o grupo IR, assim como no tecido pulmonar, que evidenciou diferenças estatisticamente significantes na comparação de IR com SH (p=0,006), PTX (p=0,0433) e SH+PTX (p=0,0040). A marcação citoplasmática de COX 2 revelou diferença estatisticamente significante ao comparar o grupo IR com o grupo SH+PTX (p=0,0015), Na avaliação do tecido pulmonar foi observado o grupo IR estabelecendo diferenças estatisticamente significantes na comparação com os grupos SH (p=0,0455), PTX (0,0143) e SH+PTX (p=0,0455). A avaliação de apoptose por imunohistoquímica para caspase 3 clivada evidenciou diferença com significância estatística ente os grupos IR e SH (p=0,0085) e os grupos PTX e SH (p=0,0120) em tecido intestinal. Em tecido pulmonar, entre IR e PTX (p=0,0090) e SH e PTX (p=0.0412). A marcação citoplasmática de Bcl-2 evidenciou que somente entres os grupos IR e SH+PTX (p=0,0012) se estabeleceu significância estatística em tecido intestinal No pulmão a diferença foi evidenciada em relação ao grupo IR e os grupos SH (p=0,0128), PTX (p=0,0085) e SH+PTX (p=0,0066). Conclui-se que o uso associado de pentoxifilina e solução salina hipertônica oferece os melhores resultados dos pontos de vista metabólico, inflamatório e da inibição da apoptose / Ischemia-reperfusion (I/R) of the mesenteric vessels cause acute vascular insufficiency and is followed by multiple organs failure and high morbidity and mortality. The benefits of hypertonic saline (NaCl 7,5%) and pentoxifylline were tested to improve metabolic and oxygen status of tissues with reduced inflammatory reaction and apoptosis, both in the gut as in the lung as target organ. 24 male Wistar rats weighing 200 to 250g. They underwent laparotomy and ischemia by clamping the mesenteric vessels for 40 minutes. The reperfusion period was 80-minute long. Every 40 minutes, blood was collected for arterial gas analysis. The animals were set into 4 groups (n=6): I/R (IR) received isotonic saline just before reperfusion (4ml/kg). Hypertonic saline group (HS) received 7.5% hypertonic saline solution (4ml/kg) and Pentoxifylline group (PTX) received pentoxifylline (30mg/kg)diluted in NaCl 0.9% at the end of the mesenteric ischemia. Hypertonic saline+pentoxifylline group (SH-PTX) received both solutions at the same doses. Biopsies of intestine and lung were collected at the end of the experiment and were subjected to HE staining and immunohistochemistry staining to COX 2, cleaved caspase-3 and Bcl-2. About the values of sO2, a statistically significant difference was established when groups were compared at 40 (p=0.0099) minutes and 80 (p=0.0074) of reperfusion. The lactate values were statistically significant after 40 (p=0.0069) and 80 (p=0.098) minutes of reperfusion as well. Histological evaluation with HE revealed a statistically significant difference in the comparison of SH (p=0.0200), PTX (p=0.0200) and HS + PTX (p=0.0412) groups compared to IR group in intestine tissue and SH (p=0.0006), PTX (p=0.0433) and HS + PTX (p=0.040) in lung tissue. Cytoplasmic staining of COX 2 revealed a statistically significant difference when comparing IR (p=0.0015) to HS+PTX in intestinal tissue. The evaluation of the lung tissue for COX 2 showed IR group setting statistically significance when compared to HS 9p=0,045), PTX (0.0143) and HS+PTX (p=0.0455) groups. The evaluation of apoptosis by immunohistochemistry for cleaved caspase 3 revealed that there was a significant difference between IR versus SH (p=0.0085) and PTX versus HS (p= 0.0120) in intestinal tissue and IR versus PTX (p=0,0090) and PTX versus SH (p=0.0412) in lung tissue. The cytoplasmic Bcl-2 expression shows that only between groups IR versus HS+PTX (p = 0.0012) statistical significance was established in intestinal tissue. Lung tissue showed the difference was evidenced in relation to IR versus SH (p=0.0128), PTX (p=0.0085) and HS+PTX (p=0.0066). It may be concluded that the combined use of pentoxifylline and hypertonic saline offers best results on metabolic, inflammatory and apoptosis inhibitory aspects