Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T03:47:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_AmandaBortolini_D.pdf: 6025388 bytes, checksum: 97930bc131f2a0eac6926dae1eeb9319 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Modificações epigenéticas do DNA ou da cromatina atuam principalmente no controle da atividade de elementos de transposição, podendo também silenciar genes, geralmente quando estes estão associados a elementos de transposição ou sequências repetidas. Em plantas, alguns alelos epigenéticos afetando caracteres como morfologia floral, florescimento, estatura ou amadurecimento do fruto foram descritos, revelando o potencial deste tipo de regulação para gerar variabilidade fenotípica herdável não necessariamente vinculada a alterações da sequência de DNA. No entanto, o impacto de mecanismos epigenéticos em processos de evolução adaptativa é ainda bastante desconhecido, em parte, pela falta de informação sobre variação epigenética em populações naturais. Identificamos Qua-Quine Starch (QQS) de Arabidopsis thaliana como um gene sob um controle epigenético flexível e, portanto, particularmente propenso a variações epialélicas frequentes na natureza. QQS é um gene recente, que provavelmente originou-se de novo em Arabidopsis thaliana em uma região rica em elementos de transposição. Mostramos que QQS apresenta-se diferencialmente expresso entre acessos naturais assim como entre indivíduos diretamente coletados na natureza e que estas diferenças de expressão estão negativamente correlacionadas com o nível de metilação de sequências repetidas localizadas em sua região promotora e 5' UTR, não estando relacionadas a variação genética em cis ou trans. Mostramos ainda que variação epialélica em QQS é independente do nível de metilação de transposons vizinhos e que pode ser estavelmente herdada entre gerações. Considerando o impacto potencial de padrões de expressão contrastantes de QQS no metabolismo de amido, um importante componente para produção de biomassa e crescimento, sugerimos que variação epialélica em QQS possa ter implicações adaptativas. Nossos dados também apontam pela primeira vez uma ligação potencial entre mecanismos epigenéticos e o processo de evolução de genes novos. Propomos que genes novos, especialmente os de origem de novo, poderiam ser mais propensos a variar epigeneticamente, o que permite um ajuste fino de seu padrão de expressão até que o estado mais vantajoso seja fixado geneticamente / Abstract: Epigenetic modifications of DNA or chromatin control of the activity of transposable elements and can also silence genes which are associated to transposons or repetitive sequences. In plants, epigenetic alleles affecting characters such as floral morphology, flowering, stature or fruit ripening have been described, highlighting the potential of this type of regulation in generating heritable phenotypic diversity, not necessarily linked to DNA sequence alterations. However, the impact of epigenetic mechanisms in adaptative evolution is still largely unknown, in part, due to the lack of information about epiallelic variation in natural populations. We have identified Qua-Quine Starch (QQS) of Arabidopsis thaliana as a gene under flexible epigenetic control and thus particularly prone to epiallelic variation in nature. QQS is a recent gene that likely originated de novo in Arabidopsis thaliana in a transposon-rich region. We show that QQS is differentially expressed among natural accessions as well as among individuals directly sampled from the wild and that these expression differences are negatively correlated with the DNA methylation level of repeat sequences located on QQS promoter and 5'UTR region and are not correlated with cis or trans genetic variation. We also show that epiallelic variation at QQS is independent of the methylation status of nearby transposable elements and can be stably inherited across generations. Considering the potential impact of contrasting QQS expression patterns on starch accumulation, an important component of biomass production and growth, we suggest that epiallelic variation at QQS may have adaptative implications. Our data also points for the first time to a potential link between epigenetic mechanisms and the evolution of novel genes. We suggest that novel genes, more specifically those created de novo, could be endowed with an increased potential for epigenetic variation and thus for adjusting their expression pattern until the most adaptive state becomes genetically fixed / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Le 134Cs et le 137Cs, isotopes radioactifs du césium relâchés entre autres à la suite des accidents de Tchernobyl et Fukushima, sont des sources de préoccupations majeures pour la sécurité sanitaire et la protection des écosystèmes. La contamination des plantes est liée en partie à leur capacité à absorber le césium présent dans la solution du sol via des transporteurs. Le césium emprunte en effet, au moins en partie, le système de transport potassique sans disposer de transporteurs qui lui sont spécifiques. Il existe une grande diversité de transporteurs potassiques et la part du flux total qu’ils prennent en charge dépend du niveau de potassium fourni à la plante. Nous avons fait varier ce niveau et étudié son impact sur l’absorption et la distribution du césium dans la plante. Outre les phénomènes de compétition existant entre les deux éléments, le type de transporteurs dominant à un niveau de potassium donné a également une influence sur le transport du césium. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des familles de transporteurs potassiques ayant de plus fortes chances d’être impliquées dans le transport de césium. Ainsi, les résultats produits pendant cette thèse mettent en évidence le rôle in planta du transporteur KUP9, jusque-là peu étudié, dans les flux de césium chez Arabidopsis thaliana. Nous n’observons pas de modifications de l’absorption du potassium chez les mutants invalidés sur ce transporteur : il serait donc possible de le manipuler pour moduler l’absorption de césium sans que la nutrition potassique ne soit altérée. / 134Cs and 137Cs, two radioactive isotopes unintentionally released after the Chernobyl and the Fukushima accidents, are of major concern for ecosystems protection and human health. Plants contamination is due to their ability to absorb cesium from the soil solution via transporters. Indeed, cesium which is supposed to have no role in plants can pass through potassium transporters. Proteins involved in potassium transport are diverse and the part of fluxes covered by each of them depends on the level of potassium supplied to the plant. We tested the effects of this level on uptake and distribution of cesium into the plant. Beside competition between the two elements, transporters which are dominant for a given potassium supply condition modify the cesium transport. Making the link between these modifications and knowledge on identity and properties of potassium transporters, we highlighted candidates with high potential for cesium transport. Hence, results produced during my thesis demonstrate in planta the role of KUP9 transporter, which has received little attention so far, in cesium fluxes in Arabidopsis thaliana. Changing in potassium uptake has not been observed in mutant lines disrupted in this KUP9 transporter suggesting interestingly that it could be possible to modulate cesium uptake without alteration of potassium nutrition.

Manifestation visible des cross-overs génétiques, les chiasmata lient les paires de chromosomes homologues afin de les orienter correctement sur le fuseau méiotique en Métaphase et Anaphase I. Ils résultent d'un processus complexe et étroitement régulé impliquant l'induction de cassures double-brins et de leur réparation par l'invasion d'un duplex d'ADN homologue faisant office de modèle. La recombinaison est ainsi essentielle pour le synapsis et la ségrégation correcte des chromosomes méiotiques à la première division méiotique, et pour la génération de la variabilité génétique. Bien que les processus permettant à un chromosome de s'apparier seulement à son homologue ne soient pas complètement élucidés, l'appariement des chromosomes homologues est étroitement lié à la recombinaison catalysée par les enzymes d'échange de brins d'ADN RAD51 et DMC1. Ces deux protéines ont des capacités très similaires in vitro, mais sont fonctionnellement distinctes in vivo.La première partie de ma thèse montre l'impact de l'élimination de l'activité d'échange de brins de RAD51 dans la méiose d'Arabidopsis, tout en conservant sa fonction de facteur accessoire pour l'action de DMC1. La recombinaison peut donner lieu à des cross-over (CO) et non-cross-over (NCO) et la recombinase spécifique de la méiose DMC1 a été jugée particulièrement importante dans la production de CO interhomologue. Des résultats récents suggèrent fortement toutefois que DMC1 est la seule recombinase active dans la méiose et doit donc être responsable des résultats de CO et NCO. Etant donné qu'environ 95% de la recombinaison méiotique homologue dans Arabidopsis n'entraîne pas de cross-overs interhomologues, Arabidopsis est un modèle particulièrement sensible pour tester l'importance relative des deux protéines - même des effets mineurs sur la population d'événements non-cross-over devraient produire des effets détectables sur les cross-overs. DMC1 catalyse la réparation de toutes les cassures d'ADN méiotiques en présence d'une protéine RAD51 catalytiquement inactive (fusion RAD51-GFP), et les résultats de mon travail montrent que cela n'a pas d'effet détectable sur les taux relatifs de recombinaison de CO et de NCO : à la fois localement, à l'échelle du chromosome et du génome. Et non plus sur la progression de la division méiotique. Ce travail a abouti à une publication dans le journal PLoS One (Singh G, Da Ines O, Gallego ME & White CI (2017) Analyse de l'impact de l'absence d'activité d'échange de brins de RAD51 dans la méiose d'Arabidopsis PLoS ONE 12: e0183006- 16).Des publications antérieures montrent une synapsis homologue partielle et incomplète en l'absence de rad51 et xrcc3 dans la méiose d'Arabidopsis. Cela s'accompagne de la présence de nombreuses fibres courtes ZYP1 dans ces noyaux, ce qui pourrait indiquer de faibles longueurs de complèxe synaptonémale (SC). Ce synapsis partielle dépend à la fois de SPO11 et de DMC1 et implique des péricentromères, montrant que DMC1 est capable (au moins partiellement) d'entraîner le synapsis dans les péricentromères en l'absence de RAD51. Afin de mieux caractériser ceci et pour tester l'hypothèse que les fibres ZYP1 courtes montrent la présence d'une initiation de SC à ces sites, j'ai méné des expériences d'immunofluorescence et d'imagerie SIM. Utilisant un coloration DAPI et les antiséra ASY1, ZYP1 et CENH3, j'ai conduite des analyses cytogénétiques de le synapsis dans les mutants rad51, xrcc3 et des plantes sauvages. Ces travaux faisaient l'objet de la deuxième partie de mes travaux de thèse. Dans les plantes mutantes, j'observe effectivement des fibres courtes ZYP1 comprenant des centromères, mais elles ne sont pas la règle, ce qui signifie que le synapsis ne commence pas nécessairement à des centromères ou des péricentromères. (...) / The visible manifestation of genetic crossing-over, chiasmata link homologous chromosome pairs to permit them to properly orient on the meiotic Anaphase I spindle. They are the result of an intricate and tightly regulated process involving induction of DNA double- strand breaks and their repair through invasion of a homologous template DNA duplex. Recombination is thus essential for the synapsis and accurate segregation of meiotic chromosomes at the first meiotic division, and in doing so, generates genetic variation. Although the processes permitting a chromosome to pair only with its homologue are not fully understood, successful pairing of homologous chromosomes is tightly linked to recombination catalysed by the DNA strand exchange enzymes RAD51 and DMC1. Both proteins share very similar capabilities in vitro, but are functionally distinct in vivo. The first part of my thesis shows the impact of eliminating the strand exchange activity of RAD51 in Arabidopsis meiosis, while retaining its function as an accessory factor for the action of DMC1. Recombination can give rise to both crossover (CO) and non-crossover (NCO) outcomes and the meiosis-specific recombinase DMC1 has been thought to be of particular importance in the production of inter-homolog CO. Recent results however suggest strongly that that DMC1 is the only active recombinase in wild-type meiosis and thus must be responsible for both CO and NCO outcomes. Approximately 95% of meiotic homologous recombination in Arabidopsis does not result in inter-homologue crossovers and Arabidopsis is thus a particularly sensitive model for testing the relative importance of the two proteins - even minor effects on the non-crossover event population should produce detectable effects on crossing-over. DMC1 catalyses repair of all meiotic DNA breaks in the presence of the catalytically inactive RAD51 (RAD51-GFP fusion) and the results of my work show that this has no detectable effect on the relative rates of CO and NCO recombination, both locally and chromosome- and genome-wide, nor on the progression of the meiotic division. This work has resulted in a publication in the journal PLoS One (Singh G, Da Ines O, Gallego ME & White CI (2017) Analysis of the impact of the absence of RAD51 strand exchange activity in Arabidopsis meiosis. PLoS ONE 12: e0183006–16).Previous publications show partial, incomplete homolog synapsis in the absence of rad51 and xrcc3 in Arabidopsis meiosis. This is accompanied by the presence of many short ZYP1 fibres in these nuclei, possibly indicating short stretches of Synaptonemal Complex (SC). The partial synapsis is both SPO11- and DMC1-dependent and involves peri-centromeres, showing that DMC1 is able to (at least partially) drive synapsis in peri-centromeres in the absence of RAD51. In an effort to better characterize this and to test the hypothesis that the short ZYP1 fibres show the presence of initiation of SC at these sites, immunofluorescence and SIM imaging with DAPI staining and ASY1, ZYP1 and CENH3 antisera were carried out for cytogenetic analyses of synapsis in rad51 and xrcc3 mutants and the WT in the second part of my thesis work. Although I do observe short ZYP1 fibres including centromeres in the mutants, these are not the rule, so synapsis does not necessarily begin at centromeres or peri-centromeres. The superresolution imaging does confirm the presence of stretches of 4-chromatid fibres in xrcc3 plants and this approach will be extended in future work of the group to probe the nature of the RAD51-independent partial meiotic chromosome synapsis.Finally, I have designed and built CRISPR/CAS9 constructs with the aim of creating meiotic DSB hotspots at specific genomic loci. Taking advantage of single nucleotide polymorphism data, these constructs were designed to specifically cleave sites in the Arabidopsis Col-0 ecotype, and not in Ler-0 plants. (...)

Le cycle cellulaire est fermement contrôlé par l’activité de kinases cycline dépendantes (CDKs). Les CDKs d’Arabidopsis, plante à fleur, ont été classées en six types, parmi lesquels les CDKs de type A- et B- sont les acteurs pajeurs du cycle cellulaire végétal. Les CDKs de type B sont spécifiques aux plantes, alors que les CDKs de type A sont des homologues fonctionnels des cdc2/Cdc28p de levure et contiennent un motif conservé PSTAIRE. Il a récemment été observé que, même si les plantes mutantes cdka;1-/- sont viables, elles sont naines et ne peuvent survivre en culture sur sol. La restauration de cette croissance en terre de culture peut néanmoins être obtenue par expression des CDKs de type B. Mais ce sauvetage est incomplet et n’a pu être observé que pour l’expression de CDKB1 et non CDKB2. Ce résultat soulignant le fait que les CDKA;1, CDKB1 et CDKB2 ont des fonctions différentes. Ici, nous avons réalisé une analyse de corrélation entre structure et fonction en échangeant des acides aminés clefs ou domaines entres ces différentes kinases. Les résultats obtenus ont mis en exergue le fait que la structure dans son intégralité est importante pour la fonction de chaque CDK et que les domaines ne peuvent être facilement échangés au sein des différentes CDKs. De plus, la non complémentation des plantes mutantes cdka;1-/- par l’expression des protéines cdc2/CDC28 de levure ou Cdk1 et Cdk2 humaines, démontre le rôle spécifique de la CDK1;1 de plante. Fait intéressant, des plantes qui surexpriment CDK2;2 montrent une croissance accélérée du système racinaire et aérien conduisant à une floraison précoce de 10-15 jours par rapport à une plante sauvage et à une augmentation significative du poids sec de la partie aérienne de la plante et de ses graines. Ces dernières, semées et cultivées sur un milieu contenant de la Bléomycine (composé domageant l’ADN) ont à nouveau montré une meilleure croissance racinaire que des plantes sauvages. Ce résultat indique donc que la répression de l’expression des protéines CDKB2 suivant des dommages à l’ADN n’est pas essentielle. La modulation de l’activité des protéines CDKB2 représente ainsi une nouvelle possibilité d’augmenter la croissance végétale en condition de culture rude. / The cell cycle is tightly controlled through the activities of cyclin-dependent kinases (CDKs). CDKs in the flowering plant Arabidopsis have been classified into six types, among which the A- and B-type CDKs are key players of the plant cell cycle. While B-type CDKs are plant specific, A-type CDKs are functional homologs of yeast cdc2/Cdc28p and contain a conserved PSTAIRE motif. It has been recently observed that, although cdka;1-/- mutant plants are viable, they are extremely dwarfed and cannot survive on soil.. Growth on soil of cdka;1-/- mutants can be restored by the expression of B-type CDKs. However, this rescue was incomplete and was only observed when CDKB1 and not CDKB2 was expressed. These results pointed at distinct features of the three kinases CDKA;1, CDKB1, and CDKB2. Here, exchanging key amino acids and swapping domains between these kinases performed a structure-function analysis. However, the obtained results emphasize that structural integrity of each CDK is delicate and that individual domains cannot be easily exchanged between different CDKs. Moreover, the failure of yeast cdc2/CDC28 and human Cdk1 and Cdk2 to rescue cdka;1-/- mutants stresses the plant specific role of CDKA;1. Interestingly, plants expressing CDKB2;2 showed accelerated growth of the root and the shoot leading to flowering at approximately 10-15 days earlier than the wild type with a significant increase in aboveground dry biomass and seed weight. Remarkably, the roots of CDKB2;2 overexpression lines grew even on DNA damage-inducing media faster than wild-type roots, indicating that the previously observed down-regulation of CDKB2 expression after DNA damage is not essential in the DNA damage response. Thus, modulation of CDKB2 activity represents a novel possibility to enhance plant growth even on adversary conditions.

Le fer (Fe) est un micro-élément essentiel pour les plantes. Nous avons récemment montré que l'ascorbate joue un rôle central dans le transport de Fe dans lesgrainesen participant à la réduction de Fe3+ pour l'absorption de Fe2+. En outre, l'activité de l'efflux d’ascorbate à la surface de l'embryon est cruciale dans ce processus. Nous avons utilisé une stratégie de complémentation de levure pour isoler les transporteurs d'efflux d’ascorbate, en exprimant une banqued'ADNc d'Arabidopsis dans le mutant perte de fonction de la réductase ferrique, Δfre1, incapable de se développer en carence en Fe. L’expression de deux ADNc nommésMATEet GALa permis de restaurerla croissance de Δfre1 en catalysant l’efflux de l'ascorbate dans le milieu, permettant de rétablir l'activité de réduction ferrique. Sur la base de ces résultats très prometteurs, nous avons poursuivi l’étude du rôle de ces transporteurs d'efflux d’ascorbate putatifs, MATE et GAL, dans le transport et l'homéostasie du Fe chez Arabidopsis thaliana. Dans cette étude, nous avons identifié la protéine MATE comme un transporteur vacuolaire qui est potentiellement impliqués dans le chargement d’ascorbate vers la vacuole pour réduire le Feintra-vacuolaire. Cette activité de transport est cruciale pour la remobilisation de Fe au cours de la germination et pour répondre à la carence de Fe dans le reste de la plante. La protéine GAL est localisée à la membrane plasmique où elle pourrait catalyser l’efflux d’ascorbate pour remobiliser le pool de Fe apoplastique. En effet, des mutants perte de fonction de GAL sont très sensibles à la carence en fer et perturbés dans la perception du statut nutritionnel en Fe dans des conditions de suffisance en Fe. En conclusion, les deux transporteurs d'ascorbate putatifs identifiés dans cette étude semblent être impliqués dans l'homéostasie du fer en régulant la circulation des pools de Fe subcellulaires. Cette recherche a contribué à découvrir et à mettre en évidence le lien entre le transport de fer et le métabolisme de l’ascorbate. / Iron (Fe) is an essential microelement for plants. We have recently shown that ascorbate plays a central role in Fe transport to seeds by mediating Fe3+ reduction for the uptake of Fe2+. Moreover, the ascorbate efflux activity at the embryo surface was crucial in this process. We have used a yeast complementation strategy to isolate ascorbate efflux transporters, by expressing an Arabidopsis cDNA library in the Δfre1 mutant that lacks ferric reductase activity and is unable to grow in Fe limiting conditions. The expression of two cDNAs named MATE and GAL is able to rescue the growth defect of Δfre1by mediating efflux of ascorbate in the medium, reconstituting a ferric reduction activity. Therefore, we have studied the roles of putative ascorbate efflux transporters, MATE and GAL, in Fe transport and homeostasis in Arabidopsis thaliana. In this study, we have identified the MATE protein as a vacuolar transporter potentially involved in loading ascorbate to the vacuole to reduce intra-vacuolar Fe. This transport activity appears to be crucial to remobilize Fe during germination and to participate in the response to Fe deficiency in the rest of the plant, as revealed by the phenotypical analyses of knock out mutant plants. The GAL protein is localized to the plasma membrane where it could potentially catalyze the efflux of ascorbate toward the apoplast to remobilize apoplastic Fe pools. Indeed, GAL knock out mutants are highly sensitive to Fe deficiency and disturbed in the sensing of Fe nutritional status in Fe-replete conditions. In conclusion, the two putative ascorbate transporters identified in this study appear to be involved inthe iron homeostasis by regulating the movement of subcellular Fe pools. This research has contributed to discover and highlight the link between iron and ascorbate metabolism and transport.

L'ARNr 5S est une partie intégrante du ribosome indispensable pour la synthèse des protéines. Cette fonction essentielle nécessite une régulation fine de l'expression des ARNr 5S en fonction des exigences cellulaires. L'ARNr 5S est codé par des gènes organisés en répétitions en tandem principalement situés dans les régions péricentromériques des chromosomes 3, 4 et 5 dans le génome Col-0 d'Arabidopsis thaliana. L’étude approfondie de l’organisation, la dynamique et la régulation épigénétique des gènes d’ARNr 5S reste cependant difficile du fait de l’absence d’assemblage de ces régions hautement répétées dans la séquence du génome d’Arabidopsis disponible dans TAIR10.Dans cette thèse, nous apportons de nouvelles informations sur les gènes d'ARNr 5S chez Arabidopsis. Nous avons confirmé les signatures d'ADN spécifiques par séquençage haut débit, identifié des polymorphismes spécifiques des régions chromosomiques portant des ADNr 5S et ainsi défini de nouvelles séquences de référence. Nous avons également étudié le statut épigénétique des gènes ARNr 5S, montrant que ces gènes sont globalement enrichis en marques répressives. Les loci situés sur les chromosomes 4 et 5 présentent également des modifications post-traductionnelles d’histones et des variants d’histone particuliers et caractéristiques d’une activité de transcription. Nous avons aussi montré que les loci d'ADNr 5S sont très dynamiques au sein de l'espèce Arabidopsis avec des variations entre différent écotypes du nombre de copies de gènes d’ARNr 5S et de l’importance relative de chaque cluster. En utilisant l'écotype Ler et des mutants spécifiques, nous montrons que le locus du chromosome 5 est une source majeure de réarrangements chromosomiques qui affectent l'organisation de la chromatine dans le noyau. Enfin, nous suggérons que des variations de l’état chromatinien des gènes d'ARNr 5S peuvent conduire à une différence de transcription dans les différents écotypes.Cette étude permet d’établir un rôle de l'organisation de la chromatine dans la régulation transcriptionnelle et l'organisation des gènes d'ARNr 5S. / 5S rRNA is an integral component of the ribosome and is essential for protein synthesis. 5S rRNA expression is therefore tightly regulated to suit the cellular requirements. 5S rRNA is encoded by gene arrays organized in tandem repeats mainly situated in the pericentromeric regions of chromosomes 3, 4 and 5 in the Arabidopsis thaliana Col-0 genome. Full genome assembly remains challenging in these highly repeated regions and impedes further investigation of their organization, dynamics and epigenetic regulation.In this thesis, we provide information on 5S rRNA genes in Arabidopsis thaliana. We confirmed specific DNA signatures by deep sequencing and define chromosome-specific polymorphisms and new reference sequences. We also studied the epigenetic status of the 5S rRNA genes showing that these genes are enriched in repressive marks whereas the loci on chromosome 4 and 5 also display peculiar histone modifications and variants characteristic of transcriptional activity. We report that 5S rDNA loci are highly dynamic within the Arabidopsis species with high level of variation in global copy number and cluster proportion between ecotypes. Using the Ler ecotype, in which reorganization events were recorded, and specific mutant backgrounds, we identified chromosome 5 rDNA locus as a major source of variation and observed altered chromatin organization in nuclear space as a consequence of 5S rDNA locus variation. Finally, we suggest that differences in chromatin states at the two main 5S rDNA loci can lead to differential usage of 5S rRNA genes indifferent ecotypes.The analysis provides evidence for a role of chromatin organization in transcriptional regulation and 5S rDNA organization.

N-Acylethanolamines (NAEs) are endogenous plant lipids hydrolyzed by fatty acid amide hydrolase (FAAH). When wildtype Arabidopsis thaliana seeds were germinated and grown in exogenous NAE 12:0 (35 µM and above), growth was severely reduced in a concentration dependent manner. Wildtype A. thaliana seeds sown on exogenous abscisic acid (ABA) exhibited similar growth reduction to that seen with NAE treatment. AtFAAH knockouts grew and developed similarly to WT, but AtFAAH overexpressor lines show markedly enhanced sensitivity to ABA. When low levels of NAE and ABA, which have very little effect on growth alone, were combined, there was a dramatic reduction in seedling growth in all three genotypes, indicating a synergistic interaction between ABA and NAE. Notably, this synergistic arrest of seedling growth was partially reversed in the ABA insensitive (abi) mutant abi3-1, indicating that a functional ABA signaling pathway is required for the full synergistic effect. This synergistic growth arrest results in an increased accumulation of NAEs, but no concomitant increase in ABA levels. The combined NAE and ABA treatment induced a dose-dependent increase in ABI3 transcript levels, which was inversely related to growth. The ABA responsive genes AtHVA22B and RD29B also had increased expression in both NAE and ABA treatment. The abi3-1 mutant showed no expression of ABI3 and AtHVA22B, but RD29B expression remained similar to wildtype seedlings, suggesting an alternate mechanism for NAE and ABA interaction. Taken together, these data suggest that NAE metabolism acts through ABI3-dependent and independent pathways in the negative regulation of seedling development.

Le sujet de cette thèse est l’étude de la régulation de l’expression du facteur de transcription LEAFY COTYLEDON 2 (LEC2), qui est un, régulateur clé du développement de la graine d’Arabidospsis thaliana. La graine offre un mode de propagation et de protection des espèces végétales à graines, indispensable à leur survie. La graine est l’élément de base de l’agriculture, en tant que semence, et de l’alimentation humaine, aussi bien sous forme brute que sous forme transformée (farines, huiles…). Elle a aussi de très nombreuses applications industrielles dans l’industrie et les biocarburants. Le développement de la graine, comme beaucoup d’étapes nécessaires à la vie de la plante, est controlé par des phénomènes complexes, incluant des facteurs de transcription. LEC2, ainsi que 2 autres facteurs de transcription de type B3 (FUSCA 3 et ABI3) et un facteur à domaine de fixation CAAT (LEAFY COTYLEDON 1), sont les quatre facteurs clés du développement de la graine d’Arabidospsis thaliana, appelés AFLs (ABI3, FUS3, LEC1, 2). Les gènes AFLs s’expriment spécifiquement dans l’embryon et sont fortement réprimés dans les parties végétatives, par de multiples mécanismes impliquant, entre autre, des facteurs de transcription et des acteurs plus généraux modifiant la structure de la chromatine. Bien que la régulation de LEC2 ait déjà été largement étudiée, les mécanismes précis de répression ainsi que l’activation de ce gène, sont encore méconnus.Le travail présenté est basé sur un travail de délétion de promoteurs, qui a révélé l’existence de 3 boîtes de régulation, essentielles à une activité correcte du promoteur de LEC2. Deux boîtes, dont une correspondrait à une boîte de fixation de facteurs MADS et une à une boîte GAGA dans la séquence transcrite non traduite de LEC2, sont essentielles à l’activité du promoteur. La 3ème séquence, d’une longueur de 50pb, est nécessaire à la répression de LEC2 dans les parties végétatives par des mécanismes épigénétiques. La corrélation de la présence de cette boîte avec un enrichissement dans la marque H3K27me3 au locus nous a permis de rapprocher cette séquence de répression d’une PRE (Polycomb response element) de type végétal. / The aim of this work is to study the regulation of the transcription factor LEAFY COTYLEDON 2, which is a key regulator of seed developpement in Arabidopsis thaliana.Seeds have essential functions in the environnement for plant propagation and as embryo protective tools. Furthermore, numerous products issued from the agriculture or involved in human food (e.g. cereals, oil, flour) are based on seeds. Several industrial apllications depend, as well, on this organ such as oil production for human consumption, additives for some industrial processes, or biofuel synthesis.Seed developemental phases are dependant of a complex regulatory network composed in major part with transcription factors, that were found to be central components of plant evolution and domestication.LEC2, FUS3, ABI3 (three B3 type factors) and LEC1 (a CATT binding factor) are named AFL (ABI3, FUS3, LEC1, 2) genes, and are key regulators of Arabidopsis seed development. AFL genes are specifically expressed in embryo and repressed in vegetatives tissues. This repression has been principally studied in germinating seedlings and was shown to be caused by a set of transcription factors and chromatin structure modifiers.Beside the fact that LEC2 regulation has been extensively studied within the past few years, it was known that other mechanisms of repression and activation were still to be discovered. The work carried out on LEC2 presented here, mainly based on an extensive promoter deletion analysis, has allowed the discovery of three essential nucleotidic sequences necessary for a proper LEC2 promoter activity. The two first regulatory sequences are similar to a MADS box binding element and a GAGA binding site, and were found to be essentials for LEC2 promoter activity. The third sequence (named RLE for Repression of LEC2 Element) is 50bp long and lead to the repression of LEC2 promoter activity after onset of seed germination. A very strong correlation between RLE and the enrichment of H3K27me3 mark deposition at specific loci, suggests this sequence is the first PRE-like (Polycomb response element) element identified in plants.

O gene thi1 foi isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de A. thaliana devido à sua capacidade de complementar mutantes de E. coli para rotas de reparo de DNA. O posterior seqüenciamento desse gene permitiu a identificação de similaridade com genes de fungos ativados em condições de estresse ou ativados na ausência de tiamina (vitamina B1). A síntese de tiamina é de grande importância já que na forma pirofosfatada é coenzima essencial para vários processos vitais das células. No presente estudo, foi realizada a caracterização funcional do gene thi1 utilizando-se, para tanto, linhagens de A. thaliana mutante e/ou com expressão diferencial desse gene. Foram analisados parâmetros biológicos como viabilidade de sementes, antioxidantes, danos no DNA, e atividade transcricional e traducional do gene thi1. Foi iniciado, também, o processo de padronização da quantificação de tiamina em plantas. Foi observado, para a linhagem mutante, menor viabilidade de sementes, maior produção de antioxidantes e maior quantidade de danos no DNA de cloroplastos. Quanto à atividade transcricional e traducional, foi observado que o gene thi1 apresenta um pico de expressão no período da tarde com um ritmo circadiano em potencial. Além disso, o acúmulo da proteína nos tecidos acompanha o perfil de expressão de RNAm thi1, o que sugere que o modo de regulação primária do gene é em nível transcricional. A análise comparativa de proteína por gel bi-dimensional entre as linhagens selvagem e mutante permitiu a identificação de quatro proteínas em maior quantidade na mutante, sendo duas identificadas por seqüenciamento: enolase e fosfoglicerato desidrogenase. Na análise de tiamina foi observado que a linhagem mutante acumula um composto, não identificado, que emite fluorescência no mesmo comprimento de onda que as tiaminas, sendo, provavelmente, um precursor do tiazol. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que THI1 defectivo acarretaria em desbalanço metabólico e, não necessariamente, que o gene thi1 estaria envolvido em dupla função. Em bactérias, entre os precursores de tiazol, estão a cisteína e o gliceraldeído 3-fosfato (G3P). O G3P em excesso seria deslocado para o ciclo de Calvin a fim de regenerar a ribulose 1,5-bisfosfato. Maior quantidade de G3P, maior taxa fotossintética, maior produção de ROS, maior produção de antioxidantes na mutante. A maior disponibilidade de G3P aumentaria o fluxo de glicólise e, consequentemente, de respiração mitocondrial, aumentando a taxa de ROS. A fosfoglicerato desidrogenase, em maior quantidade na mutante, está envolvida na síntese de cisteina que acarreta na produção de glutationa. A glutationa e a cisteína, por sua vez, atuariam induzindo o promotor da SOD, acarretando, então, na produção de mais antioxidantes. Todos esses antioxidantes estariam envolvidos na detoxificação de ROS presente em excesso na linhagem mutante, que levaria à menor viabilidade de sementes e maior quantidade de danos no DNA. Devido à grande quantidade de ROS, haveria superexpressão de enolase, envolvida no bloqueio da proliferação celular e, subsequentemente, em morte celular programada, o que explicaria o retardo no desenvolvimento da linhagem mutante / thi1 gene was previously isolated from A. thaliana cDNA library due to its capacity to complement mutant Escherichia coli defective in DNA repair. The late analyse of this gene showed its similarity with yeast genes activated under stress conditions or activated in the absence of thiamine. It means that THI1 has bifunctional activity, being involved in thiamine biosynthesis and repair/tolerance to DNA damage. The thiamine biosynthesis is important because its phosphorilated form is a coenzyme essential to several vital process at the cell. The repair/tolerance to DNA damage shows its importance because it is necessary to maintenance the genetic stability of the individual. In the present study, we report the functional characterization of thi1 gene using A. thaliana lines with differential expression of this gene. We analyzed the seed viability, the fresh weight of different lines, thi1 mRNA expression, the amount of protein produced and the expression in situ using the thi1-GUS construction in different conditions. Besides that we quantified free radicals in the wild-type (WT) and mutant lines and analysed the response of the mutant line, with defective THI1, to the production of antioxidant enzymes and non-enzimatics antioxidants. We also quantified DNA damage in chloroplast of WT and mutant lines and we did comparative proteomic analysis between and began the standardization of the thiamine quantification in plants. All these results together lead us up to a better understanding about THI1 activity at the cellular metabolism. Previous results suggested that besides thiamine synthesis, THI1 would be involved in repair/tolerance to DNA damage. Results obtained in this study strengthen the hypothesis of this another function of the thi1 gene. Considering that the mutant line does not produce a higher quantity of ROS, as indicated by hydrogen peroxide quantification, but shows more antioxidants and more DNA damage, probably the genetic material of this line is more susceptible to damage, showing that the defective THI1 protein could not protect it efficiently.

MYB30 est un facteur de transcription d’Arabidopsis thaliana connu pour son rôle de régulateur positif des défenses via la production d’acides gras à très longue chaîne (VLCFA). La cuticule, une couche hydrophobe protectrice qui recouvre les parties aériennes de la plante, est composée majoritairement de molécules lipidiques dérivées des VLCFA. Dans cette thèse, nous avons montré que le gène MYB30 est exprimé dans les cellules épidermiques de l’embryon, à une étape du développement qui coïncide avec la mise en place de la cuticule embryonnaire. Nos travaux révèlent que lors de l’embryogenèse, MYB30 contrôle l’expression de gènes de biosynthèse de la cuticule et la production de composés cuticulaires. En accord avec cela, nous avons montré que MYB30 est requis pour la formation d’une cuticule embryonnaire fonctionnelle. De plus, l’expression de MYB30 est dépendante de GASSHO1 et GASSHO2 (GSO1/2), deux récepteurs de type Receptor Like Kinase (RLK) impliqués dans une voie de signalisation spécifique à la graine, nécessaire pour la formation de la cuticule chez l’embryon. Nos données indiquent également que MYB30 régule négativement l’expression de GSO2, et que MYB30 pourrait agir en aval des deux RLK pour la formation de la cuticule embryonnaire. D’autre part, nous avons montré que ces deux RLK jouent également un rôle positif dans l’activation des réponses immunitaires de la plante adulte. Enfin, notre étude indique que MYB30 est aussi impliqué dans l’élongation cellulaire chez les plantules étiolées probablement via la régulation de la production de composés pariétaux. En conclusion, ces travaux identifient de nouveaux rôles pour MYB30, et le placent à l’interface entre les réponses de défense et le développement de la plante. / MYB30 is an Arabidopsis thaliana transcription factor known for its role of positive regulator of defense responses through the production of very long chain fatty acids (VLCFAs). The cuticle, a hydrophobic and protective layer that covers the aerial parts of the plant, is mainly composed of VLCFA-derived lipid molecules. In this thesis, we have shown that the MYB30 gene is expressed in the epidermal cells of the embryo, at a developmental stage that corresponds to the establishment of the embryonic cuticle. Our work reveals that during embryogenesis, MYB30 controls the expression of cuticle biosynthetic genes and the production of cuticular compounds. In agreement, we have shown that MYB30 is required for the formation of a functional embryonic cuticle. In addition, MYB30 expression is dependent on GASSHO1 and GASSHO2 (GSO1/2), two Receptor Like Kinases (RLKs) involved a seed-specific signaling pathway, necessary for the cuticle formation in the embryo. Our data also indicates that MYB30 negatively regulates GSO2 expression and that MYB30 may act downstream of the two RLKs in embryonic cuticle formation. Moreover, we have shown that these two RLKs also play a positive role in the activation of immune responses in adult plants. Finally, our study indicates that MYB30 is additionally involved in cell elongation in etiolated seedlings, likely by regulating the production of cell wall components. In conclusion, this work identifies new roles of MYB30, placing it at a crossroads between defense responses and plant development.