À l’ère du numérique, valoriser les données en leur donnant un sens est un enjeu capital pour supporter la prise de décision stratégique et cela dans divers domaines, notamment dans le domaine du marketing numérique ou de la santé, ou encore, dans notre contexte, pour une meilleure compréhension de la biologie des structures des acides nucléiques. L’un des défis majeurs de la biologie structurale concerne l’étude des structures des acides ribonucléiques (ARN), les effets de ces structures et de leurs altérations sur leurs fonctions. Contribuer à cet enjeu important est l’objectif de cette thèse. Celle-ci s’inscrit principalement dans le développement de méthodes et d’outils pour l’exploration efficace des structures secondaires d’ARN. En effet, explorer les structures secondaires d’ARN contribue à lever le voile sur leur fonction et permet de mieux cerner leur implication spécifique au sein des processus cellulaires. Dans ce contexte nous avons développé le modèle des super-n-motifs qui contribue à une meilleure représentation de la complexité structurale des ARN et offre un moyen efficace d’évaluer la similarité des structures d’ARN en tenant compte de cette complexité. Le modèle des super-n-motifs facilite l’étude des ARN dont le rôle est inconnu. Il permet de poser des hypothèses sur la ou les fonctions des ARN lorsque ceux-ci partagent une similarité structurale sans équivoque. Nous avons aussi développé la plateforme structurexplor pour faciliter l’exploration des structures secondaires, c’est-à-dire de permettre, en quelques clics, de caractériser les populations de structures d’ARN en, par exemple, faisant ressortir les groupes d’ARN partageant des structures similaires. La mise en œuvre du modèle des super-n-motifs et de la plateforme structurexplor a contribué à une meilleure compréhension de la phylogénie structurale des viroïdes qui sont des agents pathogènes à ARN attaquant les plantes, phylogénie jusqu’alors basée que sur leurs séquences.

Nombre de programmes ont été développés pour identifier des sites de fixation de facteurs de transcription. La plupart ne sont pas capables d’inférer des motifs composés de deux mots en autorisant une variation de leur espacement, caractéristiques des sites de fixation des sous-unités s de l’ARN polymérase (SFFS). Cette thèse vise à l’élaboration d’un algorithme prenant en compte toutes les connaissances biologiques structurelles de ces sites en vue de leur prédiction fiable. Nous présentons une nouvelle approche, SIGffRid (pour SIGma Factor Finder using R’MES to select Input Data), pour l’identification des SFFS qui compare deux génomes bactériens phylogénétiquement apparentés. La méthode analyse des paires de régions promotrices de gènes orthologues. Elle utilise la sur-représentation statistiquement dans les génomes complets comme critère de sélection des boîtes -35 et -10 potentielles. Des motifs composites conservés sont alors groupés en utilisant des paires de courtes graines, en autorisant la variabilité de l’espacement qui les sépare. Les motifs sont ensuite étendus suivant des considérations statistiques. Les plus significatifs sont retenus. Cet algorithme a été applique´ avec succès à la paire de génomes bactériens apparentés de Streptomyces coelicolor A3(2) et Streptomyces avermitilis. Nous démontrons que notre approche, combinant des critères statistiques et biologiques, parvient à prédire des SFFS, et abordons les améliorations envisagées. / Many programs have been developed to identify transcription factor binding sites. Most of them are not able to infer two-word motifs with variable spacer lengths, characteristics of RNA polymerase Sigma (s) Factor Binding Sites (SFBSs). The aim of this thesis is to design an algorithm taking into account the biological structural observations about these sites, in order to their relevant prediction. We describe a new approach, SIGffRid (SIGma Factor binding sites Finder using R’MES to select Input Data), to identify SFBSs by comparing two related bacterial genomes. The method performs a simultaneous analysis of pairs of promoter regions of orthologous genes. SIGffRid uses a prior identification of over-represented patterns in whole genomes as selection criteria for potential -35 and -10 boxes. These patterns are then grouped using pairs of short seeds, allowing a variable-length spacer between them. This is followed by motif extension guided by statistical considerations. Finally, statitically feasible and relevant motifs are selected. We applied our method to the pair of related bacterial genomes of Streptomyces coelicolor A3(2) and Streptomyces avermitilis. We demonstrate that our approach combining statistical and biological criteria was successful to predict SFBSs, and envisage ameliorations.

Los virus del grupo C (GRCV) son un complejo que pertenecen al género Orthobunyavirus, de la familia Peribunyaviridae (anteriormente denominado Bunyaviridae). Estos virus están asociados con enfermedades febriles en humanos que generalmente habitan en áreas tropicales y subtropicales de América del Sur y América Central. A pesar de que muchos GRCV han sido aislados de mosquitos, animales y seres humanos, los análisis genéticos de estos virus aún son limitados. En el Perú, el centro de investigaciones de enfermedades tropicales de la marina de los Estados Unidos (NAMRU-6) viene conduciendo desde los años noventa una vigilancia pasiva de las enfermedades febriles. Durante este tiempo, se lograron recuperar e identificar mediante la prueba de inmunofluorescencia 65 aislamientos de GRCV de pacientes febriles habitantes del norte y sur de la Amazonía peruana. Para caracterizar estos aislamientos, se secuenciaron una región de 500 pb del segmento S y una región de 750 pb de los segmentos M y L. El análisis de la secuencia de los aislamientos clínicos mostró identidades de nucleótidos que oscilaban entre el 68% y el 100% y las identidades de secuencia de aminoácidos deducidas que oscilaban entre 72% y 100%. Las secuencias se compararon con las siguientes cepas referenciales: virus Caraparu (CARV), virus Murutucu (MURV), virus Oriboca (ORIV), virus Marituba (MTBV), virus Apeu (APEUV) y virus Madrid (MADV). La comparación de secuencias de los segmentos L y S de las cepas clínicas con cepas referenciales mostró dos clados; clado I formado por aislamientos con alta correlación con CARV-MADV y clado II conformado por aislamientos con alta correlación con MURV, ORIV, APEUV y MTBV. Las secuencias del segmento M contiene algunos aislamientos de GRCV diferentes filogeneticamente a los de segmento L y S y su distribución filogenética está altamente relacionada con la microneutralización serológica. Estos resultados demuestran las relaciones genéticas y serológicas de los GRCV que circula en la Amazonía peruana y la divergencia genética de los GRCV en el norte de la Amazonía. / Tesis

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

On sait maintenant depuis quelques décennies que seule une petite fraction du génome est constituée de séquences codantes pour des protéines et que la majorité de l'ADN non codant, jadis considéré comme « poubelle », assure d'importantes fonctions biologiques. Avec ce nouveau paradigme, notre perception de l'expression et la régulation génique est passée d'une vision axée sur les protéines à une vision plus centrée sur les ARN, tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. L'avènement des techniques de séquençage à haut débit comme le RNA-Seq (séquençage ARN) a fortement contribué à la démystification de cette partie « non codante » de l'ARN. Outre le triumvirat de gènes d'ARNt, d'ARNr et d'ARNm, les génomes abritent de nombreux loci qui codent pour de petits ARN régulateurs non canoniques repartis dans de nombreuses classes. Les microARN (miARN) et les fragments dérivés des ARNt (tRFs) sont les deux classes de petits ARN non codants (ARNnc) les plus abondants et partageant des similarités dans leurs mécanismes. Bien que souvent éclipsés par les protéines, ils sont au cœur de la régulation post-transcriptionnelle et sont des acteurs émergents de la relation hôte-pathogène. Ces travaux de thèse s'inscrivent dans ce thème et traitent des relations hôtes-pathogènes sous l'angle des petits ARNnc à travers deux projets (#1 et #2) complémentaires qui ambitionnent d'apporter une lecture et des perspectives nouvelles. Dans le projet #1, nous avons travaillé avec le virus à ARN Ebola (EBOV), un agent pathogène connu pour provoquer une fièvre hémorragique mortelle, qui a été responsable de plusieurs épidémies en Afrique et demeure encore aujourd'hui une menace pour la santé publique mondiale. En combinant RNA-Seq, PCR quantitative et analyses computationnelles, nous avons obtenu le premier transcriptome détaillé des miRNA (miRNome) d'une lignée de cellules hépatiques humaines infectées par l'une des trois souches variantes de EBOV dont Mayinga, Makona et Reston. Lors de l'infection par EBOV, il y'a une expression différentielle de seulement 1/5 du miRNome de l'hôte au cours du temps avec une modulation spécifique des miR-122-5p, miR-148a-3p et miR-21-5p. Les données obtenues mettent en relief, au-delà des manifestations cliniques jusque-là connues, de nouvelles différences substantielles entre les souches vis-à-vis de leur effet sur le miRNome. Dans une seconde phase, avec la même approche, nous avons découvert, caractérisé et validé deux miARN viraux codés par les génomes EBOV (Mayinga et Makona). Ces deux miARN viraux peuvent potentiellement cibler des gènes impliqués dans le phénotype hémorragique, la régulation de la réplication virale et la modulation de la défense immunitaire de l'hôte. Le projet #2 s'inscrit dans un contexte où nous avions découvert fortuitement l'existence d'espèces d'ARN inférieures à 16 nt (appelés ici vsRNA pour very small RNA) qui s'avèrent fonctionnels chez les eucaryotes alors qu'ils étaient souvent retirés des jeux de données de séquençage, car considérés comme étant des « produits de dégradation ». Nous avons étendu notre analyse RNA-Seq aux bactéries pour caractériser les vsRNAs de Escherichia coli K-12 MG1655 et cinq autres souches bactériennes. L'étude est complétée par l'analyse des vésicules dérivées de la membrane externe (Outer Membrane Vesicles ; OMVs) produites par E. coli K-12 MG1655 en raison de leurs rôles déterminants pour améliorer des chances de survie, la régulation des interactions microbiennes et la promotion de la pathogenèse. Les résultats montrent l'existence de vsRNAs variés et très abondants avec les tRFs comme un biotype majeur, notamment ceux dérivés de l'ARNt isoleucine (Ile-tRF). En guise de preuve de concept de la fonctionnalité de ces vsRNAs de type tRFs, nous avons étudié en détail le très abondant et thermodynamiquement stable Ile-tRF. Nos analyses montrent qu'il est modulé sélectivement par le stress environnemental et peut être transféré via les OMVs (où il est particulièrement enrichi) aux cellules humaines HCT116 où il favorise l'expression des ARNm codant pour des membres de la famille des MAP-kinase. Notre étude est la toute première chez E. coli à rapporter l'existence de tRF abondants, trouvés dans des vésicules (OMVs) et assumant des fonctions potentielles chez l'hôte. L'Ile-tRF est également le premier tRF fonctionnel de 13 nt rapporté chez les bactéries. / For several decades now, it has been known that only a small fraction of the genome is made up of protein-coding sequences and that the majority of non-coding DNA, historically considered as "junk", carries out important biological functions. With this new paradigm, our perception of gene expression and regulation has shifted from a protein-centered view to a more RNA-centered view in both prokaryotes and eukaryotes. The advent of high-throughput sequencing techniques such as RNA sequencing (RNA-Seq), has strongly contributed to the demystification of this "non-coding" part of RNA. Besides the triumvirate of tRNA, rRNA, and mRNA genes, genomes harbor numerous loci that encode small non-canonical regulatory RNAs distributed in many classes. MicroRNAs (miRNAs) and tRNA-derived fragments (tRFs) are the two most abundant classes of small non-coding RNAs (ncRNAs) and share similarities in their mechanisms. Although often overshadowed by proteins, they are at the heart of post-transcriptional regulation and are emerging players in the host-pathogen relationship. This thesis addresses the host-pathogen relationship from the perspective of small ncRNAs through two complementary projects (#1 and #2) that aim to provide new insights and perspectives. In project #1, we worked with the Ebola RNA virus (EBOV), a pathogen known to cause a deadly hemorrhagic fever, which has been responsible for several epidemics in Africa and remains a global public health concern to this day. By combining RNA-Seq, quantitative PCR and computational analyses, we obtained the first detailed miRNA transcriptome (miRNome) of a human liver cell line infected with one of the three variant strains of EBOV including Mayinga, Makona and Reston. During EBOV infection, there is a differential expression of only 1/5 of the host miRNome over time with specific modulation of miR-122-5p, miR-148a-3p and miR-21-5p. The data obtained highlight, beyond the previously known clinical manifestations, substantial new differences between the strains with respect to their effect on the miRNome. In a second phase, using the same approach, we discovered, characterized and validated two viral miRNAs encoded by the EBOV genomes (Mayinga and Makona). These two viral miRNAs can potentially target genes involved in the hemorrhagic phenotype, the regulation of viral replication and the modulation of host immune defense. Project #2 was developed in a context where we had fortuitously discovered the existence of RNA species smaller than 16 nt (called here vsRNA for very small RNA) that were functional in eukaryotes but were often removed from sequencing datasets because they were considered as "degradation products". We have extended our RNA-Seq analysis to bacteria in order to characterize vsRNAs from Escherichia coli K-12 MG1655 and five other bacterial strains. The study is completed by the analysis of Outer Membrane Vesicles (OMVs) produced by E. coli K-12 MG1655 because of their critical roles in enhancing survival, regulating microbial interactions and promoting pathogenesis. The results show the existence of diverse and highly abundant vsRNAs with tRFs as a major biotype, especially those derived from isoleucine tRNA (Ile-tRF). As a proof of concept of the functionality of these tRF-like vsRNAs, we have studied in detail the highly abundant and thermodynamically stable Ile-tRF. Our analyses show that it is selectively modulated by environmental stress and can be transferred via OMVs (where it is particularly enriched) to human HCT116 cells where it promotes the expression of mRNAs encoding members of the MAP-kinase family. Our study is the first ever in E. coli to report the existence of abundant tRFs found in vesicles (OMVs) with potential functions in the host. Ile-tRF is also the first functional 13 nt tRF reported in bacteria.

Titre de l'écran-titre (visionné le 5 septembre 2023) / L'instabilité génomique est considérée comme l'une des « caractéristiques du cancer ». Au cours des dernières décennies, divers processus de réparation de l'information génétique ont été découverts, nous permettant de mieux comprendre comment la dérégulation de ces processus peuvent conduire au développement du cancer. Notre groupe de recherche s'intéresse particulièrement au processus de réparation des cassures double-brin (DSBs) de l'ADN, la forme la plus nocive de dommages à l'ADN. La jonction d'extrémités non homologues canonique (c-NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) sont les principales voies de réparation des DSBs. Afin d'enclencher la réparation des DSBs, les cellules régulent soigneusement le choix entre ces deux processus de réparation. Le processus de résection de l'ADN facilite le choix entre ces voies de réparation. La résection de l'ADN est caractérisée par la dégradation de l'ADN pour créer un long substrat d'ADNsb favorisant la réparation par HR. En revanche, l'inhibition de la résection de l'ADN favorise la réparation des DSB par la voie c-NHEJ. Les mutations de perte de fonction des protéines impliquées dans la facilitation de la résection de l'ADN conduisent souvent à des troubles génétiques et au développement de cancers. Le développement du cancer a souvent été associé à des mutations de BRCA1, une protéine impliquée dans la résection de l'ADN et le processus de réparation des RH. La létalité synthétique est devenue un concept important dans la réparation de l'ADN et la recherche sur le cancer. Il décrit le phénomène par lequel l'inactivation simultanée de deux événements conduit à la létalité cellulaire, même si chaque événement individuellement est toléré. Le traitement contre le cancer basé sur la létalité synthétique le plus efficace qui ait été développé jusqu'à présent utilise les inhibiteurs de PARP (PARPi). PARP-1 dans une protéine impliquée dans divers processus cellulaires, dont la régulation de la réparation de l'ADN. Il a été constaté que l'inhibition de PARP-1 est synthétiquement létale avec un déficit en HR. Les tumeurs déficientes en HR, sont sensibles aux PARPi alors que leurs homologues cellulaires normaux HR-compétents tolèrent le traitement. Cependant, bien qu'il s'agisse d'une option de traitement prometteuse, de nombreux patients développent encore une résistance aux PARPi. Une façon par laquelle les tumeurs déficientes en BRCA1 développent une résistance à PARPi est la réactivation de la résection de l'ADN. En l'absence de BRCA1 fonctionnel, les inhibiteurs de la résection de l'ADN empêchent l'utilisation de HR pour la réparation des DSBs. Des mutations de perte de fonction dans ces inhibiteurs de la résection de l'ADN entraînent la réactivation de la résection de l'ADN et de la HR. Par conséquent, il est important de comprendre la relation entre les protéines qui facilitent la résection de l'ADN et celles qui l'inhibent. Avec cette compréhension, de meilleures approches pour atténuer le développement de la résistance peuvent être développées. Dans cette thèse, nous approfondissons la relation entre l'inhibition de la résection de l'ADN et le développement de la résistance aux PARPi. Nous discutons du processus de résection de l'ADN et de la façon dont divers inhibiteurs de la résection de l'ADN fonctionnent pour inhiber la réparation par RH. Nous décrivons une méthode pour développer de nouveaux inhibiteurs chimiques qui peuvent être utilisés pour cibler MRE11, une composante importante de la machinerie de résection de l'ADN. De plus, nous avons identifié un nouvel inhibiteur de la résection de l'ADN, DYNLL1, et caractérisons son rôle dans l'inhibition de la résection de l'ADN. Enfin, nous contribuons davantage à la compréhension du mécanisme d'action d'un inhibiteur connu de la résection de l'ADN, RIF1. En outre, nous identifions une nouvelle interaction synthétique létale entre RIF1 et MRE11 qui pourrait être avantageuse dans le développement d'un nouveau traitement contre le cancer avec un défaut dans l'une ou l'autre des protéines. En résumé, nous décrivons de nouveaux mécanismes d'action pour la régulation négative de la résection de l'ADN impliquant DYNLL1 et RIF1. De plus, ces résultats placent MRE11 au cœur de la régulation de la résection de l'ADN, soulignant l'importance du développement de nouveaux inhibiteurs chimiques qui le ciblent. / Genomic instability is considered to be one of the "Hallmarks of Cancer". In recent decades, research on the topic has uncovered various DNA repair processes that cells use to maintain genome stability. This has also given us a better understanding of how errors from and dysregulation of these processes can lead to cancer development. Our research group is particularly interested in the repair process for DNA double-strand breaks (DSBs), the most harmful form of DNA damage. Canonical Non-Homologous End-Joining (c-NHEJ) and Homologous (HR) Recombination are the major DSB repair pathways. In order to facilitate proper DSB repair, cells carefully regulate the choice between these two repair processes. One manner in which cells facilitate the choice between these two pathways is through the process of DNA resection. DNA resection is the degradation of DNA following DSB induction to create a long ssDNA substrate that favours HR repair. In contrast, inhibition of DNA resection favours DSB repair through the c-NHEJ pathway. Loss-of-function mutations of proteins involved in facilitating DNA resection often lead to genetic disorders and cancer development. Cancer development has often been associated with mutations in BRCA1, a protein involved in the DNA resection and HR repair process. Synthetic lethality has become an important concept in DNA repair and cancer research. It describes the phenomenon wherein the simultaneous occurrence of two events leads to unviability or lethality, in this case of the cell, even though each event individually is tolerated. In cancer research, this has been taken advantage of when developing novel treatments particularly in cancer types with a frequently occurring mutation. The most successful synthetic lethality-based cancer treatment that has been developed thus far has been PARP inhibitors (PARPi). PARP-1 in a protein involved in various cellular processes, including the regulation of DNA repair. It was found that PARP-1 inhibition is synthetically lethal with a deficiency in HR. It was found that HR-deficient tumours, especially those with a loss-of-function mutations in BRCA1, are sensitive to PARPi treatment whereas their HR-proficient normal cell counterparts tolerated the treatment. In the clinic, this meant that patients with cancers that are BRCA1-deficient can be effectively treated with PARPi. However, although a promising treatment option, many of the patients still develop PARPi resistance requiring the need for other treatment options. It has been found that one manner in which BRCA1-deficient tumours develop PARPi-resistance is through the reactivation of DNA resection. In the absence of functional BRCA1, DNA resection inhibitors prevent the use of HR for the repair of DSBs. One of the ways these tumours develop PARPi-resistance is by developing loss-of-function mutations in these DNA resection inhibitors. These mutations lead to the reactivation of DNA resection and HR. Therefore, it is important to understand the relationship between proteins that facilitate DNA resection and those that inhibit it. With this understanding, better approaches for mitigating development of resistance can be developed. To further understand the relationship between DNA resection inhibition and PARPi-resistance development, we discuss what is known in the literature about the DNA resection process and how various DNA resection inhibitors work in order to inhibit HR repair. We describe a method for developing novel chemical inhibitors that can be used to target DNA repair proteins using MRE11--an important component of the DNA resection machinery--as an example. Furthermore, we identify a novel DNA resection inhibitor, DYNLL1, and characterize its role in DNA resection inhibition. Lastly, we contribute further to the understanding of the mechanism of action of a known DNA resection inhibitor, RIF1. Furthermore, we identify a novel synthetic lethal interaction between RIF1 and MRE11 that could be advantageous in the development of novel cancer treatment with defect in either protein. In summary, we describe novel mechanisms of action for the negative regulation of DNA resection involving DYNLL1 and RIF1. Furthermore, these results put MRE11 at the heart of DNA resection regulation highlighting the importance of development of novel chemical candidates that target it.

Plusieurs types de granules ARN sont observables dans toutes les cellules. Certains correspondent à des structures où la régulation post-transcriptionnelle est effectuée; parmi ceux-ci on retrouve les granules de stress (GS) et les "processing bodies" (PB). Les GS sont des structures ribonucléoprotéiques cytoplasmiques formées suite à un stress cellulaire et dans lesquels les ARNm sont remisés pour y être transitoirement réprimés et protégés en attendant de meilleures conditions physiologiques. Les PB sont aussi des granules cytoplasmiques ribonucléoprotéiques formés entre autre des composants de la machinerie de dégradation et de la surveillance de l'ARN. De nombreuses études citent l'apparition des GS suite à l'irradiation aux UV. Cependant, cette observation n'a pas été validée. Nous avons donc cherché à caractériser les granules induits par les UV en suivant le comportement de FMRP, une protéine de liaison à l'ARN présente dans les GS. Dans cette étude, nous avons montré que les UV induisent la formation de granules cytoplasmiques qui n'ont ni la même taille, ni la même cinétique d'apparition et de disparition, ni la même composition des GS. Nous avons aussi noté l'absence des protéines de la petite sous-unité ribosomale normalement présentes dans les GS. Nous avons montré également que les cellules irradiées peuvent reprendre certaines fonctions physiologiques. Nous proposons donc l'hypothèse qu'il existerait une nouvelle classe de granules ARN induits par les UV dans lesquels seront accumulés les ARN potentiellement endommagés, ceci serait un nouveau mécanisme de régulation post-tanscriptionnelle.

L'interférence à l'ARN ou RNAi est un mécanisme d'extinction de l'expression des gènes nécessitant des molécules d'ARN double-brin. Dans le cytoplasme, une machinerie enzymatique les prend en charge afin de produire de courts ARNs simple-brin de 21 nucleotides (siARN) qui vont s'associer avec une protéine Argonaute pour former le complexe effecteur appelé le complexe RISC. Ce complexe cible un ARNm par complémentarité de bases et induit sa dégradation de façon séquence spécifique. Malgré son utilisation fréquente dans les laboratoires de recherche et son fort potentiel comme agent thérapeutique, le mécanisme moléculaire par lequel le RNAi s'opère reste encore peu compris. En utilisant le nematode Caenorhabditis elegans comme modèle animal, mon projet de recherche avait pour but de mieux comprendre le fonctionnement du RNAi en déterminant : 1) la cinétique de dégradation d'un ARNm ciblé par la voie du RNAi et; 2) les caractéristiques moléculaires de l'ARN double-brin qui sont nécessaires à l'induction et au maintien du RNAi chez l'animal. Les résultats que j'ai obtenus indiquent que le clivage spécifique de l'ARNm dans la région complémentaire au siARN mène à la stabilisation d'une partie de l'ARNm ciblé suggérant que cette stabilisation serait importante pour obtenir une réponse RNAi efficace chez le nematode. De plus, mes études ont démontré que le nombre siARN, généré par la molécule d'ARN double-brin, affecte la dégradation de l'ARNm, le maintien et la transmission du RNAi chez l'animal. En résumé, mes études ont permis de mieux caractériser l'atténuation génique médiée par le RNAi chez l'animal et la mise en évidence des paramètres moléculaires importants dans la voie du RNAi. Ces observations permettront la création d'une nouvelle génération d'approches thérapeutiques utilisant le plein potentiel du RNAi comme régulateur d'expression génique.

L’immunoprécipitation de la chromatine suivie du séquençage haut débit (ChIP-seq) est une technique permettant de visualiser les interactions entre l’ADN et les protéines. Toutefois, en pratique, la résolution de cette technique laisse à désirer. En étudiant les gènes de l’ARN ribosomique (ADNr), nous avons observé que le facteur majeur limitant la résolution découle du recouvrement inégal des séquences de chaque locus. Cette inégalité est superposée à la distribution réelle de la séquence d’ADN immunoprécipitée entrainant un profil de liaison protéique aberrant. Un logiciel de déconvolution a été développé afin de corriger la couverture inégale des données ChIP-seq en les normalisant par rapport aux données de l’input (Whole Cell Extract). Lorsqu’appliqué sur les données de l’ADNr, cet outil s’est avéré très utile en fournissant un profil de liaison détaillé de la chromatine et des facteurs de transcription le long de ce gène. D’autre part, des études de localisation des sites d’interactions protéiques d’UBF, un facteur de transcription associé à l’ADNr, à la grandeur du génome couplé à des expériences de DNase-seq et de microarray ont permis de mettre en lumière les rôles potentiels d’UBF dans les régions non ribosomiques. En conclusion, nous avons développé un outil permettant la normalisation par déconvolution de données de séquençage haut-débit qui permet d’augmenter la résolution du profil de liaison protéique sur l’ADNr en plus d’identifier les rôles potentiels d’UBF à l’échelle du génome. / Chromatin immunoprecipitation followed by massively parallel sequencing (ChIP-seq) is a technique that allows to visualize interactions between DNA and proteins. However in practice, the resolution of this technique leaves much to be desired. During our studies of the ribosomal RNA genes (rDNA), we observed that one major factor limiting resolution results from the unequal recovery of sequence data across any given locus. This inequality is superimposed on the actual distribution of immunoprecipitated DNA sequences resulting in aberrant protein binding profiles. A software was developed to correct the unequal coverage of ChIP-seq data by normalizing to the input (Whole Cell Extract) with a deconvolution protocol. When applied on the rDNA, this approach has been especially useful in providing a detailed map of chromatin and transcription factor distribution across the gene. On the other hand, genome-wide localization of protein interaction sites for UBF, a transcription factor associated to rDNA, coupled with DNase-seq and microarray experiments shed light on the potential roles of UBF in non-ribosomal regions. In conclusion, we developed a tool allowing the normalization by deconvolution of high-throughput sequencing data that allows to increase the resolution of protein binding profiles on the rDNA. In addition we identified the potential roles of UBF at genome scale.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Selon l’université Johns Hopkins, plus de 600 millions de cas de coronavirus 2019 (COVID - 19) infectés par le SRAS-CoV-2 ont été signalés dans le monde depuis décembre 2019. La COVID-19 a causé une catastrophe énorme dans le monde, tuant plus de six millions de personnes. Il est donc essentiel de trouver des médicaments ou des vaccins efficaces. L'ARN polymérase ARN - dépendante (RdRp) joue un rôle clé dans la réplication du virus SARS-CoV-2. Nous avons constaté que la RdRp du SRAS-CoV-2 présentait 98,1% de similitude avec la RdRp du SRAS-CoV, alors que la similitude génomique de virus n'était que de 80%. Les alignements de séquences des coronavirus ont montré une homologie plus élevée entre les RdRps (60% - 98%) et une homologie plus faible entre les protéines Spike (24% - 77%). Les structures 3D de la RdRp et de la nucléotide transférase (NiRAN) ont été rapidement déterminées par modélisation à partir des structures correspondantes du SRAS. Dans le nouveau coronavirus, trois substitutions apparaissent dans le motif RdRp, ainsi qu'une liaison hydrogène supplémentaire, mais la structure des régions des doigts et du pouce est légèrement modifiée. La structure NiRAN est très conservatrice dans le COV. Les homologies de séquence et de structure entre RdRp et NiRAN sont donc supposées être des cibles médicamenteuses potentielles pour le traitement du COV émergent. La protéase principale (Mpro), également connue sous le nom de protéase 3-chymotrypsine-like (protéase 3CL), joue un rôle important dans le clivage des polyprotéines virales pour former des complexes de réplication fonctionnelle. Mpro est donc une cible pharmaceutique prometteuse pour le traitement de la COVID-19. Grâce à la modélisation moléculaire, à l'amarrage et à la détermination de l'activité protéasique, nous avons trouvé quatre nouveaux inhibiteurs ciblant le Mpro avec une affinité de liaison révélée par la moitié de la concentration maximale inhibitrice (IC50) et des constantes de dissociation (KD). Nos nouveaux inhibiteurs CB-21, CB-25, CP-1 et LC24-20 ont des CI50s de 14,88 µM (IC à 95%: 10,35 µM à 20,48 µM), 22,74 µM (IC à 95%: 13,01 µM à 38,16 µM), 18,54 µM (IC à 95%: 6,54 µM à 36,30 µM) et 32,87 µM (IC à 95%: 18,37 µM à 54,80 µM), respectivement. L'évaluation des interactions a montré que chaque inhibiteur avait des liaisons hydrogène ou des interactions hydrophobes avec des résidus importants, y compris les résidus catalytiques les plus importants: his41 et Cys145. La dose létale à 50% (DL50) des quatre inhibiteurs est beaucoup plus élevée que celle de l'inhibiteur bien connu de la Mpro, GC376, ce qui indique une faible toxicité. Ces quatre inhibiteurs peuvent servir de médicaments potentiels pour d'autres études in vitro et in vivo contre la COVID-19. Dans l'ensemble, pour RdRp et Mpro, nos résultats fournissent des informations utiles pour la recherche et le traitement de la COVID-19. / According to the data from Johns Hopkins University, more than 600 million Coronavirus Virus Disease 2019 (COVID-19) cases infected by SARS-CoV-2 has been reported worldwide since December 2019. COVID-19 brought huge disaster to the world with more than 6 million death cases. Therefore, finding efficient drugs or vaccines is of vital importance. RNA-dependent-RNA-polymerase (RdRp) plays a key role in SARS-CoV-2 viral replication. We found that SARS-COV-2 RdRp shares 98.1% of similarity with SARS-CoV RdRp while the genome similarity is only 80%. Sequence alignment of coronaviruses demonstrated higher identity among RdRps (60% – 98%) and lower identity among Spike proteins (24% – 77%). The RdRp and nucleotide-transferase (NiRAN) 3D-structures were quickly determined by modelling starting from the SARS counterpart structures. In COVID-19, three substitutions appeared in RdRp motifs with an additional hydrogen-bonding, but slight structural change shown in the finger and thumb domains. The NiRAN structure is well conserved in CoV. The sequence and structural homology among RdRp and NiRAN thus postulate them as potential drug targets to treat emerging CoVs. Main protease (Mpro), also called 3-chymotrypsin-like protease (3CL protease), plays an essential role in cleaving virus polyproteins for the functional replication complex. Therefore, Mpro is a promising drug target for COVID-19 therapy. Through molecular modelling, docking and a protease activity assay, we found four novel inhibitors targeting Mpro with the half maximal inhibitory concentration (IC50) and their binding affinities shown by the dissociation constants (KDs). Our new inhibitors CB-21, CB-25, CP-1 and LC24-20 have IC50s at 14.88 µM (95% Confidence Interval (95% CI): 10.35 µM to 20.48 µM), 22.74 µM (95% CI: 13.01 µM to 38.16 µM), 18.54µM (95% CI: 6.54 µM to 36.30 µM) and 32.87µM (95% CI: 18.37 µM to 54.80 µM)), respectively. The evaluation of interactions suggested that each inhibitor has a hydrogen bond or hydrophobic interactions with important residues, including the most essential catalytic residues: His41 and Cys145. All the r inhibitors have a much higher 50% lethal dose (LD50) compared with the wellknown Mpro inhibitor GC376, demonstrating its low toxicity. These four inhibitors can be potential drug candidates for further in vitro and in vivo studies against COVID-19.Overall, targeting RdRp and Mpro, our findings provide useful information for the research and treatment of COVID-19.