La transglutaminase microbienne (Microbial transglutaminase : MTG) est fortement exploitée dans l’industrie textile et alimentaire afin de modifier l’apparence et la texture de divers produits. Elle catalyse la formation de liaisons iso-peptidiques entre des protéines par l’entremise d’une réaction de transfert d’acyle entre le groupement γ-carboxamide d’une glutamine provenant d’un substrat donneur d’acyle, et le groupement ε-amino d’une lysine provenant d’un substrat accepteur d’acyle. La MTG est tolérante à un large éventail de conditions réactionnelles, ce qui rend propice le développement de cette enzyme en tant que biocatalyseur. Ayant pour but le développement de la MTG en tant qu’alternative plus soutenable à la synthèse d’amides, nous avons étudié la réactivité d’une gamme de substrats donneurs et accepteurs non-naturels. Des composés chimiquement diversifiés, de faible masse moléculaire, ont été testés en tant que substrats accepteurs alternatifs. Il fut démontré que la MTG accepte une large gamme de composés à cet effet. Nous avons démontré, pour la première fois, que des acides aminés non-ramifiés et courts, tels la glycine, peuvent servir de substrat accepteur. Les α-acides aminés estérifiés Thr, Ser, Cys et Trp, mais pas Ile, sont également réactifs. En étendant la recherche à des composés non-naturels, il fut observé qu’un cycle aromatique est bénéfique pour la réactivité, bien que les substituants réduisent l’activité. Fait notable, des amines de faible masse moléculaire, portant les groupements de forte densité électronique azidure ou alcyne, sont très réactives. La MTG catalyse donc efficacement la modification de peptides qui pourront ensuite être modifiés ou marqués par la chimie ‘click’. Ainsi, la MTG accepte une variété de substrats accepteurs naturels et non-naturels, élargissant la portée de modification des peptides contenant la glutamine. Afin de sonder le potentiel biocatalytique de la MTG par rapport aux substrats donneurs, des analogues plus petits du peptide modèle Z-Gln-Gly furent testés; aucun n’a réagi. Nous avons toutefois démontré, pour la première fois, la faible réactivité d’esters en tant que substrats donneurs de la MTG. L’éventuelle amélioration de cette réactivité permettrait de faire de la MTG un biocatalyseur plus général pour la synthèse d’amides. Mots clés: Lien amide, biocatalyse, biotransformation, transglutaminase, arrimage moléculaire, criblage de substrats, ingénierie de substrats. / Microbial transglutaminase (MTG) is used extensively in the food and textile industry to alter the appearance and texture of products. MTG catalyses the formation of isopeptide linkages between proteins by an acyl transfer reaction between the γ-carboxamide group of a glutamine ‘acyl-donor’ substrate, and the ε-amino group of a lysine ‘acyl-acceptor’ substrate. MTG is tolerant to a broad range of reaction conditions and is therefore suitable for further development as a biocatalyst. Toward developing MTG as a “green” alternative for amide synthesis, we have investigated a range of non-native donor and acceptor substrates to probe the scope of MTG reactivity. Small, chemically varied compounds were tested as alternative acyl-acceptor substrates. We observed a broad acceptor specificity. We show, for the first time, that very short-chain alkyl-based amino acids such as glycine can serve as acceptor substrates. The esterified α-amino acids Thr, Ser, Cys and Trp – but not Ile – also show reactivity. Extending the search to non-natural compounds, an aromatic ring was observed to be beneficial for reactivity, although ring substituents reduced reactivity. Overall, bonding of the amine to a less hindered carbon increases reactivity. Importantly, very small amines carrying either the electron-rich azide or the alkyne groups required for click chemistry were highly reactive as acceptor substrates, providing a ready route to minimally modified, ‘clickable’ peptides. These results demonstrate that MTG is tolerant to a variety of chemically varied natural and non-natural acceptor substrates, which broadens the scope for modification of glutamine-containing peptides. To further probe the biocatalytic potential of MTG in terms of the donor substrate, smaller analogues of the model substrate Z-Gln-Gly were tested. We did not find product formation with substrates smaller than the model substrate. We observed, for the first time, trace esterase activity with MTG. Future improvement of this activity would render MTG a more attractive, general biocatalyst for amide bond formation.

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Le triméthoprime (TMP) est un antibiotique communément utilisé depuis les années 60. Le TMP est un inhibiteur de la dihydrofolate réductase (DHFR) bactérienne chromosomale. Cette enzyme est responsable de la réduction du dihydrofolate (DHF) en tétrahydrofolate (THF) chez les bactéries, qui lui, est essentiel à la synthèse des purines et ainsi, à la prolifération cellulaire. La résistance bactérienne au TMP est documentée depuis plus de 30 ans. Une des causes de cette résistance provient du fait que certaines souches bactériennes expriment une DHFR plasmidique, la DHFR R67. La DHFR R67 n'est pas affectée par le TMP, et peut ainsi remplacer la DHFR chromosomale lorsque celle-ci est inhibée par le TMP. À ce jour, aucun inhibiteur spécifique de la DHFR R67 est connu. En découvrant des inhibiteurs contre la DHFR R67, il serait possible de lever la résistance au TMP que la DHFR R67 confère aux bactéries. Afin de découvrir des inhibiteurs de DHFR R67, les approches de design à base de fragments et de criblage virtuel ont été choisies. L'approche de design à base de fragments a permis d'identifier sept composés simples et de faible poids moléculaire (fragments) inhibant faiblement la DHFR R67. À partir de ces fragments, des composés plus complexes et symétriques, inhibant la DHFR R67 dans l'ordre du micromolaire, ont été élaborés. Des études cinétiques ont montré que ces inhibiteurs sont compétitifs et qu'au moins deux molécules se lient simultanément dans le site actif de la DHFR R67. L'étude d'analogues des inhibiteurs micromolaires de la DHFR R67 a permis de déterminer que la présence de groupements carboxylate, benzimidazole et que la longueur des molécules influencent la puissance des inhibiteurs. Une étude par arrimage moléculaire, appuyée par les résultats in vitro, a permis d'élaborer un modèle qui suggère que les résidus Lys32, Gln67 et Ile68 seraient impliqués dans la liaison avec les inhibiteurs. Le criblage virtuel de la librairie de 80 000 composés de Maybridge avec le logiciel Moldock, et les essais d'inhibition in vitro des meilleurs candidats, a permis d'identifier quatre inhibiteurs micromolaires appartenant à des familles distinctes des composés précédemment identifiés. Un second criblage virtuel, d'une banque de 6 millions de composés, a permis d'identifier trois inhibiteurs micromolaires toujours distincts. Ces résultats offrent la base à partir de laquelle il sera possible de développer iv des composés plus efficaces et possédant des propriétés phamacologiquement acceptables dans le but de développer un antibiotique pouvant lever la résistance au TMP conféré par la DHFR R67. / Trimethoprim (TMP) is a common antibiotic which is used since the 60's. TMP is an inhibitor of the bacterial chromosomal dihydrofolate reductase (DHFR). This enzyme catalyses the reduction of the dihydrofolate (DHF) to tetrahydrofolate (THF) which is essential to the biosynthesis of purines thus to cellular proliferation. Bacterial TMP resistance is documented since about 30 years. One of the cause of this resistance comes from the fact that certain bacteria express a plasmidic DHFR, the R67 DHFR, which confers TMP resistance. The R67 DHFR is not inhibited by TMP and can replace the chromosomal DHFR when the latter is inhibited by TMP. The discovery of R67 DHFR inhibitors would allow to break the trimethoprim resistance granted by R67 DHFR. In order to discover R67 DHFR inhibitors, fragment based design and virtual screening approaches were selected. By fragment based design, seven simple compounds with a low molecular mass which inhibited weakly R67 DHFR (fragments) were identified. From these fragments, more complex and symmetrical compounds inhibiting R67 DHFR in the micromolar range were identified. Kinetic studies showed these inhibitors were competitive and at least two molecules bind simultaneously to the active site of the R67 DHFR. Test of the micromolar inhibitors analog showed that the presence of carboxylate, benzimidazole and the length of the molecule all have an effect on the potency of the inhibitors. Molecular docking of the inhibitors, supported by in vitro data, were used to develop a model which suggest that residue like Lys32, Gln67 and Ile68 would be involved in the binding of the inhibitors to the R67 DHFR. Virtual screening of the 80 000 compound Maybridge library with Moldock software, followed by in vitro test of the best candidate, identified four micromolar inhibitors which are chemically distinct from the inhibitor beforehand identified. A second virtual screening of a 6 million compounds bank identified three micromolar inhibitors which are also distinct from the inhibitor beforehand identified. vi These results offer a basis which will allow further development of more potent inhibitors with more acceptable pharmacologic properties in order to develop an antibiotic which would break the TMP resistance granted by the R67 DHFR.

L'ingénierie enzymatique est un outil très avantageux dans l'industrie biotechnologique. Elle permet d'adapter les enzymes à une activité ou à une condition de réaction spécifique. En outre, elle peut permettre de déchiffrer les éléments clés qui ont facilité leur modification. Bien que l'ingénierie enzymatique soit largement pratiquée, elle comporte encore plusieurs goulets d'étranglement. Certains de ces goulets d'étranglement sont techniques, comme le développement de méthodologies pour la création de banques de mutations ciblées ou la réalisation de criblages à haut débit, et d'autres sont conceptuels, comme le déchiffrage des caractéristiques clés pertinentes d'une protéine cible pour la réussite d'un projet d'ingénierie. Parmi ces défis, l'épistasie intra-génique, ou la non-additivité des effets phénotypiques des mutations, est une caractéristique qui entrave grandement la prévisibilité. L'amélioration de l'ingénierie enzymatique nécessite une approche multidisciplinaire qui inclut une meilleure compréhension des relations structure-fonction-évolution. Cette thèse vise à contribuer à l'avancement de l'ingénierie enzymatique en étudiant deux systèmes modèles. Premièrement, des variantes dynamiques de la ß-lactamase TEM-1 ont été choisies pour étudier le lien entre la dynamique des protéines et l'évolution. La ß-lactamase TEM-1 a été largement caractérisée dans la littérature, ce qui s'est traduit par des connaissances approfondies sur son mécanisme de réaction, ses caractéristiques structurelles et son évolution. Les variantes de la ß-lactamase TEM-1 utilisées comme système modèle dans cette thèse ont été largement caractérisées, montrant une dynamique accrue à l'échelle temporelle pertinente pour la catalyse (µs à ms) mais maintenant la reconnaissance du substrat. Dans cette thèse, l'évolution in vitro de ces variantes dynamiques a été réalisée par des cycles itératifs de mutagenèse et de sélection aléatoires pour permettre une exploration impartiale du paysage de ‘fitness’. Nous démontrons que la présence de ces mouvements particuliers au début de l'évolution a permis d'accéder à des voies de mutations connues. De plus, des interactions épistatiques connues ont été introduites dans les variantes dynamiques. Leur caractérisation in silico et cinétique a révélé que les mouvements supplémentaires sur l'échelle de temps de la catalyse ont permis d'accéder à des conformations conduisant à une fonction améliorée, comme dans le TEM-1 natif. Dans l'ensemble, nous démontrons que l'évolution de la b-lactamase TEM-1 vers une nouvelle fonction est compatible avec divers mouvements à l'échelle de temps µs à ms. Il reste à savoir si cela peut se traduire par d'autres enzymes ayant un potentiel biotechnologique. Deuxièmement, la lipase Cal-A, pertinente sur le plan industriel, a été choisie pour identifier les caractéristiques qui pourraient faciliter son ingénierie. La lipase Cal-A présente des caractéristiques telles que la polyvalence du substrat et une grande stabilité thermique et réactivité qui la rendent attrayante pour la modification des triglycérides ou la synthèse de molécules pertinentes dans les industries alimentaire et pharmaceutique. Contrairement à TEM-1, la plupart des études d'évolution in vitro de la lipase Cal-A ont été réalisées dans un but industriel, avec une exploration limitée de l'espace de mutation. Par conséquent, les caractéristiques qui définissent la fonction de la lipase Cal-A restent insaisissables. Dans cette thèse, nous faisons état de la mutagenèse ciblée de la lipase Cal-A, confirmant l'existence d'une région clé pour la reconnaissance du substrat. Cela a été fait en combinant une nouvelle méthodologie de création de bibliothèque basée sur l'assemblage Golden-gate avec une visualisation structurelle basée sur des scripts pour identifier et cartographier les mutations sélectionnées dans la structure 3D. La caractérisation et la déconvolution de deux des plus aptes ont révélé l'existence d'une épistasie dans l'évolution de la lipase Cal-A vers une nouvelle fonction. Dans l'ensemble, nous démontrons que l’identification d'une variété de propriétés suite à la mutagenèse ciblée peut grandement améliorer la connaissance d'une enzyme. Cette information peut être appliquée pour améliorer l'efficacité de l'ingénierie dirigée. / Enzyme engineering is a tool with great utility in the biotechnological industry. It allows to tailor enzymes to a specific activity or reaction condition. In addition, it can allow to decipher key elements that facilitated their modification. While enzyme engineering is extensively practised, it still entails several bottlenecks. Some of these bottlenecks are technical such as the development of methodologies for creating targeted mutational libraries or performing high-throughput screening and some are conceptual such as deciphering the key relevant features in a target protein for a successful engineering project. Among these challenges, intragenic epistasis, or the non-additivity of the phenotypic effects of mutations, is a feature that greatly hinders predictability. Improving enzyme engineering needs a multidisciplinary approach that includes gaining a better understanding of structure-function-evolution relations. This thesis seeks to contribute in the advancement of enzyme engineering by investigating two model systems. First, dynamic variants of TEM-1 ß-lactamase were chosen to investigate the link between protein dynamics and evolution. TEM-1 ß-lactamase has been extensively characterized in the literature, which has translated into extensive knowledge on its reaction mechanism, structural features and evolution. The variants of TEM-1 ß-lactamase used as model system in this thesis had been extensively characterized, showing increased dynamics at the timescale relevant to catalysis (µs to ms) but maintaining substrate recognition. In this thesis, in vitro evolution of these dynamic variants was done by iterative rounds of random mutagenesis and selection to allow an unbiased exploration of the fitness landscape. We demonstrate that the presence of these particular motions at the outset of evolution allowed access to known mutational pathways. In addition, known epistatic interactions were introduced in the dynamic variants. Their in silico and kinetic characterization revealed that the additional motions on the timescale of catalysis allowed access to conformations leading to enhanced function, as in native TEM-1. Overall, we demonstrate that the evolution of TEM-1 b-lactamase toward new function is compatible with diverse motions at the µs to ms timescale. Whether this can be translated to other enzymes with biotechnological potential remains to be explored. Secondly, the industrially relevant Cal-A lipase was chosen to identify features that could facilitate its engineering. Cal-A lipase presents characteristics such as substrate versatility and high thermal stability and reactivity that make it attractive for modification of triglycerides or synthesis of relevant molecules in the food and pharmaceutical industries. Contrary to TEM-1, most in vitro evolution studies of Cal-A lipase have been done towards an industrially-specified goal, with limited exploration of mutational space. As a result, features that define function in Cal-A lipase remain elusive. In this thesis, we report on focused mutagenesis of Cal-A lipase, confirming the existence of a key region for substrate recognition. This was done by combining a novel library creation methodology based on Golden-gate assembly with script-based structural visualization to identify and map the selected mutations into the 3D structure. The characterization and deconvolution of two of the fittest revealed the existence of epistasis in the evolution of Cal-A lipase towards new function. Overall, we demonstrate that mapping a variety of properties following mutagenesis targeted to specific regions can greatly improve knowledge of an enzyme that can be applied to improve the efficiency of directed engineering.