La résistance pléïotropique aux médicaments est l'un des obstacles majeurs limitant l'utilisation de la chimiothérapie comme possibilité thérapeutique anticancéreuse. Bien que non totalement élucidé, ce phénomène de résistance observé a été associé à la surexpression d'une protéine de 170kDa, appartenant à la classe des protéines de transport ABC, ATP dépendante. Il a été démontré que les cellules surexprimant la MDR développent également un phénomène de résistance à l'induction de l'apoptose rendant ainsi les essais de sensibilisation des cellules résistantes aux médicaments et les recherches menées pour cette fin très avantageux et louables pour la thérapie anti-cancer. Dans la présente étude nous avons investigué la possibilité de l'induction de l'apoptose chez des cellules de l'ovaire de hamster chinois surexprimants la protéine MDR (CHO MDR CHRC5) et des cellules parentales ne développant pas la résistance pléïotropique aux médicaments (CHO AuxB1) par le choc thermique. Pour mieux comprendre ce phénomène de résistance, nous nous sommes intéressé en particulier, à la voie du récepteur de mort Fas et à la voie intrinsèque médiée par la mitochondrie. Nos résultats montrent que le choc thermique (40-43°C) active les caspases initiatrices 9 et 8 ainsi que les caspases effectrices 3, et 7. Contrairement aux cellules AuxB1, les cellules CHRC5 exhibent une résistance à l'induction de la voie du récepteur de mort Fas par le choc thermique. La voie intrinsèque, quant à elle, est induite pareillement chez les deux lignées cellulaires. De plus, la translocation de Bax et du Bid tronqué (tBid) à la mitochondrie était responsable de la perméabilisation de la membrane mitochondriale et par conséquent la libération du cytochrome c et l'activation des caspases 9 et 3 chez les deux lignées cellulaires. Le clivage des substrats de la caspase 3 (ICAD et PARP) était similaire chez les deux modèles cellulaires, suggérant que les cellules MDR CHRC5 sont non résistantes au choc thermique. Toutefois, cette étude est la première à investiguer les mécanismes moléculaires de l'apoptose induite par le choc thermique chez des cellules surexprimants la protéine MDR et à conjecturer le rôle de l'hyperthermie dans la lutte contre la résistance pléïotropique aux médicaments en médicine clinique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hyperthermie, Résistance pléiotropique, P-glycoproteine, Apoptose, Cellules.

Il est généralement admis que l'expertise scientifique et technique des laboratoires de recherche ainsi que l'expertise médicale des services cliniques contribuent toutes à mieux connaître et à améliorer la santé de l'homme en favorisant les interfaces entre recherche fondamentale et recherche médicale cognitive et clinique. Ce présent projet vient soutenir cette contribution en soutenant l'intégration de l'hyperthermie comme possibilité thérapeutique dans la lutte contre le cancer au sein des établissements de santé canadiens. Ce travail de recherche comprend deux volets. En premier lieu, nous nous sommes intéressés à la toxicité du choc thermique et à sa capacité d'induire différentes voies de signalisation de l'apoptose. En second lieu, nous avons évalué l'effet protecteur de la thermotolérance induite à des températures douces contre la toxicité d'un choc thermique subséquent létal. Plus précisément, nous avons étudié les mécanismes moléculaires d'induction de la voie des récepteurs de mort Fas par le choc thermique (1), ainsi que la tendance du choc thermique à activer les voies de signalisation cellulaire impliquant les protéines MAP kinases et la protéine p53(2) et à générer un stress du réticulum endoplasmique (3). Dans les trois chapitres de l'étude, nous avons également investigué le rôle de la thermotolérance et des protéines de choc thermique dans la protection des cellules contre l'induction de l'apoptose par l'hyperthermie létale. L'exposition des cellules à des températures élevées létales (42-45°C) a conduit les cellules vers une mort majoritairement apoptotique. Les trois voies de l'apoptose (voie mitochondriale, voie du récepteur de mort Fas et voie du RE) ont été induites. Cependant, l'inhibition spécifique de la voie du récepteur de mort Fas nous a permis de conclure que cette dernière était responsable de l'induction de la voie intrinsèque de l'apoptose médiée par la mitochondrie. Pour sa part, la voie du réticulum endoplasmique (RE) est induite suite à un stress prolongé du RE. Il s'est avéré aussi que l'induction de cette voie n'est pas indispensable pour l'induction de l'apoptose par choc thermique létal. Durant ces cascades signalétiques, les MAP kinases, en particulier les protéines JNK et p38, jouent un rôle crucial dans la phosphorylation et l'activation de divers facteurs pro-apoptotiques tels que Bax, Puma, Noxa et p53. Ceci a conduit à l'arrêt du cycle cellulaire en phase G0/S, et à la translocation de Bax à la mitochondrie et la dégradation de Bcl-2. D'autre part, suite à l'induction de la thermotolérance à la température de la fièvre (40°), nous étions capables de protéger les cellules contre la cytotoxicité d'un choc thermique létal subséquent. Malgré qu'aucunes évidences n'aient été établi, cet effet protecteur de la thermotolérance semble être en parfaite corrélation avec l'augmentation du niveau d'expression des HSPs. L'utilisation conjointe de l'hyperthermie létale et non létale (la thermotolérance) pourrait constituer une possibilité à envisager lors du traitement du cancer par les méthodes classiques. La pertinence et l'originalité de ce projet réside dans le fait que cette alternative est avant tout naturelle et biologique, peu coûteuse, et exemptée de la plupart des effets secondaires observés lors de l'utilisation des méthodes classiques de traitement, qui sont généralement toxiques et couteuses. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hyperthermie, HSPs, Thermotolérance, Apoptose, Nécrose, Caspases, Calcium, ROS, Bcl-2, Fas, Mitochondrie, Réticulum Endoplasmique, p53, MAP kinases, Calpaïnes

Les prédictions du réseau intergouvernemental sur les changements climatiques indiquent que la concentration ambiante de dioxyde de carbone (CO2) d'environ 350 µm.mol-1 va doubler d'ici la fin du siècle. Cette hausse de CO2 combinée au réchauffement de la température va avoir un effet drastique sur l'agriculture et les écosystèmes. Grâce à leur grande variabilité génétique, le blé (Triticum aestivum) et le seigle (Secale cereale) sont très adaptés aux stress abiotiques et biotiques. Les variétés d'hiver capables de s'acclimater au froid sont plus résistantes aux basses températures. Cette meilleure capacité de tolérance pourrait-elle conférer un avantage durant la croissance et le développement des céréales soumis aux concentrations élevées de CO2 de 700 µm.mol-1? La comparaison des processus physiologiques, biochimiques et moléculaires associés à la réponse du blé et du seigle non acclimatés et acclimatés au froid durant leur croissance et développement en concentrations ambiantes et élevées de CO2 ont été l'objet de notre étude. Dans le premier article de ce travail, nous avons comparé la contribution des effets de la plasticité phénotypique observée au niveau des feuilles et de la plante entière avec les effets biochimiques et moléculaires sur la performance photosynthétique et l'utilisation de l'eau des cultivars hivernaux et printaniers de blé (cv Norstar et cv Katepwa) et de seigle (cv Musketer et cv SR4A) non-acclimatés (20°C) et acclimatés au froid (5°C). Le blé et le seigle d'hiver acclimatés au froid présentent des hausses de 22 et 44% de leur activité photosynthétique maximale (Asat) et du double de leur efficacité d'utilisation de l'eau. Les sucres produits par la photosynthèse sont exportés au niveau des organes de réserve et de la paroi cellulaire. Les analyses biochimiques et moléculaires montrent que les céréales d'hiver acclimatées au froid augmentent leur efficacité et taux de transfert d'électrons photosynthétiques, diminuent la pression d'excitation au niveau de leur photosystème II et augmentent la dissipation de l'énergie sous forme de chaleur, démontrant ainsi une meilleure performance face à l'inhibition photosynthétique associée au froid. Par ailleurs les résultats obtenus avec la surexpression de BNCBF17 chez Brassica napus indiquent que les gènes CBFs/DREBs semblent réguler la tolérance au gel et gouvernent l'architecture des plantes, l'anatomie des feuilles, la performance photosynthétique et l'efficacité de l'utilisation de l'eau. Nous discutons dans cet article des coûts et des bénéfices de la plasticité phénotypique en termes de survie hivernale et de la capacité de reproduction. Dans le deuxième article nous avons déterminé si l'exposition à court terme aux concentrations élevées de CO2 de 700 µm.mol-1 pouvait compenser l'inhibition photosynthétique induite par le froid chez les variétés printanières de céréales. Les taux d'assimilation de la photosynthèse (Asat) ont été mesurés chez deux variétés (hivernale et printanière) de blé Triticum aestivum (cv Norstar et Katepwa) et de seigle Secale cereale (cv Musketeer et cv SR4A) non acclimatées (température 20/16°C jour/nuit) et acclimatées au froid (température 5/5°C jour/nuit). Suite à une exposition courte de aux concentrations élevées de CO2 de 700 µmol C mol-1, les variétés printanières de blé et seigle acclimatées au froid présentent une diminution de 45 à 60% de leur taux de photosynthèse comparée à leurs homologues non acclimatées. Les plants de blé et de seigle d'hiver acclimatés au froid présentent une augmentation de 15 à 35% de leur photosynthèse comparativement aux plants non acclimatés. L'assimilation de CO2 durant l'acclimatation au froid est 60% moins élevée chez les variétés printanières comparativement aux variétés hivernales. Ces résultats démontrent que l'exposition à court terme aux concentrations élevées de CO2 ne peut compenser l'inhibition photosynthétique induite par le froid chez les variétés printanières. La limitation du CO2 pour la Ribulose 1, 5-biphosphate carboxylase/oxygénase que l'on observe généralement à concentration ambiante de CO2 est accentuée par l'acclimatation au froid chez les cultivars de printemps. De plus, l'exposition à court terme aux concentrations élevées de CO2, ne permet pas aux cultivars de printemps d'ajuster la sensibilité thermale associée à la photosynthèse durant l'acclimatation au froid comparativement aux cultivars d'hiver. Dans le troisième article, l'analyse du transcriptome chez le blé (Triticum aestivum. L,) d'hiver Norstar cultivé à long terme en conditions de CO2 ambiant (380 µmol C mol-1) et élevé (700 µmol C mol-1) a été initiée afin de déterminer les facteurs physiologiques et génétiques impliqués dans la réponse des plantes non-acclimatés (NA, 20°C) et acclimaté au froid (CA, 5°C) aux concentrations élevées de CO2. Les plantes acclimatées au froid en conditions de CO2 ambiant présentent, un phénotype court et robuste, une réduction de 33% de leur croissance, une hausse double du poids spécifique de leur feuille de même que de leur quantité de protéine et une hausse de 30% de leur quantité de chlorophylle par unité de surface foliaire comparativement aux plantes non acclimaté. Les concentrations élevées de CO2 ont peu d'effets sur ces paramètres morphologiques. Néanmoins les concentrations élevées de CO2 ont entraîné une hausse de 30% de la biomasse des parties aériennes du blé non acclimaté et acclimaté au froid. Le blé Norstar acclimaté au froid maintient des taux de photosynthèses en conditions de lumière et de CO2 saturantes comparables au blé non-acclimaté, mais requiert moins de quantum pour la fermeture du photosystème et pour la dissipation de l'énergie sous forme de chaleur. Les plantes non acclimaté et acclimaté au froid ne sont pas sensibles à l'inhibition photosynthétique induite par les concentrations élevées de CO2. L'effet le plus marqué des concentrations élevées de CO2 chez le blé non acclimaté est la diminution de l'expression des gènes impliqués dans la défense des plantes face aux pathogènes. Par contre, ces effets sont moins accentués chez les plantes acclimatées au froid grâce à l'induction des gènes impliqués dans la résistance aux pathogènes, dans la tolérance au gel, dans la protection et à la stabilisation du chloroplaste. Ces résultats démontrent que l'acclimatation au froid et les concentrations élevées de CO2 ont des effets opposés sur la régulation du système de défense des plantes. Ces résultats démontrent que es concentrations élevées de CO2 auront moins d'impact sur la performance et la productivité des plantes qui vivent dans les pays nordiques contrairement à celles qui vivent dans les environnements plus chauds. Avec les conditions de CO2 élevé prévu, la sélection de plantes ayant des caractères de résistance aux pathogènes est fortement suggérée. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Assimilation de CO2, concentrations élevées de CO2, acclimatation au froid, transcriptome, stress abiotiques et biotiques, gènes de résistance aux pathogènes

La maladie d'Alzheimer est une maladie dégénérative du système nerveux central. Une des caractéristiques pathologiques de la maladie est la présence de plaques amyloïdes causées par l'agrégation du peptide P-amyloïde (A|342) dans le cerveau. Ce peptide est produit à la suite de deux clivages protéolytiques de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP), par BACE (P-APP cleaving enzyme) et par le complexe y-sécrétase. Le complexe y-sécrétase est composé de 4 sous-unités connues : Préséniline-1 (PSI) ou 2 (PS2), Anterior pharynx defective 1 (APH-1), Presenilin enhancer 2 homolog (PEN-2) et Nicastrine (NCT). L'utilisation du complexe comme cible thérapeutique de la maladie d'Alzheimer est problématique car il est important dans de nombreux processus physiologiques. De plus, les mécanismes de régulation de l'activité du complexe y-sécrétase ainsi que son affinité pour ses différents substrats sont peu connus. Le haut poids moléculaire du complexe suggère aussi la présence de protéines encore non identifiées. L'objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux partenaires du complexe, transitoires ou permanents, ayant un rôle dans la régulation de ce dernier ou modulant son affinité pour ses substrats. Le système double hybride en levure a été utilisé pour identifier des partenaires protéiques des protéines appâts NCT, PEN-2 et APP, lors de criblages de banques d'ADNc de cerveau humain. Les protéines Ferritin L (polypeptide codant la chaîne légère de la Ferritin) et ISLR (immunoglobulin superfamily leucine rich repeat) ainsi que 4 protéines inconnues, ont été péchés avec la protéine-appât PEN-2, une sous-unité du complexe y-sécrétase. SNW1 (SNW domain containing 1) et WBP5 (WW domain binding protein 5) ont quant à eux été péchés à l'aide d'APP. Des analyses en double hybride et en co-immunoprécipitation ont montré que l'interaction entre Ferritin et PEN-2 est négative, alors que ISLR interagit avec trois des sous-unités du complexe y-sécrétase ce qui suggère sa présence probable dans le complexe. L'interaction entre APP et SNW1 suggère que APP par l'intermédiaire de sa partie C-terminale (AICD) pourrait être un facteur de transcription dont l'activité serait régulée par le corégulateur transcriptionnel SNW/SKIP. WBP5 pourrait quant à elle servir de lien entre APP et les partenaires du complexe. D'autres analyses sont nécessaires pour confirmer ces résultats préliminaires et définir le rôle des partenaires identifiés.

L'érythropoïèse est un mécanisme complexe responsable de la formation des erythrocytes à partir des cellules souches hématopoïétiques. Notre équipe a précédemment montré que l'hyperthermie légère favorise l'expansion et accélère la différenciation des cellules mégacaryocytes en culture. Le but de mes travaux était de caractériser les effets de l'hyperthermie légère sur les autres voies de différenciation myéloïdes (cellules érythroïdes, granulocytes et monocytes) et d'identifier les mécanismes d'action responsables des effets observés sur l'érythropoïèse. Nous montrons que l'hyperthermie légère permet un accroissement de l'expansion sur la majorité des lignées testées et accélère leur différenciation et maturation. De plus, nos résultats montrent que l'hyperthermie légère favorise une entrée rapide des cellules CD34+ quiescentes en cycle cellulaire et augmente l'expression de plusieurs protéines de choc thermique. En conclusion, nos résultats suggèrent que les effets observés de l'hyperthermie légère sur l'érythropoïèse sont en partie dus à l'activation de plusieurs sentiers de signalisation intracellulaire ainsi que du facteur proérythrocytaire GATA-1.

Chez les végétaux, la défense innée est un mécanisme de protection sophistiqué qui assure la survie de l'organisme face aux stress biotiques. Ce processus comprend la perception de l'agent pathogène, sa reconnaissance, la transmission du signal, l'intégration de celui-ci et finalement la production d'une réponse adéquate. Il existe plusieurs voies de signalisation permettant la transduction du signal vers les cibles intracellulaires. Au cours de mes travaux de doctorat, j'ai étudié les cascades de MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases), qui sont des voies de signalisation assurant le relais vers la génération de processus physiologiques appropriés. Les cascades des MAPKs sont généralement composées de trois MAPKs (MAPKKK, MAPKK et MAPK). Ces trois kinases s'activent de façon séquentielle après la perception d'un changement environnemental intrinsèque ou extrinsèque à la cellule végétale. La cascade des MAPKs est hautement conservée chez tous les eucaryotes où elle régule divers processus, dont la réponse aux différents stress biotiques. Grâce à la disponibilité de la séquence assemblée et annotée du génome de Populus trichocarpa, 11 PtiMKKs et 21 PtiMPKs ont été répertoriées. Une analyse comparée (avec Oryzae sativa et Arabidopsis thaliana) de l'organisation génomique et de la structure de ces gènes a été faite et une nouvelle nomenclature a été proposée. Par la suite, la quantification des transcrits de toutes les PtiMKKs et PtiMPKs a été réalisée dans 17 tissus et organes de peuplier et lors de l'interaction peuplier-rouille. Des feuilles de Populus nigra x P. maximowiczii (NM6) ont été inoculées avec deux espèces de rouille, soit Melampsora medusae f. sp. deltoidae (Mmd) et Melampsora larici-populina (Mlp). Chez le peuplier, Mmd engendre une réponse intermédiaire caractérisée par une faible croissance de cet agent pathogène. Mlp provoque pour sa part une réponse de susceptibilité complète permettant sa croissance sur les feuilles de peuplier. Le patron de variation transcriptomique de certaines PtiMKKs et PtiMPKs est en général comparable à ce qui est observé chez d'autres espèces végétales. Nos résultats mettent en évidence le rôle potentiel d'un groupe de MAPKs dans l'interaction rouille-peuplier. De plus, certains paralogues dupliqués chez ces deux familles de gènes montrent des profils d'expression différents. Finalement, nous avons identifié, par double-hybride, l'aliène oxyde synthase comme cible potentielle de la PriMPK3-l. L'allène oxyde synthase est une enzyme clé de la voie de biosynthèse de l'acide jasmonique. Ces travaux suggèrent une implication possible de cette phytohormone dans l'interaction rouille-peuplier étudiée.

Aeromonas salmonicida, une bactérie pathogène du poisson, possède le système de sécrétion type trois (TTSS) essentiel à sa virulence. Il a été montré qu'une culture à 25°C de ces bactéries cause la perte du plasmide pAsa5 portant le TTSS engendrant ainsi une perte de virulence. Ce projet avait pour but de tester systématiquement l'effet de la chaleur sur certains facteurs de virulence. La thermolabilité du pAsa5 a été vérifiée par PCR pour des souches cultivées à 25°C. Leur virulence a été comparée à leur souche parentale avec l'amibe Dictyostelium discoideum. Les résultats ont montré que la perte de virulence est associée au réarrangement de pAsa5 qui s'est montré variable entre les souches et pour une même souche après différents traitements thermiques. Ce projet propose une nouvelle vision sur la thermolabilité du pAsa5. L'identification de l'origine du réarrangement permettra de contrer la virulence d'A. salmonicida lors de futurs projets.

Le cancer est une maladie évolutive qui se développe par l'intermédiaire de l'acquisition progressive par une même cellule d'un ensemble de mutations qui dissocient les liens moléculaires qui relient normalement la prolifération cellulaire aux mécanismes suppresseurs de tumeur, comme la differentiation, la sénescence et l'apoptose. De fait, l'émergence de la plupart des cancers humains résulte de la coopération entre des mutations qui élèvent ou dérégulent l'expression de l'oncoprotéine c-Myc et d'autres qui inactivent l'apoptose. Parallèlement, il a été proposé que le maintien du phénotype tumoral dépende du développement de mutations secondaires qui pallient les déséquilibres cellulaires associés au processus de transformation néoplasique. À cet effet, la surexpression constitutive du chaperon moléculaire Hsp90 représente l'une des mutations adaptatives les plus communément rencontrées dans le cancer. La fonction de Hsp90 semble collaborer à la transformation néoplasique en permettant la maturation d'un ensemble restreint de protéines à l'origine du développement des traits phénotypiques propres à la cellule tumorale, en prévenant la formation d'agrégats protéiques toxiques et en facilitant le transport intracellulaire et la sécrétion des protéines. Par conséquent, la réponse cellulaire au stress médiée par Hsp90 apparaît entraver directement le programme d'apoptose enclenché par une expression dérégulée de c-Myc. Toutefois, au moment de débuter mes études doctorales, aucun lien moléculaire entre ces deux mécanismes aux fonctions opposées n'avait encore été déterminé. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que le programme d'apoptose mis en place par une expression dérégulée de c-Myc requiert l'inactivation de Hsp90. La surexpression de c-Myc inhibe la fonction de Hsp90 par l'intermédiaire de l'induction du clivage du cofacteur p23 par les caspases. L'inactivation de Hsp90 accélère et accroît sélectivement l'apoptose des cellules transformées en provoquant la dégradation de multiples oncoprotéines tributaires de la fonction de Hsp90. À l'inverse, une inhibition du clivage de p23 contrecarre l'apoptose et contribue à la transformation des cellules qui surexpriment c-Myc en I facilitant la maturation et l'activation des substrats de Hsp90. Nous en concluons que le clivage de p23 lors de l'apoptose constitue un mécanisme inhibiteur de la transformation néoplasique déterminant puisqu'il fait obstacle à la réponse cellulaire au stress médiée par Hsp90. Nos observations mettent en évidence le rôle central de Hsp90 dans l'initiation tumorale et suggèrent que l'inhibition de p23 puisse représenter une approche viable dans le traitement des cancers caractérisés par une expression élevée ou dérégulée de c-Myc. En outre, nous démontrons qu'une expression dérégulée de c-Myc stabilise la sous-unité inductible a du facteur de transcription HIF-1 à la suite du retrait des facteurs trophiques en inactivant les enzymes prolyl-4-hydroxylase 2. L'activité transcriptionnelle du facteur de transcription HIF-1 facilite l'adaptation des cellules tumorales à leur milieu par la mise en place de mécanismes comme la glycolyse, l'érythropoïèse et l'angiogenèse. Ainsi, nous avons observé que l'accumulation de HIF-1 a corrèle avec une substitution de l'isoforme COX4-1 pour l'isoforme COX4-2 de l'enzyme mitochondriale cytochrome-oxydase, une adaptation qui accroît la synthèse d'ATP par la chaîne respiratoire. De plus, nous avons remarqué la conversion concomitante de la protéine LC3-I en son dérivé clivé LC3-II, suggérant que HIF-1α contribue à induire l'autophagie. Dans l'ensemble, nos résultats indiquent que la stabilisation de HIF-1α en réponse à une expression dérégulée de c-Myc promeut la survie des cellules transformées à la suite du retrait des facteurs trophiques.

Le spermatozoïde doit subir une série de modifications membranaires et biochimiques, nommée capacitation, lui permettant ainsi d'acquérir son pouvoir fécondant. La phosphorylation en tyrosine de certaines protéines spermatiques, observée durant la capacitation, fait partie des modifications que doit subir le spermatozoïde pour être en mesure de féconder l'ovule. Au cours des dernières années, plusieurs tyrosine kinases, les enzymes responsables de cette phosphorylation, ont été identifiées dans les spermatozoïdes de différents mammifères. Des études réalisées par l'utilisation d'inhibiteurs de ces enzymes ont démontré que les membres de la famille des src pouvaient être, en partie, responsables de l'élévation du contenu en phosphotyrosine lors de la capacitation. Il a donc été entrepris de détecter la présence des différents membres de cette famille dans les spermatozoïdes. Au cours de l'étude pour l'identification des tyrosine kinases de la famille des src dans le spermatozoïde, des isofolmes codant pour yes, lyn, lck et hck ont été identifiés. De plus, un isofonne tronqué de hck, nomlné hck-tr, a été identifié dans les cellules germinales haploïdes de taureau. Le but de ce projet de doctorat était donc de déterminer si la protéine hck et/ou son isoforme tronqué étaient impliqués dans la capacitation, réaction de l'acrosome et l'hyperactivité; processus menant à la fécondation. La première partie du projet avait pour objectif de confirmer la présence des ARNm encodant les isoformes de hck dans les cellules germinales et déterminer si la protéine correspondante était exprimée au niveau des spermatozoïdes matures. Les résultats obtenus ont permis de confirmer la présence des messagers identifiés et de montrer la présence, par l'utilisation d'anticorps spécifiques, des deux protéines dans les différentes cellules spermatogéniques. La caractérisation de ces isoformes a par la suite été entreprise permettant ainsi la localisation de hck -tr dans le testicule et le spermatozoïde bovin. La présence d'une forme active de la kinase pleine longueur a, quant à elle, été démontrée dans le testicule ainsi que dans les spermatozoïdes épididymaires et éjaculés. La dernière partie du projet consistait en la détermination des rôles potentiels que pouvaient avoir les isoformes de hck dans les événements menant à la fécondation. Hck-tr pourrait ainsi agir comme un inhibiteur puisque sa présence a provoqué une importante diminution de l'activité enzymatique de hck. Les résultats obtenus ont aussi permis d'identifier plusieurs protéines qui interagissaient spécifiquement avec hck, hck-tr ou les deux isoformes. Bien que certaines de ces protéines soient associées à des structures présentes dans la tête du spermatozoïde, la majorité des candidats identifiés sont retrouvés au niveau du flagelle. Cette étude permettra de mieux comprendre les implications de cette tyrosine kinase dans la phosphorylation en tyrosine observée durant la capacitation, la réaction de l'acrosome et l'hyperactivation du spermatozoïde

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste pouvant causer des infections pulmonaires chroniques chez les gens atteints de la Fibrose Kystique (FK). Pour réussir à s’implanter dans les voies respiratoires des patients FK, P. aeruginosa dispose d’un important arsenal de facteurs de virulence, dont la sécrétion de protéases, de lipases, de phospholipases ainsi que la production de toxines spécifiques. Le séquençage complet du chromosome de P. aeruginosa souche PAO1 (6.3 Mb) a révélé une organisation génomique hautement régulée. Dans le but de mieux comprendre l’interaction hôte-pathogène, nous avons utilisé la technique de mutagenèse à étiquette (STM). La STM a permis d’isoler 214 mutants incapables de maintenir l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Parmi ceux-ci, le mutant STM2895, contenant un transposon dans le gène PA2895, a été retenu pour des analyses plus approfondies. L'étude phénotypique de STM2895 a permis de constater un défaut dans la production d’exoprotéases lorsque comparé à la souche sauvage PAO1. La caractérisation biochimique de ce défaut, utilisant des tests de dégradation spécifiques et l’immunobuvardage, a démontré qu’au moins deux des quatre protéases majeures sécrétées par P. aeruginosa sont impliquées. En effet, les élastases LasA et LasB ont été démontrées non fonctionnelles probablement dues à un problème de repliement. PA2895, une protéine possédant un domaine transmembranaire prédit, ne code pour aucune fonction connue, mais il est co-transcrit avec le gène PA2896, un facteur sigma putatif de type ECF (extracytoplasmic function). Des analyses en transcriptome sur le mutant STM2895, ainsi que sur un mutant de délétion de PA2896, ont permis de lier l’opéron au métabolisme du fer. De plus, des études in vivo dans le modèle d’infection pulmonaire chronique chez le rat ont clairement démontré que le mutant STM2895 est incapable de se maintenir dans l’hôte au même niveau que la souche sauvage PAO1. Le gène PA2895 est donc essentiel au maintien in vivo de P. aeruginosa dans le poumon de rat. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that can cause pulmonary infections in cystic fibrosis patients (CF). To overcome innate self defense, P. aeruginosa possesses a wide arsenal of virulence factors. These include degradation enzymes such as proteases, lipases and phospholipases and the production of three specific toxins: exotoxin A and exoenzymes S and T. Sequencing of the complete P. aeruginosa chromosome (strain PAO1) of 6.3 Mb revealed a highly regulated and complex genomic organization. In order to better understand host-pathogen molecular interactions, we developped a new signature-tagged mutagenesis (STM) approach based on PCR screening. The PCR-based STM technology lead to the identification of 214 mutants deficient in their ability to maintain a chronic pulmonary infection in the rat lung. In that pool of STM mutants, STM2895, which contains a transposon insertion in functional PA2895, was the most frequently drafted during the whole mutant library screening. Phenotypic analyses of the STM2895 strain allowed us to identify an exoprotease production defect as compared with wild type strain PAO1. The biochemical characterization of that proteolytic default using specific degradation assays combined with western blotting revealed that at least two (LasA and LasB) of the four major exoproteases from P. aeruginosa STM2895 strain are inactive. In fact, LasA and LasB elastases were shown to be present in the STM2895 culture supernatant, correctly processed but inactive due to a probable misfolding of proteins. The PA2895 gene (unknown function) encodes a protein with a predicted transmembrane domain. Basic genomic context analyses strongly suggest a cotranscription unit with the downstream gene PA2896, a putative sigma 70 factor from ECF (extracytoplasmic function) type. Microarray experiments on the STM2895 strain and an insertional mutant of the PA2896 gene were performed to establish a link between the putative PA2895-PA2896 operon and the metabolism of iron. Transcriptome analysis also demonstrated a repressive action of PA2895 on the transcription of PA2896 putative sigma factor. Finally, in vivo studies in the rat lung chronic infection model clearly showed a ten-fold decrease in survival capacity of the mutant strain when compared to the PAO1 wild-type strain.