La SUMOylation est une modification post-traductionnelle, réversible, qui module une variété de processus cellulaires principalement associés à des événements nucléaires. Lors d'une analyse du protéome de fractions subcellulaires de prostate, nous avons révélé plusieurs caractéristiques incluant la présence d'une quantité particulièrement abondante de peptides SUMO-1 libres. Une observation similaire a été faite dans le pancréas exocrine, un tissu également spécialisé dans une activité unique de sécrétion. À partir de ces données, qui suggèrent que les peptides SUMO jouent un rôle important dans ces tissus, nous avons identifié une série de protéines membranaires potentiellement SUMOylées. Une caractérisation approfondie de ces candidats, à l'aide d'un système de surexpression dans les cellules LNCaP, indique que les protéines ANXA1 et ANXA2 sont SUMOylabiés. Nous avons démontré par mutagénèse dirigée que la SUMOylation de l'ANXAl correspond à une multi-SUMOylation qui a lieu à la fois dans une séquence consensus, sur le résidu K257, et au niveau de la région flexible du domaine N-terminal qui ne correspond à aucune séquence consensus. Des résultats similaires ont été obtenus pour TANXA2. Nous observons que la mutation Y21F diminue de façon marquée la SUMOylation de l'ANXAl, suggérant qu'une connexion existe entre la phosphorylation dépendante de l'EGF et la SUMOylation. L'ensemble de nos résultats montre que la SUMOylation est impliquée dans la régulation des fonctions de ANXA1 et ANXA2 et suggère la présence de mécanismes qui coordonnent le trafic membranaire dans les voies de l'exocytose et de l'endocytose.

La tyrosinémie héréditaire de type I, un désordre autosomique récessif, aboutit à des lésions du foie et des reins avec un développement de carcinomes hépatocellulaires. Cette maladie est due à une déficience de la fumarylacétoacétate hydrolase menant à l'accumulation du fumarylacétoacétate qui peut être empêchée par l'administration de NTBC. L'objectif du travail est d'étudier les changements physiopathologiques et moléculaires qui peuvent survenir si le patient cesse de prendre le NTBC pour une raison et un temps donnés. Des souris FAH ~'~ ont été soumises à un protocole à deux interruptions de NTBC séparées par une reprise du traitement pendant un mois. Sans NTBC soit au premier ou au deuxième arrêt, ces souris subissent une diminution du poids corporel avec une hépatomégalie et une néphromégalie et montrent une induction de l'expression de protéines anti-apoptotiques, de PKC, MEK1/2 et ERK1/2. Une réversibilité de ces modifications a été observée en présence du NTBC de façon précoce et rapide.

Le glaucome primaire à angle ouvert (GPAO) est caractérisé par une dégénérescence du nerf optique causant une perte des champs visuels périphériques. Onze loci ont été cartographiés pour la maladie, mais seulement trois gènes ont été caractérisés: TIGR/myocilin, optineurin et WDR36. Cette étude utilise l'analyse de liaison génétique et le génotypage à haut débit pour cartographier les gènes responsables du GPAO dans la population fondatrice canadienne-française. Onze familles (365 individus) furent testées au locus GLC1D (8q23) par analyse de liaison génétique en utilisant des marqueurs microsatellites. Deux familles démontrant une liaison potentielle furent agrandies et une troisième famille fut aussi étudiée en profondeur. Nous avons aussi génotype 343 patients non apparentés et 73 individus normaux sur le même locus pour trouver une signature allélique commune. Des deux familles agrandies, une a démontré l'absence de liaison, tandis que l'autre semble être liée au locus GLC1D. Cette dernière famille (RN) possède une valeur lod maximale de 1,34 à 9 = 0,0 au marqueur D8S555. De plus, une autre famille (TB) possède une valeur lod maximale de 0,4 à 6 = 0,0 au marqueur D8S200, en utilisant un modèle de transmission autosomique dominante à pénétrance incomplète. Sauf pour une phénocopie, un haplotype caractéristique co-ségrégue avec la maladie dans chacune des deux familles. De plus, une signature allélique, comprises entre les marqueurs D8S1779 et D8S281, représentant une région de 0,46 cM (1,27 Mb), fut trouvée comme étant significativement plus fréquente chez les patients malades que chez les individus normaux Nos résultats démontrent que le GPAO dans deux des familles étudiées serait potentiellement lié au locus GLC1D sur le chromosome 8q23. De plus, la signature allélique découverte semble confirmer la présence d'un gène muté causant le glaucome dans cet intervalle. Cette signature permet en plus de prioriser un gène candidat, CSMD3, pour le séquençage. L'étape suivante sera d'entreprendre le séquençage des gènes candidats cartographiés dans cet intervalle, en commençant par CSMD3, pour trouver les mutations délétères. / Primary open angle glaucoma (POAG) is characterized by an optic nerve degeneration, which causes the lost of peripheral visual fields. Up to date, eleven loci have been mapped, but only three genes have been characterized: TIGR/myocilin, optineurin and WDR36. Our study uses genetic linkage analysis and high throughput genotyping to map genes responsible for POAG in the founding population of French Canadians. Eleven families (365 individuals) have been tested on the GLCID locus (8q23) by genetic linkage analysis, using microsatellite markers. Two families, who showed linkage potential, were further extended and a third family was also further studied. We have also genotyped 343 unrelated patients and 73 controls on this same locus to find possible common allelic signatures. Of the two extended families, one showed no signs of linkage, while the other seems to be linked to GLCID. This family (RN) has a maximum lod score value of 1,34 at 0 = 0,0 for marker D8S555. Furthermore, another family (TB) showed a maximum led score of 0,4 at 0 = 0,0 for marker D8S200, using an autosomal dominant transmission model with incomplete penetrance. Excluding one phenocopy, a common haplotype co-segregates with glaucoma in both these families. In addition, an allelic signature, located between markers D8S1779 and D8S281, representing a region of 0,46 cM (1,27 Mb), was found to he significantly more common in affected individuals when compared to controls. Our results demonstrate that POAG in two of the studied families is potentially linked to locus GLC I D on chromosome 8q23. Furthermore, the allelic signature found in this region only confirms with more evidence the presence of a disease causing gene. Additionally, this signature provides information permitting the prioritization of a particular candidate gene, CSMD3. The next step will be the sequencing of candidate genes mapped in the defined interval to find disease causing mutations.

Il est bien accepté dans des modèles en culture que les dynamiques mitochondriales et le remodelage des crêtes régulent le fonctionnement mitochondrial sous diverses conditions de stress, particulièrement l’apoptose et la famine. Malgré la quantité impressionnante de recherche effectuée dans ce domaine, on en connait encore très peu au sujet de l’importance des dynamiques mitochondriales et du remodelage de la structure mitochondriale sous des conditions physiologiques. Dans les années 1960, Hackenbrock a démontré que des mitochondries isolées adoptent des conformations internes distinctes selon l’état métabolique. D’après ses observations, il a prédit que les changements ultrastructurels de la mitochondrie régulent la production fonctionnelle de l’organite. Cependant, il n’est pas évident que ces changements ultrastructuraux suivent bien les changements métaboliques in vivo dans des conditions physiologiques. De plus, le métabolisme hépatique nécessite une adaptation constante de la production bioénergétique et biosynthétique de la mitochondrie suite aux changements de l’état anabolique/catabolique de la cellule hépatique. Toutefois, le fonctionnement de ce processus est encore largement inconnu. Dans cette étude, nous apportons les premières descriptions quantitatives in vivo de la réponse adaptative du réticulum mitochondrial aux transitions métaboliques du foie. Grâce à un modèle hépatique de souris postprandiale et une analyse cryo- microscopie électronique (cryo-EM) quantitative, nous montrons que, 5 heures après un repas, la voie mTORC1 est bloquée, le réseau mitochondrial se fragmente, la densité des crêtes diminue et la capacité respiratoire des mitochondries chute. Ces changements sont accompagnés d’une augmentation parallèle de la longueur des contacts mitochondrie-réticulum endoplasmique (MERCs), qui contrôle les échanges de calcium et de phospholipides entre les deux organites. De plus, ces évènements sont associés à l’expression transitoire de deux fragments C-terminaux (CTFs) inconnus jusqu’à présent provenant de la protéine Optic atrophy-1 (OPA1), une GTPase qui régule les dynamiques des crêtes mitochondriales et des mitochondries. Grâce à un protocole in vitro, nous montrons que ces CTFs proviennent d’un nouveau clivage d’OPA1, appellé clivage-C, qui élimine l’activité d’OPA1 en la coupant. Plus important encore, nous montrons que le clivage-C nécessite la présence de Mitofusin-2 (MFN2), une protéine clé dans la régulation de la fusion mitochondriale et dans la génèse des MERCs, mais pas la présence de l’homologue Mitofusin-1 (MFN1), ce qui confirme le lien entre le remodelage des crêtes et l’assemblage des MERCs. / It is well established in cultured models that mitochondrial dynamics and cristae remodeling regulate mitochondrial function under different stress conditions, such as starvation and apoptosis. Despite the tremendous amount of research in this field, relatively little is known about the significance of mitochondrial dynamics and ultrastructure remodeling under normal physiological conditions in vivo. In the 1960’s, Hackenbrock demonstrated that isolated mitochondria adopt distinct internal conformations under different metabolic states. Based on these observations, he predicted that mitochondrial ultrastructural changes regulate the organelles functional output. However, whether these ultrastructural changes also accompany metabolic transitions in vivo, under physiological conditions, is not known. Further, hepatic metabolism requires mitochondria to adapt their bioenergetic and biosynthetic output to the ever-changing anabolic/catabolic state of the liver cell, but the wiring of this process is still largely elusive. In this study, we provide the first in vivo quantitative description of the adaptive response of the mitochondrial reticulum to hepatic metabolic transitions. Using a postprandial mouse liver model and quantitative cryo-EM analysis we show that at 5 hours after feeding the mTORC1 signaling is blocked, the mitochondria network fragments, the cristae density decreases and the mitochondrial respiratory capacity drops. These changes are accompanied with a parallel increase in the mitochondria-ER contact (MERCs) lengths, which control calcium and phospholipids fluxes between the two organelles. Further, these events are associated with the transient expression of two previously unidentified C-terminal fragments (CTFs) of Optic atrophy-1 (OPA1), a mitochondrial GTPase that regulates cristae and mitochondrial dynamics. Using an in vitro assay, we show that these CTFs originate from a novel OPA1 processing, termed C-cleavage that eliminates OPA1 activity by breaking off the GTPase. Importantly, we show that C-cleavage requires the presence of Mitofusin-2 (MFN2), a key regulator of mitochondria fusion and MERCs biogenesis, but not that of its homolog Mitofusin-1 (MFN1), thereby linking cristae remodeling to MERCs assembly.

Dans le laboratoire du Dr. Charron, le gène Mekl a été inactivé par mutagenèse d'insertion et il a été démontré que les embryons Mekl'' mouraient à la mi-gestation à cause d'une vascularisation déficiente du placenta (Giroux et al., 1999). Chez les placentas Mekl'' la structure du labyrinthe (impliqué dans les échanges nutritifs et gazeux entre le fœtus et la mère) est réduite voire quasi-inexistante. Les objectifs de la présente thèse étaient (i) d'étudier en détails le phénotype placentaire Mekl'", (ii) d'étudier la signalisation de la voie ERK/MAPK in vitro dans un modèle cellulaire participant au développement du placenta, et (iii) de générer un allèle conditionnel de Mekl afin de faire le 'rescue' du placenta Mekï'~. Par marquage immunohistochimique, il a été montré qu'il y a plus de cellules apoptotiques et moins de cellules prolifératives dans la région chorion-allantois du placenta Mekt' en comparaison avec les placentas Mekt/+ . Des analyses westerns sur des extraits totaux de placentas ont montré que la voie ERK/MAPK est beaucoup moins activée chez les spécimens Mekl~'~. Chez les placentas Mekl*'*, il a été montré que MEK1/2 sont activés de façon ubiquitaire dans la région du labyrinthe alors que, ERK1/2 sont principalement activés au niveau des syncytiotrophoblastes (SCT). Chez les placentas Mekl'', bien que MEK2 soit fortement activé au niveau de la jonction chorion-allantois, aucune activation de ERK n'est détectée à la jonction chorion-allantois. Par hybridation in situ, en utilisant le gène Gcml comme un marqueur des précurseurs de SCT, il a été montré que chez les placentas Mekl"', les SCT sont déterminés au bon moment, semblent se différencier normalement, mais sont incapables d'envahir le chorion pour guider la formation du réseau vasculaire du labyrinthe. Ces résultats suggèrent l'implication de Mekl dans la migration et/ou la différenciation des SCT. Par ailleurs, nous avons aussi montré que chez les spécimens Mekl1 ''", la p38/MAPK est phosphorylée au niveau des cellules endothéliales entourant les vaisseaux sanguins fœtaux du labyrinthe. Ce résultat concorde avec les données publiées dans la littérature indiquant que la voie p38 /MAPK est impliquée dans l'angiogenèse. L'activation de p38/MAPK chez les placentas Mekl'1 ' semble normale. Nos résultats suggèrent donc que la voie ERK/MAPK serait essentielle pour la morphogenèse de la barrière formée par les SCT alors que la p38/MAPK serait plutôt impliquée dans l'angiogenèse des cellules épithéliales des vaisseaux sanguins du labyrinthe. D'autre part, plusieurs lignées de trophoblastes souches (TS : cellules souches participant activement dans la morphogenèse du placenta) Mekl+/+ et une lignée de TS Mek2'y ' ont pu être dérivés. Cependant, aucun TS Mekl' ' n'a pu être établi et deux des quatre lignées Mekl''' établies dans les conditions de culture de cellules TS, se sont avérées être des cellules embryonnaires souches (ES). Cette observation soulève plusieurs questions intéressantes en rapport au rôle de Mekl dans la prolifération et la différenciation des TS et/ou des cellules ES in vitro. Des travaux sont actuellement en cours dans notre laboratoire pour approfondir ces rôles. Un autre volet du présent projet était d'étudier le rôle de Mekl dans le développement de l'embryon proprement dit, il a été montré que lorsque les cellules ES Mekl'' sont agrégées avec des embryons tétraploïdes on arrive à générer des embryons et des placentas qui se développent normalement jusqu'au stade E13.5. Cependant, cette sauvegarde est incomplète, car l'embryon à E13.5 présente une morphologie légèrement anormale. Pour confirmer ce résultat, un allèle conditionnel chez lequel l'exon 3 de Mekl est flanqué par deux sites loxP (Mekl*10™) a été généré. L'excision de l'exon 3 génère un allèle nul de Mekl (MeklA ). En utilisant une lignée de souris transgénique exprimant la Crerecombinase spécifiquement dans l'épiblaste (Sox2Cre), des embryons MeklA/Aayant un placenta de type sauvage ont été généré. De plus, les souris MeklA/A sont viables et fertiles en l'absence de MEK1. En conclusion, les résultats décrits dans cette thèse suggèrent fortement que Mekl est requis principalement pour le développement des structures extra-embryonnaires du placenta murin. / Previously, it has been shown that Mekï' embryos die between E9.5-10.5 without any major embryonic malformations, while the placenta presented marked reduction in labyrinthine vascularisation (Giroux et al., 1999). By western analyses we showed that the ERK/MAPK pathway is much less activated in the Mekï ' placentas compared to wild type specimens. Our immunohistochemical analyses revealed that in Mekl+/+ placentas, MEKl/2 are ubiquitous and highly activated in the labyrinth (where gaseous and nutrient exchange take place between the fetus and the mother). ERK1/2 are activated mostly in syncytiotrophoblasts (SCT: ultimate barrier separating fetal and maternai blood flows in the labyrinth). In Mekï" placentas, MEK2 is mostly activated in the chorio-allantoic junction while ERK1/2 are activated exclusively in the allantois and not in the chorio-allantoic junction. Mekï'' placentas presented abnormal morphogenesis of the SCT barrier. Indeed, in Mekï'" placentas, we showed that SCT precursors (Gcm/-positive cells) are determined at the right moment (around E8.5), seemed to be able to differentiate but did not seem to be able to invade the chorion. We also showed that in Mekl*'+ specimens, the p38/MAPK pathway is phosphorylated in endothelial cells surrounding the labyrinthine fetal blood vessels. This observation is in accord with data published in literature assigning an important role of the p38/MAPK pathway in angiogenesis. Activation of the p38/MAPK pathway in Mekï' embryos seemed normal. Our results suggest that signaling through Mekl might be essential for SCT barrier morphogenesis. Furthermore, Giroux et al., (1999) showed that Mekï'" mouse embryonic fibroblasts failed to migrate in response to a fibronectin matrix. Hence we were interested to verify the migration and differentiation potentials of a cell type participating actively in placental development, i.e. trophoblast stem cells (TS). We managed to isolate several wild type and one Mekl'' TS cell lines while we did not obtain any Mekï'' TS. Interestingly, the cells obtained from Mekï'' blastocysts were mainly embryonic stem cells (ES). Hence these findings posed new questions concerning the implication of Mekl in the growth and maintenance of TS cells in vitro. Experiments are being carried out in our laboratory to pour light on these interrogations. Furthermore, we wanted to investigate the role of Mekl in the development of the embryo after E10.5. Using the tetraploid aggregation strategy, we were able to generate live E13.5 Mekl' ' embryos, hence suggesting that the Mekl phenotype is probably extra-embryonic and cell-autonomous. We confirmed thèse results by generating a conditional Mekl allele, in which the exon 3 of Mekl is flanked by two loxP sites (Mekla ° xed). By crossing this mouse with transgenic Cre mouse line (Sox2cre) expressing Cre recombinase specifically in the epiblast, we showed that the Mekl null {MeklA/A) mouse is viable and fertile. Our results demonstrate that Mekl is primordial for extraembryonic development in mouse.

Le spermatozoïde, afin d'être en mesure de féconder l'ovule, doit subir une série de modifications membranaires et biochimiques, regroupées sous le terme capacitation. De ces modifications, une augmentation de la phosphorylation en tyrosine de certaines protéines spermatiques spécifiques ainsi qu'une augmentation du Ca²⁺ intracellulaire sont observées. Il a été démontré que la phosphorylation sur résidu tyrosine associée à la capacitation des spermatozoïdes est sous le contrôle étroit du Ca²⁺, de la voie AMPc/PKA et des dérivés actifs de l'oxygène. De plus, il a été montré que la libération des réservoirs de Ca²⁺ par la thapsigargine, un inhibiteur spécifique des Ca²⁺ -ATPase du réticulum endoplasmique et sarcoplasmique (SERCA), pouvait provoquer l'augmentation de la phosphorylation en tyrosine et ce, dépendante des tyrosines kinases de la famille de src. Tous ces éléments suggèrent qu' il y a une Ca²⁺-ATPase sensible à la thapsigargine présente dans les spermatozoïdes permettant l'accumulation de Ca²⁺ dans les réservoirs et qu'au moins un membre de la famille de src dont l'activité est Ca²⁺ -dépendante est présente dans les spermatozoïdes. Dans un premier temps, j'ai identifié la Ca²⁺-ATPase SERCA2. C'est la première étude qui démontre que ce type de Ca²⁺ -ATPase est présente dans les spermatozoïdes de mammifères. La présence de SERCA2 au niveau de l'acrosome dans les spermatozoïdes humains, murins et bovins, suggère que cette Ca2+ -ATPase puisse contrôler la [Ca2+]i en accumulant le Ca²⁺ au niveau de l'acrosome. Puisque src est modulée positivement par le Ca²⁺, j'ai vérifié sa présence et son rôle dans les spermatozoïdes humains. Dans cette étude, j'ai clairement démontré que l'activité de src est Ca²⁺ dépendante et modulée positivement par la voie AMPc/PKA. De plus, la kinase src semble active tout au long de la capacitation et pourrait donc contribuer à l'augmentation de la phosphorylation associée à la capacitation. Enfin, j'ai tenté d' identifier des substrats de src par deux approches différentes. L'identification de ces protéines permettra de mieux comprendre le rôle de cette tyrosine kinase dans les fonctions Ca²⁺ -dépendantes du spermatozoïde.

L’orme, un arbre très apprécié pour le paysagisme urbain, est menacé par des champignons ophiostomatoïdes causant la maladie hollandaise de l'orme (MHO). Dans le xylème de l’orme, ces champignons se répandent passivement grâce à leurs cellules levuriformes bourgeonnantes et se servent de la forme mycélienne pour progresser dans les vaisseaux non infectés. Ce dimorphisme pourrait faciliter la colonisation de l’hôte, ce qui indique une possible liaison avec la virulence. Plusieurs stimuli affectent le dimorphisme, y compris des inhibiteurs de lipoxygénases. Les lipoxygénases (Lox), ainsi que les cyclooxygénases (Cox) sont des dioxygénases qui catalysent la formation d’oxylipines à partir d’acide gras. Ces molécules modulent le développement fongique et agissent possiblement dans le dimorphisme et la virulence des Ophiostoma. L’objectif de cette thèse est d’analyser le dimorphisme des agents de la MHO et vérifier si cette transition et la pathogénie sont modulées par des gènes qui encodent des enzymes du groupe des dioxygénases. Nous avons examiné l’effet de différents stimuli sur le dimorphisme des souches d’ophiostomatoïdes qui causent la MHO. Nous avons aussi vérifié si l’acide linoléique induit la transition de levure-mycélium et la formation de structures de reproduction chez ces agents. Également, nous avons identifié et caractérisé des gènes qui encodent des dioxygénases chez les génomes d’O. novo-ulmi H327 et d’O. ulmi W9. De plus, nous avons produit une souche Δppo1 d’O. novo-ulmi pour explorer la fonction de ce gène. Cette transition est probablement modulée par différents mécanismes et voies car la réponse à la manipulation de stimuli variait selon la souche analysée. L’acide salicylique, inhibiteur de cyclooxygénases, réduit la production de mycélium chez les souches testées. Néanmoins, l'acide linoléique a stimulé la formation de mycélium ainsi que la production des structures de reproduction. Aucun gène lox mais deux gènes cox sont présents dans les génomes d’O. novo-ulmi H327 et d’O. ulmi W9. Selon nos résultats, un de ces gènes cox (gène ppo1 ou g7173) ne semble pas lié à la virulence ni aux fonctions essentielles du cycle de vie d’O. novo-ulmi. Toutefois, les mutants Δppo1 produisent moins de mycélium que les souches sauvages en milieu liquide contenant de l’arginine. D’après nos résultats, les cyclooxygénases pourraient être liées au dimorphisme des agents de la MHO. / Elm trees, which are valued for urban landscaping, are threatened by ophiostomatoid fungi causing Dutch elm disease (DED). These fungi are transported passively in the elm xylem as yeast-budding cells and switch to the mycelial form to progress in uninfected vessels. This dimorphism may facilitate colonization of the host, which indicates its possible association with fungal virulence. Several stimuli affect dimorphism, among them lipoxygenase inhibitors. Lipoxygenase (Lox) and cyclooxygenase (Cox) are dioxygenases which catalyze oxylipins from fatty acids. These molecules modulate fungal growth and are possibly involved in dimorphism and virulence in Ophiostoma. The objective of this thesis was to analyze dimorphism of DED agents and verify whether this transition and pathogenesis are modulated by genes that encode dioxygenase enzymes. The effect of different stimuli on dimorphism was examined in ophiostomatoid strains that cause DED. I also verified if linoleic acid induced transition from yeast to mycelium and production of reproductive structures in these agents. In addition, I identified and characterized genes that encode dioxygenases in genomes of O. novo-ulmi H327 and O. ulmi W9. Finally, I produced a Δppo1 strain of O. novo-ulmi to determine the function of this gene. This transition is probably modulated by different mechanisms and pathways since the response to the manipulation of stimuli varied according to the strain analyzed. Salicylic acid, a cyclooxygenase inhibitor, reduced mycelial production in the strains tested. However, linoleic acid stimulated the production of mycelia and reproductive structures. No lox gene but two cox genes are present in the genomes of O. novo-ulmi H327 and O. ulmi W9. According to our results, one of these cox genes (gene ppo1 or g7173) does not seem related to the virulence or essential functions of the O. novo-ulmi life cycle. Nonetheless, the Δppo1 mutants produced less mycelia in liquid medium with arginine compared to the wild-type. As observed with these data, cyclooxygenases could be related to dimorphism of DED agents.

Ce mémoire porte sur l'étude d'une variante d'épissage du cotransporteur humain cation-chlore orphelin (huCCC9a), un membre de la superfamille des cotransporteurs cation-chlore qui compte neuf membres, CCC1 à 7 qui ont pour fonction de transporter les ions Na+ et/ou K+ avec le Cl" à travers les surfaces cellulaires, et CCC8 et 9, dont les substrats ioniques demeurent inconnus à ce jour. Nous avons découvert que huCCC9, bien qu'il appartienne à la famille des CCCs, fait partie d'un groupe plus large de protéines appelé « famille des transporteurs d'acides aminés-polyamines-organocations » (ou APC pour l'acronyme anglais amino acid-polyamine-organocation transporter s). Nous avons donc voulu savoir si huCCC9a est impliqué dans le mouvement transmembranaire (tm) des polyamines d'autant plus que la plupart des cellules animales semblent être capable de promouvoir le transport facilité de tels substrats sans que la nature moléculaire exacte des protéines responsables, contrairement aux organismes unicellulaires, ait pu être déchiffrée. Nos résultats ont montré que huCCC9 permettait le transport de la spermidine > spermine > putrescine. De plus, nous avons aussi trouvé que l'influx de polyamines par CCC9a est augmenté en présence de certains acides aminés, que cet influx est indépendant des ions Na+ , K+ et Cl" et qu'il est inhibé par le furosémide et la pentamidine. Ces résultats revêtent une importance capitale en ce qu'ils correspondent à la première identification faite à ce jour d'un transporteur de polyamine chez les cellules animales et en ce sens qu'il semble exister un lien important entre le métabolisme intracellulaire des polyamines et la carcinogenèse de même qu'entre le gène CCC9a et une maladie appelée psoriasis vulgaris. / Cation-Cl" transporters (CCCs) belong to a large family of proteins that includes nine isoforms: CCC1 to 7, which have been shown to promote Cl" movement along with Na+ and/or K+ movement across cell surfaces, and CCC8 and 9, which have not been ascribed a specific transport function yet. The CCCs are also part of a larger family of proteins that are regrouped under the name amino acid-polyamine-organocation carriers (APC). In contrast to the CCCs, however, proteins involved in polyamine transport have only been isolated from unicellular species and do not necessarily belong to the APC family. In this work, we have found that a splice variant of CCC9 (called CCC9a) probably operates as one such polyamine transporter in higher species given that its expression in HEK-293 cells increases the influx of spermidine > spermine > putrescine at the cell surface and that it is otherwise widely distributed in certain mammals. We have also found that the influx of PAs by CCC9a increases further in the presence of certain amino acids, is Na+ -K+ -Cl"-independent and is inhibited by furosemide and pentamidine. Hence, a group of substrates that are transported by CCC9 as well as the molecular identity of a PA transport System in animal cells have been uncovered through this work for the first lime. These findings are of special interest given that CCC9 has been linked to the development of psoriasis vulgaris in the population and that intracellular PAs play a key role in cellular proliferation.

L’infiltration d’éosinophiles dans la muqueuse bronchique est une caractéristique majeure de l’asthme. Les protéases sont essentielles pour réguler la migration cellulaire du sang vers la muqueuse bronchique. Les travaux présentés dans cette thèse décrivent quelques mécanismes de la modulation de l’activité protéolytique des éosinophiles. Parmi les nombreuses protéases exprimées par l’éosinophile, la métalloprotéinase de la matrice (MMP)-9 et la plasmine générée via la protéine activatrice de type urokinase (uPA) sont cruciales dans la migration de ces cellules dans les tissus. Cette thèse décrit le mécanisme d’action de deux types de médiateurs lipidiques, les cystéinyl-leucotriènes (cysLTs) et l’acide 5-oxo-6,8,11,14-éicosatétraénoïque (5-oxo-ETE), dans le recrutement des éosinophiles. En présence de 5-oxo-ETE, l’éosinophile migre en sécrétant la MMP-9, la plasmine et exprime plus fortement le récepteur de l’uPA (uPAR). Nous avons démontré que les cysLTs sont impliqués dans la migration sans toutefois influencer la protéolyse. Par contre, le montelukast, un antagoniste du récepteur cysLT de type 1 (CysLT1), diminue l’expression d’uPAR, la sécrétion de MMP-9 et la génération de plasmine. Ces résultats suggèrent que le montelukast ne serait pas un antagoniste neutre du CysLT1, mais un agoniste inverse, quoique cette hypothèse doive être confirmée. Ensuite, pour mieux comprendre comment le 5-oxo-ETE induit la sécrétion de protéases, la signalisation sous-jacente a été étudiée. Les travaux démontrent que la protéine kinase C (PKC)-δ, la PKC-ζ, l’extracellular signal-regulated kinase (ERK)-1/ 2 et la p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) jouent un rôle majeur dans la migration induite par le 5-oxo-ETE. Notamment, l’activation d’ERK-1/2 semble dépendre de la présence de plasminogène dans le milieu. La plasmine générée à partir du plasminogène peut activer ERK-1 /2 et ainsi stimuler la sécrétion de MMP-9. Ces résultats démontrent la complexité de la régulation des protéases chez l’éosinophile et documente le rôle primordial des PKC et des MAPK dans cette modulation. / Infiltration of eosinophils into the bronchial mucosa is a key feature in asthma pathology. With the influence of mediators, eosinophils have the capacity to interact with structural cells, modulate their functions, promote airway remodelling, and activate and recruit other inflammatory cells. Proteases are essential to promote cell migration from blood into tissue and interactions with tissue structural cells and extracellular matrix components. This work presents some of the mechanisms modulating eosinophil protease activity, more specifically the production of MMP-9 and plasmin. Herein, we evaluated the mechanism of action of two lipid mediators, the cysteinyl-leukotrienes (cysLTs) and the 5-oxo-ETE, in eosinophil recruitment. 5-Oxo-ETE elicits eosinophil migration by activating MMP-9 secretion, plasmin generation and by increasing uPAR expression. The cysLTs are also implicated in eosinophil migration but not in protease activation. On the other hand, montelukast, a cysLT type 1 receptor antagonist, decreases uPAR expression, MMP-9 secretion and plasmin generation. These results suggest that montelukast is not a neutral antagonist, but an inverse agonist in eosinophils, although this hypothesis needs to be validated. Thereafter, we were interested in signalling induced by 5-oxo-ETE. Our results demonstrated that protein kinase C (PKC)-δ, PKC-ζ, extracellular signal-regulated kinase (ERK)-1/2 and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) play a major role in eosinophil migration. The implication of ERK-1/2 seems to depend on plasminogen presence in the medium. Plasmin generated from plasminogen activates ERK-1/2 and stimulates MMP-9 secretion. These results demonstrate the complex regulation of eosinophil proteases and the essential implication of PKC and MAPK in this process.

Chez les arbres, la formation du bois dépend de la différenciation d'un tissu vasculaire appelé xylème secondaire. Les parois cellulaires du xylème sont riches en lignines, ce qui leur confère rigidité et imperméabilité indispensables au transport de la sève brute et au maintien du port dressé. La xylogénèse requiert la coordination de l'expression de plusieurs centaines de gènes dans le temps et dans l'espace. Cette coordination est assurée au niveau transcriptionnel par différents médiateurs protéiques, parmi lesquels il y a des facteurs de transcription de la famille MYB-R2R3. Peu de gènes de cette sous famille ont été préalablement caractérisés chez les conifères. Mon travail de thèse a consisté dans un premier temps à identifier plusieurs gènes MYBR2R3 potentiellement impliqués dans la formation du xylème chez les conifères, en particulier chez le pin loblolly (Pinus taeda) et l'épinette blanche (Picea glauca), et à réaliser leur caractérisation moléculaire. Différentes analyses phylogénétiques ont permis de mettre en évidence des similarités et des différences significatives dans la structure de cette famille entre les gymnospermes et les angiospermes. L'expression de ces mêmes gènes a été quantifiée par RT-QPCR, ce qui a révélé que PgMYB2, 4 et 8 sont préférentiellement exprimés dans le xylème secondaire de l'épinette et que leurs transcrits s'accumulent dans le bois de compression. La deuxième partie de mon travail a visé la caractérisation fonctionnelle de deux MYB-R2R3 de pin (PtMYBl et 8) réalisée via leur surexpression constitutive chez des transformants stables d'épinette. Ces deux facteurs MYB induisent une lignification ectopique cependant plus intense avec PfMYB8, qui bloque le développement normal des racines et conduit à la mort des plantules in vitro. L'analyse du transcriptome des plantules transgéniques par biopuces à ADN a dévoilé entre autres, l'augmentation de l'expression des gènes de la synthèse des lignines. La dernière partie de ma thèse est consacrée à la caractérisation fonctionnelle de PtMYBM placé en parallèle sous le contrôle d'un promoteur constitutif et d'un promoteur préférentiel du xylème (gène codant l'alcool cinnamylique deshydrogénase). Les plantules transgéniques ont une synthèse accrue de plusieurs terpènes et produisent de nombreux transcrits potentiellement associés aux mécanismes de défense. / In trees, wood formation depends on the differentiation of a vascular tissue refered to as secondary xylem. Xylem cell walls are rich in lignins, which confer stiffness and impermeability, properties essential for the mechanical support of the tree and for the transport of water and minerals. Xylogenesis requires the coordinated expression of several hundred genes in time and space. The regulation of gene expression is controled at the transcriptional level by different protein mediators, including transcription factors of the R2R3-MYB family. Hitherto, very few genes of this sub-family have been characterized, specially in conifers. The first part of my thesis consists in the identification and molecular characterization of several genes belonging to this family and potentially involved in xylem formation in conifers, particularly in loblolly pine (Pinus taeda) and white spruce (Picea glauca). Phylogenetic analyses highlight the major similarities as well as significant differences in the MYB family structure between gymnosperms (trees) and angiosperms (herbaceous plants and trees). I used qRT-PCR to determine transcript levels of these genes and assess their expression profiles in spruce. The data showed that the spruce transcripts for PgMYB2, 4 and 8 accumulate preferentially in secondary xylem and are upregulated in compression wood. The second part of my work aimed the functional characterization of two pine R2R3-MYB (PtMYBl and 8) via their constitutive overexpression in stable spruce transformants. The overexpression of both of these MYB transcription factors led to ectopic lignification. However, the overexpression of PtMYB8 led to a more intense lignification; it also prevented normal root development leading to the death of the in vitro plantlets. Microarrays analyses of the transgenic plantlets showed that there was a significant upregulation of many lignin biosynthesis genes, among others. The final section of my thesis describes the functional characterization of PtMYB14 based on its overexpression with either a constitutive promoter or a xylem-preferential promoter (gene coding for the cinnanyl alcohol dehydrogenase). Both types of transgenics plantlets accumulated several terpenes compounds and produced numerous transcripts potentially involved in defence mechanisms.