Cette thèse porte sur l'étude de la structure du peptide amyloïde-p (AP) (25-35) et de ses interactions avec des membranes. L'Ap (25-35) est la séquence cytotoxique de l'Ap (1-40/42), soit le peptide parent majoritairement impliqué dans la formation de plaque senile extracellulaire dans la maladie d'Alzheimer. L'Ap fut proposé être au centre de la problématique, reliée à l'agrégation pathogène. L'implication des membranes est une aire émergente et moins explorée jusqu'à maintenant. Les objectifs de cette thèse furent de caractériser la structure de l'Ap (25-35) en fonction de diverses conditions physico-chimiques, en absence et en présence de membranes. Nous avons également proposé un rôle protecteur du cholestérol dans ces interactions. Nous avons donc utilisé diverses méthodes biophysiques dans le but de mieux définir l'Ap (25-35) à titre de cible thérapeutique potentielle. • Nous avons montré que l'agrégation de l'Ap (25-35) dépend de la concentration et est favorisée à pH physiologique et faible force ionique. Le peptide interagit avec les membranes de PC, PG et PC/PG et une désagrégation partielle de l'Ap (25-35) en résulte. L'Ap (25-35) n'induit que peu de pores membranaires. Le peptide se présente majoritairement en structure de feuillets-p intermoléculaires antiparallèles et de protofilaments. La présence d'un coude-p de type II est proposée près des résidus en N-terminal. Le peptide se désagrège dans le temps, mais l'interaction membranaire prévient ce phénomène. L'Ap (25-35) montre une structure étendue dans son domaine hydrophobe et le registre des brins-p optimise l'interaction hydrophobe. Le peptide interagit différemment avec les membranes selon sa concentration. La présence d'une haute teneur en cholestérol atténue les effets membranaires de l'Ap (25-35) et une réduction protège tout autant les membranes. Le peptide interagit en surface, au niveau des têtes polaires des lipides et nous avons proposé que l'axe moléculaire des protofilaments soit parallèle au plan de la membrane. / This thesis reports the study of the structure of the amyloid-p (AP) (25-35) and its interactions with membranes. This peptide is the cytotoxic sequence of the parent peptide Ap (1-40/42), mostly found in the extracellular deposits responsible for the senile plaque formation typical of Alzheimer's disease. The Ap peptide was proposed to be at the core of the problematic related to pathogenic aggregation. The involvement of membranes is a new and less explorated area so far. The main objective of this thesis was to characterize the* structure of the AP (25-35) peptide as a function of many physico-chemical conditions, in the absence and in the presence of membranes. We have also explored the protective role of cholesterol in these interactions. To do so, we have used several biophysical techniques in the aim to better define the Ap (25-35) peptide as a potential therapeutic target. We have shown that the aggregation of the AP (25-35) peptide depends on concentration and is favored at physiological pH and at low ionic strength. The peptide interacts with membranes made of PC, PG and PC/PG and this interaction results in a partial disaggregation of the peptide. The Ap (25-35) peptide does not significantly induce pore formation in membranes. The peptide is structured mostly as intermolecular antiparallel p-sheets and as protofilaments. The presence of a type II p-turn is proposed in the N-terminal region. The peptide disaggregates as a function of time, but this trend is hindered by the interaction with membranes. The Ap (25-35) peptide shows an extended structure in its hydrophobic domain and the register of the p-strands optimizes the hydrophobic interactions. The peptide interacts differently with membranes as a function of concentration. The presence of a high amount of cholesterol attenuates the membrane effects of the peptide and a reduced amount also protects the membranes in the same extent. The AP (25-35) peptide interacts at the surface of the membranes, especially with the lipid polar head groups and we propose that the molecular axis of the protofilaments is basically parallel to the plane of the membrane.

Le traitement des nouveau-nés prématurés représente un défi de taille en médecine pédiatrique. Plusieurs évidences indiquent que ces enfants ne pourront compléter leur développement alvéolaire. L'importance des facteurs mécaniques en tant que régulateurs de l'alvéolisation est de plus en plus évidente. L'oligoamnios réduit la distension à l'intérieur du poumon, résultant en une hypoplasie pulmonaire alors que l'augmentation de la distension induite par l'occlusion trachéale (OT) foetale stimule le développement pulmonaire de façon significative. L'OT est une technique intéressante pour l'étude du développement pulmonaire, mais son caractère invasif rend souhaitable son remplacement par une approche pharmacologique. Le postulat à la base de nos travaux est qu'une accentuation des forces d'étirements du tissu pulmonaire en fin de gestation accélère le développement pulmonaire selon un patron mimant celui du développement pulmonaire normal et que l'élucidation des mécanismes biomoléculaires impliqués rendra possible la modulation du développement pulmonaire. J'ai participé à l'identification de processus biomoléculaires impliqués dans le développement pulmonaire accéléré par TOT. Je devais ensuite cibler un sentier de signalisation ayant un apport potentiel à la réponse aux changements de tensions intra-luminales et évaluer son rôle fonctionnel en inhibant ou en stimulant son activité in vivo. Nous avons travaillé avec le modèle de souris foetales. L'oligoamnios a été provoqué par ponction utérine à 14,5 jours de gestation et les poumons des foetus ont été récoltés 72 heures plus tard. L'OT a été effectuée chez la souris à 16,5 jours de gestation et les poumons des foetus ont été récoltés 3 ou 24 heures plus tard. Dans un sous-groupe, du fasudil, un inhibiteur des Rho kinases (ROCKs), a été injecté de façon intra-péritonéale à des femelles à 16 jours de gestation. Le facteur nécrosant cytotoxique 1 (CNF1 : cytotoxic m necrotizing factor 1) a été utilisé afin de stimuler le membre A de la famille de gène homologue de Ras (RhoA : Ras homolog gene family, member A), un important régulateur positif de l'activité des ROCKs. Le plasmide contenant CNF1 et la glutathione S-transférase a été inséré et amplifié dans E. coli BL21. Suite à son induction par l'IPTG (isopropyl (3-D-l-thiogalactopyranoside), la protéine de fusion a pu être isolée sur une colonne glutathione sépharose puis injectée dans le liquide amniotique à 16,5 jours de gestation. Les poumons ont été récoltés 24 heures après l'injection. L'expression des ROCKs (ROCK1, ROCK2) et a-actine (a-smooth muscle actin ; a-SMA) a été évaluée par immunobuvardage et le développement pulmonaire a été évalué par la mesure du nombre de générations de saccules alvéolaires. Nous avons démontré au cours des dernières années que l'un des effets les plus importants de l'OT est de favoriser l'expression des gènes du cytosquelette. Nous avons confirmé que l'expression de l'a-actine est accrue très rapidement suite à TOT. De plus, nous avons démontré que l'expression de ROCK2, un important régulateur du cytosquelette d'actine, varie en fonction du niveau de distension intra-luminale pulmonaire. En effet, son expression est diminuée dans le modèle d'oligoamnios alors qu'elle est rapidement augmentée suite à l'OT. L'inhibition de l'activité de ROCK par le fasudil inhibe l'effet bénéfique de l'OT sur le développement pulmonaire. Enfin, la stimulation de RhoA par CNF1 favorise la génération de voies aériennes distales d'une façon similaire à l'OT. En conclusion, la modulation du développement pulmonaire par l'inhibiteur de ROCK2 et de l'activateur de RhoA indique que le sentier RhoA/ROCK joue un rôle critique en tant que mécanosenseur dans le développement pulmonaire foetal.

Ce mémoire porte sur l'étude d'une variante d'épissage du cotransporteur humain cation-chlore orphelin (huCCC9a), un membre de la superfamille des cotransporteurs cation-chlore qui compte neuf membres, CCC1 à 7 qui ont pour fonction de transporter les ions Na+ et/ou K+ avec le Cl" à travers les surfaces cellulaires, et CCC8 et 9, dont les substrats ioniques demeurent inconnus à ce jour. Nous avons découvert que huCCC9, bien qu'il appartienne à la famille des CCCs, fait partie d'un groupe plus large de protéines appelé « famille des transporteurs d'acides aminés-polyamines-organocations » (ou APC pour l'acronyme anglais amino acid-polyamine-organocation transporter s). Nous avons donc voulu savoir si huCCC9a est impliqué dans le mouvement transmembranaire (tm) des polyamines d'autant plus que la plupart des cellules animales semblent être capable de promouvoir le transport facilité de tels substrats sans que la nature moléculaire exacte des protéines responsables, contrairement aux organismes unicellulaires, ait pu être déchiffrée. Nos résultats ont montré que huCCC9 permettait le transport de la spermidine > spermine > putrescine. De plus, nous avons aussi trouvé que l'influx de polyamines par CCC9a est augmenté en présence de certains acides aminés, que cet influx est indépendant des ions Na+ , K+ et Cl" et qu'il est inhibé par le furosémide et la pentamidine. Ces résultats revêtent une importance capitale en ce qu'ils correspondent à la première identification faite à ce jour d'un transporteur de polyamine chez les cellules animales et en ce sens qu'il semble exister un lien important entre le métabolisme intracellulaire des polyamines et la carcinogenèse de même qu'entre le gène CCC9a et une maladie appelée psoriasis vulgaris. / Cation-Cl" transporters (CCCs) belong to a large family of proteins that includes nine isoforms: CCC1 to 7, which have been shown to promote Cl" movement along with Na+ and/or K+ movement across cell surfaces, and CCC8 and 9, which have not been ascribed a specific transport function yet. The CCCs are also part of a larger family of proteins that are regrouped under the name amino acid-polyamine-organocation carriers (APC). In contrast to the CCCs, however, proteins involved in polyamine transport have only been isolated from unicellular species and do not necessarily belong to the APC family. In this work, we have found that a splice variant of CCC9 (called CCC9a) probably operates as one such polyamine transporter in higher species given that its expression in HEK-293 cells increases the influx of spermidine > spermine > putrescine at the cell surface and that it is otherwise widely distributed in certain mammals. We have also found that the influx of PAs by CCC9a increases further in the presence of certain amino acids, is Na+ -K+ -Cl"-independent and is inhibited by furosemide and pentamidine. Hence, a group of substrates that are transported by CCC9 as well as the molecular identity of a PA transport System in animal cells have been uncovered through this work for the first lime. These findings are of special interest given that CCC9 has been linked to the development of psoriasis vulgaris in the population and that intracellular PAs play a key role in cellular proliferation.

L’infiltration d’éosinophiles dans la muqueuse bronchique est une caractéristique majeure de l’asthme. Les protéases sont essentielles pour réguler la migration cellulaire du sang vers la muqueuse bronchique. Les travaux présentés dans cette thèse décrivent quelques mécanismes de la modulation de l’activité protéolytique des éosinophiles. Parmi les nombreuses protéases exprimées par l’éosinophile, la métalloprotéinase de la matrice (MMP)-9 et la plasmine générée via la protéine activatrice de type urokinase (uPA) sont cruciales dans la migration de ces cellules dans les tissus. Cette thèse décrit le mécanisme d’action de deux types de médiateurs lipidiques, les cystéinyl-leucotriènes (cysLTs) et l’acide 5-oxo-6,8,11,14-éicosatétraénoïque (5-oxo-ETE), dans le recrutement des éosinophiles. En présence de 5-oxo-ETE, l’éosinophile migre en sécrétant la MMP-9, la plasmine et exprime plus fortement le récepteur de l’uPA (uPAR). Nous avons démontré que les cysLTs sont impliqués dans la migration sans toutefois influencer la protéolyse. Par contre, le montelukast, un antagoniste du récepteur cysLT de type 1 (CysLT1), diminue l’expression d’uPAR, la sécrétion de MMP-9 et la génération de plasmine. Ces résultats suggèrent que le montelukast ne serait pas un antagoniste neutre du CysLT1, mais un agoniste inverse, quoique cette hypothèse doive être confirmée. Ensuite, pour mieux comprendre comment le 5-oxo-ETE induit la sécrétion de protéases, la signalisation sous-jacente a été étudiée. Les travaux démontrent que la protéine kinase C (PKC)-δ, la PKC-ζ, l’extracellular signal-regulated kinase (ERK)-1/ 2 et la p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) jouent un rôle majeur dans la migration induite par le 5-oxo-ETE. Notamment, l’activation d’ERK-1/2 semble dépendre de la présence de plasminogène dans le milieu. La plasmine générée à partir du plasminogène peut activer ERK-1 /2 et ainsi stimuler la sécrétion de MMP-9. Ces résultats démontrent la complexité de la régulation des protéases chez l’éosinophile et documente le rôle primordial des PKC et des MAPK dans cette modulation. / Infiltration of eosinophils into the bronchial mucosa is a key feature in asthma pathology. With the influence of mediators, eosinophils have the capacity to interact with structural cells, modulate their functions, promote airway remodelling, and activate and recruit other inflammatory cells. Proteases are essential to promote cell migration from blood into tissue and interactions with tissue structural cells and extracellular matrix components. This work presents some of the mechanisms modulating eosinophil protease activity, more specifically the production of MMP-9 and plasmin. Herein, we evaluated the mechanism of action of two lipid mediators, the cysteinyl-leukotrienes (cysLTs) and the 5-oxo-ETE, in eosinophil recruitment. 5-Oxo-ETE elicits eosinophil migration by activating MMP-9 secretion, plasmin generation and by increasing uPAR expression. The cysLTs are also implicated in eosinophil migration but not in protease activation. On the other hand, montelukast, a cysLT type 1 receptor antagonist, decreases uPAR expression, MMP-9 secretion and plasmin generation. These results suggest that montelukast is not a neutral antagonist, but an inverse agonist in eosinophils, although this hypothesis needs to be validated. Thereafter, we were interested in signalling induced by 5-oxo-ETE. Our results demonstrated that protein kinase C (PKC)-δ, PKC-ζ, extracellular signal-regulated kinase (ERK)-1/2 and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) play a major role in eosinophil migration. The implication of ERK-1/2 seems to depend on plasminogen presence in the medium. Plasmin generated from plasminogen activates ERK-1/2 and stimulates MMP-9 secretion. These results demonstrate the complex regulation of eosinophil proteases and the essential implication of PKC and MAPK in this process.

Chez les arbres, la formation du bois dépend de la différenciation d'un tissu vasculaire appelé xylème secondaire. Les parois cellulaires du xylème sont riches en lignines, ce qui leur confère rigidité et imperméabilité indispensables au transport de la sève brute et au maintien du port dressé. La xylogénèse requiert la coordination de l'expression de plusieurs centaines de gènes dans le temps et dans l'espace. Cette coordination est assurée au niveau transcriptionnel par différents médiateurs protéiques, parmi lesquels il y a des facteurs de transcription de la famille MYB-R2R3. Peu de gènes de cette sous famille ont été préalablement caractérisés chez les conifères. Mon travail de thèse a consisté dans un premier temps à identifier plusieurs gènes MYBR2R3 potentiellement impliqués dans la formation du xylème chez les conifères, en particulier chez le pin loblolly (Pinus taeda) et l'épinette blanche (Picea glauca), et à réaliser leur caractérisation moléculaire. Différentes analyses phylogénétiques ont permis de mettre en évidence des similarités et des différences significatives dans la structure de cette famille entre les gymnospermes et les angiospermes. L'expression de ces mêmes gènes a été quantifiée par RT-QPCR, ce qui a révélé que PgMYB2, 4 et 8 sont préférentiellement exprimés dans le xylème secondaire de l'épinette et que leurs transcrits s'accumulent dans le bois de compression. La deuxième partie de mon travail a visé la caractérisation fonctionnelle de deux MYB-R2R3 de pin (PtMYBl et 8) réalisée via leur surexpression constitutive chez des transformants stables d'épinette. Ces deux facteurs MYB induisent une lignification ectopique cependant plus intense avec PfMYB8, qui bloque le développement normal des racines et conduit à la mort des plantules in vitro. L'analyse du transcriptome des plantules transgéniques par biopuces à ADN a dévoilé entre autres, l'augmentation de l'expression des gènes de la synthèse des lignines. La dernière partie de ma thèse est consacrée à la caractérisation fonctionnelle de PtMYBM placé en parallèle sous le contrôle d'un promoteur constitutif et d'un promoteur préférentiel du xylème (gène codant l'alcool cinnamylique deshydrogénase). Les plantules transgéniques ont une synthèse accrue de plusieurs terpènes et produisent de nombreux transcrits potentiellement associés aux mécanismes de défense. / In trees, wood formation depends on the differentiation of a vascular tissue refered to as secondary xylem. Xylem cell walls are rich in lignins, which confer stiffness and impermeability, properties essential for the mechanical support of the tree and for the transport of water and minerals. Xylogenesis requires the coordinated expression of several hundred genes in time and space. The regulation of gene expression is controled at the transcriptional level by different protein mediators, including transcription factors of the R2R3-MYB family. Hitherto, very few genes of this sub-family have been characterized, specially in conifers. The first part of my thesis consists in the identification and molecular characterization of several genes belonging to this family and potentially involved in xylem formation in conifers, particularly in loblolly pine (Pinus taeda) and white spruce (Picea glauca). Phylogenetic analyses highlight the major similarities as well as significant differences in the MYB family structure between gymnosperms (trees) and angiosperms (herbaceous plants and trees). I used qRT-PCR to determine transcript levels of these genes and assess their expression profiles in spruce. The data showed that the spruce transcripts for PgMYB2, 4 and 8 accumulate preferentially in secondary xylem and are upregulated in compression wood. The second part of my work aimed the functional characterization of two pine R2R3-MYB (PtMYBl and 8) via their constitutive overexpression in stable spruce transformants. The overexpression of both of these MYB transcription factors led to ectopic lignification. However, the overexpression of PtMYB8 led to a more intense lignification; it also prevented normal root development leading to the death of the in vitro plantlets. Microarrays analyses of the transgenic plantlets showed that there was a significant upregulation of many lignin biosynthesis genes, among others. The final section of my thesis describes the functional characterization of PtMYB14 based on its overexpression with either a constitutive promoter or a xylem-preferential promoter (gene coding for the cinnanyl alcohol dehydrogenase). Both types of transgenics plantlets accumulated several terpenes compounds and produced numerous transcripts potentially involved in defence mechanisms.

Le produit pharmaceutique Taxol® a pour principe actif une molécule synthétisée chez le genre Taxus, le paclitaxel. L'espèce qui peuple nos forêts, le Taxus canadensis Marsh., possède une deuxième molécule d'intérêt pour l'industrie, le DHB. À cet effet, nous avons démontré que les teneurs ainsi que la synthèse hebdomadaire de ces molécules appelées taxanes fluctuent au cours de la saison et d'une année à l'autre. Le stade phénologique représenté par la fin de la croissance en longueur des rameaux apicaux est le moment où les taxanes sont à leur plus forte teneur dans la biomasse. Ce projet a confirmé la possibilité d'induire in vivo la synthèse des taxanes dans les parties aériennes en croissance par l'application de 15 000

L'effet à court terme de la disponibilité en azote sur la formation du bois a été étudié chez le peuplier hybride. Les analyses ont été menées sur de jeunes arbres cultivés en serres et qui répondent rapidement à la fertilisation avec différentes concentrations de nitrate d'ammonium. Les arbres ayant reçu un apport élevé d'azote (10 mM) ont produit des fibres de xylème plus courtes (+ 18%) et au diamètre plus larges (+ 17%) dont la paroi cellulaire est plus épaisse par rapport aux témoins (apport d'azote 1 mM). Des colorations histologiques suggèrent que ces fibres accumulent moins de lignines et produisent une paroi enrichie en cellulose. Des variations dans la composition du bois ont aussi été mises en évidence par microspectrophotométrie FT-IR. Des analyses du bois ont donc été entreprises pour déterminer plus précisément le contenu en lignines et pour caractériser la structure des lignines qui sont déposées. Les arbres fortement fertilisés en azote produisent un bois dont la teneur en lignines est inférieure à celle des témoins (diminution de 100/0) d'après la méthode au bromure d'acétyle, mais pas selon la méthode e Klason. Par contre, la structure des lignines semble nettement affectée par l'apport élevé d'azote: on observe une diminution de la fréquence des liaisons β-O-4 et du rapport SIG, ainsi qu'une augmentation de la fréquence des unités H, des esters p-OH benzoïques et des unités G à groupe phénolique libre. Ces caractéristiques sont similaires à celles des lignines de peuplier formées lors des premiers stades de lignification. La fertilisation azotée affecte le taux de cellulose des parois ainsi que l'expression de gènes associés à la mise en place de la paroi. Des analyses réalisées pendant 28 jours de fertilisation ont montré une accumulation rapide des transcrits d'enzymes impliquées dans l'incorporation de nucléotides de sucres en réponse à l'azote. Au contraire, les transcrits de certains gènes participant à la lignification étaient moins abondants. Nos données suggèrent qu'une fertilisation azotée élevée modifie la formation des fibres du xylème de peuplier en leur donnant des caractéristiques similaires à celles des fibres de bois juvénile et de bois de tension.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Cette étude vise à comprendre les facteurs impliqués dans la liaison membranaire de la recoverine, une neuroprotéine sensible au calcium jouant un rôle dans le processus de phototransduction visuelle des photorécepteurs. Il est connu que la liaison de 2 ions calcium par les motifs EF-Hand de cette protéine entraîne l'extrusion de son groupement myristoyle et ainsi, son recrutement aux membranes et l'inhibition de la protéine qu'elle régule. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire des solides ont été utilisées afin d'étudier le rôle méconnu de la composition membranaire des photorécepteurs sur la liaison de la recoverine, en plus du rôle du calcium et de la N-myristoylation. Les résultats obtenus suggèrent que la présence de calcium ainsi que de membranes insaturées favorisent significativement à la fois la stabilité structurale de la recoverine et l'insertion de son groupement myristoyle dans les membranes.

Les souches Lactobacillus rhamnosus RW-9595M et ATCC 9595 possèdent 17 cadres de lecture ouverts (ORF) identiques à 99 % identifiés comme gènes de biosynthèse putatifs des EPS. Par contre, les quantités produites diffèrent avec 543 mg l-1 pour RW-9595M et 108 mg l-1 pour ATCC 9595. La phosphorylation réversible a été proposée comme mécanisme pour réguler la polymérisation des EPS chez les bactéries lactiques. Parmi les protéines participant à la polymérisation, on propose la tyrosine kinase, la tyrosine phosphatase et la co-polymérase. Cette étude cherche à démontrer l’impact de la phosphorylation de ces protéines, surtout la co-polymérase (Wzd), sur le complexe de ces protéines chez L. rhamnosus. Afin de tester l’effet de la phosphorylation sur leurs interactions, Wzd (co-polymérase) et Wze (kinase) ont été exprimées chez L. lactis ou chez E. coli. Chez L. lactis ssp. cremoris, certaines combinaisons de gènes peuvent être associées à la production d'EPS in vivo. Chez E. coli, l'expression des gènes peut être contrôlée, permettant d'exprimer et de purifier des protéines dans le but d'effectuer l'étude de leurs interactions in vitro. Les clones de la souche L. lactis ssp. cremoris MG1363 (naturellement non productrice d’EPS) transformée avec l’opéron EPS de RW-9595M ou ATCC 9595 produisent respectivement 326 et 302 mg l-1, mais avec des rendements inférieurs à la production chez la souche d'origine RW-9595M. Lors des essais in vitro, Wzd et Wze ne s’autophosphorylent pas lorsqu'elles sont seules, mais ensemble elles forment un complexe. Le complexe entre ces deux protéines non phosphorylées permet la phosphorylation de Wzd par Wze en présence d’ATP. Wze est libérée par la déstabilisation de cette interaction suivant la phosphorylation. L’existence de Wzd phosphorylée et de l’ATP conduit à l’auto-phosphorylation de Wze par une interaction transitoire. De plus, l’activité de Wzd est modulée par la phosphorylation des tyrosines en permettant l’autophosphorylation de Wze. Or, la phosphorylation de Wzd peut être une étape de phosphorylation réversible pour la polymérisation des EPS. Cette étude contribue à la compréhension de la relation entre les caractéristiques et les fonctions biologiques des polymères d'EPS. / Lactobacillus rhamnosus RW-9595M and ATCC 9595 have 99 % identical 17 open reading frames (ORFs) identified as putative genes coding for EPS biosynthesis and both strains produce very different EPS amounts: 543 mg l-1 (RW-9595M) and 108 mg l-1 (ATCC 9595). Reversible phosphorylation has been proposed as a mechanism to regulate the polymerization of EPS in lactic acid bacteria and three proteins, tyrosine kinase, tyrosine phosphatase and co-polymerase are proposed to be responsible for this regulation. The aim of this project was to demonstrate the impact of the phosphorylation of these proteins, especially the co-polymerase (Wzd), on the protein complex for EPS polymerization in L. rhamnosus. To test the effect of phosphorylation on their interactions, Wzd and Wze were expressed in L. lactis subsp. cremoris and E. coli. In L. lactis subsp. cremoris, the presence of certain combinations of genes can be associated with EPS production yields. In E. coli, gene expression can be controled and the proteins purified in order to study their interactions and phosphorylation state in vitro. Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363, a non EPS-producing strain, was transformed with two recombinant plasmids coding for the genes required for EPS synthesis. These transformants with operons from either RW-9595M or ATCC 9595 produce 326 and 302 mg l-1 respectively, with lower yields than RW-9595M. The proteins encoded by wzd and wze are respectively the co-polymerase and the kinase which theoretically participate in determining the chain length of the EPS. These two proteins do not autophosphorylate when they are alone, but together form a complex. The non-phosphorylated complex of two proteins allows the phosphorylation of Wzd by Wze, in the presence of ATP. This phosphorylation destabilizes the protein interaction with Wze. The transient interaction with phosphorylated Wzd leads to autophosphorylation of Wze in the presence of ATP. In addition, the activity of Wzd is modulated by tyrosine phosphorylation allowing autophosphorylation of Wze. Thus, the phosphorylation of Wzd may be an additional step of reversible phosphorylation for polymerization of EPS. This study may help advance our understanding of the relationship between the characteristics and biological functions of these polymers.

Les gènes Mekl et Mekl codent pour les activateurs des MAPK ERK1 et ERK2. Afin de déterminer la fonction de ces deux activateurs dans la voie ERK/MAPK lors du développement embryonnaire, les gènes Mekl et Mek2 ont été inactivés chez la souris. Les embryons Mekl ''' meurent à mi-gestation d'une malformation du placenta caractérisée par une sous-vascularisation du labyrinthe, région du placenta impliquée dans les échanges nutritionnels et gazeux foeto-maternels. Les souris Mek2 ~'~ sont viables et fertiles et ne présentent aucun phénotype. Afin d'évaluer le rôle possible du gène Mekl lors du développement embryonnaire, les deux mutations ont été introduites chez les mêmes individus. De façon inattendue, les souris Mekl +/" : Mek2 +/ ~ présentent une diminution du taux de survie de 90%. Les souris Mekl +/ ~ : Mekl +/ ~ meurent durant la gestation à partir du jour 14.5. L'analyse phénotypique montre un problème au niveau de la prolifération, responsable de la diminution de la taille du placenta. Un problème au niveau de la vascularisation du placenta est également observé. L'analyse des génotypes montre que la mort des embryons est causée par un problème qui se situe au niveau des structures extra-embryonnaires. Ces résultats suggèrent que la perte de deux allèles du gène Mekl a moins d'impact sur le développement embryonnaire que la perte d'un allèle de chaque gène Mek, suggérant un rôle important de Mekl lors du développement. Des analyses montrent également que le phénotype au niveau du placenta s'aggrave avec l'augmentation du nombre d'allèles mutés Mek. Ce phénomène pourrait s'expliquer par un effet de dosage des gènes Mek. Un allèle Mekl hypomorphe a été généré ainsi qu'un allèle conditionnel. Ces nouveaux allèles ont servis à tester cette hypothèse. Les phénotypes des différents mutants ont été caractérisés et sont présentés. / MEKl and MEK2 are dual-specificity kinases that activate the extracellular signal - regulated kinase (ERK) mitogen-activated protein (MAP) kinases upon agonist binding to receptors. To determine the function of Mekl and Mek2 during embryonic development, we inactivated each Mek gene in the mouse. Mekl'1 ' embryos died at 10.5 days of gestation. Histopathological analyses revealed a reduction in vascularization of the placenta that is due to a marked decrease of vascular endothelial cells in the labyrinthine region. Mekl''' mice are viable and fertile, and they do not present flagrant morphological alteration. To determine the role of each Mek gene during embryonic development, we introduced both mutations in the same mouse. Surprisily, 90% of the Mekl+/ ~ : Mekl+/ ~ mice died before birth. Histopathological analyses suggest a problem with the vascularization of the placenta and the proliferation of the trophoblasts in the labyrinth. Genotyping analyses revealed that embryos die due to a problem with the extra-embryonic structures. The results show that the loss of two alleles of Mekl gene is less important for the embryo development than the loss of one allele of each Mek gene suggesting an important role of Mekl in embryo development. Our data also indicate that the expressivity of the placental phenotype increases with the number of mutated Mek alleles. This can be explained by a gene dosage effect of the Mek genes. We have also generated an Mekl hypomorph allele and a conditional allele. Those alleles will be used to test this hypothesis. The characterization of the phenotype for each mutant will be presented.