L'asthme est une maladie inflammatoire chronique des voies aériennes dont l'incidence a augmenté dramatiquement au cours de ces deux dernières décennies. Chez les individus sensibles, cette inflammation induit des épisodes de sifflements récurrents, une oppression thoracique, une sécrétion de mucus ainsi qu'une obstruction des voies respiratoires, un recrutement éosinophilique et une hyperréactivité broncho-pulmonaire (HRB). Les avancées dans la compréhension de la physiopathologie de l'asthme ont été réalisées grâce aux modèles expérimentaux murins. Ces travaux ont mis en évidence le rôle de différentes cellules dans l'immunorégulation de l'inflammation bronchique, notamment les lymphocytes T de type Th2. Toutefois, les mécanismes immunologiques impliqués dans la protection ou l'exacerbation de la maladie sont encore peu connus. Au cours de notre étude, nous avons mis en évidence l'influence de cellules Natural Killer T invariantes (iNKT) dans le développement de l'asthme allergique expérimental. Les cellules iNKT représentent une population immunorégulatrice de lymphocytes T, caractérisée par l'expression d'une chaîne alpha invariante du TCR (Va14Ja18 et Va24Ja18, respectivement chez la souris et chez l'homme) qui est positivement sélectionnée par la molécule CD1d. Ces cellules synthétisent rapidement et massivement de nombreuses cytokines, comme l'IL-4 et l'IFN-g, lorsqu'elles sont simulées par l'a-galactosylcéramide (a-GalCer), glycolipide reconnu spécifiquement par les lymphocytes iNKT. Le spectre d'action attribué aux cellules iNKT est particulièrement large. Elles sont impliquées dans le contrôle des réponses immunes contre des infections, des maladies autoimmunes, des modèles de contact de sensibilité et des tumeurs.<br /><br />En utilisant un modèle où les souris sont immunisées de façon systémique par l'ovalbumine (OVA) et ensuite stimulées au niveau des voies aériennes par ce même antigène (étape désignée comme « challenge »), nous avons démontré que les cellules iNKT sont impliquées dans la sévérité de l'asthme allergique expérimental. En effet, divers symptômes de l'asthme sont diminués chez les souris déficientes en cellules iNKT (Ja18-/-), notamment, l'inflammation éosinophilique, la production de cytokines de type Th2, comme l'IL-4 et l'IL-5, la sécrétion d'IgE et l'HRB. L'implication des cellules iNKT dans la sévérité de l'asthme a été confirmée puisque le transfert adoptif des cellules iNKT à des souris Ja18-/- rétablit les symptômes décrits ci-dessus. <br /><br />En nous basant sur ces résultats, nous nous sommes demandés si nous pourrions modifier la sévérité de l'asthme allergique en agissant sur les lymphocytes iNKT. Pour cela, nous avons traité des souris par l'a-GalCer. Nous avons ainsi démontré qu'une seule injection d'a-GalCer 1 h avant le premier challenge intranasal à des souris précédemment immunisées inhibait la totalité des symptômes de l'asthme. L'administration intranasal de l'a-GalCer inhibe les symptômes de l'asthme chez les souris immunisées et provoquées par l'OVA. Cette protection peut être transférée chez des souris immunisées grâce à des cellules en provenance de souris traitées par l'a-GalCer. L'implication de l'IFN-g dans cette protection a été mise en évidence par des anticorps neutralisants, ainsi que par le transfert de cellules iNKT en provenance de souris IFN-g-/-. <br /><br />En conclusion, nos résultats démontrent que les cellules iNKT sont impliquées dans la sévérité de l'asthme allergique expérimental en activant la sécrétion de cytokines de type Th2 et que le traitement par l'a-GalCer, qui agit spécifiquement sur les lymphocytes iNKT, inhibe le développement de la maladie en induisant la sécrétion d'IFN-g. Ainsi, nos résultats suggèrent que l'a-GalCer pourrait constituer un nouvel outil thérapeutique dans le traitement de l'asthme allergique.

Les maladies allergiques sont en constante augmentation tant en prévalence qu'en gravité. Les mécanismes physiopathologiques connus impliquent l'induction d'une réponse Th2 par les cellules dendritiques, conduisant à une production d'IgE et une inflammation. L'immunité innée a récemment été mise en avant dans le contrôle de l'immunité adaptative, spécifique de l'antigène. Cependant, le rôle des cellules Natural Killer (NK), cellules de l'immunité innée connues essentiellement pour leurs fonctions anti-tumorales et anti-microbiennes, est encore inconnu dans la pathologie allergique. Néanmoins, quelques études ont montré une modification de certaines sous-populations de cellules NK chez les patients asthmatiques allergiques. Le but général du travail de thèse était d'étudier le rôle des cellules NK dans l'asthme allergique. Dans un premier temps, les variations quantitatives et qualitatives des cellules NK, ainsi que l'effet de leur déplétion ont été évalués dans l'asthme expérimental. Dans un deuxième temps, l'effet de CCL18, chimiokine impliquée dans l'asthme allergique, a été étudié sur les cellules NK de sujets non allergiques et de sujets allergiques. Tout d'abord, le premier modèle murin d'asthme expérimental utilisé était celui très largement décrit chez les souris BALB/cByJ, consistant en deux sensibilisations systémiques d'ovalbumine (OVA) et d'alum suivies de trois provocations allergéniques d'OVA par aérosols. Chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, une augmentation du nombre de précurseurs de cellules NK, mais également du nombre de cellules NK, et plus particulièrement des cellules NK immatures, a été observé dans les ganglions médiastinaux (ganglions drainant les poumons). Celle-ci était accompagnée d'une augmentation du pourcentage de cellules NK ayant incorporé du BrdU. Outre ces variations quantitatives, nous avons également montré que les cellules NK étaient activées. Dans les poumons, le nombre de cellules NK n'était pas significativement modifié chez les souris sensibilisées et challengées à l'OVA comparativement aux souris contrôle. Néanmoins, une diminution non significative du nombre de cellules NK, et plus particulièrement des cellules NK les plus matures chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA a été observée. De plus, comme dans les ganglions médiastinaux, les cellules NK pulmonaires étaient activées. Nous avons ensuite évalué l'effet de la déplétion des cellules NK par administration de l'anticorps anti-ASGM1 avant les provocations allergéniques sur l'inflammation pulmonaire allergique. Chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, la déplétion en cellules NK diminuait significativement l'éosinophilie dans les lavages bronchoalvéolaires, sans affecter pour autant l'hyperréactivité bronchique et les taux sériques d'immunoglobulines spécifiques de l'OVA (IgE, IgG2a et IgG1) (Article soumis). La déplétion des cellules NK par l'anti-ASGM1 n'étant pas totale (73%), nous avons choisi de reproduire ces expériences chez les souris NKDTR qui expriment le récepteur de la toxine diphtérique dans le promoteur du gène NKp46, permettant la déplétion spécifique et plus efficace (>90%) des cellules NK (Collaboration Pr E Vivier et Dr T Walzer). Ces souris étant de fond génétique C57BL/6, nous avons mis au point un autre modèle de sensibilisation allergique pulmonaire. Les souris ont reçu deux sensibilisations systémiques d'ovalbumine (OVA) et d'alum suivies de deux séries de trois provocations allergéniques d'OVA par voie intranasale. Dans les ganglions médiastinaux, contrairement au modèle précédent, aucune modification du nombre de cellules NK et de la distribution des sous-populations n'a été observée chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA. D'un point de vue phénotypique, chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA, les cellules NK étaient activées et l'expression membranaire du CD107a augmentée témoignant ainsi d'une dégranulation. Dans les poumons, le pourcentage de cellules NK les plus matures était diminué chez les souris sensibilisées et provoquées à l'OVA. Les cellules NK pulmonaires étaient également activées et l'expression membranaire de CD107a augmentée. Le pourcentage de cellules NK exprimant l'IFN-g était diminué. Concernant CCL18, cette dernière est une chimiokine produite préférentiellement au niveau du poumon. Dans le laboratoire, il a été montré que la production de CCL18 était augmentée chez les patients asthmatiques, et qu'elle recrutait les lymphocytes Th2 et les basophiles, suggérant le rôle de cette chimiokine dans l'asthme allergique. Notre objectif était d'évaluer la réponse des cellules NK isolées du sang périphérique de sujets allergiques vis-à-vis de CCL18 et de la comparer à celle de sujets non allergiques. Le récepteur de CCL18 étant encore inconnu, nous avons analysé son expression par les cellules NK par la fixation de CCL18 biotinylé. L'étude en cytométrie en flux a révélé que des cellules NK de donneurs allergiques et non allergiques exprimaient un récepteur pour CCL18. De plus, nous avons montré que les cellules NK de sujets allergiques et non allergiques migraient en réponse à CCL18, et ce dans une voie dépendante des protéines G. L'attraction des cellules NK par CCL18 était dépendante du donneur, mais indépendante du statut allergique. Aucune attraction préférentielle d'une sous-population de cellules NK (CD56hi ou CD56lo) par CCL18 n'a été mise en évidence. CCL18 était également capable de stimuler la cytotoxicité des cellules NK de sujets allergiques et de donneurs non allergiques, vis-à-vis des cellules cibles Jurkat. Les réponses étaient variables en fonction du donneur, mais une fois encore étaient indépendantes du statut allergique. Enfin, CCL18 n'induisait pas de production de cytokines (IFN-g et TNF-a) par les cellules NK de sujets allergiques et non allergiques. Au vu de l'ensemble de ces résultats, nous pouvons conclure que les cellules NK de sujets allergiques sont attirées et activées par CCL18 de façon similaire aux cellules NK de sujets non allergiques. En résumé, ces travaux ont permis de montrer que, dans un modèle murin d'asthme allergique, les cellules NK s'accumulent dans les ganglions médiastinaux et semblent réguler l'éosinophilie pulmonaire. Nous avons également montré que les cellules NK de sujets allergiques ne présentaient pas de dysfonctionnement dans la réponse vis-à-vis de CCL18 comparativement aux sujets non-allergiques.

Lasthme est une pathologie inflammatoire caractérisée par une inflammation, une hyperréactivité et un remodelage bronchique. Des études menées sur des souris déficientes en MMP-8 et en MMP-19 nous ont permis de démontrer que ces deux protéases jouaient un rôle protecteur vis-à-vis du développement de l'inflammation dans la pathologie asthmatique. En effet, suite à la sensibilisation et à l'exposition par inhalation à lallergène (Ovalbumine),les souris déficientes en MMP-8 en MMP-19 développent respectivement une inflammation neutrophilique et éosinophilique significativement plus importante comparativement aux souris wild-type. Dans une seconde partie de ce travail, nous avons évalué les effets de deux inhibiteurs synthétiques des MMPs administrés en inhalation sous une formulation adéquate dans notre modèle murin dasthme. Suite à ladministration de ces deux inhibiteurs, nous avons observé une diminution de linflammation au sein du lavage bronchoalvéolaire. De plus, nous observons une diminution de linfiltration du tissu pulmonaire par les cellules inflammatoires. Lhyperréactivité bronchique observée suite à linhalation de doses croissantes de méthacholine est également significativement diminuée. Ces résultats sont comparables à ceux obtenus après linhalation de Fluticasone, stéroïde inhalé utilisé très largement en clinique humaine et utilisé dans nos expériences comme médicament de référence. Afin dobserver les modifications morphologiques bronchiques, nous avons mis au point un modèle murin dasthme permettant une exposition de longue durée (90 jours) aux allergènes. En plus de développer une inflammation pulmonaire, les souris traitées vont voir la structure de leurs bronches se modifier. L'inhalation de doxycycline diminue significativement l'inflammation, la réactivité bronchique et diverses caractéristiques du remodelage bronchique telles que l'hyperplasie des cellules à mucus, le dépôt de collagène péribronchique, l'épaisseur de la membrane basale sous-épithéliale et l'épaisseur de la couche de cellules musculaires lisses. Au cours de ces travaux, nous avons caractérisé des modèles murins dasthme. Nous avons démontré que linhibition de certaines MMPs est délétère, nous incitant à les considérer comme des « anti targets ». Nous avons, dans une seconde partie, pu apporter la démonstration que linhibition de certaines MMPs précises (MMP-2, -9 et -14) par des inhibiteurs relativement spécifiques administrés en inhalation améliore le phénotype asthmatique. Par ces travaux, nous avons contribué à la compréhension globale des mécanismes impliquant les MMPs dans la pathologie asthmatique et nous suggérons que de nouvelles voies thérapeutiques, basées sur linhibition de certaines MMPs, pourraient faire lobjet de développements futurs.

SUMMARY Respiratory mucosal surfaces are constantly exposed to a broad range of non-pathogenic environmental antigens. In the absence of proinflammatory signals, inhalation of harmless antigens results in immunological tolerance. Indeed, lung dendritic cells stimulate the development of antigen-specific regulatory T cells. Nevertheless, epidemiological studies have shown that ambient air contains not only inert antigens but also immunostimulatory molecules of microbial origin. Of particular interest are endotoxins, a cell wall component of gram-negative bacteria that is ubiquitous in the environment. In spite of the fact that high levels of endotoxin exposure in early life protect against allergic sensitization, most evidence indicates that exposure to house-dust endotoxin is a significant risk factor for increased asthma prevalence and severity. When the respiratory tract is stimulated with airborne endotoxins, lung dendritic cells lose their tolerogenic properties and rather promote the development of an allergic response directed against concomitant aeroantigens. Although endotoxins are omnipresent in the environment and favour airway allergy, only a minority of people develops asthma. A unifying model reconciling these conflicting observations is still lacking. We report here that LPS-triggered airway allergy is tightly controlled by lung interstitial macrophages, a cell population that remains largely uncharacterized. Interstitial macrophages could be distinguished from alveolar macrophages by their unique capacity to inhibit lung dendritic cell maturation and migration upon LPS stimulation, thereby preventing sensitization to concomitant inhaled antigens. We furthermore demonstrated that functional paralysis of LPS-stimulated dendritic cells involves interleukin-10 production by interstitial macrophages. Finally, we demonstrate that specific in vivo elimination of interstitial macrophages leads to overt asthmatic reactions to innocuous airborne antigens inhaled along with low LPS doses. Our study thus reveals a crucial role for interstitial macrophages in maintaining immune homeostasis in the respiratory tract and provides an explanation for the paradox that airborne LPS has the ability to promote the induction of Th2 responses by lung dendritic cells but does not provoke airway allergy under normal conditions. In the presence of LPS, interstitial macrophages, but not alveolar macrophages, break the link between innate and adaptive immunity, allowing harmless inhaled antigens to escape from T cell-dependent responses. RÉSUMÉ Le système respiratoire est continuellement exposé à de nombreux antigènes environnementaux non pathogéniques. En labsence de signal proinflammatoire, linhalation dantigènes inoffensifs aboutit au développement dune tolérance immunologique. Dans ces conditions, les cellules dendritiques pulmonaires tolérogènes stimulent le développement de lymphocytes T régulateurs. Cependant, les études épidémiologiques montrent que lair ambiant ne contient pas que des antigènes inertes mais également des molécules immunostimulatrices dorigine microbienne dont les endotoxines (LPS, lipopolysaccharide). La présence dans lenvironnement de ce composant de la paroi des bactéries Gram négatives est ubiquiste. Malgré le fait que lexposition à de hauts niveaux de LPS durant lenfance semble protéger contre la sensibilisation allergique, la plupart des études montrent que les endotoxines contenues dans la poussière domestique constituent un facteur de risque significatif pour la prévalence et la sévérité de lasthme. Quand le système respiratoire est stimulé par le LPS aérogène, les cellules dendritiques perdent leurs propriétés tolérogènes et deviennent capables dinduire le développement dune réponse allergique. Bien que les endotoxines soient omniprésentes dans lenvironnement et favorisent lallergie des voies respiratoires, seulement une minorité de personnes est asthmatique. Ces observations contradictoires impliquent lexistence de mécanismes protecteurs non encore décrits capables de prévenir les réponses allergiques induites par les endotoxines. Nous montrons dans ce travail que lallergie des voies respiratoires induite par le LPS est étroitement contrôlée par les macrophages interstitiels, une sous-population de macrophages pulmonaires dont la fonction in vivo navait jamais été caractérisée. Les macrophages interstitiels peuvent être distingués des macrophages alvéolaires par leur capacité unique à inhiber la maturation et la migration des cellules dendritiques induites par lexposition du système respiratoire au LPS, prévenant ainsi la sensibilisation aux aéroantigènes inhalés concomitamment. De plus, nous démontrons que linhibition fonctionnelle des cellules dendritiques implique la sécrétion dIL-10 par les macrophages interstitiels. Finalement, nous montrons que lélimination spécifique des macrophages interstitiels in vivo aboutit au développement dune réponse asthmatique dirigée contre les aéroantigènes inoffensifs inhalés avec de faibles doses de LPS. Notre travail révèle un rôle crucial des macrophages interstitiels dans le maintien de lhoméostasie immunitaire du tractus respiratoire et fournit une explication au paradoxe que le LPS aérogène a la capacité de favoriser linduction de réponses Th2 par les cellules dendritiques mais ne provoque pas dallergie des voies respiratoires dans les conditions normales. En présence de LPS, les macrophages interstitiels, mais pas les macrophages alvéolaires, brisent le lien entre limmunité innée et limmunité adaptative, permettant aux antigènes inhalés déchapper aux réponses dépendantes des lymphocytes T.

La prévalence de la maladie asthmatique est en constante augmentation à travers le monde. Au cours de la vie dun asthmatique, la fonction pulmonaire diminue plus fortement comparativement aux sujets normaux. Ceci est lié à linflammation et au remodelage des voies aériennes. Les caractéristiques principales du remodelage bronchique consistent en des dommages épithéliaux, une hyperplasie des cellules musculaires lisses, une hyperplasie glandulaire, et une fibrose sous-épithéliale incluant un dépôt de collagène dans la lamina reticularis de lépithélium bronchique. Les traitements actuels de lasthme ne sont pas efficaces dans le contrôle du remodelage bronchique et ne permettent pas de contrôler efficacement la maladie dun point de vue clinique. Pour cette raison, le développement de nouveaux agents thérapeutiques semble nécessaire afin de permettre un contrôle de linflammation aigue, de lhyperréactivité et du remodelage bronchiques. Dans ce travail, nous avons dans un premier temps, mis au point un modèle murin permettant létude de la réponse inflammatoire aigue mais également du remodelage bronchique. Grâce au développement de ce modèle murin, nous avons pu détecter par analyse transcriptomique de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour la maladie asthmatique telles que lAgr2, le Cd209e, le Col6 et le C1qa. Dautres gènes préalablement décrits comme surexprimés dans lasthme ont également été étudiés afin de valider notre modèle (MMP-12, Fcgr2b, Ccl8, chi3l3 et Arg1). Suite à cela, nous avons décidé dinvestiguer le rôle de la MMP-12 dans la pathologie asthmatique car bien que ce gène soit connu pour être surexprimé dans la maladie, son rôle exact dans la pathologie asthmatique nétait pas encore clair. La MMP-12, également appelée métalloélastase du macrophage, est une pro-enzyme de 54 kDa qui est clivée en deux formes actives de 45 kDa et de 22 kDa. Elle est exprimée principalement par les macrophages alvéolaires mais également par les cellules épithéliales bronchiques, les cellules dendritiques et les cellules musculaires lisses. Le substrat principal de cette enzyme est lélastine qui représente environ 2.5% du poids sec des poumons. En plus de son activité élastolytique, la MMP-12 peut dégrader dautres composants de la matrice extracellulaire comme le collagène de type IV, la fibronectine, la laminine, la vitronectine, les protéoglycans, etc. Elle a également la capacité dactiver la pro-MMP-2 et la pro-MMP-3 qui peuvent à leur tour activer la pro-MMP-9 et la pro-MMP-1. Cette cascade protéolytique explique comment la MMP-12 peut provoquer une dégradation exagérée dune grande variété de composant de la matrice extracellulaire. La MMP-12 est également capable de dégrader dautres substrats non liés à la matrice extracellulaire. Une régulation anormale de lexpression de la MMP-12 est rencontrée dans différentes pathologies telles que les maladies inflammatoires de la peau, lanévrisme de laorte, le cancer et lemphysème pulmonaire. Afin détudier plus avant le rôle de la MMP-12 dans linflammation allergique et dans le remodelage bronchique, nous avons appliqué notre modèle murin à des souris déficientes pour le gène de la MMP-12 ainsi quaux souris wild-type correspondantes. A la fin de chaque protocole expérimental, la résistance bronchique mesurée à laide du système Flexivent est moins importante chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène lorsquon les compare aux souris de type sauvage correspondantes. Les pourcentages déosinophiles présents dans le lavage bronchoalvéolaire des souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène sont significativement moins importants que ceux présents chez les souris de type sauvage correspondantes et ce quelque soit le temps dexposition. Les mêmes différences ont été observées pour le score inflammatoire et pour linfiltration des éosinophiles au sein des parois bronchiques. Le pourcentage de cellules caliciformes présentes dans lépithélium bronchique est significativement moins important chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène durant 1 et 5 semaines comparativement aux souris de type sauvage correspondantes mais plus aucune différence na pu être observée après 10 semaines dexposition. Le nombre de mastocyte est significativement moins important chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lallergène durant 5 et 10 semaines comparativement aux souris sauvages correspondantes. Aucune différence na pu être observée après 1 semaine dexposition. Enfin, lépaisseur de la couche de muscle lisse est significativement moins importante chez les souris déficientes pour le gène de la MMP-12 exposées à lovalbumine durant 5 et 10 semaines comparativement aux souris de type sauvage correspondantes. Suite à ces résultats, nous avons montré que le MMP-12 était une cible thérapeutique potentielle pour lasthme. Nous avons également montré que les principales modifications dues au déficit de ce gène survenaient dès la première semaine dexposition. Nous avons donc décidé de tester les effets de linstillation dun siRNA ciblant la MMP-12 dans notre modèle murin dinflammation aigue. Un western blot et une PCR spécifiques de la MMP-12 ont été réalisés afin de sassurer que le siRNA permettait bien de diminuer lexpression de ce gène. Linstillation de siRNA ciblant la MMP-12 entraine bien une diminution de lexpression de ce gène tant au niveau de lARNm quau niveau protéique. Le pourcentage déosinophiles présents dans le lavage bronchoalvéolaire des souris exposées à lallergène ayant été instillées avec le siRNA ciblant la MMP-12 est significativement diminué par rapport à celui des souris exposées à lallergène ayant été instillées avec du PBS ou avec un siRNA scramble. De plus, cette diminution dépend de la dose de siRNA utilisée. Les mêmes observations ont pu être réalisées en ce qui concerne linfiltration des éosinophiles au sein des parois bronchiques ainsi que pour le pourcentage de cellules à mucus présentes dans lépithélium bronchique. Linstillation du siRNA chez les souris exposées à lallergène entraine une diminution du score inflammatoire par rapport aux souris ayant été instillées avec du PBS ou avec le siRNA scramble mais cette diminution semble moins dépendre de la dose de siRNA utilisé. Les niveaux dexpression de CCL-11 et de lIL-13 mesurés par ELISA sont diminués suite au traitement avec le siRNA ciblant lARNm de la MMP-12 comparativement aux souris contrôles. De même, les niveaux dexpression du TNF-α et de larginase I mesurés par western blot sont diminués après linstillation du siRNA ciblant la MMP-12. Au terme de ce travail, nous pouvons donc conclure que le MMP-12 joue un rôle important dans la pathologie asthmatique et que ladministration de siRNA ciblant ce gène permet de diminuer linflammation à éosinophiles ainsi que lhyperplasie des cellules à mucus. Ceci permet de penser que la MMP-12 est une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour le traitement de lasthme.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Médecine.Biologie cellulaire : Reims : 2007. / Bibliographie f.115-134.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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