Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Les maladies allergiques sont en constante augmentation tant en prévalence qu’en gravité. Les éosinophiles sont fortement impliqués dans le dommage et le dysfonctionnement tissulaire et participent à l’entretien de l’inflammation allergique. Différentes cellules de l’immunité innée sont impliquées dans le contrôle de la réaction allergique. Parmi elles, les cellules NK, connues essentiellement pour leurs fonctions anti-tumorales et anti-microbiennes, pourraient réguler différents aspects de la réaction. Dans le sang périphérique de patients asthmatiques, les cellules NK présentent des capacités cytotoxiques accrues, ainsi qu’une prédominance de cellules NK2 comparativement à la prédominance de cellules NK1 chez les sujets non allergiques. Chez des patients atteints de dermatite atopique, le nombre et la cytotoxicité des cellules NK périphériques sont diminués, ainsi que leur capacité à produire de l’IFN-g. De plus, le dialogue entre les cellules NK et les cellules dendritiques est moins efficace chez le sujet asthmatique, menant ainsi à une capacité réduite de production d’IFN-g par les cellules NK. Dans des modèles murins d’inflammation pulmonaire, la déplétion en cellules NK par l’anti-NK1.1 ou l’anti-ASGM1 avant l’immunisation inhibe l’éosinophilie pulmonaire, l’infiltrat des LT CD3+ et l’augmentation des taux d’IL-4, IL-5 et IL-12 dans le LBA. Néanmoins, la déplétion avec l’anti-ASGM1 après l’établissement de l’inflammation éosinophilique retarde sa résolution, suggérant un rôle double des cellules NK dans l’inflammation allergique. Le recrutement et la fonction des cellules NK humaines dans l’allergie par le biais de l’analyse in vitro du rôle de CCL18 sur les cellules NK a été analysé. Cette chimiokine est préférentiellement produite au niveau du poumon et possède une double fonction dans la pathologie allergique puisqu’elle recrute les LTh2, mais également les LT reg et génère des DCs tolérogènes capables d’induire des LT reg, uniquement chez des donneurs non allergiques. Nous avons évalué la réponse des cellules NK de sujets allergiques vis-à-vis de CCL18 et l’avons comparée à celle de cellules NK provenant de sujets non allergiques. Nos travaux ont montré que CCL18 attire in vitro les cellules NK de sujets non allergiques et induit leur cytotoxicité, de façon dépendante des protéines G. Par contre, les cellules NK de sujets allergiques ne répondent pas au CCL18. La deuxième partie du travail s’est basée sur l’hypothèse d’un dialogue entre les cellules NK et les éosinophiles qui modifierait leurs fonctions respectives. Des cellules NK et des éosinophiles autologues ont été cocultivés pendant 3 et 12h, à différents ratios. Nous avons montré que les cellules NK activent directement les éosinophiles comme en témoignent l’augmentation de la libération de l’ECP, l’EDN, et de l’expression du CD63, du CD69 et la diminution de l’expression du CD62L sur les éosinophiles. De plus, les cellules NK induisent l’apoptose et la mortalité des éosinophiles dès la première heure de coculture. Cependant l’apoptose et la mortalité des cellules NK ne sont pas modifiées. La fixation des cellules NK empêche presque totalement l’activation et l’apoptose des éosinophiles, suggérant l’implication de molécules de surface et peut être de facteurs solubles. Les interactions entre molécules de surface restent à déterminer, et l’IFN-g et le TGF-β ne sont pas impliqués. Cependant, les voies de signalisation p38MAPkinase, ERK, JNK et PI3kinase interviennent dans l’activation des éosinophiles. La voie mitochondriale et ROS sont impliquées dans l’apoptose des éosinophiles induite par les cellules NK.En résumé, ces travaux ont permis de montrer que les cellules NK de sujets allergiques présentent un dysfonctionnement dans la réponse vis-à-vis de CCL18 comparativement aux sujets non-allergiques. De plus, nos résultats suggèrent que les cellules NK pourraient réguler l’inflammation à éosinophiles en induisant leur activation et/ou leur apoptose. / Allergic diseases are steadily increasing both in prevalence and severity. Known physiopathological mechanisms involve the induction of a Th2 response by dendritic cells, leading to IgE production and inflammation, in particular linked to the recruitment of eosinophils. Eosinophils are heavily involved in injury and tissue dysfunction and contribute to the maintenance of inflammation. Different cells of innate immunity were shown to be involved in the control of allergic reaction. Among them, (NK) cells, primarily known for their anti-tumor and anti-microbial functions, may regulate different aspects of allergic reaction as suggested by studies in humans or mice. In the peripheral blood of patients with asthma, NK cells exhibit increased cytotoxic capacity, and a predominance of NK2 cells compared to the prevalence of NK1 cells in non-allergic subjects. In patients with atopic dermatitis, the number and cytotoxicity of peripheral NK cells are reduced, as well as their ability to produce IFN-g. Moreover, the dialogue between NK cells and dendritic cells is less effective in asthmatic patients, leading to a reduced capacity of IFN-g production by NK cells. In murine models of pulmonary inflammation, depletion of NK cells by anti-NK1.1 or anti-ASGM1 before immunization inhibits pulmonary eosinophilia, the infiltration of CD3+ T cells and increased levels of IL-4, IL-5 and IL-12 in the bronchoalveolar lavage. However, depletion with anti-ASGM1 after the establishment of eosinophilic inflammation delays its resolution, suggesting a dual role of NK cells in allergic inflammation.We studied the recruitment and function of human NK cells in allergy through in vitro analysis of the role of CCL18 on NK cells. This chemokine is preferentially produced in the lungs and has a dual role in allergic diseases since it recruits Th2 cells but also regulatory T cells and generates tolerogenic DCs capable of inducing regulatory T cells only from non-allergic donors. We evaluated the response of NK cells in allergic subjects towards CCL18 and compared it to that of NK cells from non-allergic donors. We showed that CCL18 attracts NK cells from non-allergic subjects and induces their cytotoxicity in a G protein dependent pathway. However, NK cells from allergic subjects did not respond to CCL18. This chemokine has no effect on the proliferation of NK cells, but may negatively regulate IFN-g production.The second part of the thesis is based on the hypothesis of a dialogue between NK cells and eosinophils which would modify their respective functions. NK cells and autologous eosinophils were cocultured during 3 and 12 hours, at different ratios. We showed that NK cells directly activate eosinophils as evidenced by the increased release of ECP, eosinophil derived neurotoxin EDN, and the expression of CD63, CD69, and reduced expression of CD62L on living eosinophils. In addition, coculture with NK cells induced apoptosis and mortality of eosinophils in the first hours of coculture. However, apoptosis and death of NK cells were not changed. Fixation of NK cells prevented almost completely the activation and apoptosis of eosinophils, suggesting the involvement of surface molecules, however soluble factors cannot be excluded. These interactions require cell contact, but the molecules involved remain to be determined. Concerning soluble factors, IFN-g and TGF-β are not involved in these mechanisms. However, the signaling pathways p38MAPkinase, ERK, JNK and PI3-kinase are involved in eosinophils activation. Concerning eosinophil apoptosis induced by NK cells, the mitochondrial pathway is more involved than the caspase pathway.In summary, our studies show that NK cells from allergic patients exhibit a defect in their response towards CCL18 compared to non-allergic subjects. In addition, these results suggest that NK cells may regulate eosinophilic inflammation by inducing their activation and / or apoptosis.

Cytotoxiques en lysant différents types de cellules et régulent la réponse immunitaire. Leur rôle dans l’asthme et ses exacerbations reste encore à identifier même si des modifications phénotypiques ont été observées chez des patients asthmatiques et qu’il a été récemment montré dans un modèle murin qu’elles n’intervenaient pas dans le développement de l’asthme allergique. L’objectif de la thèse était de mieux comprendre la place des cellules NK dans la pathologie asthmatique en se focalisant sur deux aspects : l’exacerbation viro-induite et l’inhibition par des composants microbiens.L’hypothèse pour la 1ère partie de la thèse était que les cellules NK de patients asthmatiques pouvaient présenter une dysfonction dans leur réponse à des agents microbiens qui pourrait favoriser l’exacerbation de la réaction asthmatique. Pour cela, nous avons analysé l’activation, la cytotoxicité et la production de cytokines de cellules NK provenant de patients asthmatiques sévères stimulées avec des molécules mimant des microorganismes ou un rhinovirus vivant (HRV), en comparaison avec des donneurs sains. Nous avons montré que les cellules NK de patients sévères étaient moins cytotoxiques que les cellules NK de donneurs sains en réponse à la stimulation avec un agoniste de Toll-Like Receptor 3 ou du TLR7/8 et avec HRV. En outre, lorsqu’elles sont stimulées avec de l’IL-12 et de l’IL-15, des cytokines produites pendant l’infection virale, les cellules NK de patients asthmatiques sévères expriment moins d’IFN-γ que les cellules NK de donneurs sains. Nos résultats suggèrent que l’activation des cellules NK de patients asthmatiques pourrait être insuffisante pendant les infections respiratoires et pourraient participer à l’aggravation de l’asthme.L’hypothèse pour la 2ème partie de la thèse était que les cellules NK pourraient participer à l’inhibition de la réaction asthmatique allergique dans un modèle murin. Dans des souris C57BL/6 sensibilisées à l’ovalbumine, l’instillation de FSL1, un agoniste de TLR2/6 inhibe la réaction asthmatique allergique. Cette inhibition étant associée à des modifications de la population des cellules NK, nous avons analysé leur rôle grâce à des souris déficientes en cellules NK. En l’absence de cellules NK, les souris développent un asthme allergique, et l’inhibition par FSL1 est maintenue. Par conséquent, les cellules NK ne jouent pas de rôle dans le développement de l’asthme allergique expérimental, ni dans son inhibition induite par un agent microbien. Cependant, elles pourraient être modifiées par l’environnement allergique, et avoir ainsi un rôle dans les exacerbation viro-induites. Cette question cruciale rejoint le travail réalisé dans la première partie de la thèse.En conclusion, nos résultats suggèrent que les fonctions des cellules NK seraient modifiées dans la pathologie asthmatique, qu’elle soit allergique ou non. Notre hypothèse est que le défaut d’activation des cellules NK participerait aux exacerbations viro-induites de l’asthme. Les perspectives de ces travaux sont de poursuivre la caractérisation des cellules NK chez les patients asthmatiques sévères et d’évaluer le rôle des cellules NK dans un modèle murin d’exacerbation de la réaction asthmatique.L’hypothèse pour la première partie de la thèse était que les cellules NK de patients asthmatiques pouvaient présenter une dysfonction dans leur réponse à des agents microbiens qui pourrait favoriser l’exacerbation de la réaction asthmatique. Pour cela, nous avons analysé l’activation, la cytotoxicité et la production de cytokines de cellules NK provenant de patients asthmatiques sévères stimulées avec des molécules mimant des microorganismes ou un rhinovirus vivant (HRV), en comparaison avec des donneurs sains. Nous avons montré que les cellules NK de patients sévères étaient moins cytotoxiques que les cellules NK de donneurs sains en réponse à la stimulation avec un agoniste de Toll-Like Receptor 3 ou du TLR7/8 et avec HRV [...] / Asthma is a chronic inflammatory disease of the airways affecting 334 million of people worldwide. Among asthma patients, 5% suffers from severe asthma. Severe asthma represents a major unmet need because, despite heavy treatments, patients still suffer from uncontrolled asthma symptoms, frequent exacerbations and a dramatic decrease in their respiratory capacity. The role of microorganisms in asthma is complex. On one hand, a group of epidemiologic and experimental studies have shown that chronic exposure with bacteria or microbial compounds, particularly during early childhood, would provide protection against allergic asthma. On the other hand, respiratory viruses are responsible for 80% of exacerbations and are associated with an increasing risk of developing asthma in children, whether allergic or not. Natural Killer cells (NK) are lymphocytes involved in innate antiviral immunity. They have cytotoxic functions by lysing different types of cells but also regulatory functions by producing cytokines and activating other immune cells. Their role in asthma and its exacerbations has yet to be identified, although phenotypic changes have been observed in asthmatic patients and it has recently been shown in a mouse model that they are not involved in the development of allergic asthma. The objective of the thesis was to better understand the role of NK cells in asthmatic pathology by focusing on two aspects : virus-induced exacerbation and inhibition by microbial compounds.The hypothesis for the first part was that NK cells from asthma patients may present a dysfunction in their response to microbial agents that could promote the exacerbation of the asthmatic reaction. To do this, we analysed NK cell activation, cytotoxicity and production of cytokines from severe asthmatic patients stimulated with molecules mimicking microbes or a human rhinovirus (HRV), compared to healthy donors. We showed that NK cells from severe asthma patients were less cytotoxic than NK cells from healthy donors in response to stimulation with a Toll-like Receptor 3 or TLR7/8 agonist and HRV. Moreover, when stimulated with IL-12 and IL-15, cytokines produced during viral infections, NK cells from severe asthma patient express less IFN-γ than NK cells from healthy donors. Our results suggest that the activation of NK cells in asthma patients may be insufficient during respiratory infections and may contribute to the worsening of asthma.The hypothesis for the second part was that NK cells may participate to the inhibition of a mouse model of allergic asthma. In C57BL/6 mice sensitized with ovalbumin, instillation of FSL1, agonist of TLR2/6, inhibits the features of experimental asthma. Since this inhibition is associated with changes in the population of NK cells, we analysed their role using mice deficient in NK cells. In the absence of NK cells, mice develop allergic asthma, and inhibition by FSL1 is maintained. Therefore, NK cells do not play a role in the development of experimental allergic asthma or in its inhibition induced by a microbial agent. However, they may be modified by the allergic environment, and thus have a role in viro-induced exacerbations. This crucial question is in line with the work done in the first part of the thesis.In conclusion, our results suggest that the functions of NK cells may be modified in asthmatic pathology, whether allergic or not. Our hypothesis is that the defect in NK cell activation may participate to virus-induced asthma exacerbations. Perspectives of this work are to further characterize NK cells in severe asthma patients and to evaluate the role of NK cells in a mouse model of asthma exacerbation.

L'asthme professionnel (AP) est la maladie respiratoire d'origine professionnelle la plus fréquente dans les pays industrialisés. Il s'agit d'une pathologie complexe dite « multifactorielle » mettant en jeu un grand nombre de facteurs de risques génétiques, constitutionnels, comportementaux et environnementaux. Sur le plan génétique, l'asthme professionnel représente un bon modèle pour l'étude de l'asthme chez l'adulte et les mécanismes d'interactions gène-gène-environnement masquant ou modulant l'effet de la génétique restent encore à élucider. Aucune étude épidémiologique sur l'asthme professionnel n'a examiné le rôle des facteurs génétiques à un stade très précoce de l'exposition aux allergènes et aux irritants aéroportés. Nous avons donc cherché dans un premier temps à évaluer le rôle de certains polymorphismes génétiques en rapport avec l'inflammation et l'allergie, à savoir les IL4RA, IL13, TNFa, IL1A et IL5, sur le déclin de la fonction pulmonaire, l'apparition d'une obstruction ou d'une hyperréactivité bronchiques et l'évolution du monoxyde d'azote exhalé (FeNO) chez 441 apprentis boulangers/pâtissiers et coiffeurs (étude MIBAP). Dans cette première partie nous observons des interactions entre IL13 R130Q/IL4RA S478P et IL13 R130Q//IL4RA Q551R et la diminution du volume expiratoire forcé ou de la capacité vitale forcée. Le génotype GG du TNFA-G308A a été trouvé associé à l'hyperréactivité bronchique dans l'ensemble de la population et chez les sujets non atopiques ; nous avons aussi observé que certaines interactions gène-gène étaient associées à une modification du FeNO au cours des deux années d'apprentissage. Dans un deuxième temps, des déterminants nutritionnels de l'asthme ont été explorés dans une population de jeunes travailleurs engagés dans ces métiers à risque depuis 3 à 10 ans (étude ABCD). Les apports en vitamines, principalement les vitamines A, C, E D, et en acides gras polyinsaturés omégas 3 et 6 ont été étudiés par questionnaire de fréquence, le diagnostic d'asthme professionnel étant réalisé au moyen d'une batterie d'outils (examen clinique, spirométrie et test de réversibilité d'une obstruction bronchique, mesure du FeNO et examen des taux sériques d'IgE spécifiques). Les résultats portant sur 31 cas d'asthme professionnel et 196 témoins montrent une différence en fonction de la filière : chez les boulangers-pâtissiers, aucun facteur nutritionnel n'est objectivé, contrairement au groupe des coiffeuses chez qui les asthmatiques présentent des apports plus élevés des vitamines A et D. Un déficit en B12 semble être un facteur de risque de survenue d'asthme professionnel et ce indépendamment de la filière. En revanche, aucune corrélation n'est trouvée avec les taux sériques de l'homocystéine et la vitamine B9. A travers ces études au sein de ces jeunes populations à risque, il ressort que l'expression de certains facteurs de risque de l'asthme professionnel sont modulables en fonction du type d'exposition. Des comportements alimentaires à l'environnement de travail, l'émergence d'une maladie telle que l'asthme professionnel fait appel à des facteurs multiples dont la plupart peuvent être contrôlés et limités par des mesures de prévention efficaces / Occupational asthma (OA) is the occupational respiratory disease most common in industrialized countries. It is a multifactorial disease involving a large number of risk factors genetic, constitutional, behavioral and environmental. At the genetic level, occupational asthma is a good model for the study of adult asthma and the mechanisms of interaction gene-gene-environment masking or modulating effect of genetic remain to be elucidated. None epidemiological studies on occupational asthma have examined the role of genetic factors in a very early exposure to allergens and airborne irritants. We initially assess the role of genetic polymorphisms related to inflammation and allergy, namely IL4RA, IL13, TNF, IL1A and IL5, on the decline of lung function, bronchial hyperresponsiveness and increasing of exhaled nitric oxide (FeNO) in 441 apprentice bakers / pastry-makers and hairdressers (MIBAP study). In this first part we observed interactions between IL13 and IL13 R130Q R130Q/IL4RA S478P / / IL4RA Q551R and decreased forced expiratory volume or forced vital capacity. The GG genotype of TNFA-G308A was found associated with bronchial hyperreactivity in the general population and in non-atopic subjects, we also observed that some gene-gene interactions were associated with a change in the FeNO after two years of training. In a second time, nutritionals determinants of asthma were investigated in a population of young workers employed in these occupations at risk from 3 to 10 years (ABCD study). Intake of vitamins, especially vitamins A, C, E,D, and polyunsaturated fatty acids omega 3 and 6 were studied by frequency questionnaire, the diagnosis of occupational asthma is achieved through a battery of tools (review clinical spirometry and reversibility of bronchial obstruction, FeNO measurement and examination of serum specific IgE). The results on 31 cases of occupational asthma and 196 controls showed a difference in terms of the sector: among bakers, no nutritional factor is objectified, unlike the hairdresser's asthmatics that have higher intakes vitamins A and D. B12 deficiency appears to be a risk factor for onset of occupational asthma regardless of the sector. In contrast, no correlation was found with serum levels of homocysteine and vitamin B9. Through studies in these young people at risk, it appears that the expression of certain risk factors of occupational asthma is flexible, depending on the type of exposure. The emergence of a disease such as occupational asthma involves multiple factors, most of which can be controlled and limited by effective preventive measures