Thèse d'exercice : Médecine. Neurologie : Université de Nantes : 2007. / Bibliogr.

L’atrophie optique dominante (AOD, MIM#165500) est une pathologie héréditaire affectant un individu sur 30 000 environ. Elle touche principalement les cellules ganglionnaires de la rétine qui composent le nerf optique, entraînant une baisse d’acuité visuelle. Cette pathologie, génétiquement et cliniquement hétérogène, est majoritairement due aux mutations du gène OPA1. La protéine mitochondriale OPA1 est impliquée dans de multiples fonctions telles que la fusion des mitochondries, le métabolisme énergétique, l’apoptose et la maintenance de l’ADN mitochondrial. Afin d’appréhender les effets globaux des dysfonctions d’OPA1, nous avons développé des approches métabolomiques et lipidomiques non-targeted sur des plasmas et des fibroblastes de patients ainsi que sur des modèles murins. En dépit des spécificités de chaque modèle et matrice, nos études ont clairement révélé des altérations métaboliques communes dont une déficience en aspartate. Ce déficit est impliqué dans le métabolisme des nucléotides et est en relation directe avec le défaut énergétique révélé dans nos différents modèles. Avec l’approche lipidomique, nous avons montré dans les fibroblastes de souris invalidés pour le gène OPA1 une augmentation importante des triglycérides qui est en lien avec le défaut énergétique. De plus, nous avons mis en évidence un remaniement majeur des phospholipides qui témoigne d’un profond remodelage des structures membranaires mitochondriales. Ces approches nous ont ainsi permis d’avoir de nouvelles données sur les implications physiopathologiques d’OPA1. L’ensemble de ce travail ouvre de nouvelles perspectives pour une meilleure prise en charge de la pathologie. / Dominant Optic Atrophy (DOA, MIM #165500) is an inherited disease affecting one of 30,000 individuals. It mostly affects the retinal ganglion cells that make up the optic nerve, leading to the decrease invisual acuity. This genetically and clinically heterogeneous pathology is mainly related to the mutations on OPA1 gene. The mitochondrial protein OPA1 has been implicated in many functions including mitochondrial fusion, energy metabolism, apoptosis and maintenance of mitochondrial DNA. In order to investigate the overall effects of OPA1 dysfunctions, we developed non-targeted metabolomic and lipidomic approaches on patients' plasmas and fibroblasts as well as on OPA1 knock-out mouse fibroblast model. Despite the specificities of each model and matrix, we clearly revealed a common metabolic alteration including an aspartate deficiency due to the energy defect observed in all our models and responsible for the alteration of nucleotide metabolism. With a lipidomic approach, we revealed in the knock-out cell model a huge increase of triglycerides which is related to the energetic deficiency. Moreover, we highlighted a major alteration on phospholipids, testifying a deep remodeling of mitochondrial membrane structures. Taken together, our analysis revealed new pathophysiological roles of OPA1. Finally, our work opens new perspectives to improve the diagnosis and the patient care.

Le Syndrome de Wolfram (SW; OMIM #222300, prévalence 1-9 / 1000 000) est une maladie neurodégénérative, qui se présente avec un début juvénile, intégrant le diabète insipide, diabète sucré, l’atrophie optique (AO), et la surdité. AO est généralement son premier symptôme neurologique, commençant à l’âge de 11 ans et se terminant par la cécité 8 ans plus tard. Malheureusement, un modèle murin du SW approprié aux symptômes ophtalmologiques n'a pas encore été trouvé, donc la recherche de la thérapie pour sauver la vision en est à ces débuts. Dans cette thèse j’ai étudié l’atteinte visuelle de deux modèles de souris mutantes pour le SW et succès d’une approche de thérapie génique (TG) avec le gène humain WFS1.Premièrement, les souris Wfs1exon8del sont été examinées à 3 et 6 mois pour l’acuité visuelle (AV) et la sensibilité aux contrastes (SC) via changements dans le reflexe optomoteur (ROM), la fonction rétinienne neurale par électrorétinogramme (ERG), ainsi que la physiologie de l’œil par la fondoscopie et tomographie par cohérence optique (TCO). De plus, la proportion des cellules ganglionnaire de la rétine (CGRs) et la perte axonale dans le nerf optique (NO) à 7 mois ont été examinés avec marquage anti-Brn3a et microscopie électronique, respectivement. Il y avait une perte progressive de l’AV et la SC chez les souris KO à partir du 1 mois. Elle était accompagnée d'une pâleur du disque optique (DO), d'amincissement de la rétine ainsi que des lésions axonales. Par contre, il n’avait pas de perte des CGRs ni stress du réticulum endoplasmique dans la rétine. Brièvement, les souris KO présentent un phénotype ophtalmique du SW significatif et peuvent servir comme modèle.Deuxièmement, à la recherche d'un autre modèle du SW, les fonctions visuelles de la lignée Wfs1E864K de la souris ont été étudiées. Déjà à 1 mois, les souris Wfs1E864K/E864K avait une perte drastique de la fonction des CGRs, mais en gardant le nombre de cellules à un niveau normal. Ceci a été accompagné par un amincissement de la rétine et d’un sévère dommage du NO, comme montré par le TCO et la fondoscopie, respectivement. En conséquence, les souris Wfs1E864K/E864K, avec leur fort phénotype ophtalmique, pourraient servir comme modèle du SW classique.Enfin, pour enquêter sur les futures options de traitement contre le SW, les souris de la lignée Wfs1exon8del à 1 mois ont subi une TG intravitréenne avec AAV-2/2-CMV-WFS1. Les examens à 3 et 6 mois ont montré une amélioration de l’AV, ainsi que le sauvetage de la pâleur du DO et réduction des lésions axonales chez les souris KO. En outre, aucun effet indésirable lié à des injections TG n’ont été noté. Suivant cette idée, les souris Wfs1E864K/E864K ont également été soumis à la TG intravitréenne, délivrée à P14, mais sans succès.En conclusion, la lignée Wfs1exon8del de la souris est un modèle fiable du SW, y compris les aspects visuels. Je propose le modèle Wfs1E864K/E864K comme une alternative, en particulier pour enquêter sur la fonction de Wfs1 dans l'œil. Enfin, la GT intravitréenne avec WFS1 a un potentiel pour sauver partiellement le phénotype ophtalmique, ouvrant la voie vers le traitement pour les patients du SW / Wolfram Syndrome (WS; OMIM #222300, prevalence 1-9 / 1 000 000) has a juvenile onset and incorporates diabetes insipidus, diabetes mellitus, optic atrophy (OA), and deafness; leading to death in middle age. OA is its first neurological symptom, starting in adolescence and ending with blindness within 8 years. Unfortunately, a suitable WS mouse model comprising ophthalmologic symptoms has not yet been found, therefore the search for its treatment is delayed. In this thesis, I studied visual impairment in two WS mouse models along with a success of a gene therapy (GT) approach with the human WFS1 gene.Firstly, 3 and 6 months old Wfs1exon8del mice were examined for the visual acuity (VA) and contrast sensitivity via changes in the opto-motor reflex (OMR), the neural retinal function via electroretinogram (ERG), as well as the eye physiology via fundoscopy and optic coher-ence tomography (OCT). Also, the proportion of retinal ganglion cells (RGC) and the axonal loss at the age of 7 months were determined with anti-Brn3a immuno-labeling of retinal sections and electron microscopy of optic nerve (ON) sections, respectively. There was a progressive loss of VA and contrast sensitivity in Wfs1exon8del-/- mice, starting already at 1 month of age. It was accompanied by optic disc pallor, retinal thinning as well as axonal damage. However, there was no RGC loss and the endoplasmic reticulum (ER) stress in the retina was at a normal level. It suggested a presence of another cause for the reported degeneration in KO mice; in opposition to what was proposed in the literature. I brief, KO mice exhibit significant WS ophthalmic phenotype.Secondly, in search for another model, visual functions of Wfs1E864K mouse line were investigated. This line was originally a model of Wolfram-like Syndrome, characterized by dominant mutations in WFS1 leading to congenital progressive hearing impairment, diabetes mellitus and OA. Only homozygous mutants, however, showed expected visual impairment. Already at 1 month of age, Wfs1E864K/E864K mice had drastic loss of RGC function, albeit keeping the cell number at a normal level. This was accompanied by retinal thinning and a severe ON damage, as shown with OCT and fundoscopy, respectively. In contrast, the RGC function in Wfs1E864K/+ mice dropped slightly only at the age of 7 and 12 months, showing that the pathology of the E864K mutation-driven disease in mice is different than in humans. Therefore, Wfs1E864K/E864K mice, with their strong ophthalmic phenotype, could potentially serve as a model of the classical WS.Finally, to investigate future treatment options, 1 month old Wfs1exon8del+/+ (WT) and Wfs1exon8del-/- (KO) mice underwent a uni- and bi-lateral intravitreal gene therapy (GT) with AAV-2/2-CMV-WFS1. Exams at 3 and 6 months of age showed improved VA, as well as optic pallor and axonal damage rescue in KO mice. Also, no adverse effects related to either GT or sham injections were noted. Following this idea, the Wfs1E864K/E864K mice were also subjected to intravitreal GT, delivered at P14, but without success.In conclusion, Wfs1exon8del mouse line is a reliable model of WS, including the visual aspects. I propose the Wfs1E864K/E864K model as an alternative, especially to investigate Wfs1 function in the eye. Finally, the intravitreal AAV-driven GT with WFS1 has a potential to partially rescue the ophthalmic phenotype, paving the wave towards the treatment for WS patients.

Les mitochondries sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que le catabolisme des nutriments, la phosphorylation oxydative, l'apoptose et la régulation des flux calciques. Elles ont une structure dynamique, qui s'adapte en permanence aux besoins cellulaires, et sont sous le contrôle de réseaux de régulation coordonnant leur masse, leur structure et leurs fonctions. Le protéome mitochondrial est ainsi composé d'une très grande diversité de protéines qui dérive en partie de l'ancêtre procaryote des mitochondries et résulte majoritairement d'une information codée par le génome nucléaire, mais aussi d'une information plus restreinte portée par le génome mitochondrial. Sept cents protéines mitochondriales ont été caractérisées chez l'homme, grâce à diverses approches de protéomique, de génomique et de bio-informatique, mais il est probable que les mitochondries en comportent un nombre bien supérieur. La caractérisation de ces protéines est essentielle à la compréhension des nombreuses maladies génétiques et communes associées à des dysfonctionnements mitochondriaux. Au cours de ce travail de thèse nous avons comparé in silico les séquences des protéines mitochondriales humaines avec celles des procaryotes, mettant en évidence que les protéines impliquées dans les pathologies sont majoritairement homologues à des protéines procaryotes. Nous avons ensuite développé une stratégie de recherche bio-informatique de nouvelles protéines mitochondriales basée sur leur origine procaryote et la présence d'une extension N-terminale caractéristique. L'ensemble des protéomes procaryotes connus a été comparé au génome humain et différents outils de filtrage ont été développés pour identifier de nouvelles protéines. Parallèlement à cette stratégie globale de criblage, nous nous sommes focalisés sur l'étude d'une des protéines participant à la fusion mitochondriale qui est associée à l'atrophie optique autosomique dominante, la protéine Opa1. Cette dynamine GTPase est impliquée dans le remodelage de la membrane interne mitochondriale, l'apoptose, la maintenance de l'ADN mitochondrial et le métabolisme énergétique. Nous avons développé une base de données internationale répertoriant les différents variants affectant Opa1 afin de caractériser son spectre mutationnel. Cet outil a secondairement servi à une étude clinique multicentrique portant sur près de mille patients porteurs d'une neuropathie optique. À travers ces deux approches, nous avons pu développer de nouveaux outils bio-informatiques qui devraient contribuer à une meilleure compréhension de la physiopathologie mitochondriale.

L'atrophie optique autosomique dominante (ADOA) et la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A) sont deux neuropathies héréditaires respectivement liées aux mutations des gènes OPA1 et MFN2. Les protéines OPA1 et MFN2 sont impliquées dans la dynamique de fusion des mitochondries. Ces organites intracellulaires sont essentiels dans les processus de synthèse d'ATP. L'hypothèse d'un déficit énergétique impliqué dans la physiopathologie de ces neuropathies devait alors être testée. Nous avons mis en évidence une baisse d'efficacité des phosphorylations oxydatives dans les fibroblastes de peau de patients atteints d'ADOA et de CMT2A. Ce découplage est associé à une baisse d'activité du complexe IV et à une augmentation de l'activité du complexe V dans le cas de l'ADOA. Dans le cas de la CMT2A, le découplage est associé à une augmentation de l'activité et de la quantité de la translocase des nucléotides adényliques (ANT). Une étude sur mitochondries isolées de cerveaux d'un modèle murin MFN2(R94Q) de CMT2A montre une baisse d'activité des complexes II et V associée à l'ouverture du canal mitochondrial potassique sensible à l'ATP (mKATP). Nos résultats montrent qu'OPA1 et MFN2, deux protéines de la dynamique mitochondriale ont un rôle majeur dans la régulation énergétique mitochondriale.