La cystinose (MIM 21980) est une maladie de surcharge lysosomale héréditaire rare caractérisée par un efflux défectueux de cystine hors des lysosomes. Le gène impliqué dans la cystinose code pour une protéine transmembranaire lysosomale, la cystinosine, qui fonctionne comme un co-transporteur de cystine et de protons. De plus, la cystinosine, possède deux motifs d’adressage aux endosomes tardifs et aux lysosomes: un classique, le motif GYDQL dans sa partie C-terminale, et un nouveau signal conformationnel dans la boucle située entre les 5ème et 6ème domains transmembranaires. La première partie de mon projet de thèse vise à caractériser le trafic intracellulaire de la cystinosine. L’adressage des protéines de la membrane lysosomale à ces organelles peut se faire par deux voies, la voie directe (intracellulaire) et la voie indirecte (via la membrane plasmique), médiées par les complexes AP (AP- 1 à AP -4 et probablement récemment décrit AP- 5). Grâce à l’utilisation de la technique du double hybride, nous avons identifié une forte interaction entre le motif GYDQL et la sous-unité μ3 du complexe AP3. Par ailleurs, nous avons montré que la déplétion d'AP-3 dans des cellules HeLa conduit à une augmentation de localisation de la cystinosine-GFP à la membrane plasmique ainsi que à la rétention de la protéine chimère, proteine CD63 dont le signal d’adressage a été remplace par celui de la cystinosine (CD63-Cter-GFP), dans l’appareil de Golgi. Ces résultats confirment l’importance de la voie directe AP-3–dépendante dans l’adressage de la cystinosine au lysosome. La deuxième partie de mon projet a consisté à caractériser un éventuel nouveau rôle de la cystinosine. Grâce à une approche de protéomique, nous avons montré que la cystinosine interagissait avec divers membres de la voie mTORC1: les Rag GTPases RagA et RagC, les composantes du complexe Ragulator et la v -ATPase, pompe à protons couplant l’hydrolyse de l’ATP avec le transport de protons. Lors de la stimulation par des acides aminés, l’hétérodimère actif de Rag GTPases et le complexe pentamérique Ragulator recrutent mTORC1 à la surface des lysosomes, à proximité de son activateur Rheb, déclenchant la cascade de signalisation. En outre, il a été récemment montré que l'interaction, dépendante des acides aminés, entre la v-ATPase et le complexe Ragulator-Rag est nécessaire pour l’activation de mTORC1. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la cystinosine et la v-ATPase pourraient fonctionner ensemble dans un mécanisme lysosomal de détection d'acides aminés appelé "inside-out". En effet, nous avons montré que l'absence de cystinosine a un impact à la fois sur le recrutement de mTORC1 aux lysosomes et sur le positionnement de ces organelles en réponse à la déprivation puis à l’ajout des acides aminés, ce qui démontre le double rôle de ce transporteur d'acides aminés. Ce rôle nouvellement décrit de la cystinosine pourrait aider à mieux comprendre la physiopathologie de la cystinose, conduisant ainsi à l'amélioration des traitements existants. / Pas de résumé en anglais

- / -

Pas de résumé en français / Pas de résumé en anglais

Biologie cellulaire et moléculaire / Cell and molecular biology

Στην χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, η μειωμένη διήθηση του πλάσματος οδηγεί στην αυξημένη συγκέντρωση τοξινών στο αίμα. Αυτό προκαλεί δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, η οποία περιλαμβάνει την φλεγμονή, την αθηροσκλήρωση και τελικά την υπέρταση. Στο πλαίσιο της μελέτης της δράσης των μη διηθούμενων τοξινών, χρησιμοποιήθηκε ορός ασθενών πριν και μετά την αιμοκάθαρση. Ως in vitro σύστημα μελέτης, χρησιμοποιήθηκε πρωτογενής καλλιέργεια ενδοθηλιακών κυττάρων από ομφάλια φλέβα ανθρώπου (HUVEC) και ελέγχθηκε η επίδραση ορού πριν και μετά την αιμοκάθαρση, στον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, την μετανάστευση και την «επούλωση πληγών» των κυττάρων αυτών. Επίσης, μελετήθηκε η έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών MMP-2 και MMP-9 και των αναστολέων τους TIMP-1 και 2 σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης καθώς και η έκφραση του κολλαγόνου IV και της ελαστίνης. Χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενα πειράματα έδειξαν ότι ο μετά-ορός, σε σχέση με τον προ-ορό, επάγει τον πολλαπλασιασμό, την μετανάστευση και την διαδικασία της «επούλωσης πληγών» των ενδοθηλιακών κυττάρων με στατιστικά σημαντικό τρόπο, ενώ βρέθηκε να μειώνει την απόπτωση. Επίσης βρέθηκε ότι ο προ- ορός, σε σχέση με τον μετά- ορό, επάγει με στατιστικά σημαντικό τρόπο, την έκφραση και ενεργότητα των MMP-2 και MMP-9, ενώ καταστέλλει την έκφραση καθώς και τα επίπεδα των αναστολέων TIMP-1 και TIMP-2. Τέλος καταστέλλει την έκφραση των βασικών συστατικών της εξωκυττάριας ύλης, του κολλαγόνου IV και της ελαστίνης. Συμπερασματικά, ο ορός πριν την αιμοκάθαρση φαίνεται να συμμετέχει στην δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, καταστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό και την μετανάστευση και επάγοντας ταυτόχρονα την απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Παράλληλα ο προ-ορός καταστρέφει την εξωκυττάρια ύλη των ενδοθηλιακών κυττάρων επάγοντας τις MMP-2 και -9, καταστέλλοντας τους αναστολείς τους TIMP-1 και -2 και μειώνοντας ταυτόχρονα την έκφραση του κολλαγόνου IV και της ελαστίνης. / In chronic renal disease, reduced glomerular filtration results to increased toxin concentration in blood. This leads, among others, to endothelial dysfunction which concludes inflammation, atherosclerosis and finally hypertension. In this study, in order to investigate the effect of non-filtrated toxins, we used pre-haemodialysis and post-haemodialysis serum (control) from end-stage renal patients. As in vitro system of study we used the primary endothelial cell culture from human umbilical vein (HUVEC) and the effect of pre- and post- haemodialysis serum on cell proliferation, migration, apoptosis and wound healing was investigated. In addition, the expression of matrix metalloproteases MMP-2 and MMP-9 and their inhibitors TIMP-1 and TIMP-2 was examined. Time course and dose-response experiments revealed that pre-serum reduces proliferation, migration and wound healing, while induced apoptosis in a statistically significant manner. Pre-, compared to post-haemodialysis serum, induces the expression and activity of MMP-2 and MMP-9, while inhibits the expression of TIMP-1 and TIMP-2. Concluding, uremic toxins lead to endothelial dysfunction, inhibiting cell proliferation, cell migration and inducing apoptosis. In addition, uremic toxins contribute to the degradation of extracellular matrix, inducing MMP-2 and MMP-9 and inhibiting TIMP-1 and TIMP-2.

Μελέτη της κυτταροτοξικής και κυτταρογενετικής δράσης της δοξορουβικίνης σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, καθώς επίσης και της ικανότητας της εν λόγω ένωσης να επάγει την παραγωγή της 8-οξογουανίνης. Επίσης η μελέτη της συμμετοχής του πολυμορφισμού Ser326Cys στη δράση της παραπάνω ένωσης. / Evaluation of the involvment of Ser326Cys polymorphism to the cytotoxic and cytogenetic activity of doxorubicin in human lymphocytes cultured in vitro

- / -

L’assemblage et la propagation du Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) met en jeu des évènements moléculaires et cellulaires impliquant des interactions entre protéines virales et co-facteurs cellulaires, tels que les régulateurs du trafic vésiculaire des protéines. Le virus doit notamment échapper aux mécanismes de défense de l’hôte afin de se disséminer dans l’organisme. La protéine BST2 « Bone marrow STromal antigen 2 » (Tetherin/CD317/HM1.24) appartient à une famille de médiateurs de l’immunité intrinsèque de l’hôte : les facteurs de restriction. BST2 inhibe la libération des particules virales néo-formées en les séquestrant à la surface des cellules infectées. La protéine virale Vpu permet de lever cette restriction en excluant BST2 des zones de bourgeonnement viral. Les mécanismes exacts par lesquels Vpu contrecarre l’activité anti-virale de BST2 au site de bourgeonnement ne sont pas complètement élucidés, mais résultent d’une altération du trafic intra-cellulaire du facteur de restriction. Une caractérisation précise des fonctions cellulaires de BST2, encore mal définies, et des mécanismes moléculaires et cellulaires régulant cette protéine et son activité permettrait de mieux appréhender son rôle au cours de l’infection, ainsi que les mécanismes développés par Vpu pour contrecarrer son activité anti-virale. Dans cette optique, nous avons entrepris un crible protéomique dans le but d’identifier des co-facteurs cellulaires de BST2. Compte tenu de l’importance des machineries de régulation du trafic intra-cellulaire dans la biogenèse virale et les contre-mesures par lesquelles Vpu contrecarre BST2, nous nous sommes essentiellement focalisés sur deux protéines de la famille EHD (Eps15 Homology Domain) : EHD4 et EHD1, deux GTPases impliquées dans la régulation du trafic vésiculaire des protéines au niveau des endosomes précoces et de recyclage respectivement. EHD4 en particulier a précédemment été décrite comme étant un régulateur de la biogenèse de virions VIH-1 infectieux selon des modalités qui restent à définir. Les objectifs de mon projet de thèse ont été (i) d’analyser / valider le rôle d’EHD4 dans la régulation du trafic intra-cellulaire de BST2 en conditions non-infectieuses, (ii) d’évaluer le rôle d’EHD4 dans l’activité anti-virale de BST2 et son antagonisme par la protéine virale Vpu, et finalement (iii) de documenter la contribution des protéines EHD4 et EHD1 dans le de cycle de réplication du VIH-1. Nous avons pu montrer qu’EHD4 interagit avec BST2 et régule son trafic intra-cellulaire au niveau des endosomes précoces. La déplétion d’EHD4 induit une altération majeure du trafic de BST2, caractérisée par une rétention de BST2 au niveau des endosomes précoces, associée à un ralentissement de son adressage vers les compartiments de dégradation lysosomale. Dans un contexte infectieux, EHD4 ne semble pas requise pour la dégradation de BST2 induite par Vpu, ni pour l’antagonisme de son activité anti-virale par la protéine virale. Cependant, nous avons révélé une implication majeure d’EHD4 et d’EHD1 dans le cycle de réplication du VIH-1 : en effet, leur déplétion respective aboutit à un ralentissement drastique de la propagation virale. EHD4 et EHD1 favorisent le déroulement d’une étape précoce de l’infection antérieure à la rétro-transcription du génome virale dans la cellule nouvellement infectée. De plus, EHD4 et EHD1 contribuent à la biogenèse de virus infectieux : leur déplétion respective perturbe le trafic intra-cellulaire des constituants viraux, l’intégrité des zones de bourgeonnement viral et l’incorporation de la glycoprotéine d’enveloppe dans les virions nouvellement produits. Ces altérations se traduisent par une diminution de l’infectivité des virions produits en l’absence des protéines EHD4 et EHD1. / Assembly and egress of Human Immunodeficiency Virus (HIV) involve a highly orchestrated series of interactions between proteins encoded by the virus and cellular cofactors, such as regulators of intra-cellular vesicular trafficking. One key challenge for the virus is to overcome several levels of host defence mechanisms to propagate. The cellular protein BST2 (Bone marrow STromal cell antigen-2), also called Tetherin, was recently identified as a cellular restriction factor that retains viral particles at the surface of infected cells, thereby considerably reducing viral release. The accessory protein Vpu encoded by the HIV-1 counteracts this restriction by reducing BST2 expression at the viral budding sites. This process comes along with a diminished global expression of BST2 in the cells. The mechanisms underlying Vpu-mediated BST2 down-regulation at the viral budding sites are not fully understood. Studies performed in the laboratory, along with others published by international research groups, showed that this activity relies on interference with BST2’s intra-cellular trafficking. A deeper caraterization of BST2’s cellular functions and modes of regulation would allow for a better understanding of its role against HIV-1 infection and the viral countermeasures antagonizing its antiviral activity. To this aim, we performed a protemic screening in order to identify new BST2 cofactors. As HIV-1 hijacks the cellular machineries involved in the regulation of vesicular intra-cellular traffcking to promote virion biogenesis and BST2 antagonism, we focused our investigations on two hits belonging to the EHD family (Eps15 Homology Domain) : EHD4 and EHD1. Both proteins are GTPases that regulate the intra-cellular vesicular trafficking, respectively at early and recycling endosomes. EHD4 has previously been involved in the regulation of the biogenesis of infectious HIV-1 viral particles, the underlying mecanisms remaining unclear to date. The goals of the research project constituting my Ph.D were to (i) analyze / validate the implication of EHD4 in the regulation of BST2’s intra-cellular trafficking in a non-infectious context, (ii) decipher the role of EHD4 in the regulation of BST2’s antiviral activity and its Vpu-mediated antagonism, and (iii) assess the invovlment of EHD4 and EHD1 in the replication cycle of HIV-1. We showed here that EHD4 interacts with BST2 and regulates its intra-cellular trafficking at early endosomes in a non-infectious context. EHD4 depletion induces a major alteration of BST2 trafficking, as internalized BST2 seem to be retained at an early endosomal level and unefficiently targeted towards the lysosomal degradation pathway. In the context of HIV-1 infection, EHD4 does not seem to be required in the Vpu-mediated BST2 degradation, nor in the antagonism of BST2’s antiviral activity. Nevertheless, we unveiled a major involvment of both EHD4 and EHD1 in the HIV-1 replication cycle : their respective depletion leads to a severe impairment of viral propagation. EHD4 and EHD1 seem to facilitate an early step of the viral cycle prior to reverse transcription. Moreover, EHD4 and EHD1 participate in the biogenesis of infectious virions : their respective depletion alters the intra-cellular trafficking of viral components, the viral budding sites organization and the incorporation of the viral envelope glycoprotein into nascent particles. Thoses phenotypes combined result in a drastic decrease of the infectivity of virions produced in the absence of either EHD4 or EHD1.

La dynamique et la distribution mitochondriale sont essentielles pour l’homéostasie énergétique cellulaire. CLUH est une protéine indispensable à la distribution mitochondriale, dont la déplétion provoque une agrégation mitochondriale périnucléaire. Afin de comprendre le rôle de CLUH dans le métabolisme cellulaire, nous avons généré des cellules knockout CLUH par la méthode CRISPR-cas9. Nos résultats montrent que l’agrégation mitochondriale est associée à la diminution de la taille cellulaire et à la réduction quantitative des complexes de la chaîne respiratoire, menant ainsi à des défauts de la phosphorylation oxydative. Cette déficience énergétique est due à la perturbation de la traduction mitochondriale, et provoque un shift métabolique vers la glycolyse. Le profil métabolique des cellules KO montre un dysfonctionnement du cycle de Krebs et une altération de l’oxydation des acides gras. Dans ce sens, nous avons déterminé une fonction cruciale de CLUH dans le couplage de la distribution mitochondriale au contrôle de l’état cellulaire énergétique et métabolique. Pour approfondir l’analyse de la fonction de CLUH, nous avons effectué une étude de prédiction des domaines fonctionnels in silico, et avons identifié cinq domaines évolutivement conservés au sein de la séquence primaire de CLUH. De plus, nous démontrons que CLUH oligomérise en tétramères et en octomères, qui sont déstabilisés par l’expression ectopique de formes tronquées de CLUH dépourvues des domaines Clu-Nou TPR, par un effet dominant négatif. En résumé, nos résultats montrent l’importance de CLUH dans le maintien de l’homéostasie métabolique cellulaire, et une régulation potentielle de ses fonctions par oligomérisation. / Mitochondrial dynamics and distribution are critical insupplying ATP in response to energy demands. CLUHis a highly conserved protein involved in mitochondrial distribution, whose dysfunction leads to mitochondrial clustering around the nucleus. To gain insight into the role of CLUH in cellular metabolism, we generated CLUH knockout cells using CRISPR/Cas9. We show that mitochondrial clustering is associated with a smaller cell size and with decreased abundance of respiratory complexes, resulting in OXPHOS defects. This energetic impairment was found to be due to the alteration of mitochondrial translation, leading to a metabolic shift towards glucose dependency. Metabolomic profiling by mass spectrometry disclosed a dysfunctional Krebs cycle and an alteration of fatty acidoxidation. Thus, we established a clear function of CLUH in coupling mitochondrial distribution to the control of cellular energetic and metabolic status. To further analyze CLUH function, we performed in silico the prediction of the functional domains of this protein, disclosing 5 evolutionary conserved domains within the CLUH primary sequence. We reveal an oligomerization of CLUH into tetramers and octamers, and show a dominant negative effect associated to the expression of CLUH truncated forms missing Clu-N or TPR domains. Taken together, our studies reveal the importance of CLUH in maintaining cellular metabolism homeostasis and the potential regulation of its function through oligomerization.

Η δεσμίνη, η μυοειδική πρωτεΐνη των ενδιαμέσων ινιδίων, δημιουργεί ένα εκτενές δίκτυο που συνδέει τη συσταλτή συσκευή των μυοκυττάρων με την κυτταροπλασματική μεμβράνη -στο επίπεδο των εμβόλιμων δίσκων για τα καρδιομυοκύτταρα- τον πυρήνα και διάφορα μεμβρανώδη κυτταρικά οργανίδια. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν η διερεύνηση του μηχανισμού καρδιοπροστασίας που παρέχει ο κυτταροσκελετός της δεσμίνης in vivo, καθώς και η γενικότερη συμμετοχή της στα μονοπάτια της απόπτωσης. Η αποδιοργάνωση του κυτταροσκελετού είναι μια βασική διαδικασία για την εξέλιξη του μονοπατιού της απόπτωσης. Τόσο τα μικροϊνίδια της ακτίνης, όσο και τα ενδιάμεσα ινίδια -συμπεριλαμβανομένων και των πυρηνικών λαμινών- αποτελούν υπόστρωμα πέψης για διάφορα μέλη της οικογένειας των κασπασών. Η δεσμίνη είναι γνωστό ότι πέπτεται in vitro από ανασυνδυασμένη κασπάση-6, στο 263 ασπαρτικό οξύ. Το αμινοτελικό προϊόν αυτής της πέψης δεν είναι ικανό να συμμετέχει στη συγκρότηση ινιδίων, αλλά αντίθετα παρεμποδίζει αυτή τη διαδικασία σχηματίζοντας συσσωματώματα. Ως in vivo μοντέλο επαγωγής της απόπτωσης χρησιμοποιήθηκαν διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν, ειδικά στην καρδιά, τον Παράγοντα Νέκρωσης Όγκων (Tumor Necrosis Factor, TNF-α). O TNF-α έχει βρεθεί ότι επάγει διαφορετικά μονοπάτια κυτταρικού θανάτου ενεργοποιώντας, μεταξύ άλλων, μέλη της οικογένειας των πρωτεολυτικών ενζύμων, των κασπασών. Το μυοκάρδιο των ποντικιών που υπερεκφράζει TNF-α (ΜΗCsTNF) χαρακτηρίζεται αρχικά από ομόκεντρη υπερτροφία των καρδιομυοκυττάρων που ακολουθείται από διάταση τόσο των κόλπων, όσο και των κοιλιών. Τα ποντίκια αυτά πεθαίνουν από καρδιακή ανεπάρκεια σε ποσοστό 25% πριν τη συμπλήρωση του έκτου μήνα ζωής. Στο μυοκάρδιο των ΜΗCsTNF ποντικιών ελέγχθηκε αρχικά ο υποκυτταρικός εντοπισμός της δεσμίνης. Η δεσμίνη στην καρδιά των ΜΗCsTNF ποντικιών έχει χάσει τον εντοπισμό της στους εμβόλιμους δίσκους, αλλά διατηρεί, εν μέρει, την παρουσία της στους Ζ-δίσκους. Προκειμένου να διαπιστωθεί εάν εκτός από τη δεσμίνη, έχει αλλοιωθεί η παρουσία και άλλων πρωτεϊνών των εμβόλιμων δίσκων, μελετήθηκε στο μυοκάρδιο αυτών των ποντικιών, η υποκυτταρική κατανομή της δεσμοπλακίνης, της β-κατενίνης και της κοννεξίνης 43, που είναι χαρακτηριστικές πρωτεΐνες των δεσμοσωμάτων, των συνδέσμων πρόσδεσης και των χασματοσυνδέσμων, αντίστοιχα. Οι πρωτεΐνες αυτές αρχικά φαίνεται να αγκυροβολούνται στους εμβόλιμους δίσκους, παροδικά όμως απομακρύνονται και κατευθύνονται προς την πλευρική επιφάνεια των καρδιομυοκυττάρων. Μελέτη με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο αποκάλυψε ότι εκτός από την κατανομή συγκεκριμένων πρωτεϊνών, είναι διαταραγμένη και η γενική αρχιτεκτονική των εμβόλιμων δίσκων. Επιπρόσθετα, πιστοποιήθηκε ότι η δεσμίνη πέπτεται in vivo και συσσωρεύεται σε συσσωματώματα. Η παρουσία συσσωματωμάτων δεσμίνης έχει συσχετιστεί με αρκετές κληρονομικές μυοπάθειες στον άνθρωπο, οι οποίες χαρακτηρίζονται ως Μυοπάθειες Σχετιζόμενες με τη Δεσμίνη (Desmin Related Myopathies, DRM). Μεταλλάξεις, αλλά και τροποποιήσεις στη δεσμίνη ή σε άλλες πρωτεΐνες με τις οποίες αλληλεπιδρά προκειμένου να δημιουργήσει το συνεχόμενο κυτταροσκελετικό δίκτυο, έχουν ως συνέπεια τη συγκέντρωση συσσωματωμάτων στο κυτταρόπλασμα και έχουν ενοχοποιηθεί για τη διατατική μυοκαρδιοπάθεια και την εξέλιξη της καρδιακής ανεπάρκειας. Στο μυοκάρδιο των ΜΗCsTNF ποντικιών πιστοποιήθηκε η παρουσία δύο διαφορετικών ειδών συσσωματωμάτων της δεσμίνης. Τα πρώτα εμφανίζουν διάχυτο κυτταροπλασματικό πρότυπο και η δεσμίνη σε αυτά συνεντοπίζεται με την HSP25, ενώ τα δεύτερα τείνουν να περιοριστούν κοντά στον πυρήνα και εδώ η δεσμίνη συνεντοπίζεται με την ουμπικουϊτίνη. Μελέτη της υπερδομής των συσσωματωμάτων έδειξε ότι ποικίλουν σε μέγεθος και σύσταση, καθώς περιέχουν κυστίδια, μιτοχόνδρια, μεμβρανώδες υλικό και υλικό υψηλής πυκνότητας, που φαίνεται ότι παρεμποδίζουν, εκτός από τη λειτουργία του πρωτεασώματος, την συσταλτική ικανότητα των μυοϊνιδίων και συμβάλλουν στην εξέλιξη της καρδιακής ανεπάρκειας. Προκειμένου να μελετηθεί η σπουδαιότητα της δεσμίνης στην παθολογία του μυοκαρδίου που υπερεκφράζει TNF-α, ΜΗCsTNF ποντίκια διασταυρώθηκαν με ποντίκια που δεν εκφράζουν δεσμίνη (des-/-). Τα des-/- ποντίκια χαρακτηρίζονται από μια παροδική υπερτροφία των καρδιομυοκυττάρων, η οποία ακολουθείται από ανάπτυξη διατατικής μυοκαρδιοπάθειας με εξέχοντα χαρακτηριστικά τις ανωμαλίες στα μιτοχόνδρια, το μαζικό κυτταρικό θάνατο και τις εκτενείς εναποθέσεις ασβεστίου στην εξωτερική επιφάνεια της καρδιάς και κολλαγόνου στο εσωτερικό της. Τα ΜΗCsTNF des-/- ποντίκια παρουσίασαν δραματική μείωση και στις δύο μορφές συσσωματωμάτων, ενώ η δεσμοπλακίνη και η β-κατενίνη -πρωτεΐνες που ανήκουν σε μια ενιαία και διαπλεκόμενη μορφή κυτταρικών συνδέσεων, την “area composita”- διατήρησαν σημαντικά την παρουσία τους στους εμβόλιμους δίσκους. Οι παρατηρήσεις αυτές υπογραμμίζουν το βαθμό στον οποίο η δεσμίνη συμμετέχει στην εξέλιξη του ΜΗCsTNF φαινοτύπου. Παραδόξως, στο μυοκάρδιο των ΜΗCsTNF des-/- ποντικιών δεν παρατηρούνται τα μορφολογικά χαρακτηριστικά που προκαλεί η έλλειψη της δεσμίνης, ενώ διατηρούνται αυτά της υπερέκφρασης του TNF-α, υποδηλώνοντας ενδεχόμενη προστατευτική δράση του TNF-α για τα des-/- καρδιομυοκύτταρα. Η διερεύνηση του μηχανισμού της πέψης της δεσμίνης από την κασπάση-6, αλλά και της απομάκρυνσής της από τους εμβόλιμους δίσκους, με τις συνακόλουθες συνέπειες, αποτέλεσε τον επόμενο στόχο αυτής της εργασίας. Για το σκοπό αυτό, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν τη μεταλλαγμένη δεσμίνη D263E, η οποία στο 263 αμινοξύ φέρει αντί για ασπαρτικό, γλουταμινικό οξύ. Η D263E δεσμίνη δεν πέπτεται από τις κασπάσες στο ΜΗCsTNF μυοκάρδιο, διατηρεί σε μεγάλο βαθμό την παρουσία της στους εμβόλιμους δίσκους και φαίνεται ότι συγκρατεί και τις υπόλοιπες πρωτεΐνες της “area composita” στη δομή αυτή. Επιπλέον, τα συσσωματώματα της ουμπικουϊτίνης μειώνονται σημαντικά και χάνεται ο συνεντοπισμός με τη δεσμίνη σε όσα από αυτά σχηματίζονται. Τέλος, η παρουσία της D263E δεσμίνης μείωσε τον αριθμό των αποπτωτικών καρδιομυοκυττάρων στο ΜΗCsTNF μυοκάρδιο και βελτίωσε σημαντικά την καρδιακή λειτουργία. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας υπογραμμίζουν ότι η δεσμίνη είναι ένα μόριο με σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της μυοκαρδιοπάθειας και της καρδιακής ανεπάρκειας, στο μοντέλο που προκαλείται από την υπερέκφραση του TNF-α. Η συμμετοχή της στο μονοπάτι της απόπτωσης ως υπόστρωμα πέψης για τις κασπάσες και οι επακόλουθες συνέπειες, αποτελούν βάση μελέτης του ρόλου των ενδιαμέσων ινιδίων και για άλλες εκφυλιστικές νόσους. / Desmin, the muscle specific intermediate filament protein, forms a three-dimensional scaffold which links the contractile apparatus to the plasma membrane intercalated disks (IDs), the nucleus and also other membranous cellular organelles. The main goal of this study was to assess the mechanism of cardioprotection by the desmin cytoskeleton in vivo and its participation in the apoptotic pathway. Disruption of the cytoskeleton is a key event in apoptotic cell death pathways. Both actin microfilaments and intermediate filaments -including the nuclear lamins- are substrates for cleavage by different members of the caspase family. Desmin is known to be specifically cleaved in vitro, by caspase-6, at the 263 aspartic acid residue. The amino-terminal product of desmin cleavage is completely unable to assemble into filaments and forms intracellular aggregates. The in vivo model used for the induction of apoptosis was transgenic mice that overexpress specifically in the heart the Tumor Necrosis Factor-α (ΤΝF-α). ΤΝF-α has been described to induce several cell death pathways that converge on activation of different members of the caspase proteolytic enzyme family. The myocardium of mice that overexpress ΤΝF-α (ΜΗCsTNF) is characterized by concentric hypertrophy of cardiomyocytes followed by chamber dilation. 25% of ΜΗCsTNF mice die by heart failure before the age of sixth month. We examined the subcellular localization of desmin in the myocardium of ΜΗCsTNF mice. Desmin is absent from the IDs of ΜΗCsTNF myocardium whereas it preserves, in part, its presence at Z-disks. In order to delineate whether the relocalization of desmin influences the position of other ID proteins, we examined the subcellular localization of desmoplakin, β-catenin and connexin 43, which are characteristic proteins of desmosomes, adherent junctions and gap junctions respectively. At early stages, these proteins localize almost normally in MHCsTNF cardiomyocytes, however, in the 3-month old MHCsTNF mice, all studied proteins were primarily localized at the lateral, non-junctional, side of the cardiomyocytes. Ultrastructural study of the MHCsTNF myocardium revealed that the overall ID architecture is altered. Additionally, we show that desmin is cleaved in vivo and accumulates into cytoplasmic aggregates. The presence of desmin positive aggregates has been correlated with several human inherited myopathies called Desmin Related Myopathies (DRM). Mutations within its gene or in the genes of other desmin associated cytoskeletal proteins, result in accumulation of aggregates in the cytoplasm and have been linked to Dilated Cardiomyopathy (DCM) and heart failure. In the MHCsTNF myocardium we observe two distinct kinds of aggregates that are positive for desmin. The first ones are diffused in the cytoplasm and desmin colocalizes with HSP25, while in the second category the aggregates tend to be restricted near the nucleus and desmin colocalizes with ubiquitin. Ultrastructural study of the aggregates reveals that they are variable in size and composition, consisting of vesicles, mitochondria, membranous whorls and, occasionally, clumps of electron dense material, suggesting that, in addition to other functions such as proteasome activity, they may interfere with the sarcomere contraction thereby leading to impairment of cardiac function. In order to study the importance of desmin in the development of the ΜΗCsTNF pathology, we crossed ΜΗCsTNF mice with desmin null mice (des-/-). In desmin-deficient mice transient cardiomyocyte hypertrophy is followed by development of a DCM that is characterized by mitochondrial functional, ultrastructural and other defects, extensive cell death, fibrotic lesions and calcium deposition at the external surface of the heart. ΜΗCsTNF des-/- mice showed significant decrease in both kind of aggregates, whereas desmoplakin and β-catenin -proteins that belong to the uniform cardiomyocyte junctional structure “area composita”- preserve at high degree their presence at IDs. These observations underline the level at which desmin participates in the progress of ΜΗCsTNF phenotype. Surprisingly, the myocardium of ΜΗCsTNF des-/- mice eliminated the morphological defects caused by the absence of desmin while retained those caused by TNF-α overexpression, suggesting a possible counteracting action of TNF-α in the des-/- cardiomyocytes. To investigate the mechanism and the importance of desmin cleavage by caspase-6 and its withdrawal from IDs with the concomitant consequences, we generated transgenic mice with cardiac-restricted expression of a desmin mutant (D263E), harboring a substitution of the 263 aspartic acid (D) with a glutamic acid (E), which renders desmin resistant to caspase mediated cleavage. We showed that D263E desmin is indeed resistant to caspase cleavage in the ΜΗCsTNF myocardium, largely retains its proper ID localization and allows the same for the other proteins of the area composita. Additionally, the ubiquitin positive aggregates are diminished and the few generated do not colocalize with desmin. Importantly, D263E desmin expression attenuated cardiomyocyte apoptosis, prevented left ventricular wall thinning and improved function of MHCsTNF hearts. To summarize, the data presented in this study underline that desmin is a target and mediator of ΤΝF-α induced cardiomyopathy and heart failure. Its contribution in the pathway of apoptosis as a substrate for caspase cleavage and the subsequent participation in the formation of aggregates and the alteration of the ID architecture is the baseline for the study of the role of Intermediate Filaments in degenerative diseases.