L’autophagie, processus catabolique lysosomal de recyclage de constituants cellulaires, est essentielle à la survie, à la différenciation et au maintien de l’homéostasie cellulaire. Ce processus est fréquemment impliqué dans la survie et la chimiorésistance des tumeurs. La leucémie aiguë promyélocytaire (LAP) est caractérisée par un blocage de la différenciation de la lignée hématopoïétique au stade promyélocytaire. Le traitement des LAP a considérablement progressé depuis l’administration aux patients de doses pharmacologiques d’acide rétinoïque tout-trans (ATRA), un puissant agent de différenciation. L’objectif de ma thèse a consisté à étudier la régulation de l’autophagie au cours de l’induction de différenciation des cellules de LAP par l’ATRA et de rechercher son implication éventuelle dans les mécanismes d’action de ce traitement et les modes d’échappement observés. Lors de mon travail de thèse, j’ai mis en évidence une activation de l’autophagie lors de l’induction de la différenciation granulocytaire des cellules de LAP par l’ATRA. J’ai montré que cette réponse était associée à une inhibition de la voie mTOR et une induction de l’expression des protéines BECLIN 1 et p62/SQSTM1. De façon intéressante, les cellules de LAP résistantes à la maturation par l’ATRA ne sont pas capables d’induire l’expression de p62/SQSTM1 en réponse à l’ATRA. De même, l’expression de p62/SQSTM1 dans les blastes des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde est plus faible que celle des granulocytes de sujets sains. L’ensemble de ces données indique que l’expression de p62/SQSTM1 est réprimée dans les phénotypes immatures des cellules myéloïdes mais au contraire induite dans les cellules leucémiques qui s’engagent vers une différenciation terminale (granulocytes/neutrophiles). Enfin, j’ai démontré que les protéines BECLIN 1 et p62/SQSTM1 sont essentielles à la survie de cellules de LAP matures mais non pas à l’engagement de ces cellules vers la différenciation granulocytaire. Ainsi, ces résultats suggèrent qu’en permettant la survie des cellules de LAP différenciées, p62/SQSTM1 et BECLIN 1 pourraient contribuer au développement des résistances à l’ATRA et/ou à l’induction des complications associées à ce traitement tel que le syndrome de différenciation. / Autophagy, a lysosomal process used by the cell to degrade and recycle cytoplasmic constituents, is essential for cell survival, differentiation and the maintenance of cellular homeostasis. Autophagy is often involved in cell survival and resistance to anti-tumor therapy. Acute promyelocytic leukemia (APL) results from a blockade of granulocyte differentiation at the promyelocytic stage. All-trans retinoic acid (ATRA), a potent differentiation agent, has been shown to induce clinical remission in APL patients. The aim of our study was to investigate the regulation and roles of autophagy during ATRA-induced APL cells maturation into neutrophils/granulocytes with the ultimate objective to identify critical mechanisms involved in chemoresistance of APL patients. During my thesis, I demonstrated that autophagy is upregulated during the course of ATRA-induced neutrophil/granulocyte differentiation of APL cells. This response is associated with inhibition of mTOR activity and upregulation of both BECLIN 1 and p62/SQSTM1 proteins. Interestingly, induction of p62/SQSTM1 by ATRA was impaired in maturation-resistant NB4 cells but is re-activated when differentiation was restored in these cells. Accordingly, primary blast cells of AML patients exhibited significantly lower p62/SQSTM1 mRNA levels than did granulocytes from healthy donors. Together, these results highlight that p62/SQSTM1 expression level is repressed in immature myeloid cells compared to mature ones. Moreover, I demonstrated that BECLIN 1 and p62/SQSTM1 proteins are essential for the survival of myeloid cells that undergo differentiation but have no crucial effect on the granulocytic differentiation. This finding may help to elucidate the mechanisms involved in ATRA resistance of APL patients, and in the ATRA syndrome caused by an accumulation of mature APL cells.

Chez les mammifères, les carences nutritionnelles telles que les carences en acides aminés constituent un stress nutritionnel important. Pour faire face à ces situations, l'organisme dispose de processus adaptatifs tels que l'autophagie, régulés par de multiples voies de signalisation. Au niveau cellulaire, plusieurs voies de signalisation sont impliquées dans la régulation de ces processus adaptatifs qui permettent la survie cellulaire lors de différentes conditions de stress environnementaux y compris la carence en acides aminés. En particulie,r la voie eIF2α/ATF4 joue un rôle crucial dans l'adaptation des cellules à ces différents stress notamment en régulant la transcription de nombreux gènes cibles spécifiques. L'objectif de ce travail était donc de déterminer le rôle de la voie eIF2α/ATF4 dans la régulation de la transcription des gènes impliqués dans l'autophagie en réponse à carence en acides aminés. En utilisant p62 comme un modèle de travail, nous avons montré que la kinase GCN2 qui phosphoryle eIF2α et les facteurs de transcription ATF4 et CHOP jouent un rôle clé dans la régulation de la transcription d'un grand nombre de gènes impliqués dans le processus autophagique en réponse à une carence en acides aminés. Nous avons en particulier identifié 3 classes de gènes de l'autophagie selon leur dépendance à ATF4 et CHOP et la liaison de ces facteurs sur les éléments spécifiques de leurs promoteurs en fonction de l'intensité du stress. PLus généralement, nous avons démontré que ce mécanisme pouvait également être activé par la kinase PERK lors d'un stress du réticulum endoplasmique. Enfin, nous avons pu montrer que durant les 6 premières heures de la carence en acides aminés, la voie eIF2α/ATF4/CHOP n'est pas impliquée dans la diminition de la viabilité cellulaire. Cependant, lorsque la carence en acides aminés est prolongée (16-48h), CHOP joue un rôle clé dans la régulation de l'apoptose et dans la répression du processus autophagique en contrôlant la transcription des gènes cibles spécifiques. Ainsi, ce travail a permis de mettre en évidence qu'en cas de carence en acides aminés, la voie eIF2α/ATF4/CHOP joue un rôle clé dans le devenir de la cellule. En fonction de la durée et de l'intensité du stress, la régulation très coordonnée de ces mécanismes moléculaires va permettre successivement la survie de la cellule et ensuite l'apoptose. / In mammals nutritional deficiencies such as amino acid limitation are an important nutritional stress. To deal with these situations, the body has adaptive processes such as autophagy regulated by multiple signaling pathways. At the cellular level, several signaling pathways are involved in the regulation of these adaptive processes that allow cell survival in different conditions of environmental stress, including amino acid deficiency. In particular, the eIF2α/ATF4 pathways plays a crucial role in the adaptation of these cells to various stresses such as the transcriptional regulation of many specific target genes. The aim of this work was to identify the role of the eIF2α/ATF4 pathway in the stress-regulated transcription of mammalian autophagy genes. Using p62 as a working model, we have shown that the GCN2 eIF2α-kinase and ATF4 and CHOP transcription factors are required to increase transcription of a set of autophagy genes implicated in the formation, elongation and function of the autophagosome. We also identify 3 classes of autophagy genes according to their dependence on ATF4 and CHOP and the binding of these factors to specific promoter cis elements. Furthermore, different combinations of CHOP and ATF4 bindings to target promoters allow the trigger of a differential transcriptional response according to the stress intensity. Furthermore, we have demonstrated that the same mechanism can also be activated by ER stress through PERK eIF2α-kinase activation. We also show that during the first 6h of starvation, CHOP up-regulates a number of autophagy genes while cell viability is not affected. By contrast, when the amino acid starvation is prolonged (16-48h), we demonstrated that CHOP has a dual role in both limiting autophagy and inducing apoptosis through the transcriptional activation of specific target genes. Thus, this work establishes that following amino acid starvation, the eIF2α/ATF4 pathway plays a key role in the cell fate. Depnding on the duration and intensity of the stress, the highly coordinated regulation of these molecular mechanisms sequentially will allow the survival of the cell and subsequently apoptosis.

Comme pour la plupart des virus à ARN+, le VHC induit des remaniements membranaires appelés membranous web. Les protéines non structurales virales formant le complexe de réplication du virus sont associées à ces membranes néosynthétisées. La compréhension de la mise en place de ces membranes cellulaire est encore actuellement mal connue. Afin d’étudier ce phénomène, nous avons dans un premier temps sélectionné des clones cellulaires Huh7.5 hébergeants un réplicon sous-génomiquedu virus. Nous avons ainsi pu mettre en évidence la présence d’un réseau multivésiculaire semblant provenir de l’induction de mécanismes d’autophagie. Plus récemment l’utilisation du modèle de propagation du virus complet nous a permis de mieux caractériser ce réseau multivésiculaire en déterminant trois sous réseaux vésiculaires structuralement différents. L’analyse de cette étude est effectuée principalement par microscopie électronique avec des techniques innovantes tels que la reconstruction tridimensionnelle et des immunogolds. / As other RNA viruses, HCV induces membrane alterations termed membranous web and its nonstructural proteins forming the viral replication complex are associated to these neo-synthesized membranes. The mechanism underlying these host cell membranes alterations is still currently unknown. To investigate this mechanism, we initially selected Huh7.5 cells clones harbouring a HCV subgenomic replicon. We were able to demonstrate the presence of a multivesicular network apparently linked to the autophagy induction mechanisms. More recently, using the cell culture-adapted HCVsystem, we better characterized this network by determining three multivesiculars vesicles structurally different subnets. This study was carried out mainly by performing electron microscopy observations,with using innovative techniques such as three-dimensional reconstruction and immunogold.

Yersinia pseudotuberculosis appartient à la famille des Enterobacteriaceae et peut être responsable de syndromes articulaires et digestifs. Au cours de la colonisation de l’hôte, une minorité des bactéries va, en plus de l’étape de multiplication extracellulaire présenter une phase de réplication intracellulaire dans les macrophages. Une partie des Y. pseudotuberculosis va se répliquer dans les macrophages en usurpant la voie de l’autophagie, afin de créer une niche réplicative au sein des autophagosomes bloqués dans leur maturation. Le trafic membranaire associé à l’infection de Y. pseudotuberculosis reste à ce jour peu caractérisé. Dans un premier temps, nous avons observé que lors de l’infection d’une cellule épithéliale par Y. pseudotuberculosis, la vacuole bactérienne est associée avec le marqueur des autophagosomes, la protéine LC3 mais de façon surprenante cette vacuole ne présente pas deux mais une membrane unique. Par ailleurs, nous avons montré que les protéines SNARE jouent un rôle majeur au cours du trafic intracellulaire de Y. pseudotuberculosis. VAMP3 et VAMP7 sont recrutées de manière séquentielle au niveau de la vacuole de Y. pseudotuberuclosis. VAMP7 va participer au recrutement de LC3 au niveau de la vacuole bactérienne et nous proposons que VAMP3 est un des constituants du check-point permettant l’adressage de la bactérie vers des vacuoles présentant une ou de multiple membranes positives pour LC3. Par la suite, nous nous sommes intéressés à la caractérisation des protéines de la voie autophagique et des endosomes, recrutées au niveau de la vacuole bactérienne à membrane unique et positive pour LC3. Nous avons mis en évidence que les protéines impliquées dans la formation de l’autophagosome et les marqueurs des endosomes précoces sont recrutées au niveau de la vacuole contenant Y. pseudotuberculosis. Cette vacuole positive pour LC3 va en suite acquérir les marqueurs des endosomes tardifs et du lysosome mais n’est pas acidifiée. En outre, nous avons initié des travaux sur un criblage en haut contenu afin d’identifier les partenaires des protéines SNARE et leurs rôles dans le trafic intracellulaire de Y. pseudotuberuclosis. Ces travaux démontrent l’importance de l’analyse de l’ultrastructure des compartiments positifs pour LC3. Ils illustrent comment la bactérie s’adapte à son environnement pour établir sa niche réplicative. Ils présentent enfin l’importance de la régulation de l’autophagie avec la première mise en évidence d’un check-point entre deux voies de compartimentation positives pour LC3 mais morphologiquement différentes. / Yersinia pseudotuberculosis is a member of the Enterobacteriaceae family. In human, Y. pseudotuberculosis infection is responsible for enteric and, in rare cases, erythema nodosum. During host colonization, a minor part of Y. pseudotuberculosis presents an intracellular replication step. Y. pseudotuberculosis can replicate inside macrophages by hijacking the autophagy pathway. The bacteria are able to block autophagosome maturation by acidification impairment, which allows to create a replicative niche. The membrane traffic during internalization of Yersinia remains poorly characterized. First, we highlighted that in epithelial cells, Y. pseudotuberculosis replicates mainly in vacuoles positive for LC3, a hallmark of autophagy. Surprisingly, this LC3-positive-vacuole presents only single limiting membrane. Second, we showed that SNARE proteins play a role in Y. pseudotuberculosis intracellular traffic. VAMP3 and VAMP7 are sequentially recruited to Yersinia-containing vacuoles (YCVs). VAMP7 is involved in the LC3 recruitment to YCVs with single- and double-membrane. We proposed that VAMP3 is a component of the molecular checkpoint for bacterial commitment to either single- or double-membrane LC3-positive pathway. Third, we characterized the traffic of endosomal proteins recruited to LC3-positive-YCV with single membrane in epithelial cells. We showed that markers of early endosome and proteins involved in autophagosome formation, are recruited to YCVs during the early stage of infection. Then, the vacuole acquire late endosomal and lysosomal proteins but acidification is not observed. Finally, we initiated a high-content screening approach for the identification of SNARE partners.Overall this work illustrates the importance of LC3-positive compartment ultrastructure analysis. Our result demonstrate how bacterial subvert the molecular machinery of the host in order to create a replicative niche. Finally, we present the importance of autophagy regulation by highlighting for the first times the existence of a molecular checkpoint between two LC3-positive vacuoles with different morphologies

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des hémopathies malignes caractérisées par une accumulation dans la moelle et le sang de progéniteurs hématopoïétiques bloqués dans un stade différenciation. La mutation FLT3-ITD, qui entraîne une activation constitutive du récepteur à activité tyrosine kinase FLT3, est retrouvée dans 20-25% des LAM et est associée à un mauvais pronostique. De nombreux inhibiteurs de FLT3 ont été développés et certains sont testés en clinique mais des études mettent en évidence l'apparition de résistance. Une meilleure compréhension des mécanismes oncogéniques de FLT3-ITD est donc nécessaire afin d'améliorer le traitement des LAM. Mes travaux de thèse ont été centrés sur l'analyse du processus autophagique qui correspond à l'un des mécanismes de résistance décrits dans les cellules cancéreuses en réponse aux traitements. Au cours de cette étude, nous avons constaté que l'expression de FLT3-ITD augmente l'autophagie basale des cellules de LAM, et que l'inhibition du récepteur réduit cette autophagie dans des échantillons primaires de LAM et dans des lignées cellulaires. Nous avons pu montrer que l'autophagie est requise pour la prolifération et la survie in vitro et in vivo des cellules de LAM et que sont ciblage permet de surmonté la résistance aux inhibiteurs de FLT3. De plus, nous avons identifié la protéine ATF4 comme un acteur essentiel au processus d'autophagie en aval de FLT3-ITD. Ces résultats suggèrent que le ciblage de l'autophagie ou d'ATF4 chez les patients exprimant les mutations de FLT3 peut représenter une stratégie thérapeutique prometteuse et innovatrice dans les LAM. / Acute myeloid leukemias (AMLs) are a family of hematological malignancies characterized by an accumulation in the marrow and blood of hematopoietic progenitors blocked in their differentiation process. The FLT3-ITD mutation is found in 20-25% of AMLs and is associated with a poor prognosis. Different FLT3 inhibitors have been developed and some of them are clinically tested but resistance to treatment has been observed in many patients. A better understanding of AML biology is necessary in order to improve the treatment of AMLs. My thesis project focused on the analysis of the autophagic process, which is one of the mechanisms described in the resistance of cancer cells. In this study, we found that the FLT3-ITD expression increases basal autophagy in AML cells, and that the receptor inhibition reduced this autophagy in primary patient samples and cell lines. We show that autophagy is required for proliferation and survival in vitro and in vivo of leukemic cells lines and inhibition of autophagy overcomes resistance to FLT3 inhibitors. In addition, we identified the ATF4 protein as a key actor of the autophagy process induced by the FLT3-ITD mutation. These results suggest that targeting autophagy or ATF4 may represent a promising and innovative therapeutic strategy for FLT3 mutated AMLs.

La plupart des chimiothérapies sont connues pour exercer une immunosuppression en plus de leur effet cytotoxique, car elles ciblent sans distinction les cellules à prolifération rapide telles que les cellules tumorales ainsi que les cellules du système immunitaire. Cependant, la radiothérapie ainsi que certaines chimiothérapies comme les anthracyclines ou l’oxaliplatine ont montré une propriété immunostimulante, grâce à l’induction d’une mort cellulaire dite immunogène. Cette mort cellulaire se caractérise par la libération de signaux de danger par la cellule mourante qui vont activer le système immunitaire. Tout d’abord, l’exposition de la calréticuline à la surface de la cellule va être un signal de phagocytose pour les cellules dendritiques. Les cellules succombant à la mort cellulaire libèrent aussi HMGB1 qui en se liant à TLR4 permet un apprêtement et une présentation des antigènes tumoraux efficace. Ensuite, la libération d’ATP qui agit sur les récepteurs P2RX7 permet l’activation de l’inflammasomme NLRP3 et conduit à la sécrétion d’IL-1β indispensable pour l’activation des lymphocytes T CD8+ sécrétant de l’IFN-γ. L’autophagie est un processus de dégradation permettant de limiter l’instabilité génomique et l’initiation de cancers. L’autophagie, peut être induite après un stress du réticulum endoplasmique, qui est nécessaire à l’exposition de la calréticuline lors de la mort cellulaire immunogène. Nous avons donc cherché à évaluer l’importance de l’autophagie après traitement aux chimiothérapies immunogènes. Nous avons montré que l’autophagie est requise pour induire la libération d’ATP lors de la mort cellulaire immunogène. De plus, nous avons montré que l’ATP libéré par les cellules mourantes après traitement aux chimiothérapies immunogènes permet le recrutement de cellules de type monocyte inflammatoire (CD11b+Ly6ChighLy6G-) ainsi que de leurs précurseurs. En outre, l’ATP est un facteur important dans la différenciation de ces cellules en cellules dendritiques inflammatoires. Les cellules CD11b+Ly6ChighLy6G- ont montré une grande capacité à présenter les antigènes tumoraux aux lymphocytes T CD8+ permettant leur activation. Les cellules déficientes pour l’autophagie n’ont quant à elles pas permit le recrutement de cellules dendritiques dans les tumeurs ni l’activation de lymphocytes T CD8+. Ces travaux ont permit de montrer l’importance de l’autophagie pour mettre en place une réponse immunitaire anti-tumorale spécifique lors du traitement avec des chimiothérapies immunogènes. De plus, nous avons montré que l’ATP est impliqué dans le recrutement et la différenciation de cellules avec un phénotype de monocytes inflammatoires. L’ensemble de ces résultats apporte de nouveaux éléments dans la caractérisation du processus de mort cellulaire immunogène. / Most of the cytotoxic agents used in cancer therapy are known to be immunosuppressive, because of their unspecific targeting of rapidly dividing cells, like tumor cells, but also cells of the immune system. However, radiotherapy, as well as some chemotherapeutic agents such as anthracyclines or oxaliplatine were reported to have immunostimulatory effects, thanks to their capacity to induce immunogenic tumor cell death. This type of cell death is characterized by the release of danger signals from the dying tumor cell, which will activate the immune system. As a first event, exposure of calreticulin from the dying tumor cell will act as an « eat-me » signal for dendritic cells. Once released, the nuclear protein HMGB1 will bind to TLR4, facilitating antigen processing and presentation. The dying tumor cells will also release ATP, which acts on P2X7 receptors and activates NLRP3 inflammasomme, leading to IL-1 release, necessary for IFN-- producing CD8+ T cells activation. Autophagy is a degradation process limiting genomic instability and cancer initiation. It can be induced after a stress of the endoplasmic reticulum (ER). ER-stress is also involved in calreticulin exposure during immunogenic cell death, so we aimed at understanding the role of autophagy in immunogenic cell death. We found that autophagy is required for the release of ATP after treatment with immunogenic chemotherapies. Moreover, we showed that ATP released from the dying cells is necessary for the recruitment of immune cells with inflammatory monocyte phenotype (CD11b+Ly6ChighLy6G-), as well as their precursors. ATP was also important for the differentiation of these inflammatory monocytes into dendritic cells. These CD11b+Ly6ChighLy6G- cells were efficient in presenting the tumor antigens to CD8+ T cells, and to induce a tumor-specific immune response. However, autophagy-deficient cells were not able to recuit dendritic cells or to induce CD8+ T cells activation. These studies showed the importance of autophagy in tumor-specific immune response, after treatment with immunogenic chemotherapies. We also reported that ATP is involved in the recruitment and differentiation of cells with inflammatory monocytes phenotype. Altogether, these results give new insights in the concept of immunogenic cell death.

Le cancer colorectal est une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde entier. Des études épidémiologiques révèlent une corrélation inverse entre le risque de développer un cancer du côlon et un régime alimentaire riche en ail. De nombreux travaux scientifiques rapportent l'activité anti-cancéreuse des polysulfures de diallyle (PSDA) dérivés de l'ail dans divers types de cancer in vitro et in vivo. Le mécanisme d'action le mieux connu repose sur l'induction de l'arrêt mitotique suivi de l'apoptose. La tubuline est identifiée comme nouvelle cible thérapeutique des PSDA. La tubuline est fondamental dans la progression de l'autophagie, source nutritionnelle essentielle pour le développement du cancer au stade avancé, et l'activation de l'autophagie joue un rôle de chimiorésistance dans le traitement du cancer du côlon. L'hypothèse de ce projet est que les PSDA dérivés de l'ail interagissent avec la tubuline pour altérer l'organisation du réseau microtubulaire responsable de l'inhibition de la prolifération cellulaire et de la modulation de l'autophagie dans le cancer du côlon. Dans un premier temps, nous avons analysé l'impact du TTSDA/TTSDB sur le réseau microtubulaire. Nous avons montré que le TTSDA/TTSDB interagissait avec la tubuline par spectrométrie en masse. Nous avons montré que l'organisation microtubulaire est altérée dans les trois lignées cellulaires : HT-29 (mutées BRAF), SW480 (mutées KRAS) et SW620 (mutées KRAS, métastatiques), plus sensibles au TTSDB que le TTSDA. Dans un deuxième temps, nous avons étudié le rôle anticancéreux du TTSDB dans le cancer du côlon. Nous avons montré que le TTSDB induisait un arrêt mitotique suivi de la mort cellulaire dans toutes lignées confondues. Son activité antiproliférative est validée dans un système de culture 3D et in vivo. Nous avons aussi montré que l'effet du TTSDB est comparable aux agents altérant les microtubules. Dans un troisième temps, nous avons évalué l'impact du TTSDB dans l'autophagie. L'inhibition de l'autophagie est accompagnée par l'accumulation de la protéine p62, qui joue un rôle de survie dans les cellules HT-29 uniquement. Ensemble, nous avons identifié l'autophagie comme mécanisme de survie lors de l'arrêt mitotique prolongé en fonction du type cellulaire. Cette étude permettra d'envisager un ciblage thérapeutique selon le profil génétique du cancer du côlon / Colorectal cancer is a major cause of morbidity and mortality worldwide. Epidemiological studies reveal an inverse correlation between the risk of developing colon cancer and a garlic-rich diet. Many scientific studies reported the anti-cancer activity of diallyl polysulfides (DAPS) derived from garlic in various types of cancer in vitro and in vivo. The best-known mechanism of action is the induction of mitotic arrest followed by apoptosis. Here tubulin is identified as a new therapeutic target for DAPS. Tubulin is fundamental in the progression of autophagy, an essential energy source for the development of advanced cancer, and autophagy activation plays a role of chemoresistance against the treatment of colon cancer.The hypothesis of this project is that garlic-derived DAPS interact with tubulin to alter the microtubule network organization responsible for the inhibition of cell proliferation and modulation of autophagy in colon cancer.First, we analyzed the impact of DATTS/DBTTS on the microtubular network. We have shown that DATTS/DBTTS interacts with tubulin by mass spectrometry. We have shown that the microtubule organization is altered in the three cell lines: HT-29 (BRAF mutated), SW480 (KRAS mutated) and SW620 (metastatic, KRAS mutated), which were more sensitive to DBTTS than DATTS. In a second step, we studied the anticancer activity of DBTTS in colon cancer. We showed that DBTTS induced mitotic arrest followed by cell death in all cell lines. Its anti-proliferative activity is validated in a 3D culture system and in vivo. We have also shown that the effect of DBTTS is comparable to microtubule altering agents. In a third step, we evaluated the impact of DBTTS in autophagy. Inhibition of autophagy is accompanied by accumulation of the p62 protein, which plays a survival role in HT-29 cells only.Altogether, we identified here autophagy as a survival mechanism during prolonged mitotic arrest depending the cell type. This study will allow us to consider targeted therapy according to the genetic profile of colon cancer

De plus en plus d’études suggèrent un rôle important du métabolisme énergétique dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Ainsi, une intolérance au glucose, une résistance à l’insuline et un hypermétabolisme lipidique sont très souvent retrouvés chez les patients et dans les modèles animaux de SLA. Cependant, les bases cellulaires et moléculaires qui sous-tendent ces altérations restent largement méconnues. Une récente étude menée dans un modèle souris de SLA, indique qu’un dysfonctionnement de la pyruvate déshydrogénase (PDH) induirait, dans les muscles rapides, un déséquilibre des voies cataboliques vers une utilisation privilégiée des lipides, et non plus du glucose. Dans ce contexte, nous avons voulu évaluer dans quelles mesures un programme ciblé d’exercice physique pourrait réorienter les voies métaboliques vers une utilisation privilégiée du glucose dans les souris SOD1(G93A), modèle de SLA. Nous avons comparé les effets de deux types d’entraînement, l’un basé sur un exercice de course de faible intensité, assimilable à un exercice d’endurance, l’autre basé sur un exercice de nage à forte intensité, assimilable à un exercice de force/résistance. Contrairement à la course, l’exercice de nage réduit significativement l’intolérance au glucose, augmente le taux sanguin de lactate et le stockage lipidique dans les adipocytes. Dans le muscle rapide tibialis, touché très précocement par la maladie, nous mettons en évidence une altération de l’expression de GLUT4, transporteur musculaire majeur du glucose, et de la glyceraldehyde-3 phopshate deshydrogenase (GAPDH), une enzyme clé de la glycolyse. Ces altérations moléculaires sont retrouvées dans des biopsies musculaires de patients SLA. L’entraînement à la nage des souris SLA stimule l’expression de GLUT4 et de GAPDH, grâce à la réactivation de processus d’autophagie, et réactive les enzymes du métabolisme aérobie, telles que la citrate synthase, enzyme du cycle de Krebs, et la cytochrome oxydase, appartenant à la chaîne respiratoire mitochondriale. L’ensemble de ces données indique qu’un exercice bien calibré peut améliorer le métabolisme énergétique dans un contexte de SLA, et ouvre la voie à une utilisation de l’exercice physique en complément d’une potentielle modulation pharmacologique de la PDH chez les patients. / The use of physical exercise as an intervention for alleviating symptoms in Amyotrophic-Lateral-Sclerosis (ALS) is debated. We have reported that swimming based exercise sustained motor function, induced a significant neuroprotection and extended SOD1(G93A) ALS mouse lifespan in contrast to running based exercise. Because exercise types are expected to differentially alter, in trained skeletal muscles, the energy metabolism, whose defects have been very recently linked to ALS-induced motor-neuron death, we compared the impact of either a daily swimming- or running-based training on several metabolic indicators in ALS mice. We indicate that, unlike running, the swimming-based training of ALS mice led to a significant increase in lipogenesis and glucose tolerance, and reverse the metabolic switch affecting fast-twitch muscles. Besides, our data highlighted detrimental-side effects of the running-based training that further shifted the energetic status towards a more oxidative metabolism. Thus, the present data outline the paramount importance of the choice of the exercise type when designing rehabilitation protocols for ALS patients.

La macroautophagie, appelée ici autophagie, est un processus de dégradation lysosomale qui joue un rôle clé dans l'immunité en dégradant des micro-organismes intracellulaires mais également en activant des réponses immunitaires. Cependant, de nombreux virus ont développé des stratégies pour inhiber, utiliser voire détourner l'autophagie à leur propre bénéfice. L'objectif de cette thèse a été d'analyser la place de l'autophagie dans l'infection par le virus de la rougeole (VR). Ce travail démontre que les souches atténuées du VR utilisent plusieurs voies moléculaires successives d'induction d'autophagie dans les cellules infectées. En effet, elles sont capables d'induire une première vague d'autophagie très précoce mais transitoire par l'engagement de l'une des isoformes de leur récepteur d'entrée CD46. Après un bref retour à l'état basal, une deuxième vague d'autophagie est induite par l'interaction de la protéine virale non structurale C avec la protéine cellulaire autophagique IRGM. La formation de syncytia conduit à une troisième voie d'induction d'autophagie qui permet de maintenir l'autophagie mise en place. Cette autophagie soutenue est exploitée par le VR afin de limiter la mort des cellules infectées, ce qui promeut la production de particules virales. Les souches virulentes du VR, incapables de lier CD46, et utilisant comme récepteur d'entrée la protéine CD150, n'induisent que l'autophagie tardive qui est également utilisée pour favoriser la production de particules virales infectieuses. Ce travail de thèse montre donc que l'induction d'une autophagie soutenue lors de l'infection par le VR promeut l'infection, principalement en limitant la mort cellulaire / Macroautophagy, thereafter referred to as autophagy, is a lysosomal degradation which plays a key role in immunity by directly degrading intracellular pathogens but also by favouring innate and adaptive immune responses. However, several viruses have evolved strategies to inhibit, exploit or even hijack autophagy for their own benefit. The aim of this thesis was to analyse the role of autophagy in the course of measles virus (MeV) infection. This work demonstrates that attenuated strains of MeV induce successive autophagy signalling in infected cells, via distinct and uncoupled molecular pathways. First, attenuated MeV strains are able to induce a first early and transient wave of autophagy through the engagement of one of the isoform of their cellular receptor CD46. Soon after infection, a new autophagy signalling is initiated by the interaction of the non-structural MeV protein C with the cellular autophagic protein IRGM. Strikingly, this second autophagy signalling can be sustained overtime within infected cells via a third autophagy input resulting from cell-cell fusion and the formation of syncytia. Sustained autophagy is exploited by MeV to limit the death of infected cells and to improve infectious viral particle formation. Interestingly, virulent strains of MeV, which do not use CD46 as a cellular receptor but use CD150, are unable to induce the early autophagy wave, whereas they induce and exploit the late and sustained autophagy. Thus, this work demonstrates that the induction of a sustained autophagy during MeV infection promotes infectivity, mostly by limiting cell death. Overall, this work describes an unusual and complex interplay between autophagy and MeV

L'autophagie est un processus d'autodigestion qui se produit dans toutes les cellules eucaryotes et conduit à la dégradation d'éléments du cytoplasme (organites, macromolécules) par le lysosome. Ce mécanisme, qui se produit de manière basale, permet le renouvellement du contenu cytoplasmique mais également la survie cellulaire lorsqu'il est induit par différents stress (carence nutritionnelle, hypoxie…). L'autophagie est alors impliquée dans diverses pathologies comme les maladies neurodégénératives et le cancer car sa dérégulation peut grandement perturber l'homéostasie cellulaire. Le but de ma thèse est de déterminer le rôle de la protéine nucléaire et cytoplasmique BAT3 dans l'autophagie et d'étudier son mécanisme de régulation. Cette protéine de 150 kDa, également appelée BAG6 ou Scythe, est composée de nombreux domaines protéiques (UBL, Prolin-rich, NLS, BAG) qui lui permettent d'interagir avec de multiples partenaires. Sa fonction majeure réside dans le contrôle qualité du cytoplasme mais BAT3 est aussi impliquée dans l'immunité ou l'apoptose. Ce travail identifie la protéine BAT3 comme essentiel pour l'autophagie basale et induite. Nous montrons que son mécanisme d'action passe par la régulation de la localisation de l'acétyltransférase p300 et l'acétylation de ces substrats : p53 et une protéine de la machinerie de l'autophagie : ATG7. En effet, BAT3 (i) limite la présence de p300 dans le cytosol en (ii) maintenant un faible et régulable niveau d'acétylation d'ATG7 et (iii) permet l'acétylation de p53 dans le noyau au cours de la carence nutritionnelle, événement indispensable à l'induction de l'autophagie. / Autophagy, literally meaning self-eating, is a highly evolutionary conserved process in eukaryotes in which parts of the cytoplasm (organelles, macromolecules) are degraded by lysosomes. Basal autophagy is a quality control mechanism allowing the renewal of the cytoplasm but autophagy is also induced by cellular stress (starvation, hypoxia…) to improve cell survival. Autophagy has been implicated in several physiopathologies such as cancer or neurodegenerative diseases. Deregulations of autophagy may profoundly affect homeostasis.The purpose of my thesis is to explore the role of the nucleo-cytoplasmic shuttling protein BAT3 in autophagy and the mechanism of BAT3-dependent autophagy.Also known as BAG6 or Scythe, this 150 kDa protein is composed of various domain (UBL, Prolin-Rich, NLS, BAG) by which BAT3 interacts with multiple partners. The major of role BAT3 seems to be the protein quality control but BAT3 is also implicated in immunity and apoptosis. Our work demonstrates that the protein BAT3 is essential for basal and starvation-induced autophagy. We show that BAT3 regulation of autophagy is mediated by the modulation of p300 acetyltransferase intracellular localization and acetylation of two subtrates: p53 and the autophagy-related protein ATG7. Indeed, Bat3 allows: (i) the limitation of p300 into cytosol resulting in (ii) the maintenance of a low level of ATG7 acetylation and (iii) the increase of the starvation-induced p53 autophagy leading to the induction of autophagy.