Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf Major-Histokompatibilitätskomplex Klasse-II (MHC-II) -Molekülen ist von entscheidender Bedeutung für eine Reihe von immunologischen Prozessen. Die mechanistischen Grundlagen dieses Präsentationsweges sind aber noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum molekularen Verständnis der Abläufe zu leisten, die an der endogenen Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-II-Molekülen beteiligt sind. Dazu sollte am Beispiel des nukleär lokalisierten Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase II (NucNeoR) sowie des viralen Kernantigens Epstein-Barr-virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) und entsprechender antigenspezifischer MHC-II-restringierter CD4+ T-Zellen die verantwortlichen Präsentationswege in professionell und nicht-professionell antigenpräsentierenden Zellen untersucht werden. In beiden Zellsystemen wurde NucNeoR über einen endogenen Präsentationsweg und nicht über die Freisetzung und Wiederaufnahme als exogenes Protein auf MHC-II-Molekülen präsentiert. Durch die Verwendung chemischer Inhibitoren konnte eine Beteiligung der Autophagie an der endogenen Antigenpräsentation nachgewiesen werden. Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet, wurde nach möglichen Eintrittspforten für nukleäre Proteine in diesen Abbauweg gesucht. Für die Autophagie-abhängige Präsentation von NucNeoR war weder ein CRM1-vermittelter aktiver Export des Antigens aus dem Kern ins Zytoplasma, noch eine Auflösung der Kernmembran im Rahmen der Zellteilung und der dadurch bedingten Durchmischung nukleärer und zytoplasmatischer Bestandteile notwendig. Mit Hilfe eines konditionalen Antigenexpressionsystems und der Auftrennung antigenexprimierender Zellen nach Zellzyklusphasen konnte eine verstärkte Antigenpräsentation in der G1/0-Phase nachgewiesen werden, die mit fortschreitendem Zellzyklus immer mehr abnahm. Die Antigenpräsentation korrelierte dabei mit der ebenfalls im Laufe des Zellzyklus abnehmenden Transkriptions- bzw. Translationsrate des Antigens, aber nicht mit der absoluten Menge an Antigen in den Zellen. Bei abgeschalteter Antigentranskription dagegen korrelierte die Antigenpräsentation mit der MHC-II-Oberflächenexpression, die von der G1/0- bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich zunahm. Eine ähnliche Korrelation von Antigentranskription/ Antigentranslation und Autophagie-abhängiger Antigenpräsentation wurde auch für EBNA3C und die zytoplasmatisch lokalisierte NeoR-Variante beobachtet. Diese Ergebnisse identifizieren die Autophagie-abhängige Präsentation neusynthetisierter Proteine als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene Präsentation der untersuchten nukleären Antigene auf MHC-II-Molekülen. Durch die Kopplung von Translation und autophagischem Abbau erlangen Proteine unabhängig von ihrer subzellulären Lokalisation Zugang zu diesem Präsentationsweg und erweitern so das Spektrum der intrazellulären Antigene, die einer CD4+ T-Zellüberwachung unterliegen. / The endogenous presentation of intracellular antigens on major histocompatibility complex class II (MHC-II) molecules plays an important role in adaptive immune responses, but the underlying molecular mechanisms are not well understood. The aim of this study was to gain insight into the endogenous presentation pathways for nuclear antigens on MHC-II molecules. By using antigen-specific CD4+ T cell clones, MHC-II presentation of the nuclear antigens neomycin phosphotransferase II (NucNeoR) and Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) was studied in professional and non-professional antigen presenting cells (APC). Both types of APC presented peptides derived from these nuclear proteins on MHC-II molecules by an endogenous presentation pathway and not by release and reuptake as exogenous protein. Inhibition of autophagy drastically reduced endogenous antigen presentation, indicating that nuclear proteins enter the MHC-II processing and loading compartment through autophagic vesicles. Because autophagocytosis occurs in the cytoplasm, potential entry routes for nuclear proteins into this pathway were investigated. Endogenous presentation of NucNeoR on MHC-II molecules by autophagy did neither involve the CRM1-mediated export of the nuclear protein into the cytoplasm, nor the redistribution of nuclear and cytoplasmic components following the dissolution of the nuclear envelope during mitosis. Conditional antigen expression and cell cycle phase separation of antigen-expressing cells revealed that antigen presentation was maximal in cells in G1/0 and then gradually decreased as cells progressed in the cell cycle. This reduction in antigen presentation correlated with a cell cycle-dependent decrease in antigen transcription/translation, but not with the total amount of antigen present in these cells. By contrast, when antigen expression was turned off, antigen presentation correlated with MHC-II surface expression, which increased from G1/0- to G2/M-phase. A similar correlation between antigen presentation and antigen transcription/translation was also observed for the antigens EBNA3C and the cytosolic variant of neomycin phosphotransferase II (NeoR). These results identify autophagocytosis of newly-synthesized proteins as the molecular mechanism mediating endogenous presentation of nuclear and cytosolic antigens on MHC-II molecules. By coupling protein translation and autophagocytosis, newly-synthesized proteins gain access to the endogenous MHC-II presentation pathway irrespective of their subcellular localisation and thereby broaden the spectrum of intracellular antigens that are presented to CD4+ T cells.

L'athérosclérose est une pathologie progressive, à évolution lente qui consiste en la formation d'une plaque d'athérome dans la paroi artérielle dont la rupture est à l'origine de complications athéro-thrombotiques graves. La nature et le devenir des lésions d'athérosclérose dépendent en grande partie de l'équilibre entre la survie et la mort des composants cellulaires de la plaque. Les cellules musculaires lisses (CML) qui composent la chape fibreuse sont essentielles à la stabilité de la plaque, ainsi l'apoptose des CML contribue à la fragilisation et à la rupture de la plaque. Dans des conditions de stress ou de carence nutritive les cellules activent des voies d'adaptation et de survie comme l'autophagie, un processus d'autodigestion du matériel cellulaire par la voie de dégradation lysosomale. De part sa participation à la régulation de fonctions cellulaires, une dérégulation de l'autophagie est aussi évoquée dans les maladies cardiovasculaires. Bien que l'autophagie soit un processus non sélectif, elle peut aussi éliminer sélectivement des organites tels que les mitochondries. La dégradation sélective des mitochondries ou mitophagie participe ainsi au contrôle qualité des mitochondries, mais permet aussi de prévenir l'apoptose dans des conditions pathologiques où les mitochondries sont altérées. Ainsi dans conditions de stress métabolique et oxydant la mitophagie pourrait limiter l'augmentation des ERO mitochondriaux et la libération de protéines pro-apoptotiques dans le cytosol, afin de protéger les CML de la chape fibreuse contre la mort cellulaire. L'objective de mon projet de thèse à été de caractériser et d'étudier le rôle de la mitophagie dans les CML vasculaires soumises à un stress athérogène. Nos résultats ont permis de mettre en évidence pour la première fois que la mitophagie est activée dans les CML humaines en présence de lipides athérogènes oxydés. Nous avons identifié des dysfonctions mitochondriales (altération du potentiel de membrane, fission) et la voie de signalisation Drp1/PINK1/Parkin comme impliquées dans la mise en place de la mitophagie. La quantification du flux mitophagique basal et dans les conditions d'invalidation ou de surexpression de PINK1 et Parkin dans les CML humaines nous ont permis de démontrer que la mitophagie est un mécanisme de défense contre l'apoptose induite par un stress lipidique athérogène. Dans une deuxième partie, nous avons généré un modèle murin d'athérosclérose possédant une délétion spécifique du gène Atg7 dans les CML. L'analyse du phénotype des plaques montre que la déficience en autophagie conduit au développement d'une plaque instable avec une augmentation de l'apoptose et de l'inflammation. L'analyse des paramètres de la mitophagie montre une dysfonction de ce processus à l'origine d'une altération du contrôle qualité mitochondrial avec une augmentation de la fragmentation et de la production d'ERO mitochondriaux. Ces résultats suggèrent qu'une altération du processus d'auto/mitophagie peut contribuer au développement de plaques d'athérosclérose instables. En conclusion, nos résultats renforcent l'intérêt de la mitophagie comme un nouveau marqueur de fragilisation de la plaque et une cible potentielle pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à stabiliser la plaque d'athérome. / Atherosclerosis is a progressive vascular disease, resulting from deposition of lipids in the arterial wall and subsequent plaque formation. Plaque destabilization and rupture causes rupture serious atherotrombotic complications such as myocardial infarction, stroke or sudden cardiac death. The mechanisms involved in plaque destabilization and rupture are rather complex and depend, at least in part, on the survival versus death balance of the cellular components of the lesion. The vascular smooth muscle cells (VSMCs) comprising the fibrous cap of the plaque are essential for its stability. Thus VSMCs apoptosis can lead to increased plaque fragility and rupture. During nutrient deprivation or stress conditions, the cells activate cell safeguard mechanisms such as a autophagy - a conserved lysosomal process of intracellular organelle degradation. Because of its crucial role in the regulation of cell homeostasis, deregulation of autophagy is implicated in development of different pathologies such as cardiovascular diseases. However autophagy is not only a nonselective process, but can instead target selectively organelles such as mitochondria. The selective mitochondrial degradation or mitophagy is implicated both in mitochondrial quality-control and in the prevention of apoptosis in different pathologic conditions where mitochondria are altered. Thereby the mitophagy could limit the increase of mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production and the release of pro-apoptotic proteins in the cytosol during metabolic or oxidative stress, and prevent the death of the VSMC of the fibrous cap. The objective of my research work was to characterize mitophagy and to identify its role in VSMC exposed to the atherogenic stress. We have established for the first time that in response to atherogenic stressors human VSMCs activated mitophagy. We described mitochondrial dysfunction (membrane potential alteration and fission) and the signaling pathway Drp1/PINK1/Parkin as implicated in mitophagy initiation. The quantification of mitophagy flux in baseline and PINK1 or Parkin knockdown or overexpression conditions in human VSMC allowed us to demonstrate that the mitophagy is a safeguard mechanism against apoptosis induced by an atherogenic lipid stress. Next we generated a mouse model of atherosclerosis harboring or not VSMC specific deletion of autophagy gene Atg7. The plaque phenotype analysis demonstrates that autophagy deficiency led to the destabilization of the plaque characterized by increased apoptosis and inflammation. The mitophagy parameter analysis demonstrated the dysfunction of this process leading to de alteration of mitochondrial quality-control with an increase of fragmentation and mitochondrial ROS production. These results suggest that the alteration of auto-/mitophagy can contribute to the unstable atherosclerotic plaque development. In conclusion, our results emphasize the importance of mitophagy as a new plaque instability marker and a potential target for development of new strategies aimed at stabilizing the atheroma plaque.

L’anémie est un symptôme fréquent chez les patients atteints de cancer. La libération de la cytokine pro-inflammatoire TNFα, un inhibiteur connu de l’érythropoïèse, en est l’une des causes. L’érythropoïèse est un processus nécessitant l’arrêt de la prolifération et l’autophagie. Les résultats précédents ont montré que le TNFα inhibe l’expression des marqueurs érythroïdes et module l’expression de facteurs de transcription (FT) hématopoïétiques. Notre objectif est d’étudier l’implication de la voie TNFα/sphingomyélinase (SMase)/céramide dans l’inhibition de l’érythropoïèse en utilisant des cellules souches hématopoïétiques CD34+ induites à se différencier par l’érythropoïétine recombinante (Epo). Par l’utilisation de céramides exogènes, de SMase bactérienne et d’inhibiteurs de SMases, nous montrons l’implication de la voie SMase/céramide dans l’inhibition de l’expression des marqueurs érythroïdes mais également dans l’induction de la différenciation myéloïde avec une augmentation de l’expression du CD11b. Cet effet sur la différenciation est corrélé à la modulation du réseau FT/miR impliquant GATA-1, GATA-2 et PU.1 et les miR-144, 451, 155, 146a et 223. De plus, l’analyse par microscopie électronique à transmission, l’absence de formation de punctae GFP-LC3 et l’accumulation de SQSTM1/p62 montrent que le TNFα et les céramides inhibent l’autophagie induite par l’Epo. L’analyse des protéines impliquées dans la régulation de l’autophagie montre que le TNFα et les céramides activent mTOR. Son implication est confirmée par l’utilisation de rapamycine et l’inhibition de ULK1 et Atg13. De plus, le TNFα et les céramides inhibent l’expression de bécline 1 et de la formation du complexe Atg5-Atg12. Ces résultats démontrent que la voie TNFα/SMase/céramide joue un rôle dans l’homéostasie hématopoïétique par l’inhibition de l’érythropoïèse au profit de la myélopoïèse, en impactant les réseaux de régulation FT/miR et le processus d’autophagie / Anemia is a common symptom in cancer patients. It can be caused by the release of pro-inflammatory cytokines such as TNFα, a known inhibitor of erythropoiesis. Erythropoiesis involves proliferation arrest and autophagy. Our previous studies showed that TNFα inhibits the expression of erythroid markers as well as hematopoietic transcription factors (TF) expression. The aim is to study the involvement of TNFα/sphingomyelinase (SMase)/ceramide pathway in erythropoiesis inhibition using recombinant erythropoietin (Epo)-induced CD34+ hematopoietic stem cells. Using exogenous ceramides, a bacterial SMase and sphingomyelinase inhibitors, we show the involvement of SMase/ceramide pathway in the inhibition of erythroid markers as well as the induction of myeloid differentiation as shown by the increase in CD11b expression. This effect is correlated to the modulation of the TF/miR network involving GATA-1, GATA-2 and PU.1 as well as miR-144, 451, 155, 146a and 223. We show that TNFα and ceramides inhibit Epo-induced autophagy through transmission electron microscopy analysis, the absence of GFP-LC3 punctae formation and SQSTM1/p62 accumulation. Analysis of proteins involved in autophagy regulation showed that TNFα and ceramides activate mTOR, which is confirmed using rapamycin as well as the inhibition of ULK1 and Atg13. Moreover, TNFα and ceramides inhibit Beclin 1 expression and Atg5-Atg12 complex formation. These results demonstrate the role of TNFα/SMase/ceramide pathway in hematopoietic homeostasis through an erythropoiesis-myelopoiesis switch resulting from perturbation of TF/miR network and autophagy

L'autophagie est une voie majeure de dégradation et de recyclage des constituants cytoplasmiques. C'est également un mécanisme de l'immunité innée et adaptative. Au cours de l'infection par le VIH-1, l'autophagie est déclenchée dans les lymphocytes T CD4 non infectés après contact avec les glycoprotéines d'enveloppe virale (Env). Cette autophagie participe alors à l'induction de l'apoptose dans ces cellules, mécanisme connu pour être responsable de la disparition des lymphocytes T CD4 au cours de l'infection, et donc de l'évolution vers la phase SIDA. Nos travaux ont permis de montrer que l'activité fusogénique de gp41 est responsable de l'induction d'autophagie et de la mort des lymphocytes T CD4 non infectés après leur contact avec Env. De façon tout à fait surprenante, il apparaît que l'autophagie est bloquée dans les lymphocytes T CD4 productivement infectés par le VIH-1 (souches X4 ou R5). Par contre, les macrophages, autre population cellulaire ciblée par ce virus, ne présentent aucun signe d'autophagie en réponse à la fixation de Env (souches X4 ou R5), alors qu'elle est induite dans les macrophages infectés par ces mêmes virus. Enfin, les derniers résultats nous ont permis de mettre en évidence une phase d'autophagie plus précoce, intervenant dans les deux heures suivant le contact avec Env. L'étude des acteurs impliqués dans l'induction de cette première phase a montré qu'elle était indépendante de la fusion membranaire induite par gp41, ainsi que de la liaison de Env aux récepteurs CD4 et CXCR4. Cette première phase d'autophagie est également présente dans les premières étapes d'infection des lymphocytes T CD4 par du virus libre, et est nécessaire à la réplication du VIH-1. Le VIH-1 adopte donc une stratégie d'exploitation du mécanisme autophagique afin d'optimiser sa réplication, mais également la propagation de l'infection. / Autophagy is a major catabolic pathway involved in the degradation and recycling of cytoplasmic components. It is also a mechanism of adaptive and innate immunity. During HIV-1 infection, autophagy is induced in uninfected CD4 T lymphocytes after contact with cells expressing HIV-1 envelope glycoproteins (Env, gp120/gp41). This process is a pre-requisite to their apoptosis. Thus, autophagy is implicated in the depletion of CD4 T lymphocytes during HIV-1 infection, mechanism leading to AIDS. The results obtained during my PhD have shown that the fusogenic function of gp41 is responsible for the induction of autophagy in the uninfected CD4 T lymphocytes. Surprisingly, this process is blocked in productively HIV-1-infected CD4 T lymphocytes (X4 or R5 strains). In contrast, uninfected macrophages, a preserved cell population during HIV-1 infection, do not undergo X4 or R5 Env-mediated autophagy. However, autophagosomes are present in infected macrophages. Our last results demonstrated that an early autophagic phase is triggered in target CD4 T cells 2h after the contact with Env-expressing cells. Neither the fusogenic function of gp41, nor gp120 binding to CD4 and CXCR4 is implicated in the induction of this early autophagic phase. Interestingly, this process seems necessary to establish an efficient HIV-1 replication. Our results suggest that HIV-1 adopts a strategy to use the autophagic pathway to its own profit and pointes this process as a key for the HIV-1-associated physiopathology.

L'autophagie est un processus permettant la dégradation de constituants cytosoliques dans un compartiment lytique, par leur séquestration au sein d'une vésicule à double membrane : l'autophagosome. L'autophagie est, avec la voie ubiquitine-protéasome, l'une des deux grandes voies de dégradation présente de manière fortement conservée chez les cellules eucaryotes. Présente à un niveau basal, elle peut être stimulée afin de permettre la remobilisation de ressources cellulaires, ou d'assurer des fonctions cytoprotectrices et de détoxification. La formation d'autophagosomes traduit alors la capacité du système endomembranaire à s'adapter aux besoins cellulaires. Cependant, la mécanique membranaire et moléculaire de ce phénomène reste mal comprise. L'objectif de ce travail de thèse était de mieux comprendre la formation de ce compartiment dans la cellule végétale. Pour cela, nous avons tout d'abord mis au point les conditions propices à l'étude de l'autophagie dans la racine d’Arabidopsis thaliana, puis nous avons entrepris l'identification de marqueurs des étapes de formation de l'autophagosome. L'étude par imagerie en temps réel et 3D de la protéine ATG5, impliquée dans l’expansion membranaire, nous a permis de mettre en évidence son recrutement transitoire sur un domaine particulier de l'autophagosome en formation, son ouverture. De plus, l'étude de différents acteurs du système endomembranaire, nous a permis de mettre en évidence et de caractériser l'implication du réticulum endoplasmique et de ATG9, pour aboutir à un modèle de la formation de l'autophagosome chez les plantes. / Autophagy is a catabolic process targeting cytosolic compounds to the lytic compartment after sequestration within a double membrane bound vesicle: the autophagosome. Along with the ubiquitin-proteasome pathway, autophagy is one of the main catabolic processes conserved among eukaryotic cells. Present at a basal level, it can be stimulated to allow: remobilization of cell resources, cytoprotective functions, and detoxification. Autophagosome formation demonstrates the capacity of the endomembrane system to adapt dynamically to the cell's environment. However, the membrane and molecular processes involved are still poorly understood. This work aimed to advance understanding of autophagosome formation in plant cells. First of all, we set up suitable conditions for the study of autophagy in the Arabidopsis root, then we identified markers of the autophagosome formation steps. Live and 3D imaging of the ATG5 protein, involved in membrane expansion, demonstrated its transient recruitment to a specific domain of the forming autophagosome, its aperture. Furthermore, studying different actors of the endomembrane system has allowed us to implicate the endoplasmic reticulum and ATG9, and to establish a model for autophagosome formation in plants.

Les cancers sont caractérisés par une prolifération anarchique des cellules causée par une dérégulation des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire, comme la protéine p27Kip1 (p27). Dans le noyau, p27 inhibe les complexes cycline-CDK, bloquant ainsi la progression du cycle de division cellulaire, et par conséquent, la prolifération cellulaire. Cette propriété confère à p27 un rôle de suppresseur de tumeurs. Toutefois, dans certains cancers, p27 est relocalisé dans le cytoplasme où il exerce un rôle oncogénique, cependant les mécanismes moléculaires par lesquels p27 agit comme un oncogène restent largement inconnus. Des études récentes montrent que sa localisation cytoplasmique permet à p27 d'activer l'autophagie, un processus de recyclage des constituants intracellulaires dans les cellules carencées en nutriments. Dans les cellules cancéreuses, l'autophagie est un des mécanismes d'adaptation au microenvironnement tumoral et leur permet de survivre malgré des conditions défavorables. En outre, l'autophagie peut être induite par le stress causé par les traitements anti-cancéreux, ce qui retarde l'apoptose en permettant aux cellules d'échapper aux traitements. L'autophagie induite par la localisation cytoplasmique de p27 pourrait ainsi compromettre l'efficacité des thérapeutiques anti-tumorales. Le but de mon projet de thèse était de déterminer par quels mécanismes p27 contrôle l'autophagie et participe ainsi à la survie des cellules dans des conditions de stress métabolique. Durant ma thèse, j'ai pu mettre en évidence un rôle essentiel de p27 dans la régulation de l'autophagie et de la mort cellulaire. Mes travaux indiquent que le statut de p27 cytoplasmique ou nucléaire détermine à la fois le degré d'autophagie et la susceptibilité des cellules à l'apoptose induite par la privation nutritionnelle. En utilisant des méthodes de biologie cellulaire et moléculaire, j'ai disséqué les voies de signalisation et le mécanisme moléculaire expliquant le rôle pro-autophagique de p27. De manière surprenante, il apparait que p27 régule l'autophagie par différents mécanismes en fonction de la carence infligée aux cellules. [...] / P27 controls cell cycle progression via its ability to block cyclin-CDK activity. Thus, it acts as a tumor suppressor in the nucleus. However, in certain cancers, p27 relocalizes in the cytoplasm where it may promote tumorigenesis by still largely unknown mechanisms. Recent studies have shown that the cytoplasmic localization of p27 induces autophagy, a catabolic process whereby intracellular constituents are recycled in response to nutrient depletion. In cancer cells, autophagy acts as as an adaptive response to metabolic stress in tumor tissues. Furthermore, autophagy may be induced by various cancer therapies, leading to chemotherapeutic resistance and promoting cancer cell survival. The aim of my PhD project was to determine by which mechanisms p27 controls autophagy and cell survival upon metabolic stress conditions. My results indicate that p27 plays a prominent role in the regulation of autophagy and cell death during nutrient deprivation. The status of p27 determines the rate of autophagy and the susceptibility of cells to apoptosis. Importantly, the mechanisms underlying the role of p27 in autophagy appears to be different in function of the nature of the metabolic stress. Amino acid deprivation leads to translocation of p27 to lysosomes where it participates in the inhibition of mTOR, a kinase that acts as a master regulator of cellular metabolism and autophagy. In contrast, the effect of p27 in glucose starved cells depends mostly on its role in the regulation of microtubule dynamics, which controls intracellular vesicle trafficking. Thus, in glucose starved cells, p27 promotes the fusion of autophagic vesicles and degradation of autophagy cargo. To conclude, my results show that p27 is a critical modulator of starvation-induced autophagy and its status determines the response of cells to metabolic stress. Therefore, p27 may serve as a predictive marker for treatment response targeting specific metabolic pathways and may constitute a promising target for anticancer treatment affecting these pathways.

Les laminopathies regroupent des pathologies liées aux lamines. La Progeria est due à une mutation du gène LMNA entrainant la synthèse d’une protéine anormale : la progérine. Elle s’accumule dans le noyau et entraîne des dommages cellulaires aboutissant à une sénescence prématurée, à l’origine d’un vieillissement prématuré et accéléré des patients dont le décès survient vers l’âge de 14 ans. Les microARNs (miRs) sont des petits ARNs non-codants régulant l’expression des gènes. Dans le projet principal de ma Thèse, nous avons identifié par un miRNome en RT-qPCR, 14 miRs différentiellement exprimés dans les fibroblastes HGPS. Certains d’entre eux appartenant à la région 14q32.2-14q32-3, sont surexprimés à cause de modifications chromatiniennes. Nous avons ensuite étudié l’impact de la surexpression des miR-376a-3p et miR-376b-3p sur la régulation de l’autophagie. L’inhibition de ces miRNAs entraine une augmentation du niveau d’autophagie, associée à une diminution de la progérine. Une 2ème étude miRNome réalisée en NGS, a permis d’identifier d’autres miRNAs potentiellement impliqués dans la Progeria. Dans un second projet, nous avons analysé l’expression des lamines de type A dans des cellules tumorales métastatiques issues d’épanchements pleuraux de patients atteints d’adénocarcinome bronchique. Nous avons démontré que la diminution d’expression de la lamine A chez un groupe de patient est corrélée à un mauvais pronostic. Cette diminution pourrait être due à miR-9 qui cible directement l’ARNm de la prélamine A. Ces travaux de Thèse illustrent le rôle fondamental des lamines et suggère une place importante des miRNAs dans la physiopathologie de ces 2 types de laminopathies / Laminopathies are diseases linked to lamins. Progeria (HGPS) is a genetic disease caused by a mutation in LMNA gene leading to an abnormal protein called progerin. It accumulates in nucleus and causes cell damages leading to a premature senescence. Patient die around 14 years old. miRNAs are small non coding RNA regulating gene expression. In my main project, I identified with a miRNome approach by RT-qPCR, 14 differentially expressed miRNAs in dermal HGPS fibroblasts. We demonstrated that the overexpression of the miRNAs that belong to the 14q32 region was caused by chromatin modulation. Next, we studied the role of miR-376-3p and miR-376b-3p on autophagy and demonstrated that the inhibition of their overexpression increases autophagy and decreases progerin. A second miRNome by NGS identified other miRNAs potentially linked to HGPS pathophysiology. In my second project, I studied lamins expression in metastatic cells from pleural effusion of lung adenocarcinoma patients. We showed that the decreased expression of lamin A in a group of patients was correlated with poor prognosis, which could be linked to miR-9 expression. This thesis illustrates the fundamental role of lamins and suggest the role of miRNAs in the pathophysiology of this to types of laminopathies.

Die von der WHO zu den 17 wichtigsten NTDs gezählte Leishmaniose wird durch intrazelluläre Parasiten der Gattung Leishmania hervorgerufen. Der Lebenszyklus der Parasiten besteht aus zwei Phasen. Die länglichen und beweglichen Promastigoten kennzeichnen die Phase in der Sandmücke – der Vektor der Leishmaniose. Hingegen ist die Phase im Säugerwirt durch runde unbewegliche Amastigoten charakterisiert. Aufgrund des Mangels an potenten antileishmanialen Therapien wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion zwischen L. m. Parasiten und der Hauptwirtszelle, der Makrophage, v. a. in Hinblick auf autophage Prozesse in den infizierten Makrophagen näher untersucht, um demgemäß neue Erkenntnisse zu gewinnen, welche bei der Herstellung zukünftiger anti-leishmanialer Medikamente helfen könnten. Bei der Autophagie handelt es sich um einen katabolen Prozess, wodurch Zellen bei Nahrungsmangel oder zellulärem Stress ihre Homöostase erhalten können. Durch diesen Prozess können überflüssige oder beschädigte Organellen recycelt werden, um die Funktionen der Zelle aufrechtzuerhalten. Daneben übernimmt Autophagie auch eine essenzielle Rolle bei der Abwehr von ins Zytosol eindringenden Pathogenen. Mittels des neu etablierten totalen Autophagiescore konnte festgestellt werden, dass Autophagie in L. m.-infizierten BMDM induziert wird. Die intrazellulären Amastigoten werden durch Autophagie in den BMDM verdaut. Die erhöhte autophage Aktivität konnte zudem durch Western-Blot-Analysen der autophagierelevanten Proteine ATG5, LC3B und UB bestätigt werden. Die molekulargenetischen Untersuchungen von L. m.-infizier-ten BMDM mithilfe von Affymetrix Microarrays führten zu einem Netzwerk aus autophagierelevanten und infektionsspezifischen Genen, welches als LISA bezeichnet worden ist. Hier hat sich ebenfalls eine starke Verknüpfung von autophagierelevanten Genen und den Genen der Glykolyse, einem zweiten katabolen Prozess, gezeigt. Zudem konnten zwei weitere autophagierelevante und infektionsspezifische Gene außerhalb von LISA identifiziert werden, nämlich Bnip3 und Ctse, welche im Anschluss genauer untersucht worden sind. Bei beiden Genen konnte auf Proteinebene gezeigt werden, dass sie in L. m.-infizierten BMDM signifikant erhöht sind. Durch siRNA-Analysen konnte überdies beobachtet werden, dass beide für die erfolgreiche Elimination der Amastigoten essenziell sind. Somit konnte mit den Proteinen BNIP3 und CTSE zwei potenzielle neue Ansatzpunkte für mögliche zukünftige antileishmaniale Therapien gefunden werden. Auch die in LISA enthaltenen Gene stellen prinzipiell vielversprechende Ziele für künftige Medikamente gegen Leishmaniose dar. Durch all diese Untersuchungen kommt man dem Ziel einer neuen, gezielten und nebenwirkungsärmeren Behandlung der Leishmaniose einen Schritt näher. / Leishmaniasis, listed by the WHO to be one of the 17 most important NTDs, is caused by intracellular parasites of the genus Leishmania. The life cycle of the parasites consists of two stages. The oblong and motile promastigotes characterize the stage in the sand fly, the vector of leishmaniasis. However, the stage in the vertebrate host is characterized by round immotile amastigotes. Due to a lack of capable antileishmanial therapies, the interaction between L. m. parasites and their main host cell, the macrophage, was investigated in the present work, huge focus on autophagic processes in infected macrophages. Our goal was to get new insights for the future production of antileishmanial drugs. Autophagy is a catabolic process whereby cells are able to maintain their homeostasis in times of starvation or cellular stress. During to this process, redundant or damaged organelles are recycled in order to sustain cellular viability. Furthermore, autophagy has an essential role in the defense of pathogens invading the cytosol. The newly established total autophagy score showed an autophagy induction in L. m.-infected BMDM. Intracellular amastigotes are digested by autophagy in BMDM. The increased autophagic activity could also be confirmed by western-blot analyses of the autophagy-relevant proteins ATG5, LC3B, and UB. Molecular genetic investigations of L. m.-infected BMDM by Affymetrix microarrays led to a network of autophagy-relevant and infection-specific genes, which was called LISA. Additionally, it showed a strong connection between autophagy-relevant genes and genes of the glycolysis, a second catabolic process. Moreover, we identified and further characterized two additional autophagy-relevant genes, Bnip3 and Ctse, which were not included in LISA. Both genes were significantly overexpressed on protein level in L. m.-infected BMDM. By siRNA analyses we also demonstrated their importance for successful elimination of amastigotes. Therefore, both proteins, BNIP3 and CTSE, could be new potential targets for possible future antileishmanial therapies. In addition, the genes included in LISA might be promising targets for future drugs against leishmaniasis. Due to all these investigations we are one step closer to our goal of a targeted and safe therapy of leishmaniasis.

Würzburg, Univ., Diss., 2007. / Zsfassung in engl. Sprache.

L’autophagie est un processus d’autodigestion qui se produit dans toutes les cellules eucaryotes et conduit à la dégradation d’éléments du cytoplasme (organites, macromolécules) par le lysosome. Elle peut se produire au hasard dans le cytoplasme où elle peut être sélective, par exemple d’un organite intracellulaire. Lorsque les mitochondries sont sélectivement dégradées par autophagie, on parle de mitophagie. L’autophagie et la mitophagie sont impliquées dans diverses pathologies comme les maladies neurodégénératives et le cancer car leur dérégulation peut grandement perturber l’homéostasie cellulaire.Mon projet de thèse porte sur le rôle de la protéine co-chaperonne BAG6 dans la régulation de la mitophagie.BAG6 est une protéine de 150 kDa, également appelée BAT3 ou Scythe, dont la fonction majeure réside dans le contrôle qualité du cytoplasme mais BAG6 est également impliquée dans l’immunité, l’apoptose ou l’autophagie. Nous montrons que son mécanisme d’action passe, tout d’abord, par la régulation de la morphologie mitochondriale en induisant la fission des mitochondries. Ensuite, la protéine BAG6 induit la mitophagie : les protéines impliquées dans la mitophagie (PINK1 et PARKIN) s’accumulent à la mitochondrie alors que les protéines de la mitochondrie (TOM20, TFAM et TIM23) voient leur expression diminuée. BAG6 diminue également la masse mitochondriale par un mécanisme dépendant de l’autophagie. L’analyse de la séquence de BAG6 montre qu’elle est composée de nombreux domaines protéiques incluant les domaines UBL et deux domaines LIR (LC3-Interacting Region) et nous avons montré que BAG6 interagit avec LC3 grâce à son domaine LIR2. Ces caractéristiques identifient la protéine BAG6 comme un nouveau récepteur potentiel de la mitophagie. / Autophagy, literally meaning self-eating, is a highly evolutionary conserved process in eukaryotes where elements of the cytoplasm (organelles, macromolecules) are degraded by lysosomes. Autophagy can occur randomly in the cytoplasm or can be selective of a specific organelle. Among other, the specific degradation of mitochondria is called mitophagy. Autophagy and mitophagy have been implicated in several physiopathologies such as neurodegenerative diseases or cancer. Deregulations of autophagy/mitophagy may profoundly affect homeostasis.The aim of my thesis is to characterize the role of the co-chaperonne protein BAG6 in the regulation of mitophagy.BAG6 is a 150kDa protein, also known as BAT3 or Scythe, which functions in the quality control of the cytoplasm. Moreover BAG6 is also involved in immunity, apoptosis or autophagy. Our work showed that it is implicated in the regulation of mitochondrial morphology by inducing mitochondrial fission. Also, BAG6 induces mitophagy: in presence of BAG6, mitophagy markers such as PINK1 and PARKIN are more localized at the mitochondria whereas the expression of mitochondrial specific protein’s (TOM20, TFAM and TIM23) decreases. After its sequence analysis, we discovered that BAG6 is composed of many domains such as the UBL domains and two LIR domains (LC3- Interacting Region) and that BAG6 interacts with LC3 through its LIR2 domain. These features lead to identify BAG6 as a new potential receptor of mitophagy.