Made available in DSpace on 2015-06-20T02:07:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000470792-Texto+Completo-0.pdf: 1695613 bytes, checksum: bfea5d57cf26d524d5b14d7d3ac84cdc (MD5) Previous issue date: 2014 / Melanoma is one of the most aggressive malignant tumors, and its incidence has been increasing steadily in recent years. Usually in the early stages, treatment for melanoma is local surgery with reasonable efficiency. However, treatments such as chemotherapies for advanced melanoma have limited benefits, prolonging the patient's life in a few months. Thus the search for more effective therapies for melanoma is necessary. More recent studies suggest that tumor immune response conducted by subtypes of CD4+ T helper cells subsets have an important role in cancer control. According to tumor infiltrating Th17 and Treg cellsand the cytokines they secrete the tumor microenvironment profile may be suggested anti or pro-tumor activities or exerted by these cells. In this study, we investigated the transcriptional markers of CD4+Foxp3+ T cells and CD4+RORγt+ T cells in draining lymph nodes of animals throughout the melanoma tumor growth and evaluate whether the combined action of cisplatin (cis-diamino-dichloro-platin, CDDP) and TLR2 (peptidoglycan) or TLR3 (acid-Polyribosilic Polyribocytidilic) or TLR4 (lipopolysaccharide) agonists, can change these parameters. The animals were injected with melanoma cell line B16F10 and according tumor progression the tumor draining lymph node (TDLN) were excised for analysis of Treg and Th17 cells by flow cytometry. Furthermore, we analyzed the survival of animals treated with combined therapies. We found an increase in the percentage and absolute number of Th17 and Treg cells in TDLN according tumor progression, which was consistent with previous studies. Our results indicate that treatment with cisplatin promotes tumor growth by increasing Treg and Th17 cells. Treatment with CDDP plus TLR2 agonist significantly decreases the percentage of Th17 cells in TDLN. We demonstrated here, that combinated CDDP and TLR3 or TLR4 agonist therapy impairs tumor growth and modulate the frequency of these cells by decreasing the percentage of CD4+Foxp3+ T cells. In addition, this combination also showed a modest increase insurvivalof the melanoma bearing mice. These results showed that TLRs agonists may be used in combination with cisplatin as a potential adjuvant capable impair tumor growth in melanoma bearing mice. / Melanoma é um dos tumores malignos mais agressivos, e sua incidência vem aumentando continuamente nos últimos anos. Geralmente em estágios iniciais, o tratamento para melanoma é local, por cirurgia, com razoável eficácia. Contudo, os tratamentos para melanoma em estágios avançados por quimioterapia têm benefícios limitados, prolongando a vida do paciente em poucos meses. Assim se faz necessária a busca por terapias mais efetivas para melanomas. Estudos mais recentes sugerem que a resposta imunológica tumoral realizada pelos subtipos de células T CD4+ auxiliares possuem papel importante no controle do câncer. Conforme o infiltrado tumoral de células Th17 e Treg e o perfil de citocinas que elas secretam no microambiente tumoral, pode-se sugerir atividades anti ou pró-tumorais exercidas por essas células. Neste estudo, nós investigamos os marcadores transcricionais de células T CD4+Foxp3+ e células T CD4+RORγt+ em linfonodos drenantes de animais com melanoma ao longo do crescimento tumoral e avaliamos se a ação combinada de cisplatina (cis-diamino-dichloro-platin, CDDP) com agonistas de TLR2 (Peptidoglicano) ou TLR3 (ácido Polyribosilic-Polyribocytidilic) ou TLR4 (Lipopolissacarídeo) podem alterar esses parâmetros. Os animais foram injetados com células de melanoma linhagem B16F10 e conforme a progressão tumoral os linfonodos drenantes tumorais (TDLN) foram excisados para análise de células Th17 e Treg por citometria de fluxo. Além disso, analisamos a sobrevida dos animais com a ação combinadas das terapias. Encontramos um aumento na porcentagem e número absoluto de células Th17 e Treg no TDLN conforme a progressão tumoral o qual foi condizente com estudos anteriores. Nossos resultados indicam que o tratamento apenas com cisplatina, promove o crescimento tumoral através do aumento de células Th17 e Treg. O tratamento de cisplatina com agonista de TLR2 diminui consideravelmente a porcentagem de células Th17 no TDLN. Demonstramos aqui que a combinação de terapias utilizando CDDP juntamente com agonistas de TLR3 ou TLR4, prejudica o crescimento tumoral e pode modular a frequência dessas células através da diminuição na porcentagem de células TCD4+Foxp3+. Adicionalmente, essa combinação também mostrou um modesto aumento na sobrevivência dos animais. Esses resultados mostram que agonistas de TLRs podem ser utilizados em combinação com cisplatina como potencial adjuvante capaz de induzir inibir o crescimento tumoral em modelo de melanoma murino.

Made available in DSpace on 2015-07-22T02:04:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000472476-Texto+Completo-0.pdf: 2364616 bytes, checksum: c4b022cfc35016dfceaaa75088b36bcb (MD5) Previous issue date: 2014 / Crack is a cocaine-­‐derived substance that acts as a stimulant of the central nervous system. It is characterized by low cost, quick action and high power dependency. Little is known about effects at the cellular level caused by the crack and body resilience of body during period of abstinence. Studies have shown an increased production of reactive oxygen species (ROS) after administration of cocaine. Oxidative stress occurs when there is an imbalance between the production of ROS and the ability of the antioxidant defense in combat or prevent its action. This condition can be harmful to cells, causing damage to biomolecules such as DNA, lipids and proteins. Aiming to better understand the action of crack and abstinence in redox state, this study enrolled thirty patients of program for detoxification and thirty volunteers who did not use drugs taken as control group. Blood samples were collected after 4th and the 18th day of treatment and plasma was used for biochemical analysis. Quantifications were performed oxidants markers such as protein carbonyl and protein thiols, both demonstrate protein modifications by ROS, and antioxidant markers such as glutathione peroxidase and superoxide dismutase and non-­‐enzymatic markers such reduced glutathione (GSH) and total reactive antioxidant potential (TRAP).Psychological variables were assessed through the scores obtained Cocaine Selective Severity Assessment, Fagerstrom Tolerance Questionnaire, Beck Depression Inventory version II (BDI-­‐II) and Addiction Severity Index. After four days of abstinence we observe observed an increase in oxidative markers compared to end of the treatment. After eighteen days of abstinence there is a recovery of antioxidant defenses. Also, we observed e a positive correlation between protein carbonyls and psychological variables and a negative correlation between the levels of TRAP levels and psychological variables. Thus, our results suggest that abstinence period may provide a recovery of antioxidant defenses, thereby reducing propensity for oxidative damage. / O crack é uma substância derivada da cocaína que age como estimulante do sistema nervoso central. É caracterizado pelo baixo custo, rápida ação e alto poder de dependência. Pouco se sabe sobre os efeitos a nível celular causados pelo crack e sobre a capacidade de recuperação do organismo no período de abstinência. Estudos tem demonstrado uma elevação da produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) após a administração da cocaína. O estresse oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio entre a produção de EROS e a capacidade do sistema de defesa antioxidante em combater ou prevenir sua ação. Essa condição pode ser nociva para as células, causando danos a biomoléculas como DNA, lipídeos e proteínas. Com o objetivo de melhor compreender a ação do crack e da abstinência no sistema de defesa antioxidante e no dano oxidativo, esse estudo recrutou trinta voluntárias pacientes de um programa para desintoxicação e trinta voluntárias que não faziam uso de drogas tidas como grupo controle. Amostras de sangue foram coletadas após o 4º e o 18º dia de tratamento e o plasma foi utilizado para as análises bioquímicas. Foram realizadas quantificações de marcadores oxidantes, como proteínas carboniladas e tióis proteicos, ambos demonstram modificações proteicas feitas por EROS e marcadores antioxidantes, tanto enzimáticos como glutationa peroxidase e superóxido dismutase quanto não enzimático como glutationa reduzida (GSH) e o potencial antioxidante reativo total (TRAP).As variáveis psicológicas foram avaliadas através dos escores obtidos nos questionários: Cocaine Selective Severity Assessment, Questionário de Tolerância de Fagerstrom, Inventário de Depressão de Beck versão II (BDI-­‐II) e o Addiction Severity Index. Após o 4º dia de abstinência observamos um aumento dos marcadores oxidantes em comparação ao fim do tratamento. Após dezoito dias de abstinência há uma recuperação das defesas antioxidantes. Também evidenciamos uma correlação positiva entre as proteínas carboniladas e variáveis psicológicas e uma correlação negativa entre os níveis de TRAP e as variáveis psicológicas. Dessa forma, nossos resultados sugerem que o período de abstinência pode propiciar uma recuperação das defesas antioxidantes, diminuindo assim, a propensão ao dano oxidativo.

Made available in DSpace on 2015-08-26T02:04:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000474060-Texto+Completo-0.pdf: 1372189 bytes, checksum: a43c7ff8c9402604b61dba9bcef89a8f (MD5) Previous issue date: 2015 / The potato is the third most important consumed food in the world. Despite its high productivity, many pest problems cause losses in the quantity and quality of the product. Its high susceptibility to pathogens such as the necrotrophic bacteria Pectobacterium atrosepticum, has led to the indiscriminate use of pesticides, causing damage to the environment and human population. Studies of plant resistance inducers represent an alternative for disease control in some cultures by promoting innate defense system against pathogens. Understanding the changes in plant metabolism related to defense enables the evaluation and development of new strategies and products to disease control. This work aimed was to evaluate some of the mechanisms involved in defense metabolism of Solanum tuberosum in response to the phytobacteria Pectobacterium atrosepticum as well as to the XTH and ASM elicitors. To this end, we analyzed the activities of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APx), enzymes related to defense metabolism, polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POX), phenylalanine ammonia lyase (PAL), and pathogenesis-related proteins, β-1,3-glucanase and chitinase. It was also determined the synthesis of phenolic compounds and salicylic acid (SA), and the assessment of disease progression caused by the phytobacteria in leaves pretreated with XTH. Our results showed that the elicitor XTH was able to delay the disease progression and symptoms caused by the bacteria P. atrosepticum. The elicitors ASM and XTH promoted the activation of the antioxidant enzymes, as well as the induction of certain enzymes related to defense before and after the bacterial inoculation, differing from the response pattern observed in the leaves treated only with P. atrosepticum. In addition, we observed an increase in free SA levels in leaves treated only with the phytobacteria, differing from the other treatments. In conclusion, the elicitor XTH promotes resistance to the necrotrophic bacteria P. atrospeticum by the defense metabolism activation and modulation of S. tuberosum. / A batata destaca-se como o terceiro alimento mais consumido no mundo. Apesar de sua alta produtividade, inúmeros problemas fitossanitários vêm causando perdas na quantidade e na qualidade do produto. Sua alta suscetibilidade a patógenos, como a bactéria necrotrófica Pectobacterium atrosepticum, tem levado ao uso indiscriminado de agrotóxicos, causando danos ao meio ambiente e à população humana. Estudos com indutores de resistência vegetal têm representado uma alternativa para o controle de doenças em algumas culturas através da promoção do sistema inato de defesa contra patógenos. Compreender as modificações no metabolismo vegetal relacionado à defesa possibilita a avaliação e o desenvolvimento de novos recursos e produtos para o manejo fitossanitário. Este trabalho teve por objetivo avaliar alguns dos mecanismos envolvidos no metabolismo de defesa de Solanum tuberosum em resposta à fitopabactéria Pectobacterium atrosepticum e aos indutores XTH e ASM. Para tal, foram realizadas análises de atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APx), das enzimas relacionadas ao metabolismo de defesa, polifenoloxidase (PPO), peroxidase (POX), fenilalanina amônia liase (PAL), e das proteínas relacionadas à patôgenese, β-1,3-glucanase e quitinase. Foi determinado também o acúmulo de compostos fenólicos e de ácido salicílico (AS), além da avaliação da manifestação da doença provocada pela fitobactéria em folhas pré-tratadas com XTH. Os resultados demonstraram que o indutor XTH foi capaz de retardar a progressão e os sintomas da doença provocados pela bactéria P. atrosepticum em folhas de batata. Os indutores XTH e ASM promoveram a ativação das enzimas antioxidantes, assim como a indução de enzimas relacionadas à defesa, anteriormente e posteriormente à inoculação de P. atrosepticum, diferindo do padrão de resposta observado nas folhas tratadas apenas com a bactéria patogênica. Além disso, foi observado um aumento dos níveis de AS livre nas folhas tratadas apenas com a fitobactéria, diferindo dos outros tratamentos. A partir destes resultados conclui-se que o indutor XTH promove resistência contra a bactéria necrotrófica P. atrospeticum através da ativação e modulação do metabolismo de defesa em S. tuberosum.

Made available in DSpace on 2015-10-02T02:04:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475353-Texto+Completo-0.pdf: 4655532 bytes, checksum: c5dbc2135d9425bffb99fb72fd2f27dd (MD5) Previous issue date: 2015 / Among the infectious diseases that humans have been dealing with throughout history, tuberculosis (TB) is currently the second responsible for most of the deaths worldwide. The latest estimates of WHO showed that 9 millions of new cases of TB occurred in 2013 and 1. 5 million of deaths. The emergence of new drug resistant M. tuberculosis strains is becoming a serious increasing problem as the treatment of infected patients with multi drug-resistant TB and extensively drug-resistant TB strains is much more difficult and costly. This brings discussions about the drastic situation of virtually untreatable TB cases and shows the urgent need to introduce new and effective anti-TB drugs. The research for the development of new antimycobacterial agents becomes a necessity, as well as the identification of new targets for future drugs. The histidine biosynthetic pathway is comprised of ten enzyme steps catalyzed by eight enzymes. This pathway is present in prokaryotic organisms, lower eukaryotic organisms and plants, but is absent in animals, which is in accordance with the principles of selective toxicity. Mutagenesis studies have shown that the genes of this pathway are essential for the survival of M. tuberculosis. The histidinol dehydrogenase enzyme, encoded by hisD, performs the last two steps in the biosynthesis of histidine, converting L-histidinol to L-histidine. The essentiality of the hisD gene in M. tuberculosis mutants with referred gene knockout is already described in the literature. This work describes kinetic studies using thermodynamic parameters, fluorescence spectroscopy, and pre-stationary states to better understand the enzymatic mechanism of MtHisD. Characterization of the reaction catalyzed by mycobacterial HisD is important to structure-based drug development. The data from enzyme’s kinetic characterization were the starting point for HisD specific inhibitors planning, selection, and testing. A series of eleven hydrazones derived from L-histidine was synthesized, from which four compounds were identified as showing a competitive inhibition profile for L-histidinol substrate. The interactions of these compounds with the enzyme were analyzed by molecular docking to understand the inhibitory mechanism. Results from this work are believed to enhance the understanding of mycobacterial histidine metabolism. Moreover, data from inhibition studies with the synthesized compounds, serve as the starting point for the development of new molecules to enhance the enzyme inhibition and to inhibit the M. tuberculosis growth. / Dentre as doenças infecciosas que acompanham o homem ao longo da história, a tuberculose (TB), atualmente, é a segunda responsável pelo maior número de mortes no mundo. As últimas estimativas da Organização Mundial da Saúde apontam 9 milhões de novos casos de TB em 2013 e 1,5 milhões de mortes. O surgimento de novas linhagens de M. tuberculosis resistentes aos fármacos utilizados no tratamento está se tornando um problema sério e crescente, uma vez que o tratamento de pacientes infectados com cepas de tuberculose resistente à múltiplos fármacos e extensivamente resistente à fármacos é muito mais difícil e oneroso. Isso remete a discussões sobre a drástica situação de casos de TB virtualmente incuráveis e aponta para a urgente necessidade de introduzir novos e eficazes medicamentos anti-TB no mercado. A pesquisa para o desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos torna-se necessária, bem como a identificação de novos alvos para futuros medicamentos. A via de biossíntese de histidina compreende dez etapas enzimáticas catalisadas por oito enzimas. Esta via está presente nos organismos procarióticos, organismos eucarióticos inferiores e em plantas, mas está ausente em animais, corroborando com os princípios de toxicidade seletiva. Estudos de mutagênese demonstraram que os genes desta via são essenciais para a sobrevivência do M. tuberculosis. A enzima histidinol desidrogenase, codificada pelo gene hisD, catalisa a última etapa da biossíntese de histidina, convertendo L-histidinol para L-histidina. A essencialidade do gene hisD em mutantes de M. tuberculosis, com o referido gene nocauteado, já está descrita na literatura. Este trabalho trata sobre o aprofundamento dos estudos cinéticos, utilizando ensaios para determinação de parâmetros termodinâmicos, fluorimetria e ensaios em estado préestacionário. A caracterização da reação catalisada pela enzima HisD micobacteriana é uma etapa importante para o desenvolvimento de novos fármacos de ação específica que permitam o melhor controle da tuberculose. Os dados de caracterização cinética da enzima foram utilizados como ponto de partida para o planejamento, seleção e teste de inibidores seletivos contra a HisD de M. tuberculosis. Uma série de onze hidrazonas derivadas da Lhistidina foi sintetizada, foram identificados quatro compostos com perfil de inibição competitiva pelo substrato L-histidinol. As interações destes compostos com a enzima foram analisadas por docagem molecular para melhor compreensão do mecanismo inibitório. Os resultados deste trabalho colaboram ainda para uma melhor compreensão do metabolismo da biossíntese de histidina em micobactérias. Além disso, os dados dos estudos de inibição com os compostos aqui sintetizados servem como ponto de partida para o desenvolvimento de novas moléculas visando a otimização da inibição da enzima e a da inibição do crescimento do M. tuberculosis.

Made available in DSpace on 2015-10-03T02:04:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475296-Texto+Completo-0.pdf: 1059884 bytes, checksum: dfe493d659fd6e13b6ac8c1bcc09a9aa (MD5) Previous issue date: 2015 / Neonatal exposure to lipopolysaccharides (LPS) generates a stressful stimulus capable of affecting the development of important systems, which causes lasting behavioral and neuroendocrine alterations. The aim of this study is to evaluate the response to an inflammatory stimulus in Balb/c mice exposed to LPS-induced neonatal stress at different ages and genders. Mice underwent intraperitonial injections on postnatal days 3 and 10 with either LPS (100ug/Kg) or saline solution. After 21 or 60 days of age, either saline solution was injected or an inflammatory stimulus was induced by the injection of 1% carrageenan. Inflammatory cytokines, reactive oxygen species and NETs production were measured in the peritoneal lavage. Our findings indicate that LPS-induced neonatal stress can reduce inflammatory cytokines in young animals, males and females. In adults, however, only females showed the same response pattern. In nLPS group, an increase in NETs production was observed in animals that were 60-days-old when compared to 21-days-old in both genders, which indicates an effect of neonatal stress on the ontogeny of NETs formation. The production of ROS was not affected by neonatal stress, even though an increased production was found among adults regardless of neonatal intervention. The results shown here indicate that LPS-induced neonatal stress can alter cytokine production in response to inflammatory stimuli at different ages, in a gender dependent way. Moreover, it seems like the formation of NETs throughout life is also influenced by alterations undergone during the neonatal period. / A exposição neonatal ao lipopolissacarídeo (LPS) gera um estimulo estressor capaz de afetar o desenvolvimento de importantes sistemas, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas duradoras. O objetivo desta dissertação é avaliar a resposta a um estímulo inflamatório em camundongos Balb/c submetidos à estresse neonatal por LPS em diferentes idades e sexos. Os camundongos receberam, no 3º e 10º dias de vida, injeção i. p. de LPS (100μg /Kg) ou solução salina. Após 21 ou 60 dias de vida, os mesmos foram submetidos à injeção de solução salina ou a um estímulo inflamatório através da injeção de carragenina 1%. Foram mensurados no lavado peritoneal citocinas inflamatórias, espécies reativas de oxigênio e produção de Redes Extracelulares de Neutrófilos (NETs). Os resultados encontrados demonstram que o estresse neonatal por LPS diminui a liberação de citocinas inflamatórias nos animais jovens machos e fêmeas.Já nos adultos, somente as fêmeas apresentaram a mesma resposta. Foi encontrado um aumento na produção de NETs nos animais do grupo nLPS com 60 dias quando comparado com animais nLPS com 21 dias, em ambos os sexos, indicando um efeito do estresse neonatal sobre a ontogenia da formação de NETs. A produção de ROS não sofreu influência do estresse neonatal, porém foi encontrada uma maior produção na idade adulta, independente da intervenção neonatal. Os resultados do presente estudo indicam que o estresse neonatal por LPS altera a produção de citocinas em resposta a um estímulo inflamatório em diferentes idades, em um efeito dependente do sexo. Além disso, parece que a formação de NETs ao longo da vida também é influenciada pelas alterações no período neonatal.

Made available in DSpace on 2015-10-27T01:05:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475882-Texto+Completo-0.pdf: 18258562 bytes, checksum: 5b76b66a03e3116f7e13505a183443a8 (MD5) Previous issue date: 2015 / The major depressive disorder (MDD) is a psychiatric condition which profoundly alters with the brain metabolism and neurochemistry characterized by a state of deep, chronic sadness, accompanied by anhedonia, sensation of worthlessness and lack of motivation, often leading the patient to suicide. The ventral tegmental area (VTA) is an important dopaminergic region intimately associated with the pathophysiology of MDD. Ketamine is a drug that antagonizes the glutamatergic NMDA receptors which has been shown to exert an immediate antidepressant effect and the treatment with ketamine is a promising new alternative for MDD therapeutic. Furthermore, the small animal positron emission tomography (microPET) is a technique which allows the assessment of the temporal-spatial distribution of radiolabelled molecules in vivo, and the utilization of 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) as a radiotracer for this analysis still needs standardization in our University. In this sense, this thesis has been divided into two stages. Firstly, we standardized the brain metabolic assessment technique using 18F-FDG associated with microPET in Wistar rats, and with it, we rendered a neurometabolic atlas of the distribution of 18F-FDG in 56 brain regions. We compared our neurometabolic data with data from five other scientific articles which assessed the biochemical and immunohistochemical activity of cytochrome c oxidase (COX), these techniques are traditionally used for assessment of ex vivo brain metabolism. Thus, we ranked the regions analyzed in our study and the regions from the selected COX studies, and correlated the rankings with the Spearman test for non-parametric ranked data correlation. In this study we detailed the distribution of 18F-FDG in the brain of Wistar rats. On four of the selected studies we did not find a correlation, only on Shumake at al. ´s study we found a moderate correlation (r=0. 56, p=0. 023). In the second stage, we analyzed the influence of acute ketamine treatment on the depressive-like behavior, the glucose metabolism and tyrosine hydroxylase activity (TH) (a rate-limiting dopamine synthesis enzyme) in the VTA of animals exposed to the chronic unpredictable stress (CUS). In this study, 48 Wistar rats were divided into four groups: 1-Control, 2-Ketamine, 3-CUS, 4-CUS+Ketamine. The animals undergone the CUS protocol were expose to several stressors, twice-daily, for 28 consecutive days. The treatment consisted of a single intraperitoneal injection of 10mg/kg of ketamine. For the behavioral analysis the sucrose preference test, the open field test, and the forced swim test were executed. The glucose metabolism and TH immunoreactivity in the VTA were analyzed by 18F-FDG-microPET and immunohistochemistry for TH, respectively. The CUS groups showed a decrease in sucrose solution intake and an increase in the immobility time on the forced swim test, and ketamine treatment was able to reverted the depressive-like behavior (p<0. 05. The CUS protocol and ketamine treatment did not influence upon the 18F-FDG uptake or the TH immunoreactivity in the VTA. The results obtained in this thesis aid on the standardizing of the use of 18F-FDG with microPET, for the analyses on brain metabolism in our university. Furthermore, with the CUS protocol, we confirmed the acute, antidepressant effect of ketamine, however, our finds indicated that this effect is not related to metabolic or dopaminergic physiology in the VTA. / O transtorno depressivo maior (MDD) é um distúrbio psiquiátrico que altera profundamente a neuroquímica e o metabolismo encefálico; caracterizado clinicamente por um estado de tristeza profunda crônica, acompanhada por anedonia, sensação de desvalia e falta de motivação, podendo levar o paciente a cometer suicídio. A área tegmental ventral (VTA) é uma importante região dopaminérgica intimamente relacionada com a patofisiologia do MDD. A cetamina é um fármaco antagonista de receptores NMDA glutamatérgicos que apresenta um rápido efeito antidepressivo e o tratamento agudo com cetamina é uma promissora alternativa terapêutica para os pacientes com MDD. Ademais, a tomografia por emissão de pósitrons para pequenos animais (microPET) é uma técnica que permite avaliar a distribuição temporal-espacial de moléculas radiomarcadas in vivo, e a utilização do 18F-Fluorodeoxiglicose (18F-FDG) como rádio-traçador para este tipo de análise ainda necessita ser padronizada junto a nossa Universidade. Deste modo, esta tese de doutorado foi dividida em duas etapas. Primeiramente, padronizamos a técnica de análise do metabolismo encefálico de ratos Wistar com uso de 18F-FDG associada ao microPET, e com isso confeccionamos um atlas neurometabólico detalhado da distribuição de 18F-FDG em 56 regiões encefálicas. Comparamos os dados neurometabólicos obtidos com dados de cinco artigos da literatura científica que realizaram avaliações bioquímicas e imunoistoquímicas da atividade do citocromo c oxidase (COX), técnicas tradicionalmente utilizadas para análise do metabolismo encefálico ex vivo. Para a comparação, ordenamos as regiões analisadas em nosso estudo e as regiões dos estudos de COX selecionados, então correlacionamos estas ordenações através do teste não paramétrico de correlação para dados ordenados de Spearman. Neste estudo detalhamos a distribuição de 18F-FDG no encéfalo de ratos Wistar. Em quatro dos estudos selecionados não encontramos correlação, somente com o estudo de Shumake et al. encontramos uma correlação moderada (r=0,56, p=0,023).Na segunda etapa, analisamos a influência do tratamento agudo com a cetamina sobre o comportamento símil-depressivo, o metabolismo de glicose e a atividade da enzima tirosina hidroxilase (TH) (uma enzima limitante na síntese de dopamina) na VTA de animais submetidos protocolo de estresse crônico imprevisível (CUS). Neste estudo, 48 ratos Wistar foram divididos em quatro grupos: 1-Controle, 2-Cetamina, 3-CUS, 4-CUS+Cetamina. Os animais submetidos ao protocolo CUS foram expostos a estressores variados, duas vezes ao dia, por 28 dias consecutivos. O tratamento foi uma única administração intraperitoneal de 10mg/kg de cetamina. Para análise comportamental foram realizados os testes de preferência a sacarose, campo aberto e nado forçado. O metabolismo da glicose e a imunorreatividade para TH na VTA foram analisadas por meio do 18F-FDG-microPET e imunoistoquímica para TH, respectivamente. Os grupos CUS apresentaram uma diminuição do consumo de solução de sacarose e um aumento no tempo de imobilidade no teste de nada forçado e o tratamento com cetamina foi capaz de reverter o comportamento símil-depressivo (p<0,05). O protocolo CUS e o tratamento com cetamina não exerceram influência sobre a captação de 18F-FDG e a imunorreatividade para TH na VTA. Os resultados obtidos com esta tese de doutorado possibilitaram a padronização do uso de 18F-FDG com microPET, para análise do metabolismo encefálico de ratos Wistar em nossa Universidade. Ademais, com o uso do protocolo CUS, confirmou-se o efeito antidepressivo agudo da cetamina, contudo nossos achados indicam que este não é relacionado a alterações metabólicas ou da histofisiologia dopaminérgica da VTA.

Made available in DSpace on 2015-10-28T01:15:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475905-Texto+Completo-0.pdf: 569 bytes, checksum: 660d1f723f091d3bab05811ba0439d9f (MD5) Previous issue date: 2009 / In this study, we evaluated the antinociceptive, antiinflammatory and antioxidant effects of lavender essential oil. The antioxidant activity was tested in vitro and used as screening for subsequent experiments. In animals, the effect of lavender essential oil was compared to those displayed by known antiinflammatory and analgesic drugs (dexamethasone, tramadol and indomethacine). Attempts have been made in order to suggest a probable mechanism of action. Considering the pharmacological potential of the lavender essential oil, we have also investigated its possible toxic effects. We demonstrated that the dose of 0,6 g/kg is well tolerated orally. This dose was considered safe and was used in subsequent experiments. The antiinflamatory activity was tested using two models of acute inflammation: the pleurisy induced by carrageenan and the ear edema induced by croton oil. The inflammatory response evoked by carrageenan and by croton oil were reduced by the pre-treatment of animals with lavender oil. On pleurisy, the drug used as positive control, dexamethasone, was more efficacious. However, in the ear swelling, the antiedematogenic effect of the oil was similar to the obtained for dexamethasone. The antinociceptive activity was tested using the model of pain induced by formalin injection into the hind paw of rats. In this model, lavender oil consistently inhibited nociception and presented a similar effect to tramadol. This finding suggests that the mechanism involved in the antiinflammatory effect of lavender may be related to interference in the system of intracellular second messenger phospholipase C/inositol phosphate. In conclusion, the results of this study reveal remarkable analgesic and antiinflammatory activities for the lavender essential oil. Furthermore, the effectiveness of the oil associated with the low toxicity support the interest for the application of lavender essential oil in aromatherapy, and demonstrated its important therapeutic potential. / Neste estudo, foram avaliadas as atividades antinociceptiva, antiiflamatória e antioxidante do óleo essencial de lavanda. A atividade antioxidante foi testada in vitro e serviu como screening para os experimentos posteriores. Em animais, o efeito do óleo essencial de lavanda foi comparado com drogas analgésicas e anti-inflamatórias conhecidas (dexametasona, tramadol e indometacina, respectivamente). Isto foi feito na tentativa de sugerir um provável mecanismo de ação. Considerando o potencial terapêutico do óleo essencial de lavanda foi realizado também um estudo de toxicidade aguda, no qual foi demonstrado que o óleo essencial de lavanda na dose de 600 mg/kg é bem tolerado oralmente. Esta dose foi considerada segura e utilizada nos experimentos posteriores. A atividade anti-inflamatória foi testada através de dois modelos de inflamação aguda: pleurisia induzida por carragenina e edema de orelha induzido pelo óleo de cróton. As respostas inflamatórias produzidas pela carragenina e pelo óleo de cróton foram significativamente reduzidas após o tratamento com óleo de lavanda. Enquanto na pleurisia a droga usada como controle, dexametasona, foi mais eficaz, no edema de orelha o efeito antiedematogênico do óleo foi similar ao observado para a dexametasona. A atividade antinociceptiva foi testada utilizando o modelo de dor induzida por formalina injetada na pata de ratos. Neste modelo, o óleo de lavanda inibiu a nocicepção espontânea provocada pela formalina e apresentou efeito similar ao tramadol. Esses resultados sugerem que o mecanismo envolvido no efeito anti-inflamatório da lavanda pode estar relacionado a um antagonismo de receptores acoplados a proteína G ou interferência no sistema de segundo mensageiros intracelulares fosfolipase C/fosfato de inositol. Em conclusão, os resultados deste estudo revelam atividades anti-inflamatórias e antinociceptivas do óleo essencial de lavanda. Além disso, essas atividades paralelas à baixa toxicidade encontrada também suportam o interesse para aplicação do óleo de lavanda na aromaterapia e demostram seu importante potencial terapêutico.

Made available in DSpace on 2015-11-06T01:05:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000476006-Texto+Completo-0.pdf: 2870247 bytes, checksum: 76076f40e5be705d3be21ff4d7ceb1f3 (MD5) Previous issue date: 2015 / Aging has been associated with increased generation of free radicals as well as immunosenescence. Previous studies have identified older individuals with inverted T CD4:CD8 cell ratio and increased immunity to cytomegalovirus (CMV). Here, we investigated markers of oxidative stress and antioxidant defences in older individuals with inverted CD4:CD8 T-cell ratio. From 421 healthy community-dwelling older adults recruited, 61 subjects were identified with inverted CD4:CD8 T-cell ratio. Older individuals with a CD4:CD8 ratio < 1 had increased levels of plasma advanced oxidation protein products (AOPP) and Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP), but reduced levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) as compared to subjects with normal CD4:CD8 T-cell ratio. The CMV IgG serology was negatively correlated with CD4:CD8 ratio. These markers were more evident among elderly men than women. Our data suggest a close relationship between chronic CMV infection and oxidative profile in older individuals in the midst of its influence on the peripheral T-cell subsets. / O envelhecimento tem sido associado com o aumento da geração de radicais livres, bem como com a imunossenescência. Estudos anteriores já haviam identificado os idosos que apresentavam a inversão da razão CD4:CD8 e a sorologia mais acentuada para citomegalovírus (CMV). Aqui, investigamos marcadores de estresse oxidativo e as defesas antioxidantes em idosos com a relação invertida entre as células T CD4 e CD8. De um total de 421 idosos recrutados na comunidade, 61 sujeitos foram identificados com a inversão da razão CD4:CD8. Os idosos com CD4:CD8<1 tinham níveis aumentados de produtos proteicos de oxidação avançada (AOPP) e atividade antioxidante total pelo método de redução do ferro (FRAP) no plasma, mas níveis reduzidos de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), em comparação com indivíduos com razão CD4:CD8 normais. A sorologia para CMV (IgG) foi negativamente correlacionada com a razão CD4:CD8. Estes marcadores foram mais evidentes entre os homens do que as mulheres idosas. Nossos dados sugerem uma estreita relação entre a infecção por CMV crônica e perfil oxidativo em indivíduos mais velhos no meio de sua influência sobre os subtipos de células T periféricas.

Made available in DSpace on 2016-01-15T01:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000477024-Texto+Completo-0.pdf: 18287406 bytes, checksum: a76247b63c9874ac8f9c628b100c9e0b (MD5) Previous issue date: 2015 / Dendritic cells (DCs) are the major antigen-presenting cells. They provide three main signals to fully activate T cells. Signal one is when the complex peptide:MHC (p:MHC) expressed by DC is recognized by T cell receptor; signal two is the expression of co-stimulatory molecules from the B7 family (CD80 and CD86). The third signal consists in the cytokines produced by DCs, which will bias the quality of T cell response. Once one of this signal is blocked/interrupted, T cells are not fully activated. T cells are involved in the eradication of pathogens, but also in the pathogenesis of several disorders and, strategies that modulate signal two are being used to treat these disorders. Novel therapies that inhibit the second signal (checkpoint blockade) or T cell modulation by these molecules have being used/tested to manage tumors, autoimmune disorders and transplant rejection. Our group demonstrated that the M. tuberculosis protein DnaK (prokaryote Hsp70) has an immunosuppressive role on DCs, and can suppress rejection in a murine skin allograft model. Nevertheless, the molecular mechanism involved in this response need to be further elucidated. In the present work, we demonstrated that the treatment of murine DC with DnaK could decrease the basal levels TNF-α, IFN-γ and MCP-1 produced by these cells. This modulation was concomitant with a downregulation of the transcription factors C/EBPβ and C/EBPδ in a TLR2-ERK-STAT3-IL-10-dependent way. Beyond the signal three, DnaK could also downregulate the expression of MHC II (signal one) and CD86 (signal theree) on DCs, through the induction of a molecule called MARCH1. We developed an-situ treatment of skin grafts with DnaK prior the transplant. We observed that this treatment prolongs allograft survival with a decreased alloimmunity, and this dependent on MARCH1.The molecular pathway TLR2-ERK-STAT3-IL-10 was required for MARCH1 induction by DnaK. Moreover, we found that DnaK modulates a specific skin migratory DC – the CD103+ DCs. This is the major subset involved in skin allograft rejection. We tested in which innate receptors DnaK could bind and found that DnaK could not bind directly on TLR2, but in the LOX-1 and Siglec-E receptor, in a LOX-1/Siglec-E/TLR2 complex. Finally, from the data obtained we patented a new formulation and method to treat allografts prior the transplantation. Thus, DnaK tolerizes dendritic cells through the modulation of the three signals required to activate T cells. We believe that consists an innovative strategy to treat inflammatory disorders, rejection, asthma and sepsis. / Células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígenos e fornecem três sinais principais para a ativação completa das células T. O primeiro sinal consiste na apresentação do complexo peptídeo:MHC; o segundo sinal é a expressão de moléculas co-estimulatórias da família B7, como o CD80 e CD86, e o terceiro consiste no conjunto de citocinas produzidas pelas DCs que irão moldar o tipo de resposta T que será gerada. Uma vez que algum desses dois sinais é interrompido as células T não são ativadas de forma completa e, ainda, podem entrar em anergia ou apoptose. As células T estão envolvidas não apenas em respostas de defesa, mas também em uma série de patologias, e estratégias que visam sua ativação ou inibição vem sendo usadas no manejo dessas doenças. Terapias que visam a inibição do segundo sinal (checkpoint blockade) ou a modulação das células T pelas moléculas co-inibitórias tem sido testadas e utilizadas para tumores, autoimunidade e transplantes. Nosso grupo demonstrou que a proteína DnaK (Hsp70 procariótica) de M. tuberculosis tem papel imunossupressor em células dendríticas e in vivo, podendo diminuir a rejeição de transplantes cutâneos em camundongos. Porém, os mecanismos envolvidos nessa resposta ainda precisam ser elucidados. No presente trabalho, mostramos que a DnaK foi capaz de diminuir a expressão basal de TNF-α, IFN-γ e MCP-1 em DCs de camundongos. Essa modulação foi concomitante com a diminuição de dois fatores de transcrição – C/EBPβ e C/EBPδ – de maneira dependente da via molecular TLR2-ERK-STAT3-IL-10 nas DCs. Além do terceiro sinal, a DnaK pode modular a expressão dos níveis de MHC II (primeiro sinal) e CD86 (segundo sinal) nas DCs, através da indução de uma molécula chave chamada MARCH1. Em um modelo murino de aloenxerto cutâneo, o tratamento local com a DnaK, antes do transplante, prolongou a sobrevida do enxerto e diminuiu a aloimunidade de maneira dependente de MARCH1.A indução de MARCH1 pela DnaK foi dependente da via molecular TLR2-ERK-STAT3-IL-10 nas DCs. Além disso, demonstramos que a DnaK modula exclusivamente um subtipo de DC migratório da pele – as DCs CD103+. Também observamos que esse subtipo de DC é o principal subtipo celular envolvido na rejeição de transplantes de pele, gerando um conceito biológico novo nessa área. Mapeamos os receptores inatos nos quais a DnaK pode se ligar. Testamos dez receptores inatos e vimos que essa proteína não se liga diretamente no TLR2, mas sim nos receptores LOX-1 e Siglec-E, formando o complexo LOX-1/Siglec-E/TLR2. Finalmente, a partir dos dados obtidos nessa tese, formulamos uma composição e um método para a modulação do enxerto antes da realização do transplante, e depositamos uma patente junto ao INPI. Portanto, a DnaK pode tolerizar as células dendríticas através da modulação dos três sinais necessários para a ativação das células T. Acreditamos que essa estratégia pode ser utilizada no tratamento de patologias inflamatórias, incluindo a rejeição a transplantes.

Made available in DSpace on 2016-05-10T12:03:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000478477-Texto+Completo-0.pdf: 5818535 bytes, checksum: 5b089589ca820b17117fd0c8e9d1cc90 (MD5) Previous issue date: 2016 / Gliomas represent the most common class of malignant tumors of the central nervous system being the most aggressive, and lethal brain tumors in primary brain tumors. Among the treatments, radiation is one of the most used therapies, but the intrinsic radioresistance of these tumors remains a critical problem in the management of these patients. Currently it is known that the effect of radiation extends beyond the directly cytotoxicity caused in tumor cells. Radiation therapy appears to induce an immunogenic cell death that among the features is ATP release. The ATP can cause cytotoxicity via P2X7 receptor and also acts as a sign of damage activating the immune system. The ATP can be hydrolyzed by enzymes of the purinergic system, among them the ectonucleotidase CD39, to adenosine, which has an opposite effect to ATP, causing immunosuppression. The radiation-induced ATP release and the ability of this nucleotide in modulate immune responses raised the hypothesis about the purinergic signaling participation in the tumor and immune cells response to radiation. Therefore, this study investigated: i) the role of ectonucleotidase CD39/NTPDase1 in the radiation-induced immune response in gliomas, ii) the importance of ATP-P2X7 receptor in the gliomas response to radiotherapy. Using knockout mice for CD39/NTPDase1, we observed that the deletion of this enzyme combined with radiotherapy significantly reduced the immunosuppressive cells Tregs in the tumor and spleen, attenuated the infiltration of myeloid derived suppressor cells caused by radiation and increased CCR7 expression in splenic dendritic cells and macrophages, indicating the presence of freshly mobilized antigen presenting cells available to differentiate in immune-effector cells that sustain a more prolonged antigen-specific T-cell–mediated immune response. Thereby, showing that blocking the activity of CD39/NTPDase1 can control immunosuppressive mechanisms generated by the tumor and promises to improve the radiotherapy response. Furthermore, in this study we observed that radiation actives the P2X7 receptor and by silencing this receptor on the GL261 glioma cell line, we have shown that radiotherapy is less efficient in vivo when compared with mice injected with GL261 WT cells, which constitutively express the P2X7 receptor. We also showed that patients with glioma that overexpress the P2X7 receptor, showed a better response to radiotherapy, revealing the importance of the expression of this receptor on glioma cells as a useful marker to analyze the tumor sensitivity to radiation and a successful radiotherapy response. In summary, our data shed light on the purinergic signaling for modulating the radiotherapy response in gliomas. / Os gliomas representam a classe mais comum de tumores malignos do sistema nervoso central, sendo o tumor cerebral mais agressivo e letal entre os tumores cerebrais primários. Dentre os tratamentos, a radiação é uma das terapias mais utilizadas, porém a radiorresistência intrínseca destes tumores continua a ser um problema crítico na gestão de destes pacientes. Atualmente, sabe-se que o efeito da radiação se estende além da citotoxicidade direta causada nas células tumorais. A radioterapia parece induzir uma morte celular imunogênica, que entre as características está a liberação de ATP. O ATP pode causar citotoxicidade através do receptor P2X7 e também atua como um sinal de dano celular ativando o sistema imune. O ATP pode ser hidrolisado por enzimas do sistema purinérgico, dentre elas a ectonucleotidase CD39/NTPDase1, à adenosina, que tem um efeito aposto ao ATP, causando imunossupressão. A secreção de ATP induzida pela radioterapia e a capacidade deste nucleotídeo em modular a resposta imune, levantou a hipótese da participação da sinalização purinérgica na resposta de células tumorais à radiação e na resposta imune induzida pela radioterapia. Portanto, neste estudo visou-se investigar: i) o papel da ectonucleotidase CD39/NTPDase1 na resposta imune induzida pela radioterapia em gliomas, ii) a importância da via ATP-receptor P2X7 na resposta de gliomas à radioterapia. Através de camundongos knockout para a enzima CD39/NTPDase1, observamos que a deleção desta enzima combinada com a radioterapia reduziu significativamente as células imunossupressoras Tregs no tumor e no baço, atenuou a infiltração de células mieloides supressoras causada pela radiação, e aumentou a expressão de CCR7 em células dentríticas e macrófagos localizados no baço, indicando a presença células apresentadoras de antígeno recémmobilizadas e disponíveis para se diferenciarem em células imunes efetoras que sustentam uma resposta imune mais prolongada mediada por células T antígeno específicas. Deste modo, mostrou-se que o bloqueio da atividade da CD39/NTPDase1 pode controlar mecanismos imunossupressores gerados pelo tumor e promete melhorar a resposta à radioterapia. Além disso, neste estudo observou-se que a radioterapia ativa o receptor P2X7 e através do silenciamento deste receptor na linhagem de glioma GL261, demonstramos que a radioterapia foi pouco eficiente in vivo, quando comparado com camundongos injetados com a GL261 WT, que expressa constitutivamente o receptor P2X7. Também demonstramos que pacientes com glioma que expressaram mais o receptor P2X7, apresentaram uma melhor resposta a radioterapia, revelando a importância da expressão deste receptor em células de glioma como um marcador útil para analisar a sensibilidade tumoral à radioterapia e para uma resposta bem-sucedida à radioterapia. Em suma, nossos dados lançam luz sobre a sinalização purinérgica para a modulação da resposta à radioterapia em gliomas.