Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000390427-Texto+Completo-0.pdf: 375935 bytes, checksum: 7b9cf03e42c02f1fe6df14d3ac696bcb (MD5) Previous issue date: 2007 / Objetivo: Investigar se há associação entre as variantes polimórficas - 786T>C e 894G>T (Glu298Asp) do gene que codifica para a sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS) e a ocorrência de sepse, choque séptico e disfunções orgânicas em pacientes com condições críticas de saúde. Pacientes e Métodos: Foram selecionados para esse estudo 207 pacientes críticos internados na unidade de tratamento intensivo geral (UTI) do Hospital São Lucas da PUCRS, admitidos de março de 2002 a dezembro de 2005. O grupo controle foi constituído por 149 doadores voluntários saudáveis oriundos da mesma população. A disfunção orgânica dos pacientes sépticos foi avaliada durante a primeira semana após admissão na UTI, através do escore SOFA, e foram consideradas as ocorrências de sepse, choque séptico e óbito. Os genótipos das variantes polimórficas -786C>T e 894G>T foram determinados por análise de fragmentos de restrição dos produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR). Após, foi analisada a freqüência da distribuição dos genótipos e dos alelos entre os grupos de pacientes e de indivíduos saudáveis. Resultados: A freqüência de portadores do alelo -786C entre os pacientes críticos e pacientes sépticos foi significativamente mais alta do que entre os voluntários saudáveis (58% vs 46%; P=0,021, OR=1. 64, CI 95%: 1. 05-2. 57, e 60% vs 46%; P=0,012, OR=1. 82, CI 95%: 1. 10-3. 01, respectivamente). Homozigotos - 786CC tiveram significativamente um maior grau de disfunção orgânica, medido pelo escore SOFA durante a crucial primeira semana de internação na UTI (P=0,001) sem, no entanto, haver diferença significativa na taxa de mortalidade. Homozigotos 894TT foram mais freqüentes entre os pacientes críticos e pacientes sépticos do que entre indivíduos saudáveis (25% vs 14%; P=0,017, OR=0. 49, CI 95%: 0. 25-0. 92, e 25% vs 14%; P=0,024, OR=0. 46, CI 95%: 0. 22-0. 96, respectivamente). Por outro lado, portadores do alelo 894G tiveram escores SOFA significativamente mais altos (P=0,028) e não houve relação significativa com a mortalidade. Detectou-se a presença significativamente superior do duplo-homozigoto -786CC/894TT no grupo de pacientes (P=0,002) se comparada ao grupo de sujeitos saudáveis, e o duplohomozigoto 786TT/894GG significativamente mais freqüente no grupo de voluntários (P=0,002) do que no grupo de pacientes. Conclusão: Ambas variantes polimórficas -786C>T e 894G>T da eNOS podem estar associadas com um maior risco de suscetibilidade ao desenvolvimento de condições clínicas críticas mais graves, à sepse e ao choque séptico.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000437675-Texto+Completo-0.pdf: 3014292 bytes, checksum: 10c5c967edfd4e61677f7867c8186a73 (MD5) Previous issue date: 2011 / Tuberculosis (TB) is an infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, which currently infects one-third of the world’s population. Despite the availability of the Bacille Calmette-Guérin vaccine and effective short-course chemotherapy, the increasing global burden of TB has been linked to the co-infection with HIV, the emergence of multi, extensively and now totally drug-resistant strains. Furthermore, the capacity of M. tuberculosis to remain viable within infected hosts in a long-term asymptomatic infection is an additional problem for the control of TB. Nucleotides biosynthesis pathways provide promising molecular targets for the development of new vaccines and therapeutic strategies to control the global incidence of TB. Uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) catalyzes the conversion of uracil and 5'-phosphoribosyl-a- 1'-pyrophosphate (PRPP) to uridine 5'-monophosphate (UMP) and pyrophosphate (PPi). UPRT plays an important role in the pyrimidine salvage pathway since its product (UMP) is a common precursor of all pyrimidine nucleotides. This work presents cloning, recombinant expression in Escherichia coli, and purification of the upp-encoded M. tuberculosis UPRT (MtUPRT). Mass spectrometry analysis and N-terminal amino acid sequencing confirmed the identity of homogeneous MtUPRT. The molecular mass of the native MtUPRT was shown to follow a monomer-tetramer association model by analytical ultracentrifugation. This enzyme did not show a pronounced regulation by GTP as this nucleotide did not affect enzyme kinetic parameters, and its binding was not detected by isothermal titration calorimetry (ITC).Initial velocity and ITC studies suggested that catalysis proceeds through a sequential ordered mechanism, in which PRPP binds first, followed by uracil binding, and PPi is the first product to be released, followed by UMP. ITC also showed that PRPP and UMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles indicated that groups with pK values of 5. 7 and 8. 1 are important for catalytic activity and a group with a pK value of 9. 45 is involved in PRPP binding. Pre-steady-state kinetic data suggested that product release is not the rate-limiting step of the reaction catalyzed by MtUPRT. Kinetic fluorescence studies demonstrated two forms of enzyme in solution of which only one can bind to PRPP. Knockout of the upp gene showed that this gene is not essential for M. tuberculosis H37Rv in the employed experimental conditions and the absence of upp gene did not affect the mycobacterium growth. UPRT is expressed in both high and low oxygen conditions of M. tuberculosis H37Ra growth. MtUPRT is inhibited by an active metabolite of isoxyl, which does not seem to inhibit RNA polymerase, adenine phosphoribosyltransferase and hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Minimum inhibitory concentration of isoxyl for M. tuberculosis mutant for upp gene, complemented and wild type strains was 12. 8 μg/mL, meaning that the absence of the upp gene did not affect M. tuberculosis sensitivity to isoxyl. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the nucleotide biosynthesis pathway in M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to decrease the global incidence of this pathogen. / A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, o qual atualmente infecta um terço da população mundial. Apesar da disponibilidade da vacina Bacille Calmette-Guérin e da eficaz quimioterapia de curta duração, o aumento na incidência global da TB está relacionado à co-infecção com o HIV e ao surgimento de cepas multi, extensivamente e agora totalmente resistente a drogas. Além disto, a capacidade do M. tuberculosis de permanecer viável dentro do hospedeiro infectado por longo período em uma infecção assintomática é um problema adicional para o controle da TB. As rotas de biossíntese de nucleotídeos fornecem alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de novas vacinas e estratégias terapêuticas para controlar a incidência global de TB no mundo. A uracil fosforribosil transferase (UPRT) catalisa a conversão de uracil e 5’- fosforribosil-a-1’-pirofosfato (PRPP) a uridina 5’-monofosfato (UMP) e pirofosfato (PPi). A UPRT tem um papel importante na rota de salvamento das pirimidinas já que seu produto (UMP) é o precursor comum de todos os nucleotídeos pirimídicos. Este trabalho apresenta a clonagem, expressão recombinante em E. coli, e a purificação da UPRT de M. tuberculosis codificada pelo gene upp (MtUPRT). Adicionalmente, foram realizadas análises de espectrometria de massas e sequenciamento N-terminal que confirmaram a identidade da MtUPRT homogênea. A massa molecular da MtUPRT nativa seguiu um modelo de associação monômero-tetrâmero por ultracentrifugação analítica. Esta enzima não mostrou uma regulação pronunciada por GTP já que este nucleotídeo não afetou os parâmetros cinéticos da enzima, e a sua ligação não foi detectada por calorimetria de titulação isotérmica (ITC).A velocidade inicial e os estudos de ITC sugeriram que a catálise procede através de um mecanismo ordenado sequencial, no qual o PRPP liga primeiramente, seguido pela ligação de uracil, e PPi é o primeiro produto a ser liberado, seguido pelo UMP. ITC também mostrou que a ligação de PRPP e UMP são processos termodinamicamente favoráveis. O perfil de pH indicou que grupamentos com os valores de pK próximos de 5,7 e 8,1 são importantes para a atividade catalítica e um grupamento com valor de pK próximo a 9,45 está envolvido na ligação do PRPP. Dados de cinética no estado pré-estacionário sugeriram que a liberação de produto não é a etapa limitante da reação catalisada pela MtUPRT. Estudos de fluorescência demonstraram a existência de duas formas da enzima em solução, das quais apenas uma pode ligar ao PRPP. O nocaute do gene upp demonstrou que este gene não é essencial para o M. tuberculosis H37Rv nas condições empregadas no experimento e a ausência do gene upp não afetou o crescimento micobacteriano. A UPRT mostrou ser expressa tanto em altas como em baixas concentrações de oxigênio. A MtUPRT foi inibida por um metabólito ativo do isoxyl, que não parece inibir as enzimas RNA polimerase, adenina fosforribosil transferase e hipoxantinaguanina fosforribosil transferase. A concentração inibitória mínima de isoxyl para as cepas de M. tuberculosis mutante para o gene upp, complementada e tipo selvagem foi de 12,8 μg/mL, o que significa que a ausência do gene upp não afetou a sensibilidade do M. tuberculosis ao isoxyl. Assim, estes dados podem ser úteis para um melhor entendimento sobre a via de biossíntese de nucleotídeos em M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas eficientes para diminuir a incidência global deste patógeno.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000433347-Texto+Completo-0.pdf: 402554 bytes, checksum: 52bf760eed71594340bcbb1efd3cb4a1 (MD5) Previous issue date: 2011 / Human herpesvirus 6 (HHV-6) is a Betaherpesvirus associated with Roseola Infantum (Exanthema Subitum) in primary infection. Due to its neurotropic characteristic and latency in the central nervous system, many reports associate HHV-6 with epilepsy, febrile seizures, multiple sclerosis and others neurologic diseases. In this study, HHV-6 DNA was investigated in 42 hippocampal samples from 14 patients with mesial temporal lobe epilepsy (MTLE) submitted to amygdalohippocampectomy (AH) or anterior temporal lobectomy (ATL) surgeries using a nested polymerase chain reaction (PCR). Three samples from each patient were collected and analyzed: from hippocampal head, body and tail. HHV-6 was detected in twelve of fourteen patients (85. 7%) with MTLE. Analyzing the samples resulting positive for HHV-6, all three samples were positive in three patients, in four patients two samples were positive and in five patients only one sample was positive. According to the origin of samples, seven samples from hippocampal head were positive, eight from hippocampal body and seven from hippocampal tail, showing no preferential site for viral establishment. HHV-6 positivity found in patients of the present study is higher then data found in the literature. A possible explanation would be differences in the study design, with three samples collected from each patient, which could be more representative than only one sample. Our results corroborate the hypothesis of a possible role of HHV-6 infection in epilepsy. / O Herpesvírus Humano tipo 6 (HHV-6) é um vírus da família Herpesviridae associado ao desenvolvimento de roséola infantil ou exantema súbito, doença caracterizada por febre alta, rash cutâneo e ocasionalmente convulsões febris. A prevalência mundial de infecção por HHV-6 é alta. Estima-se que cerca de 83% das crianças até 13 meses e mais de 95% das com idade até 2 anos já entraram em contato com o vírus. Existem duas variantes do HHV-6 já identificadas, as variantes A e B, sendo o HHV-6B o agente principal relacionado aos casos de roséola infantil. Epilepsia é um termo aplicado a um grupo de patologias crônicas caracterizadas, principalmente, pela ocorrência de crises epilépticas. As epilepsias representam em torno de 1% dos distúrbios neurológicos que afetam a população mundial. As crises são provocadas por uma disfunção da atividade elétrica cerebral associada a anormalidades estruturais e metabólicas causadas, em alguns casos, pela presença de vírus no sistema nervoso central. Por apresentar características como neurotropismo e latência no sistema nervoso central, procuramos relacionar o HHV-6 com a epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM). Através de reação em cadeia da polimerase (PCR), pesquisamos a presença do vírus em 42 amostras de hipocampo de 14 pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM) submetidos a amígdalo-hipocampectomia (AH) ou lobectomia temporal anterior (LTA) como tratamento para a epilepsia. Três amostras de cada paciente foram analisadas: cabeça, corpo e cauda do hipocampo. O DNA do HHV-6 foi detectado em 12 dos 14 pacientes (85,7%) com ELTM. Três pacientes foram positivos em todas as três amostras, 4 pacientes foram positivos em duas amostras e 5 em apenas uma amostra. Com relação à origem das amostras, 7 foram positivas na cabeça do hipocampo, 8 no corpo do hipocampo e 7 na cauda do hipocampo, demonstrando não haver um sítio de preferência para o estabelecimento do vírus. A positividade para HHV-6 encontrada nos pacientes deste estudo é maior do que os dados encontrados na literatura. Uma possível explicação para esta elevada positividade poderia ser as diferenças na concepção do estudo, com três amostras coletadas de cada paciente, o que II pode ser mais representativo do que a coleta de apenas uma amostra. Nossos resultados reforçam a hipótese de um possível papel da infecção pelo HHV-6 na epilepsia.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000437677-Texto+Completo-0.pdf: 769775 bytes, checksum: c4cb9d9a52d21b8a9826564fdceb6ea8 (MD5) Previous issue date: 2011 / Biopharmaceutical drugs are mainly recombinant proteins produced by biotechnological tools. Currently on the market L-asparaginase preparations, derived either from Escherichia coli or Erwinia chrysanthemi, have been used as a therapeutic agent on the effective treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. The interest in Erwinia carotovora L-asparaginase type II stems from its significantly lower glutaminase- and similar asparaginase-activity compared to current therapeutic preparations, this is particularly important since the glutaminase-activity has been implicated in causing serious side effects. The aim of this work is to apply a combination of technologies to develop a productive and simplified process for production of homogeneous and active recombinant L-asparaginase II from Erwinia carotovora (rErAII) in E. coli as host cells. The shake flasks and bioreactor conditions for productive rErAII expression are described, as well as a one-step ion-exchange liquid chromatography purification protocol followed by enzyme kinetics and thermodynamics through isothermal titration calorimetry (ITC).By using a robust fed-batch technique with pre-determined exponential feeding rates the bioreactor culture system yielded 30. 7 gram of dry cell weight and 0. 9 gram of recombinant rErAII protein in soluble form per liter of culture broth. This was achieved in cultures maintained at 30 ºC, in Terrific Broth medium under isopropil β-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) induction and using E. coli C43 (DE3) as a host cell. The established one-step purification protocol yielded more than 5 mg of homogeneous rErAII per gram of dry cell weight, corresponding to 168 mg of rErAII protein per culture liter. The work shows that it is possible to produce an active homogeneous rErAII enzyme in the soluble cell fraction through IPTG-induced E. coli fed-batch cultivation. The rErAII proved to be a promising alternative therapy in the treatment of ALL, due to its lower glutaminase activity. When compared to well-established spectrophotometric assays, the straightforward calorimetric techniques for enzyme kinetics determination are accurate and precise either for purified enzymes or crude extracts. These data will contribute to biopharmaceutical companies interested in developing biosimilars, to healthcare policies, and quality control improvement. / Biofármacos são, na sua maioria, proteínas recombinantes produzidas por ferramentas biotecnológicas. Preparações de L-asparaginase que atualmente estão no mercado, derivadas de Escherichia coli ou Eravinia chrysanthemi, têm sido utilizadas como agentes terapêuticos no tratamento efetivo de leucemia linfoblástica aguda (ALI-) por mais de 40 anos. O interesse em L-asparaginase tipo 11 de Ertivinicr carotovora decorre da sua atividade de glutaminase reduzida e sua atividade de asparaginase similar quando comparada a preparações terapêuticas atualmente em uso. Isso é particularmente importante uma vez que a atividade de glutaminase foi relacionada a sérios efeitos colaterais. O objetivo desse trabalho é aplicar uma combinação de tecnologias para desenvolver um processo simplificado e produtivo para a produção de L-asparaginase II recombinante homogênea e ativa de Envinia carolovora (rErAll) em células hospedeiras de E. coli. Neste trabalho são descritas as condições para a expressão produtiva de rErAll em agitador orbital e em biorreator, assim como um protocolo de purificação em uma única etapa, por cromatografia líquida de troca fônica, seguida pela determinação dos parâmetros cinéticos e termodinâmicos da enzima através de calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Usando uma técnica robusta de batelada alimentada, com vazão em perfil exponencial pré-determinado, o sistema de cultivo em biorreator rendeu 30,7 gramas de células secas e 0,9 gramas de proteína rErAll na fração solúvel por litro de meio de cultivo. Os resultados foram atingidos em cultivos mantidos a 30°C, em meio de cultura Terrific Broth sob indução de isopropil 0-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) e utilizando E. coli C43 (DE3) como célula hospedeira.O protocolo de purificação de uma única etapa rendeu aproximadamente 5 mg de rErAll homogênea por grama de célula seca, correspondendo a 168 mg de proteína rErAll por litro de meio de cultura. O trabalho demonstra que é possível produzir na fração celular solúvel a enzima rErAII ativa e homogênea, por meio de cultivos de E. coli em batelada alimentada sob a indução de IPTG. A rErAll mostrou ser uma terapia alternativa promissora para o tratamento de ALL devido a sua atividade de glutaminase reduzida. Quando comparada a ensaios espectrofotornétricos bem estabelecidos, as técnicas calorimétricas diretas para determinação de cinética enzimática são exatas e precisas, tanto para enzimas purificadas quanto para extratos brutos. Esses dados poderão contribuir para indústrias farmacêuticas interessadas em desenvolver biosimilares. para políticas de saúde e para o melhoramento do controle de qualidade de enzimas terapêuticas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000432578-Texto+Completo-0.pdf: 7523354 bytes, checksum: fb90e3b4e65279b64dfbdb3b93e8f365 (MD5) Previous issue date: 2011 / The consumption has been a scourge of mankind since ancient times. This illness have been charged a high price in human lives, so many efforts have been made in order to defeat the Mycobacterium tuberculosis. The complete genomics sequence of Mycobacterium tuberculosis opened a new era and had a major impact in our understanding of this pathogen and also in research for microbial drugs. The researches could identify genes and later validate the metabolic pathways. The better understanding of metabolic pathways present in Mycobacterium tuberculosis corresponds to a first step and configures a possibility of identification of new molecular targets that could be derail the bacilli. However, there is much more to do, since of the discovery of rifampicin, a first-line drug used effectively against TB, none new chemotherapy has been released. TB is nowadays responsible for two million of deaths/year and is a global emergency which needs to be urgently repressed. The present work aim to realize structural analysis of the enzyme Cytidine Deaminase (CDA; EC 3. 5. 4. 5) from Mycobacterium tuberculosis associated with substrates and products, allying techniques such as molecular docking and dynamics simulations. / A tuberculose tem sido um flagelo da humanidade desde os tempos antigos. Esta doença tem cobrado um preço alto em vidas humanas, por esta razão muitos esforços tem sido feitos com o intuito de derrotar o Mycobacterium tuberculosis. A sequência genômica do Mycobacterium tuberculosis deu início a uma nova era e foi de grande impacto para o presente conhecimento deste patógeno como também na pesquisa de drogas anti-microbiais. Com estes avanços foi possível identificar genes e mais tarde validar vias metabólicas. O melhor entendimento das vias metabólicas presentes no Mycobacterium tuberculosis corresponde ao primeiro passo e configura uma possibilidade de identificação de novos alvos moleculares que possam erradicar o bacilo. Entretanto, ainda há muito a fazer, desde a descoberta da Rifampicina, a droga de primeira linha efetivamente utilizada contra TB, nenhuma nova droga quimioterápica foi identificada. Nos dias de hoje, a TB é responsável pela morte de dois milhões de pessoas por ano, sendo considerada uma emergência global, a qual precisa ser urgentemente erradicada. O presente projeto tem o objetivo de realizar a análise estrutural da enzima Citidina Deaminase (CDA; EC 3. 5. 4. 5) de Mycobacterium tuberculosis associada com seus substratos e produtos, aliando técnicas de Dinâmica e Docagem molecular.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000438119-Texto+Completo-0.pdf: 1374944 bytes, checksum: ed0d2c4ba08c684fb0fe51136bb75979 (MD5) Previous issue date: 2012 / Endosulfan is a broad spectrum organochlorine pesticide that is still widely used in many developing countries. Following application endosulfan can get to watercourses through surface runoff from agricultural fields and disturb the nontarget aquatic animals including freshwater fish species. Given that the activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) is one of the most recurrently used biomarkers of exposure to pesticides and there are controversial results concerning the effects of endosulfan exposure and AChE activity in fish, the aim of the present study was to evaluate the effects of endosulfan in brain AChE activity and its gene expression pattern using adult zebrafish (Danio rerio) as an animal model. Moreover, we have analyzed the effects of endosulfan exposure in different parameters of zebrafish swimming activity and in long-term memory formation. After 96 hours of exposition, fish in the 2. 4 μg endosulfan/L group presented a significant decrease in AChE activity (9. 44 ± 1. 038 μmol SCh. h-1. mg protein-1; p = 0. 0205) when compared to the control group (15. 87 ± 1. 768 μmol SCh. h-1. mg protein-1; p = 0. 0205). The downregulation of brain AChE activity is not directly related with the transcriptional control as demonstrated by the RT-qPCR analysis. Our results reinforce AChE activity inhibition as a pathway of endosulfan-induced toxicity in brain of fish species. In addition, exposure to 2. 4 μg endosulfan/L during 96 hours impaired all exploratory parameters evaluated: decreased line crossings (273. 7 ± 28. 12 number of line crossings compared to the control group 344. 6 ± 21. 30, p=0. 0483), traveled distance (23. 44 ± 2. 127 meters compared to the control group 29. 39 ± 1. 585, p=0. 0281), mean speed (0. 03 ± 0. 003 meters/seconds compared to the control group 0. 04 ± 0. 002, p=0. 0275) and body turn angle (69,940 ± 4,871 absolute turn angle compared to the control group 88,010 ± 4,560 p=0. 0114). These results suggest that endosulfan exposure significantly impairs animals' exploratory performance, and potentially compromises their ecological and interspecific interaction. Our results also showed that the same endusulfan exposure did not compromise animals' performance in the inhibitory avoidance apparatus. These findings provide further evidence of the deleterious effects of endosulfan exposure in the nervous system. / Endosulfan é um pesticida organoclorado de amplo espectro ainda utilizado largamente em muitos países subdesenvolvidos. As aplicações repetidas de endosulfan podem se incorporar aos cursos de água por meio da lixiviação dos solos das plantações e atingir animais aquáticos, incluindo espécies de peixes. Dado que a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) é um dos biomarcadores de exposição aos pesticidas mais utilizados de forma recorrente e há resultados controversos envolvendo os efeitos da exposição ao endosulfan e a atividade da AChE em peixes, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do endosulfan na atividade da AChE cerebral e seu padrão de expressão gênica utilizando zebrafish adulto (Danio rerio) como modelo experimental. Além disso, nós analisamos os efeitos da exposição ao endosulfan em diferentes parâmetros de locomoção do zebrafish e na formação da memória de longo prazo. Após 96h de exposição, os peixes do tempo com 2,4 μg/L de endosulfam apresentaram um decréscimo significante na atividade da AChE (9. 44 ± 1. 038 μmol SCh. h-1. mg proteína-1; p = 0. 0205) quando comparados com o grupo controle (15. 87 ± 1. 768 μmol SCh. h-1. mg proteína-1; p = 0. 0205). A regulação inibitória da atividade da AChE cerebral não está diretamente relacionada com o controle transcricional como demostrado pela análise de RT-qPCR. Nossos resultados reforçam a inibição da atividade da AChE como via da toxicidade induzida pelo endosulfan em cérebro de de peixe. Além disso, a exposição de 2,4 μg/L do endosulfan durante 96h prejudicou todos os parâmetros exploratórios avaliados: linhas cruzadas (273. 7 ± 28. 12 número de linhas cruzadas em comparação com o grupo controle: 344. 6 ± 21. 30, p=0. 0483), distância viajada (23. 44 ± 2. 127 metros comparados com o grupo controle 29. 39 ± 1. 585, p=0. 0281), velocidade média (0. 03 ± 0. 003 metros/segundos comparados com o grupo controle 0. 04 ± 0. 002, p=0. 0275) e mudanças de ângulo (69,940 ± 4,871 mudanças de ângulo absolutas comparadas com o grupo controle 88,010 ± 4,560 p=0. 0114). Esses resultados sugerem que a exposição ao endosulfan prejudica significativamente a performance exploratória dos animais e, potencialmente, compromete suas interações interespecíficas e ecológicas. Nossos resultados também demonstraram que a mesma exposição ao endosulfan não compromete a performance dos animais no aparato de esquiva inibitória. Esses achados fornecem evidências adicionais de efeitos deletérios da exposição ao endosulfan no sistema nervoso.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000416285-Texto+Completo-0.pdf: 318970 bytes, checksum: 15220451a87c92528afabc75eff26f45 (MD5) Previous issue date: 2009 / Temperament is related to the emotional nature and is considered the basis of mood, behavior, and personality. The concept of temperament emerged about 2. 500 years. Ever since, new proposals of classification and distinction of temperaments appeared. The most studied models in psychiatry are those of emotional temperament by Cloninger and affective temperament by Kraepelin and Akiskal. Based on those main models recently, an integrative model was proposed and called the Activationinhibition- control model. This dimensional model is based on the two main emotional forces or vectors of the mind, i. e., inhibition (fear) and activation (drive and anger) traits, which are regulated by control. Also, a scale was developed and validated – the Combined Emotional and Affective Temperament Scale (CEATS) - which evaluates emotional and affective temperaments. The objective of this study was to correlate the results of the CEATS with smoking status (never, former and current smoker) and mean number of cigarettes smoked. Data was collected by an web-based survey. Among the 5379 subjects (1370 males), 60% percent were non-smokers, 17% had quitted and 23% were current smokers. The results showed that smokers were more associated with unstable affective temperaments and externalized emotional temperaments (disinhibition, poor control, and anger), lower drive and unstable affective temperaments. Lower anger and higher control and drive were associated with quitters. The evaluation of these temperament traits may help in the decision of the pharmacological treatment for smoking cessation. / O temperamento se refere à natureza emocional e pode ser considerado como a base do humor, do comportamento e da personalidade. O conceito de temperamento surgiu há cerca de 2. 500 anos. Desde então, novas propostas de classificação e distinção de temperamentos surgiram. Os modelos mais estudados são o de temperamento emocional de Cloninger e temperamento afetivo de Kraepelin e Akiskal. Baseado nesses principais modelos, recentemente foi proposto um modelo que os integra, chamado de modelo de Ativação-inibição-controle. Esse modelo dimensional proposto é baseado nas duas principais forças emocionais ou vetores da mente, ou seja, em traços de inibição (medo) e ativação (vontade e raiva), que são regulados pela função de controle. Recentemente, foi desenvolvida e validada uma nova escala – Escala Combinada de Temperamento Emocional e Afetivo (ETAFE/CEATS) – que avalia simultaneamente temperamentos emocionais e afetivos. O principal objetivo do presente estudo foi correlacionar os dados dessa escala com hábito de fumar (ser fumante, ex-fumante ou nunca ter fumado, e o número de cigarros fumados por dia em média). A coleta dos dados foi feita pela Internet. Entre os 5379 sujeitos (1370 homens), 60% eram não fumantes, 17% eram ex-fumantes e 23% eram fumantes. Os resultados mostraram que o hábito de fumar estava mais associado com temperamentos afetivos instáveis e temperamentos emocionais externalizados (desinibição, baixo controle e raiva), menor vontade e temperamentos afetivos instáveis. Menor raiva e maior controle e vontade parecem ser associados a ter deixado de fumar. A avaliação destas características de temperamento pode ajudar na decisão das opções de tratamento farmacológico para parar de fumar.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000425497-Texto+Completo-0.pdf: 1039069 bytes, checksum: f6309e74e675843d15c679f3c6d18090 (MD5) Previous issue date: 2010 / This study evaluated the antiproliferative and antifibrotic effects of the total juice red pepper “Dedo-de-Moça”, Capsicum baccatum (CB) and fractions of CB seed and fruit extracted with solvents of different polarity: water, methanol/water, butanol and dichloromethane. The study was realized in vitro, in cell culture GRX, a strain of murine hepatic stellate cells, which are at the stage of myofibroblasts, mimicking a model of human liver fibrosis. The pepper juice and its fractions inhibited the proliferation in cell culture line GRX. The effect of CB juice and fractions was compared with indomethacin, used as a positive control of phenotype reversion, known to exert antiproliferative and anti-inflammatory action. To justify if the CB juice and fractions caused inhibition of cell growth GRX through a cellular mechanism or cell death was measured release of Lactate Dehydrogenase enzyme after the treatment. The groups were compared with the control of cell death - Tween 5%, which has significantly higher values of LDH, showing that the antiproliferative effect of the CB juice and fractions was not by cell death. Furthermore, in an attempt to see if there was increased oxidative stress we measured the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). None of the treated groups differed from control. After treatment with CB juice and fractions for 5 days, cell cultures were stained with Oil Red O stain showing the presence of fat in the cell cytoplasm. Both cultures treated with juice, as the cultures treated with CB fractions showed the formation of fat droplets and phenotypic changes more evident that the control and positive control of phenotype reversion, indomethacin (increased 400x). Furthermore, the quantification of TGF-β, a profibrogenic mediator, in the supernatant of cultures treated with juice and fractions of CB was lower when compared to control. These results show the antifibrotic effects of red pepper Capsicum baccatum and demonstrate its important therapeutic potential as an antifibrotic agent. / Neste estudo foram avaliados os efeitos antifibróticos e antiproliferativos do suco total da pimenta vermelha Dedo-de-Moça, Capsicum baccatum (CB) e de frações da semente e do fruto de CB extraídas com os solventes de diferentes polaridades: água, metanol/água, butanol e diclorometano. O estudo foi realizado in vitro, em cultura de células GRX, uma linhagem murina de células hepáticas estreladas, que estão no estágio de miofibroblastos, mimetizando um modelo de fibrose hepática humana. O suco de pimenta e suas frações inibiram a proliferação celular da linhagem GRX. Este efeito foi comparado com a indometacina, utilizado como controle positivo da reversão fenotípica e conhecido por exercer efeito antiproliferativo e anti-inflamatório. Para justificar se o suco total e frações de CB provocaram inibição do crescimento das células GRX através de um mecanismo celular ou por morte celular, foi dosada a liberação da enzima Lactato Desidrogense (LDH) após o tratamento. Os grupos foram comparados com o controle de morte celular total – Tween 5%, que obteve valores significativamente maiores de LDH, demonstrando que o efeito antiproliferativo do suco e frações de CB não foi através de morte celular. Além disso, na tentativa de verificar se havia aumento do estresse oxidativo, foram dosadas as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Nenhum dos grupos tratados diferiu significativamente do controle. Após tratamento com suco total e frações de CB durante 5 dias, as culturas celulares foram coradas com Oil Red O, corante que evidencia a presença de gordura no citoplasma celular. Tanto as culturas tratadas com o suco total, quanto às culturas tratadas com as frações de CB, apresentaram formação de gotículas de gordura e mudança fenotípica evidente maiores que o controle e que o controle positivo de reversão do fenótipo, a indometacina (aumento de 400x). Além disso, a quantificação do TGF-β, que é um mediador pró-fibrogênico, no sobrenadante das culturas tratadas com suco e frações de CB foi menor do quando comparada ao controle. Esses resultados demonstraram os efeitos antifibróticos da pimenta vermelha Capsicum baccatum e evidenciam seu importante potencial terapêutico como agente antifibrótico.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000389154-Texto+Completo-0.pdf: 376076 bytes, checksum: 42625af3d28cd5491852ff5969f589f9 (MD5) Previous issue date: 2007 / Schizophrenia is a serious neuropsychiat ric disease that affects nearly 1% of the world population. It generates enormous direct (hospi talizations, medical care, medications) and indi rect (lack of productivity, familiar repercussions) social cost Schizophrenia is a complex and mul tifactor illness, with high heritabil ity (around 80%). In the past decades, some research done with the families had demonst rated a linear and di rect correlat ion between the degree of kinship and the possibility for schizophrenia. The mitochondria are the largest site of energy production in the cell and for this reason mutations in DNAmt (deletion and/or polymorphisms) can cause alterations in mitochondrial metabolism, causing tissue damage. Alterations in energy production can cause many neurodegenerative disorders as, for example, Parkinson, Alzheimer and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Some DNAmt mutat ions diminish the citochrome c oxidase activity and can be related to increased risk of schizophrenia in the population. In the present work, we investigated allele prevalence in two polymorphisms in the DNAmt of schizophrenic and control patients. We analyzed the C6489A and C7028T polymorphisms in the CO1 gene that codifies the cytochrome c oxidase. Specific oligonucleotides were used with the objective of ampli fying the polymorphic regions. The PCR products were purified and sequenced (MegaBACE 1000/GE Helthcare TM) and the generated sequences analyzed using the Chromas v2. 31 program. Eighty (80) schizophrenic patients and 80 controls were analyzed. In the statistic analysis, the Q square test and Student T Test were used. The results with p<0. 05 had been considered signi ficant. The mutant A allele in the polymorphic region C6489A was not found. In relation to the C7028T polymorphism, 80 schizophrenic patients and 80 controls were analyzed. In the 80 patients, 64 present the mutant T allele, and 55 in the cont rol samples. Significant association was found between the T allele and the risk to develop schizophrenia. We veri fied that the T allele can be considered a risk factor for schizophrenia, since that, in comparison with the C al lele, it is three times more incident in the schizophrenic patients group. In this way, we demonst rated a st rong correlation between schizophrenia and the mutant T allele. / A esquizofrenia é uma doença neuropsiquiátrica grave que atinge aproximadamente 1% da população mundial. Gera um enorme custo social direto (hospitalizações, atendimentos, medicações) e indireto (improdutividade, repercussões familiares). A esquizofrenia é uma doença complexa e multifatorial, com alta herdabilidade (cerca de 80%). Nas décadas passadas, várias pesquisas realizadas com familiares demonstraram uma correlação linear e direta entre o grau de parentesco e os riscos de surgimento da esquizofrenia. A mitocôndria é o maior sítio de produção de energia na célula e, por esta razão, mutações no DNAmt (deleções e/ou polimorfismos) podem causar alterações no metabolismo mitocondrial, ocasionando danos aos tecidos. Alterações na produção de energia podem implicar em muitas doenças neurodegenerativas, como, por exemplo, o Mal de Parkinson, Alzheimer e a Esclerose Amiotrófica Lateral. Algumas mutações no DNAmt diminuem a atividade da citocromo c oxidase e podem estar relacionadas com o aumento do risco para esquizofrenia na população. No presente trabalho, foi investigada a prevalência de alelos em dois polimorfismos no DNAmt de pacientes esquizofrênicos e de controles. Foram analisados os polimorfismos C6489A e C7028T presentes no gene CO1 que codifica para a citocromo c oxidase. Foram utilizados oligonucleotídeos específicos com o objetivo de amplificar as regiões polimórficas. Os produtos de PCR foram purificados e seqüenciados (MegaBACE 1000 / GE Helthcare TM), e as seqüências geradas analisadas, utilizando o programa Chromas versão 2. 31. Foram analisados 80 pacientes esquizofrênicos e 80 controles. Na análise estatística, foramutilizados o teste Q quadrado e Teste T de Student de uma via. Foram considerados significantes somente os resultados com p<0,05. Não foi encontrado o alelo mutante A, na região mutada C6489A. Em relação ao polimorfismo C7028T, dos 80 pacientes, 64% apresentam o alelo mutante T e, entre os controles, este alelo está presente em 55% indivíduos. Foi encontrada significativa associação entre o alelo T e o risco para desenvolver esquizofrenia. Veri ficou-se que o alelo T pode ser considerado um fator de risco para esquizofrenia, já que, na comparação com o alelo C, ele é mais de três vezes prevalente no grupo de pacientes esquizofrênicos. Dessa forma, demonstrou-se uma forte associação entre a esquizofrenia e o alelo mutante T.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000408802-Texto+Completo-0.pdf: 1288333 bytes, checksum: fed9a5577936cc05fba85f19708101ee (MD5) Previous issue date: 2008 / According to the immunological surveillance hypothesis, the immune system is relevant against tumor growth. However, the immune response is not completely able to block all tumors. A possible explanation is that immune cells tolerization induced by the tumor immunosuppressive environment enables tumor development and decreases immune efficiency against the tumor. The aim of the present investigation was to better understand the in vivo antitumoral immune response as well as to identify mechanisms that play a role in modulating a reversion of tumor induced tolerance. To that end we used three experimental models: (1) Subcutaneous B16F10 tumor injection to analyze a polyclonal immune response, (2) subcutaneous B16OVA (OVA257-264 SIINFEKL) tumor injection with OT-1 cell adoptive transfer to study a T CD8+ anti-tumoral immune response and (3) construction and subcutaneous injection of a B16F10 expressing MHC class II restricted antigen (B16F10EaRed) with TEa cells adoptive transfer to study TCD4+ anti-tumoral immune response generation. The results using these models showed a reduced number of infiltrating cells in the peritumoral area as well as a decreasing cell number in tumor draining lymph nodes as tumor grew. These findings suggested cell traffic interruption between lymph nodes and primary tumor site. Likewise, CD86 expression in dendritic cells (DCs) was decreased with tumor growth. An increased precursor frequency of anti-tumoral T CD8+ cell in the B16OVA system arrested tumor growth, but did not completely prevent it. A stronger tumor immune response was achieved with injection of intra-tumoral TLR-4 ligand, the E. coli lipopolysacharide (LPS), however only during a specific window of time after tumor injection. The B16EaRed system showed that antigen accessibility by DCs is crucial to stimulate a T CD4+ anti-tumoral immune response; as a result, there was a higher TEa cell proliferation against tumor lisates than whole tumor cells. When tumor cells were induced to undergo necrosis or apoptosis and injected subcutaneously, the result was higher percentage of CD11c+ YAe+ CD86+ cells. There was more TEa cells proliferation in draining lymph nodes from mice injected with apoptotic or necrotic cells, showing a proliferation peak at day nine after tumor injection. However, it was observed a cell contraction three days after. TEa cell division decreased gradually throughout time, suggesting there was limited antigen cell presentation in all experimental models studied. TEa cell memory differentiation was also observed in the three treatments, with emphasis in the animals that received necrotic or apoptotic tumor cells. However, the TEa cells were not able arrest tumor growth when B16EaRED was injected live. Together, these results suggest that the decrease in antigen presentation and co-stimulation throughout time, negatively affects T cell memory differentiation. The results point out that whole tumor does not deliver enough signals to generate anti-tumoral T cells with memory phenotype capable of blocking tumor growth. Contrarily, the tumor seems to create an environment that does not allow immune response, avoiding cell traffic between the draining lymph node (DLN) and the tumor site, decreasing CD86 expression on DCs cells in DLN. In addition, signals delivered by death cells simulating apoptosis or necrosis increased tumor antigen presentation and co-stimulation, but did not replace LPS delivered signals that were efficient to revert immunossupression. / De acordo com a hipótese da vigilância imunológica, o sistema imune é relevante no controle do crescimento tumoral. Entretanto, a resposta imune não é capaz de barrar a progressão de todos os tumores. Uma possível explicação para isso é a tolerização das células imunes proporcionada pelo ambiente imunossupressor gerado por tumores, favorecendo seu desenvolvimento e diminuindo a eficácia da resposta imune contra o tumor. O presente estudo visou analisar a formação de respostas imunes anti-tumorais in vivo, bem como identificar mecanismos capazes de reverter a tolerância induzida pelo tumor à resposta imune. Para realizar este trabalho foram usados três sistemas experimentais: (1) injeção subcutânea de tumor B16F10 para análise da resposta imune policlonal, (2) injeção subcutânea de B16OVA (OVA257-264 SIINFEKL) com transferência adotiva de células OT-I para o estudo da geração de resposta de células T CD8+ e (3) construção e injeção subcutânea de uma linhagem de B16F10 expressando um antígeno restrito ao MHC classe II (B16EaRFP) com transferência adotiva de células TEa para o estudo da geração de resposta anti-tumoral de células T CD4+. Com estes modelos experimentais foi observada diminuição de células no infiltrado peritumoral e da celularidade nos linfonodos drenantes (LND) à medida que o tumor B16F10 cresce, sugerindo uma interrupção do trânsito de células imunes do sítio tumoral para o LND. A expressão de CD86 nas células dendríticas (DCs) nos linfonodos diminui com o crescimento tumoral. Com a elevação da freqüência precursora de células T CD8+ anti-tumorais no sistema B16OVA, o crescimento tumoral foi retardado mas não barrado por completo. A melhora significante da resposta contra o tumor foi obtida com a injeção intratumoral de um ligante de TLR-4, o lipopolissacarideo de E. coli (LPS), mas apenas quando foi injetado via intratumoral, após o estabelecimento do tumor in vivo. O sistema B16EaRFP revelou que a acessibilidade do antígeno às células dendríticas é importante na estimulação da resposta T CD4+ anti-tumoral, resultando em maior proliferação de células TEa em resposta ao tumor lisado versus o tumor vivo. Quando as células tumorais foram induzidas a necrose e apoptose e injetadas subcutaneamente, houve maior porcentagem de células CD11c +YAe+ CD86+. Observou-se maior proliferação de células TEa nos linfonodos drenantes no grupo de camundongos injetados com células tumorais mortas por necrose, com um pico nove dias após a injeção tumoral, mas já apresentando contração após três dias. A divisão das células TEa também diminui gradualmente ao longo do tempo, sugerindo que nos três casos há apresentação limitada de antígeno. A diferenciação das células TEa em fenótipo de memória foi observada nos três tratamentos, com mais ênfase nos animais que receberam tumor induzido a necrose e apoptose. Contudo, as células TEa não foram capazes de fornecer ajuda para interromper o crescimento tumoral quando o B16EaRED foi injetado vivo. Em conjunto, os resultados sugerem que a diminuição da apresentação de antígeno e de co-estimulação ao longo do tempo impedem a diferenciação das células T em células de memória eficazes. Os resultados indicam que o tumor intacto não fornece sinais suficientes para a geração de células T de memória anti-tumoral para impedir o crescimento tumoral. Ao contrário, o tumor parece gerar um ambiente que não favorece a resposta imune, impedindo o trânsito de células imunes entre o LND e o sitio tumoral, diminuindo a expressão de CD86 em DCs no LND. Ainda, sinais fornecidos por células induzidas a apoptose ou necrose aumentam a apresentação de antígenos tumorais e os níveis de co-estimulação, embora não substituam os sinais fornecidos pelo LPS, capazes de reverter o quadro imunossupressor.