Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-11-09T10:37:11Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1627530 bytes, checksum: d83ec7a0fb0846b06086026059e722b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-09T10:37:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1627530 bytes, checksum: d83ec7a0fb0846b06086026059e722b5 (MD5) Previous issue date: 2018-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O sistema circulatório de insetos é aberto, nele a hemolinfa circula principalmente em decorrência da atividade contrátil do coração.Esse órgão está associado a células pericardiais (CP) e músculos alares (MA). O coração desempenha um importante papel do ponto de vista imunológico, uma vez que hemócitos são bombeados em decorrência da atividade cardíaca. Apesar dessa importância, ainda são escassos os trabalhos sobre a morfologia e ultraestrutura do coração e dos tecidos associados em mosquitos. Por meio de diferentes técnicas de microscopia foi analisado, de maneira comparativa, aspectos do coração, CP e MA em adultos de mosquitos hematófagos Aedes aegypti, Anopheles aquasalis e Culex quinquefasciatus e do fitófago Toxorhynchites theobaldi. O coração das espécies analisadas está na região dorsal mediana de todo o abdômen. Eles são formados por fibras musculares circulares que formam um órgão tubular e estriado. As estrias correspondem a miofibrilas. Em todas as espécies analisadas, os núcleos e mitocôndrias estão posicionados na região periférica. Entre a região de transição dos segmentos abdominais 1 a 8 foram observadas óstias incurrentes, enquanto que no cone terminal foi observado uma abertura excurrente. As CP localizam-se nas laterais do coração em regiões correspondentes aos intersegmentos abdominais. O citoplasma dessas células possui inclusões citoplasmáticas que correspondem a lisossomos e vacúolos. Em An. aquasalis e em T. theobaldi, as CP são mais numerosas e formam um cordão de células, semelhante a um sincício. Em Ae. aegypti e C. quinquefasciatus, as CP ocorrem aos pares, sendo dois ou quatro pares de CP por região intersegmentar. Os AM são polinucleados e se ligam por meio de suas ramificações à parede do coração. Em T. theobaldi os MA se ligam em todas as regiões do coração, enquanto que nos outros mosquitos eles se ligam apenas nas regiões do órgão localizados nas regiões intersegmentais. A morfologia e ultraestrutura do coração é conservada entre as espécies de mosquitos adultos de diferentes gêneros e hábitos alimentares. Entretanto, as espécies apresentam diferenças quanto à morfologia das CP e disposição dos MA, que provavelmente refletem diferenças evolutivas e fisiológicas do sistema circulatório de mosquitos. / In the opened circulatory system of insects, the hemolymph circulates mainly through of the contractile activity of a tubular-shaped heart. The heart is associated with pericardial cells (PC) and alary muscles (AM). The heart also plays an important immunological role, since hemocytes are propelled by the organ activity. Despite this importance, works dedicated to the morphology and ultrastructure of the heart and associated tissues in mosquitoes are still scarce. In the present work, the morphology of the heart, PC and AM in adults of hematophagous mosquitoes Aedes aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus and of the phytophagous Toxorhynchites theobaldi were compared by means of different microscopy techniques. The hearts of mosquitos are located in the median dorsal region of the entire abdomen. They are formed by circular muscle fibers that form a tubular and striated structure. Nuclei and mitochondria are positioned in the peripheral region of muscle fibers. Paired openings of the heart wall or ostia are located in the intersegmental regions of the abdomen from abdominal segments 1 to 8. These ostia are of the incurrent type, while in the terminal cone an excurrent opening was observed. PC are located on the sides of the heart and the cytoplasm of PC has structures that correspond to lysosomes and vacuoles. PCs are more numerous in An. aquasalis and T. theobaldi and form a cord of cells, resembling a syncytium. In Ae. aegypti and C. quinquefasciatus, PC occur in pairs, with two or four PC pairs per intersegmental region. AM are multinucleated and bind through their branches to the heart wall. In T. theobaldi AM binds in all regions of the heart, whereas in other mosquitoes they bind only in the intersegmental regions. The morphology and ultrastructure of the heart is conserved among adult mosquito species of different genera and feeding habits. However, the species present differences regarding the morphology of PC and of AM. These differences seems to be related to evolutionary and physiological differences in the circulatory system of mosquitoes.

Caulobacter crescentus é uma bactéria gram-negativa que dá origem a duas células filhas a cada divisão celular, a célula móvel e a célula talo, que se distinguem por sua morfologia, programa de desenvolvimento e capacidade de replicação do DNA. O gene alkB de C. crescentus foi identificado num clone que contém os genes de choque térmico dnaK e dnaJ (Gomes et al, 1990). Em E. coli, o gene alkB mostrou estar envolvido, juntamente com os genes alkA e ada, no reparo de lesões do DNA causadas por agentes alquilantes (Teo et al, 1986). O gene alkB de E coli forma um operon com o gene ada, sendo que o gene ada precede o gene alkB. A expressão de ambos os genes é induzida por doses não letais de agentes alquilantes, a nível de transcrição. A seqüência de aminoácidos deduzida da seqüência de nucleotídeos do gene alkB de Caulobacter crescentus mostrou uma identidade de 42,5 % com a proteína AlkB de E. coli (Kondo et al, 1986). Ao contrário do que ocorre em E.coli, este gene não faz parte de um operon com o gene ada e sua expressão não é induzida por agentes alquilantes. Através do ensaio de proteção à nuclease S1 foi demonstrada a existência de um único início de transcrição para este gene. Para medir o nível de expressão do gene alkB foi construída a fusão de transcrição alkB-placZ/290, onde o vetor repórter de transcricão (placZ/290) (Gober & Shapiro, 1992) contendo o gene da (β-galactosidase sem o seu promotor foi ligado ao fragmento Sall/Stul (0,3 kb) que contém apenas a região promotora do gene alkB. Observou-se que a transcrição do gene alkB é regulada durante o ciclo celular de Caulobacter crescentus, apresentando níveis máximos na célula talo. Verificou-se ainda, através do experimento de dupla sincronia, que a proteína AlkB de C. crescentus sintetizada na célula prédivisional é segregada tanto para a célula móvel como para a célula talo, não apresentando um padrão polar de expressão. A resposta adaptativa a agentes alquilantes foi demonstrada em C. crescentus pela detecção de um aumento na sobrevivência aos efeitos letais dos agentes alquilantes em células pré-tratadas com baixas doses destes agentes e pela identificação de uma proteína induzida por agentes alquilantes utilizando anticorpos monoclonais anti-Ada de E. coli. / Caulobacter crescentus is a gram-negative bacterium that yields two different progeny cells at each division cycle, the swarmer cell and the stalked cell, which differ in structure, developmental program and ability to replicate DNA. The alkB gene in Caulobacter crescentus was identified in a clone which contains also the heat shock genes dnaK and dnaJ (Gomes et al, 1990). In Escherichia coli the alkB gene has been shown to be involved, with alkA and ada, in the pathway for repair of DNA alkylation damage (Teo et al, 1986). The E. coli alkB gene forms an operon with the ada gene, being downstream of it. The addition of the alkylating agent MMS to E. coli cultures induces the expression of both ada and alkB, at the level of transcription. The aminoacid sequence deduced from the nucleotide sequence of the C. crescentus alkB gene has shown 42,5% identity with the AlkB protein of E. coli (Kondo et al, 1986). Contrary to what happens in E. coli, the alkB gene of Caulobacter cescentus does not form an operon with the ada gene and its expression is not induced by alkylating agents. S1 nuclease protection assays have shown the presence of a single start of transcription for the alkB gene. To investigate the expression of the alkB gene during the cell cycle of the bacterium, its regulatory region was fused to a promoterless lacZ gene present in the vector placZJ290 (Gober & Shapiro, 1992), and β-galactosidase activity and synthesis, directed by the alkB gene promoter, were determined. It was observed that expression of the alkB gene is cell cycle controlled in Caulobacter. The placZJ290 transcriptional fusion with alkB, expressed in predivisional cells did not display a polar pattern of segregation in Caulobacter crescentus. β-galactosidase synthesized in predivisional cell was partitioned in equal amounts to both cell types after cell division. An adaptive response to alkylation damage has been demonstrated in C. crescentus. The response was detected by the increased resistance to cell killing of pretreated cells with low doses of methylating agents, followed by exposure to higher doses of these agents, and by cross-reactivity of an inducible protein of 39 kDa with E. coli anti-Ada monoclonal antibodies.

A ativação dos fagócitos é crítica para a defesa contra vários patógenos, por isso a importância de estudos que desenvolvam alternativas para a ativação dessas células. Nosso estudo visou investigar os efeitos do BAY 41-2272 na ativação de fagócitos. Para este propósito avaliamos a fagocitose, liberação de superóxido e atividade microbicida. Foram usados PBMC, neutrófilos e a linhagem celular THP-1, cultivadas na presença ou ausência de BAY 41-2272 (1mM ou 3mM) por 1h ou 48h a 37°C. A liberação de superóxido foi avaliada pelo ensaio da redução do citocromo c inibido especificamente pela superóxido dismutase; a fagocitose foi analisada através da co-cultura com partículas de Zymosan e contagem das células com partículas englobadas; e a atividade microbicida foi mensurada por meio da co-cultura com E. coli enteropatogênica seguida pela contagem das CFU formadas pelas bactérias recuperadas dos fagócitos. Além disso, fizemos a dosagem de IL-12, IFN-g e TNF-a e a análise da expressão gênica do gene CYBB. Todos os tipos celulares responderam aos tratamentos. Os PBMC, neutrófilos e THP-1 tratados com BAY 41-2272 produziram significativamente mais superóxido (cerca de 50% mais), e apresentaram significativamente maior atividade fagocítica (cerca de 54% mais), microbicida (cerca do dobro) comparados ao grupo controle não tratado, além de produzir TNFa. Ainda, o tratamento com o fármaco aumentou a expressão do gene da gp91phox nas THP-1 e PBMC. BAY 41-2272, especialmente na dose de 3mM, mostrou um grande potencial na ativação dos fagócitos em vários aspectos. Este potencial pode ser explorado na busca por novas terapias destinadas ao controle de infecções, principalmente no caso das imunodeficiências. / Phagocyte activation is critical role for host defense against several pathogens, so that studies developing alternatives for activating these cell are very important. We investigated the effects of BAY 41-2272 on phagocytes activation. For this purpose we evaluated several aspects indicating cellular activation, as phagocytosis, superoxide release and microbicidal activity. We used PBMC, neutrophils and THP-1 cell lineage cultured or not with BAY 41-2272 (1mM and 3mM) for 1h or 48h at 37°C. Superoxide release was tested by superoxide dismutase-inhibitable cytochrome c reduction assay; phagocytosis was evaluated through co-culture with zymosan particles and counting of ingested particles; and microbicidal activity was measured through co-incubation with enteropathogenic E. coli followed by counting of CFU from recovered bacteria from phagocytes. We analyzed the IL-12, IFN-g and TNF-a cytokine production and gp91phox gene expression. All cell types showed a response to treatments. PBMC, PMN and THP-1 treated with BAY 41-2272 produced significantly more superoxide (about 50% more), and presented significantly more phagocytic (about 54% more), microbicidal (about twice) activity than control group and production more TNF-a than control group. The expression of CYBB gene was more expressed on treated cells than control. BAY 41-2272, especially at 3mM, showed a great potential in activation of phagocytes in several aspects. This potential should be investigated at the light of new therapies seeking infection control, mainly in immunodeficiency.

As leucemias são desordens proliferativa nas células tronco hematopoiéticas pluripotentes caracterizada por mutações que comprometem seus precursores mielóides ou linfóides levando ao desenvolvimento de leucemias similares quanto ao fenótipo (Mielóide ou Linfóide) e forma (Crônica ou Aguda). Descrito em 1960, o cromossomo philadelphia (Ph) foi a primeira anomalia cromossômica associada a uma neoplasia, a Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Em 1973, foi demonstrado que o cromossomo Ph resulta da translocação recíproca entre os braços longos do cromossomo 9 e 22 [t(9;22)(q34;q11)], produzindo um gene quimérico BCR-ABL, encontrado em 95% dos casos de LMC. A proteína quimérica codificada, BCR-ABL, com atividade tirosina quinase descontrolada, é o fator causal da LMC. Durante os anos 1990, uma série de moléculas sintéticas foram desenvolvidas e testadas para inibir especificamente a atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL, o Imatinib (STI-571 ou Gleevec) foi a primeira dessas drogas aprovadas e usadas como agente terapêutico contra a LMC, demonstrando redução do número de células leucêmicas em quase todos pacientes. No entanto muitos pacientes com resistências primárias ou secundárias foram frequentemente relatados. Os mecanismos de resistência são provavelmente heterogêneos, e no mínimo dois mecanismos envolvendo o gene BCR-ABL foram descritos em estudos realizados in vivo: amplificação do gene e ocorrência de mutações que resultam em substituições de aminoácidos associadas com o fenótipo de resistência. Diferentes níveis de resistência são frequentemente associadas a mutações pontuais recorrentes encontradas no domínio quinase da proteína c-ABL em regiões como: sítio catalítico, alça de ativação (A-loop) e alça de fosforilação (P-loop). Os primeiros estudos computacionais foram realizados com o mutante Thr334Ile e mutações na região do P-loop, e ajudaram a entender num nível molecular, os mecanismos de resistência ao Imatinib. Neste trabalho, realizamos um estudo estrutural e termodinâmico das interações entre os ligantes Imatinib e Nilotinib no sítio ativo da proteína c-ABL selvagem e em 12 proteínas com mutações específicas, além de determinar a importância do solvente (com particular interesse na molécula de água denominada Cw - que medeia a interação fármaco-proteína) no processo de resistência aos fármacos. No presente trabalho, utilizamos o método semi-empírico de energia de interação linear (LIE) de maneira alternativa: analisando as interações entre diferentes mutantes da proteína c-ABL e um inibidor (Imatinib ou Nilotinib). Os coeficientes de LIE obtidos foram os seguintes: com Cw fixa (restrição de Cw na posição inicial) = 0,2169; = 0,0654; = 1,4159; e Cw livre (sem restrição de Cw na posição inicial) = 0,0394; = 0,0077; = -2,0503. O melhor ajuste dos coeficientes de LIE foram obtidos nas simulações sem restrição da posição inicial de uma molécula de água conservada (Cw), essa escolha foi baseada no valor de energia livre absoluta da proteína c-ABL selvagem ( ) ser sempre um número mais negativo quando comparado com o valor da energia livre absoluta de cada proteína c-ABL mutada. O uso do método LIE (Linear Interaction Energy) com essa estratégia foi eficiente para analisar o efeito da interação entre diferentes proteínas c-ABL mutantes e um ligante (Imatinib ou Nilotinib). Até o momento não existem simulações de dinâmica molecular na presença de outros domínios da proteína BCR-ABL: SH2 e SH3.

O sangue do cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido usado como fonte de células-tronco hematopoiéticas (CTH) para reconstituir a função medular (hematopoiese). A maioria das vezes, esta modalidade de transplante requer a criopreservação das CTH, que permanecem congeladas até uma possível utilização futura. Na criopreservação de CTH, o reagente químico dimetilsulfóxido (DMSO) tem sido utilizado como um crioprotetor. No entanto, tem sido provado que DMSO tem efeitos tóxicos para o corpo humano. Muitos organismos na natureza possuem uma capacidade de sobreviver ao congelamento e à desidratação acumulando dissacarídeos, como a trealose e sacarose, por isso a trealose, tem sido investigada como um crioprotetor alternativo para diversos tipos celulares. Outro dano muito comum durante o congelamento é a formação de espécie reativas de oxigênio (ERO) que diminui a viabilidade celular, por isso a adição de bioantioxidantes na solução de criopreservação das células é passo muito importante. Este estudo foi dividido em duas fases na primeira foram avaliados os resultados obtidos com a adição de antioxidantes na solução de criopreservação das células de SCUP e na segunda fase avaliou-se a hipótese que a solução de criopreservação contendo trealose intracelular e extracelular melhora a recuperação e a viabilidade das células-tronco do SCUP, após a criopreservação. SCUP foi processado e submetido à criopreservação em soluções contendo na primeira fase: soluções com diferentes concentrações de DMSO (10%, 5% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (5%, 2,5%) com um dos dissacarídeos (60mmol/L) e ácido ascórbico e/ou catalase (10mg/mL); e na segunda fase: soluções contendo diferentes concentrações de DMSO (10% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (2,5%) com trealose intra (a trealose foi introduzida na célula por meio de lipossomas) e extracelular e soluções contendo trealose intra e extracelular sem DMSO, armazenados por duas semanas em N2L, e descongeladas. As células descongeladas foram avaliadas por citometria de fluxo, pelo ensaio metabólico pelo MTT e de unidades formadoras de colônias (UFC). Na primeira fase do estudo, a catalase, melhorou a preservação das células CD34+ e CD123+, a UFC e a viabilidade celular, em comparação com a solução padrão de criopreservação. Já na segunda fase do estudo, após as análises de todos os testes vimos que a solução que continha trealose intra/extracelular e DMSO mostrou uma capacidade de manutenção da viabilidade/integridade celular superior a todas as outras testadas. A solução que continha trealose intra e extracelular sem DMSO, obteve um resultado comparável com seu controle (2,5%DMSO), porém quando avaliamos a solução que continha apenas trealose intracelular não obtivemos resultados satisfatórios. A catalase pode atuar sobre a redução dos níveis ERO na solução de criopreservação das CTH de SCUP, diminuindo os danos por ele causados e a trealose deve estar presente em ambos os lados das células durante o processo de congelamento. Portanto, em testes clínicos futuros, ela poderá ser um potencial crioprotetor das células-tronco de SCUP, podendo substituir totalmente o DMSO da solução de criopreservação, minimizando com os efeitos colaterais provenientes da infusão de produtos criopreservados nos pacientes. / The umbilical cord blood (UCB) has been used as a source of primitive hematopoietic stem cells (HSC) to reconstitute the hematopoiesis. Most often, it is required the cryopreservation of HSC, which remain frozen in banks for possible future use. For cryopreservation of HSC, the chemical reagent dimethylsulfoxide (DMSO) has been used as a cryoprotectant. Many organisms in nature have a capacity of survive freezing and dehydration by accumulating disaccharides, so the trehalose, has been actively investigated as an alternative cryoprotector, other damage which is very common during freezing is oxygen free radicals formation which decreases the cellular viability after thawing, so the addition of bioantioxidants in the solution of cryopreservation of cells is very important. This study was divided into two phases: first, we evaluated the results obtained with the addition of antioxidants in the solution for cryopreservation of cord blood cells and the second phase: evaluate the hypothesis that the cryopreservation solution containing intracellular and extracellular trehalose improves recovery and viability of cord blood stem cells after cryopreservation. UBC was processed and subjected to cryopreservation solutions containing for the first phase: solutions with different concentrations of DMSO (10%, 5% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (5%, 2.5 %) with a disaccharide (60 mmol/L), ascorbic acid and/or catalase (10mg/mL), and for the second phase: solutions containing different concentrations of DMSO (10% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (2.5%) with intracellular trehalose (trehalose was introduced into the cell by means of liposomes) and solutions containing extra and intracellular trehalose without DMSO, stored for two weeks in N2L, and thawed. The thawed cells were assessed by flow cytometry, MTT and colony forming units (CFU) assays. In the first phase of the study our analysis showed catalase improved the preservation CD34+ and CD123+ cells, cell viability and CFU compared to standard cryopreservation solution. In the second phase, after testing of all test we observed that the solution containing intra/extracellular trehalose and DMSO showed superior capacity of maintaining the cell viability/integrity in relation to the others, the solution containing intra-and extracellular trehalose without DMSO, obtained a result that can be compared with its control (2.5% DMSO), and that the solution containing only intracellular trehalose did not generate satisfactory results. The catalase can act on reducing the levels of reactive oxygen species in the solution for cryopreservation of HSC of UCB reducing the damage it caused, trehalose must be present on both sides of the cells during the freezing process. Future clinical trials are needed to confirm that it may be a potential cryoprotectant of stem cells from cord blood, which can totally replace the DMSO in cryopreservation solution, eliminating the side effects from the infusion of cryopreserved products in patients already suffering from the disease base.

O sangue do cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido usado como fonte de células-tronco hematopoiéticas (CTH) para reconstituir a função medular (hematopoiese). A maioria das vezes, esta modalidade de transplante requer a criopreservação das CTH, que permanecem congeladas até uma possível utilização futura. Na criopreservação de CTH, o reagente químico dimetilsulfóxido (DMSO) tem sido utilizado como um crioprotetor. No entanto, tem sido provado que DMSO tem efeitos tóxicos para o corpo humano. Muitos organismos na natureza possuem uma capacidade de sobreviver ao congelamento e à desidratação acumulando dissacarídeos, como a trealose e sacarose, por isso a trealose, tem sido investigada como um crioprotetor alternativo para diversos tipos celulares. Outro dano muito comum durante o congelamento é a formação de espécie reativas de oxigênio (ERO) que diminui a viabilidade celular, por isso a adição de bioantioxidantes na solução de criopreservação das células é passo muito importante. Este estudo foi dividido em duas fases na primeira foram avaliados os resultados obtidos com a adição de antioxidantes na solução de criopreservação das células de SCUP e na segunda fase avaliou-se a hipótese que a solução de criopreservação contendo trealose intracelular e extracelular melhora a recuperação e a viabilidade das células-tronco do SCUP, após a criopreservação. SCUP foi processado e submetido à criopreservação em soluções contendo na primeira fase: soluções com diferentes concentrações de DMSO (10%, 5% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (5%, 2,5%) com um dos dissacarídeos (60mmol/L) e ácido ascórbico e/ou catalase (10mg/mL); e na segunda fase: soluções contendo diferentes concentrações de DMSO (10% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (2,5%) com trealose intra (a trealose foi introduzida na célula por meio de lipossomas) e extracelular e soluções contendo trealose intra e extracelular sem DMSO, armazenados por duas semanas em N2L, e descongeladas. As células descongeladas foram avaliadas por citometria de fluxo, pelo ensaio metabólico pelo MTT e de unidades formadoras de colônias (UFC). Na primeira fase do estudo, a catalase, melhorou a preservação das células CD34+ e CD123+, a UFC e a viabilidade celular, em comparação com a solução padrão de criopreservação. Já na segunda fase do estudo, após as análises de todos os testes vimos que a solução que continha trealose intra/extracelular e DMSO mostrou uma capacidade de manutenção da viabilidade/integridade celular superior a todas as outras testadas. A solução que continha trealose intra e extracelular sem DMSO, obteve um resultado comparável com seu controle (2,5%DMSO), porém quando avaliamos a solução que continha apenas trealose intracelular não obtivemos resultados satisfatórios. A catalase pode atuar sobre a redução dos níveis ERO na solução de criopreservação das CTH de SCUP, diminuindo os danos por ele causados e a trealose deve estar presente em ambos os lados das células durante o processo de congelamento. Portanto, em testes clínicos futuros, ela poderá ser um potencial crioprotetor das células-tronco de SCUP, podendo substituir totalmente o DMSO da solução de criopreservação, minimizando com os efeitos colaterais provenientes da infusão de produtos criopreservados nos pacientes. / The umbilical cord blood (UCB) has been used as a source of primitive hematopoietic stem cells (HSC) to reconstitute the hematopoiesis. Most often, it is required the cryopreservation of HSC, which remain frozen in banks for possible future use. For cryopreservation of HSC, the chemical reagent dimethylsulfoxide (DMSO) has been used as a cryoprotectant. Many organisms in nature have a capacity of survive freezing and dehydration by accumulating disaccharides, so the trehalose, has been actively investigated as an alternative cryoprotector, other damage which is very common during freezing is oxygen free radicals formation which decreases the cellular viability after thawing, so the addition of bioantioxidants in the solution of cryopreservation of cells is very important. This study was divided into two phases: first, we evaluated the results obtained with the addition of antioxidants in the solution for cryopreservation of cord blood cells and the second phase: evaluate the hypothesis that the cryopreservation solution containing intracellular and extracellular trehalose improves recovery and viability of cord blood stem cells after cryopreservation. UBC was processed and subjected to cryopreservation solutions containing for the first phase: solutions with different concentrations of DMSO (10%, 5% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (5%, 2.5 %) with a disaccharide (60 mmol/L), ascorbic acid and/or catalase (10mg/mL), and for the second phase: solutions containing different concentrations of DMSO (10% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (2.5%) with intracellular trehalose (trehalose was introduced into the cell by means of liposomes) and solutions containing extra and intracellular trehalose without DMSO, stored for two weeks in N2L, and thawed. The thawed cells were assessed by flow cytometry, MTT and colony forming units (CFU) assays. In the first phase of the study our analysis showed catalase improved the preservation CD34+ and CD123+ cells, cell viability and CFU compared to standard cryopreservation solution. In the second phase, after testing of all test we observed that the solution containing intra/extracellular trehalose and DMSO showed superior capacity of maintaining the cell viability/integrity in relation to the others, the solution containing intra-and extracellular trehalose without DMSO, obtained a result that can be compared with its control (2.5% DMSO), and that the solution containing only intracellular trehalose did not generate satisfactory results. The catalase can act on reducing the levels of reactive oxygen species in the solution for cryopreservation of HSC of UCB reducing the damage it caused, trehalose must be present on both sides of the cells during the freezing process. Future clinical trials are needed to confirm that it may be a potential cryoprotectant of stem cells from cord blood, which can totally replace the DMSO in cryopreservation solution, eliminating the side effects from the infusion of cryopreserved products in patients already suffering from the disease base.

Com o objetivo de analisar a expressão diferencial de genes em cepas de Trypanosoma cruzi pela técnica de microarranjos de DNA, construímos um protótipo de lâminas contendo 710 etiquetas de seqüências transcritas (ESTs) de epimastigotas de CL Brener e 20 genes de várias cepas do parasita. A seqüência nucleotídica estava disponível para 576 ESTs. Desta forma, seqüenciamos as 134 ESTs restantes e sua seqüência foi depositada no dbEST do GenBank. O agrupamento das sondas indicou que a lâmina continha 665 seqüências únicas. Inicialmente, avaliamos o microarranjo para a análise de genômica comparativa entre as cepas CL Brener (T. cruzi II) e Silvio (T. cruzi I). Um total de 4 hibridizações foram realizadas. Verificamos, com uma significância estatística (P≤ 0,01 no teste-t) que 31 seqüências do microarranjo (4,3%) apresentaram maior sinal de hibridização com o DNA de CL Brener, enquanto 37 sondas (5,0%) apresentaram situação inversa. Esse resultado sugere diferenças no número de cópias gênicas e/ou variação na similaridade das seqüências. Várias sondas com hibridização diferencial foram confirmadas em experimentos de Southern blot com DNA genômico dos dois isolados. Em seguida, o microarranjo foi avaliado para a análise da expressão diferencial de genes. Para isto, a lâmina foi hibridizada com cDNA de formas epimastigotas (fase midlog de crescimento) de CL Brener e Silvio. Um total de 8 experimentos de hibridização foi realizado com preparações de RNA obtidas de três cultivos independentes. Identificamos, com uma significância estatística (P≤ 0,01), 84 sondas (84/730; 11,5%) diferencialmente expressas: 35 sondas mais expressas em Silvio e 49 sondas mais expressas em CL Brener. Algumas destas sondas foram confirmadas por Northern blot. A comparação dos dados dos experimentos de hibridização do microarranjo com DNA e cDNA das duas cepas permitiu concluir que não há uma correlação direta entre a abundância de determinado ene e seu nível de expressão. Em alguns casos, observamos que seqüências com maior hibridização com o DNA de uma cepa são mais expressas na outra. Visando iniciar os estudos de expressão diferencial de genes em cepas isoladas de pacientes chagásicos, escolhemos as cepas Famema e Hem 179 (T. cruzi II), isoladas, respectivamente, de um paciente com a forma indeterminada da doença de Chagas e de um paciente com alterações cardíacas e digestivas. Observamos que aproximadamente 2,5% (18/730) das sondas apresentaram expressão diferencial nas formas epimastigotas das duas cepas e que 9,0% (65/730) das sondas mostraram razões de hibridização diferente nas formas infectantes (tripomastigotas metacíclicos). Algumas destas sondas foram confirmadas por Northern blot. Entre as sondas mais expressas em Hem 179, está a seqüência que codifica a subunidade 7 da NADH desidrogenase (ND7). O conjunto de dados permitiu concluir que microarranjos contendo predominantemente ESTs de CL Brener são uma ferramenta útil para estudos de genômica comparativa, análise de expressão gênica em isolados de T. cruzi, bem como para a descoberta de novos genes. Além disto, este estudo indicou uma regulação pós-transcricional intensa dos níveis de RNA em T. cruzi. Ampliamos os estudos para um maior número de cepas e construímos outro microarranjo contendo 710 ESTs de CL Brener (forma epimastigota), 45 ESTs da cepa Tulahuen (forma amastigota) e 32 genes de várias cepas do parasita. As 787 seqüências representam 714 seqüências únicas. O RNA total foi isolado de formas epimastigotas de cepas de três pacientes com a forma cardíaca (cepas 115, B13 e 147), e de três pacientes assintomáticos (cepas VL10, Famema e Berenice 62). Cinco da seis cepas são de regiões endêmicas de Minas Gerais (exceto Famema que é do estado de São Paulo). Após hibridização competitiva, a análise estatística dos dados indicou expressão diferencial de 14 sondas (14/787; 17,7%) entre os dois grupos de cepas. Destas, 9 sondas estão induzidas em todas as cepas isoladas de pacientes cardíacos e 4 sondas estão reprimidas em todas as cepas de cardíacos quando comparadas com as cepas de assintomáticos. Dentre as sondas mais expressa em cepas de cardíacos estão: as ESTs que codificam a subunidade 7 da NADH desidrogenase (ND7), a aspartato aminotransferase, enzima importante no processo de regeneração de metionina, e a triparedoxina peroxidase de T. cruzi, envolvida na resistência a peróxidos exógenos. Também foram reveladas 8 ESTs que não apresentam similaridade em bancos de dados. Parte destas sondas foi confirmada por Northern blot com RNA total de todas as cepas. Em alguns casos, identificamos diferenças do tamanho de transcritos entre as cepas. Em resumo, a análise da expressão diferencial de genes em cepas de pacientes com a forma cardíaca e indeterminada da doença de Chagas permitiu identificar alguns genes que podem estar relacionados à patogênese e/ou serem usados como alvo para o prognóstico da evolução doença. Posteriormente, realizamos um experimentos-piloto para investigar a resposta transcricional de fibroblastos humanos em cultura à infecção com duas cepas de T. cruzi: VL10 (isolada de indivíduo assintomático) e 147 (isolada de indivíduo com cardiopatia severa). Após 24 horas de infecção, os RNAs das monocamadas foram extraídos. No mesmo período, RNA foi extraído de fibroblastos humanos não infectados e usado como referência. Experimentos de hibridização competitiva foram realizados em lâminas de microarranjo contendo oligonucleotídios derivados de 24.000 genes humanos, construídas o Laboratório de Tecnologia Molecular do Instituto Nacional do Câncer do NIH, em Frederick, EUA chefiado pelo Dr. David Munroe. Identificamos 28 sondas diferencialmente transcritas nas células infectadas com a cepa 147 (paciente cardíaco). Destas, 27 sondas (27/28; 96,4%) estão com expressão reduzida nas células infectadas. Por outro lado, apenas uma sonda, correspondente ao gene da \"heme oxigenase (decycling) 1\", apresentou indução nas células infectadas com 147. Na infecção de células com a cepa VL10, encontramos 17 sondas diferencialmente transcritas. Destas, 16 sondas (16/17; 94,1 %) estão com expressão aumentada nas células infectadas (dentre elas, a heme oxigenase), enquanto que apenas uma sonda (proteína 5 ligante do fator de crescimento do tipo insulina) mostra situação inversa. Concluímos que as diferenças de resposta da mesma célula hospedeira à infecção pelas duas cepas são marcantes, o que determina um estudo temporal ao longo da infecção para a confirmação das observações acima. Comprovamos por PCR em tempo real o aumento da expressão da heme oxigenase na infecção pelas duas cepas e repressão da expressão da proteína 5 ligante do fator de crescimento do tipo insulina apenas em células infectadas por VL10. / To investigate differential gene expression in Trypanosoma cruzi strains by microarray DNA technology, we have constructed a prototype slide that contains 710 expression sequence tags (ESTs) of CL Brener epimastigotes and 20 genes of various parasite strains. The nucleotide sequence was available for 576 ESTs. Therefore, we have sequenced 134 additional ESTs and the sequences have been deposited in dbEST of GenBank. Clustering of these probes indicated that slide contains 665 unique sequences. Initially, we have evaluated the microarray for comparative genomic analysis between CL Brener (T. cruzi II) and Silvio (T. cruzi I) strains. Four independent experiments were performed. We verified that 31 probes (4.3%) showed statistical significant (P≤, 0.01 in t-test) higher hybridization with CL Brener DNA, whereas 37 probes (5.0%) showed the inverse situation. This suggests differences in the abundance of the genes in the genomes of the strains and/or variation in sequence similarity. Some of these probes were confirmed by Southern blot with genomic DNA of both strains. Next, we evaluated the microarray for the analysis of differential gene expression. For this purpose, the slide with hybridized with cDNA obtained from epimastigote forms in mid-log growth phase of CL Brener and Silvio strains. A total of eight hybridization experiments were perfonned with RNA preparations obtained from three independent parasite harvests. We identified 84 probes (841730; 11.5%) that showed statistically significant changes (P≤, 0.01 in t-test) in expression: 35 probes up regulated in Silvio and 49 probes up regulated in CL Brener. Some of these probes were confirmed by Northern blot. When we compared the data of the hybridization of the microarray with genomic DNA and cDNA of CL Brener and Silvio, we verified no correlation between the putative abundance of a particular gene and its expression level. In a few cases, we noticed that sequences with higher hybridization with genomic DNA of one strain were more expressed in the other. In an initial attempt of investigate differential gene expression in human T. cruzi isolates, we selected the strains Famema and Hem 179 (both T. cruz II), obtained, respectively, from an asymptomatic individual and from a patient with severe cardiopathy and digestive disorders. Differential expression of 2.5% (181730) and 9.0% (651730) of the probes was observed, respectively, in epimastigotes and metacyclic trypomastigotes of the two strains. Some of the probes were confirmed by Northern blot. Among the probes more expressed in Hem 179 is the gene encoding subunit 7 of theNADH dehydrogenase (ND7). We concluded that microarrays, containing predominantly ESTs of CL Brener, are a powerful tool for comparative genomics and gene expression analyses in T. cruzi as well as for discovery of new genes. In addition, this study has provided further evidence for a high level of post-transcriptional regulation of RNA abundance in T. cruzi. We have extended the analysis to a larger number of strains and constructed a new set of microarray slides, which contain 710 ESTs of CL Brener epimastigotes, 45 ESTs Tulahuen strain amastigotes and 32 characterized genes of various strains. These probes represent 714 unique sequences. Total RNA was extracted from mid-log phase epimastigotes of three strains isolated from patients with cardiac disorders (115, B13 and 147) and three strains from asymptomatic patients (VL10, Famema and Berenice 62). Five of these strains are from endemic areas of Minas Gerais (except Famema that is from the state of São Paulo). After competitive hybridization with the microarray, statistical analysis of the data indicated differential expression of 14 probes (14/787, 17.7%) between the two groups of strains. Among these sequences, 9 probes are up regulated in all the strains from cardiac patients and 4 probes are down regulated in all these strains as compared with all the strains isolated from asymptomatic individuals. Among the probes up regulated in the strains from cardiac patients there are ESTs encoding subunit 7 of the NADH dehydrogenase (ND7); aspartate aminotransferase, key enzyme in the methionine regeneration process; and T. cruzi tryparedoxin peroxidase, an important enzyme for resistance to exogenous peroxides. Eight ESTs with no similarity matches in databases were also disclosed. Some of these probes were confirmed by Northern blot assays with RNA of all the strains. In some cases, we noticed differences of the molecular size of the transcripts among the strains. In summary, the analysis of differential gene expression in strains isolated from human chagasic patients with the cardiac and indeterminate forms allowed the identification of some potential genes that may be related to pathogenesis and/or may be used as targets for prognosis of the evolution of Chagas disease. Subsequently, we performed a pilot experiment to investigate the transcriptional response of human fibroblasts in culture to the infection by two T. cruzi strains: VL10 (isolated from an asymptomatic patient) and 147 (isolated from a patient with severe cardiomyopathy). After 24 hours of infection, total RNA was extracted from the infected monolayers. In the same period, RNA was extracted from not infected human fibroblasts, and used as a control. Competitive hybridization experiments were performed in microarray slides containing oligonucleotides representing 24,000 human genes, constructed in the Laboratory of Molecular Technology of the National Institute of Cancer of N1H, in Frederick, EUA headed by Dr. David Munroe. We identified 28 probes differentially transcribed in cells infected with 147 strain. Of these, 27 probes (27/28; 96.4%) were down regulated in the infected celIs, and only one probe, corresponding to the heme oxygenase (decycling) 1 gene, showed up regulation. For the fibroblast infected with VL 10 strain, we found 17 probes differentially transcribed. Of these, 16 probes (16/17; 94.1%) were up regulated (among these probes there is the heme oxigenase sequence), and only one probe (insulin-like growth factor binding protein 5) showed the inverse situation. We concluded that there are drastic differences in the response of the same cell line to the infection by two parasite stmins. This determines that a temporal analysis of gene expression during the infection process should be performed to corroborate the above observations. The increase of heme oxigenase transcripts in fibroblasts infected by the two strains was comrrmed by real time-PCR This methodology also confirmed down-regulation of the insulin-like growth factor binding protein 5 rnRNA in fibroblasts infected with VL 10 strain.

Ras é uma proteína G monomérica que converte estímulos extracelulares em sinais bioquímicos intracelulares e controla uma variedade de processos biológicos, tais como, proliferação, diferenciação, adesão e morte celular por apoptose. Além da ativação mediada por fatores de crescimento e hormônios, Ras pode ser ativado pela interação com o óxido nítrico (NO·), um radical capaz de mediar processos de sinalização. Essa interação resulta na S-nitrosação do resíduo de cisteína 118 de Ras. Assim, propusemo-nos avaliar a participação da proteína Ras e das MAP quinases: ERK1/2, JNK e p38 no processo de apoptose de células THP-1 induzida pelo doador de NO·, S-nitrosoglutationa (SNOG). Para tanto, transfectamos células THP-1 com o plasmídeo que carrega o gene que codifica para a proteína Ras mutada, na qual o resíduo de cisteína 118 foi trocado por um resíduo de serina, o que tornou Ras não responsiva ao NO·. A apoptose foi evidenciada através da formação de corpos apoptóticos, exposição de fosfatidilserina e ativação de caspase-3. A modulação da apoptose via reação de S-nitrosação foi demonstrada através da diminuição estatisticamente significativa da exposição de fosfatidilserina nas células transfectadas com o plasmídeo p21 RasC118S quando comparadas com as células selvagens e parentais. A ativação da proteína Ras ocorreu após 5, 15 e 30 minutos da adição de SNOG nas células parentais; entretanto, nas células transfectadas com o plasmídeo p21 RasC118S não observamos resposta de ativação de Ras. A avaliação das MAP quinases revelou ativação de máxima de ERK após 4 horas e ativação máxima de JNK e p38 após 2 horas de incubação com SNOG. Em relação as MAP quinases nas células transfectadas, as células p21 RasC118S apresentaram diminuição apenas da ativação ERK, quando comparadas com as células p21RasWt. A utilização dos inibidores específicos de MEK, JNK e p38; PD09895, CEP11004 e SB22004, respectivamente demonstrou que apenas a inibição de ERK diminuiu significativamente a apoptose nas células THP-1. Concluímos que na apoptose de células THP-1 estimulada por NO·, o radical livre ativa Ras via S-nitrosação, que por sua vez, recruta ERK, MAP quinase participante desta cascata de sinalização. Finalmente, demonstramos que ERK exerce papel fundamental na condução do sinal de apoptose no modelo que estudamos. / Ras is a monomeric small G protein that converts intracellular stimulus into intracellular biochemical signals. Ras controls a myriad of biological processes such as, proliferation, differentiation, adhesion and cell death by apoptosis. In addition to growth factor-mediated activation of Ras, nitric oxide (NO·) directly interacts with and activates Ras via S-nitrosation on a single cysteine residue (Cys118). Therefore, we investigated the participation of Ras and of the MAP kinases (ERK, JNK and p38) in the apoptosis of THP-1 cells induced by the NO· donor S-nitrosoglutathione (SNOG). For that, we transfected THP-1 cells with a plasmid that contains the gene that codifies for the mutated Ras protein, in which the cysteine residue 118 was replaced by a serine. Apoptosis was evidenced by apoptotic bodies formation, phosphatidylserine exposition and caspase-3 activation. Parental and wild type Ras transfected-THP-1 cells (Wt) exposed phosphatidylserine upon treatment with 1.0 mM SNOG. The importance of the S-nitrosation reaction in the process was evidenced by a decrease on phosphatidylserine exposition in the cells transfected with the plasmid p21RasC118S, as compared to parental and wild type cells. Ras activation occurred within the first 30 minutes after SNOG addition to parental cells. However in p21RasC118S transfected cells, we were unable to detect activation of Ras. Regarding the MAP kinases located downstream on the Ras-mediated signaling cascade, ERK activity was maximum after 4 hours incubation with the NO· donor. JNK and p38 MAP kinase followed different kinetics, displaying maximum activity after 2 hours incubation with SNOG. The use of specific inhibitors to MEK, JNK and p38; PD09895, CEP11004 and S822004 respectively has shown that only ERK inhibition has significantly decreased THP-1 cells apoptosis. We concluded that NO· induced apoptosis in THP-1 cells activating Ras by S-nitrosation and recruiting the MAP kinase ERK, a downstream element of this signaling cascade. Furthermore, our findings support a major role for ERK in the NO· mediated apoptosis of THP-1 cells.

Este trabalho descreve a produção dos FGFs básico bovino e ácido humano (há) em E. coli utilizando o vetor pET. Para expressar o haFGF utilizamos o cDNA nativo com pequenas modificações, obtendo cerca de 40 mg da proteína por litro de cultura induzida. No caso do bbFGF, cerca de 60 pares de bases da extremidade 5 do cDNA nativo foram substituídos por oligonucleotídeos sintéticos contendo condons frequentemente usados em genes bacterianos altamente expressos e apresentando menor conteúdo de C+G do que a sequência nativa. Com este cDNA modificado, obteve-se cerca de 10mg 1-1 de bbFGF. Os FGFs intracelulares solúveis foram purificados a partir do extrato bacteriano por chromatografia de afinidade em Heparina-Sepharose atingindo um grau de pureza da ordem de 95%. O haFGF sozinho é ativo sobre fibroblastos 3T3 em cultura na concentração de ng ml-1; na presença de heparina, a atividade desloca-se para a faixa de pg ml-1. O bbFGF é ativo na concentração de pg ml-1 e sua atividade não é significantemente potenciada pela heparina. O sequenciamento da extremidade N-terminal e a análise de aminoácidos mostraram somente uma forma de haFGF recombinante correspondente à proteína autêntica de 154 aminoácidos. Foram encontradas duas formas de bbFGF recombinante, uma correspondente à proteína autêntica de 154 resíduos e outra contendo 153, onde os dois primeiros foram removidos. / Here we describe the use of the pET expression system to produce the 154 amino acid bovine basic (bb) and human acidic (ha) FGFs. To express haFGF we have used the native cDNA sequencewith minor modifications, obtaining about 40 mg of growth factor per liter of bacterial culture. In the case of bbFGF, about 60 base pairs form the 5-end of the native cDND were replaced with synthetic oligonucleotides containing codons frequently used in highly expressed bacterial genes and having a lower G+C content than the native sequence. By using this modified cDNA about 10 mg 1-1 of bbFGF was obtained. The intracellular, soluble FGFs were partially purified from bacterial extracts by heparin-affinity chromatography and shown to be more than 95% pure. The haFGF alone is active upon 3T3 fibroblasts in culture at the level of ng ml-1 or in the range of pg ml-1 when heparin is added to the incubation medium. The bbFGF is active in the range of pg ml-1 and its activity is not significantly potentiated by heparin. Only one form of recombinant haFGF corresponding to the authentic protein of 154 amino acids was found by N-terminal protein sequencing and amino acid analysis. Two forms of recombinant bbFGF were found, one corresponding to the authentic protein of 154 amino acids (about 75%) and another containing 153 amino acids where the first two residues were removed (about 25%>).

Os efeitos de ribonucleosídeos de guanina substituídos na posição C-8 na proliferação de linfócitos B estão bem documentados na literatura. Esses compostos são análogos de adutos formados pela adição de radicais livres a ribonucleosídeos e a RNA. Neste trabalho, verificamos as propriedades proliferativas de dois desses adutos, 8-metilguanosina (8-MeGuo) e 8-oxo-7 ,8-di-hidroguanosina (8-OxoGuo) e comparamos com 8-bromoguanosina (8-BrGuo), o composto mais estudado como indutor da proliferação de linfócitos B. 8-MeGuo e 8-OxoGuo foram sintetisados em rendimentos de 28 e 55%, respectivamente, e foram caracterizados por UV, NMR e CG-massa. Seus efeitos sobre a incorporação de timidina radioativa ([3H] TdR) no DNA de células de baço, fibroblasto 3T3(A31) e melanoma B16F10 foram examinados. Os dois adutos foram mitogênicos para células de baço mas foram seletivos quanto as células imortalizadas. 8-MeGuo atuou sobre células 3T3(A31) e 8-OxoGuo sobre as células de melanoma B16F10. O análogo não fisiológico 8-BrGuo foi efetivo em todas as células testadas. Experimentos de contagem de células, citotoxicidade e citometria de fluxo, indicaram que a síntese de DNA induzida pelas guanosinas substituídas na posição C-8 refletia crescimento celular. Foi proposto que os compostos agem de dentro da célula uma vez que seus efeitos são bloqueados em presença de um inibidor de transporte de nucleosídeo, mas não foram inibidos por um antagonista de receptor purinérgico. Os resultados obtidos, junto com os descritos na literatura, sugerem que no caso dos fibroblastos 3T3(A31) e células de baço de camundongo os efeitos proliferativos dos compostos não são dependentes do metabolismo desses compostos via salvação das purinas. No caso das células de melanoma, entretanto, os compostos parecem fazer parte do \"pool\" de nucleosídeos. A demonstração de que adutos produzidos por ataques radicalares em ribonucleosídeos e RNA são capazes de induzir proliferação celular, abre novas perspectivas para a compreensão do papel de radicais livres em processos carcinogênicos. / The ability of CS-substituted guanine ribonucleosides to induce B cell proliferation has been well documented in the literature. These compounds are analogues of adducts formed from free radical attack on ribonucleosides and RNA. Here we examined the proliferative properties of two of these radical adducts, 8-methylguanosine (8-MeGuo) and 8-oxo-7 ,8-dihydroguanosine (8-OxoGuo) and compared them with those of the well studied B cell mitogen, 8-bromoguanosine (8-BrGuo). 8-MeGuo and 8-OxoGuo were synthesized in yields of 28 and 55 %, respectively, and were characterized by UV, NMR and CG-MS. Their effects upon [3H] thymidine uptake by Swiss mice splenocytes, mouse embryo 3T3 (A31) fibroblasts and mouse B16F10 melanocytes were examined. Both guanosine radical adducts were shown to increase [3H] thymidine uptake by mice splenocytes but displayed selectivity in regard to continuous cell lines. 8-MeGuo acted upon 3T3(A31) fibroblasts whereas 8-OxoGuo acted upon B16F10 melanocytes. The non physiological analogue 8-BrGuo acted upon all tested cells. Parallel experiments of cell counting, cytotoxicity, and cell sorting indicated that DNA synthesis induced by the C8-substituted guanosines reflected cell growth. It is proposed that the compounds act intracellularly because their proliferative effects were blocked in the presence of a nucleoside transport inhibitor but were not inhibited by an antagonist of the A2 purine receptor. The obtained results, taken together with data from the literature suggest that in the case of 3T3 (A31) fibroblasts and mice splenocytes the proliferative effects of the compounds are not dependent on metabolism through purine salvage pathways. In the case of melanocytes, however, the compounds are likely to become part of the purine nucleoside pool. The demonstration that adducts produced by free radical attack on ribonucleosides and RNA are able to induce cell proliferation opens new perspectives for the understanding of free radical mediated carcinogenesis.