Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:43:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 325867.pdf: 3859462 bytes, checksum: 3585825c2cd70fd8e1331b2d03a3f2fa (MD5) Previous issue date: 2013 / Novas estratégias para a regeneração da pele são necessárias a fim de proporcionar um tratamento eficaz para feridas cutâneas e doenças. Dentre estas possíveis estratégias estão o desenvolvimento de novos biomateriais, a realização de terapia celular e a identificação e aplicação de fatores envolvidos no reparo de tecidos. Avanços na área de engenharia tecidual têm possibilitado o desenvolvimento de biomateriais que se assemelham a arquitetura tecidual da pele, como os substitutos dérmicos, que permitem o recobrimento da lesão e facilitam a recolonização celular, auxiliando assim a regeneração do tecido dérmico. Além disso, as células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido descritas como uma fonte atrativa de células para a engenharia de tecidos, em razão da sua multipotencialidade e capacidade de liberação de moléculas ativas importantes para o reparo tecidual. Tendo em vista estes aspectos, o presente trabalho busca estabelecer e avaliar um novo método de tratamento de lesões de pele, tendo como base a associação das CTMs derivadas da pele humana com substitutos dérmicos comerciais, utilizados atualmente em abordagens clínicas. Para isso, primeiramente, CTMs da derme humana (dCTMs) foram isoladas e sua potencialidade e características morfológicas, fenotípicas e migratórias analisadas. Os resultados obtidos mostram que as dCTMs possuem características semelhantes às CTMs derivadas da medula óssea, como: morfologia fibroblastóide, alta capacidade proliferativa, perfil de expressão de marcadores de superfície e potencial de diferenciação para fenótipos mesodermais. Além disso, as células expressam marcadores de pluripotencialidade e de linhagens neurais e mesenquimais, sem indução específica, e possuem potencial de diferenciação para a linhagem epidermal. Ademais, as dCTMs mostram alta capacidade migratória in vitro. Após esta caracterização das dCTMs, foi avaliado o crescimento e a manutenção destas células em um sistema de cultura tridimensional com os substitutos dérmicos Integra® e Pelnac®. Os resultados mostram que ambos os substitutos dérmicos suportam igualmente a adesão, proliferação e migração das dCTMs, mantendo suas características fenotípicas, tais como o perfil de expressão de marcadores de superfície, de pluripotencialidade e de linhagens neurais e mesenquimais. Tendo em vista que a associação das dCTMs com os substitutos dérmicos mostrou-se eficiente, foi avaliado a seguir o potencial terapêutico destas células associadas ao substituto dérmico (SD) Integra® no reparo de lesões de pele em camundongos. Para isso, foi avaliada a inflamação, vascularização, depósito de matriz extracelular e a re-epitelização em lesões tratadas com dCTMs associadas ao SD e em lesões mantidas apenas com o SD (controle). Os resultados demonstram que o tratamento com dCTMs + SDs aumenta o tecido de granulação, o recrutamento de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos), a vascularização, o depósito de colágeno e a re-epitelização, acelerando assim o reparo tecidual. Além disso, o tratamento com dCTMs + SDs modula a expressão de diferentes genes relacionados com o reparo tecidual na área da lesão. Em conclusão, o presente estudo isolou uma população de CTMs da pele humana, denominada de CTMs dermais (dCTM), e mostrou uma eficiente associação destas células com os SDs, representando assim uma nova ferramenta terapêutica para a engenharia tecidual. Esta associação, quando avaliada no tratamento de lesões cutâneas de camundongos, mostrou-se promissora, resultando em um reparo tecidual mais eficiente.<br> / Abstract : New strategies for skin regeneration are needed in order to provide effective treatment for cutaneous wounds and diseases. Among these possible strategies are the development of new biomaterials, cell therapy and the identification and application of factors involved in tissue repair. Advances in tissue engineering have provided the development of biomaterials similar to the skin such as dermal substitute (DS), for covering the lesion and to facilitate cell recolonization thereby supporting dermal regeneration. In addition, mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as an attractive source of cells for tissue engineering because of their multipotentiality and ability to release active molecules for tissue repair. Therefore, the present study established and evaluated a new method for treatment of skin lesions, based on the association of MSCs derived from human skin with commercial dermal substitutes currently used in clinical procedures. Thus, MSCs from human dermis (dCTMs) were isolated and their morphologic, phenotypic migratory characteristics and potentiality analyzed. The results showed that dCTMs have characteristics similar to MSCs derived from bone marrow, such as: fibroblast-like morphology, high proliferative capacity, profile of surface markers and differentiation potential for mesodermal phenotypes. In addition, these cells express pluripotent and mesenchymal and neural lineages markers, without specific induction. Moreover, the dMSCs display the potential for epidermal lineage and show high migratory capacity in vitro. It was also evaluated the growth and maintenance of these cells in three-dimensional (3D) culture system with the dermal substitutes Pelnac® and Integra® . The results showed that both dermal substitutes equally support the adhesion, spread and growth of human dMSCs in 3D-culture, maintaining MSC phenotype, expression of the pluripotent and neural and mesnchymal lineages markers. In view of these results, the therapeutic potential of these cells associated with the Integra DS in the repair of skin lesions in mice was evaluated in vivo. Inflammation, vascularization, deposition of matrix extracellular molecules and reepithelialization in skin lesions were analyzed. The results demonstrated that the treatment with dCTMs + DSs increases the granulation tissue, recruitment of inflammatory cells (neutrophils and macrophages), vascularization, collagen deposition and reepithelization, thus accelerating tissue repair. In addition, the treatment with dCTMs + DSs modulates the expression of different genes related to tissue repair. In conclusion, the present study isolated a population of MSCs from human skin, named dermal MSCs (dMSCs), and showed an efficient association of these cells with DSs, representing a new therapeutic tool for tissue engineering. This combination, when evaluated in the treatment of cutaneous lesions in mice, has shown to be promising, resulting in a more efficient tissue repair.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento. Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T18:08:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327458.pdf: 1187846 bytes, checksum: bb77d7020fe2410f5c0f4f5d63d46b99 (MD5) Previous issue date: 2014 / O glioblastoma multiforme é o tumor primário do sistema nervoso central mais frequente em adultos. No Brasil, segundo dados do INCA, a incidência de tumores deste tipo foi de 6,96/100 000 habitantes em 2005. A mediana de sobrevida é, geralmente, menor que um ano desde o diagnóstico, e a maioria dos pacientes (90% a 95%) evolui para óbito em dois anos. Com o intuito de procurar novas alternativas para o tratamento dessas neoplasias, diversos compostos têm sido estudados, entre eles, as chalconas. Chalconas são compostos fenólicos que fazem parte da via de biossintese de flavonóides em plantas e apresentam uma estrutura química simples e versátil. O objeto de estudo deste trabalho são três chalconas sintetizadas a partir da estrutura química comum da familia das chalconas, são elas A23, C31 e J11. Usando células de glioblastoma multiforme da linhagem comercial A172 e proveniente de ressecção cirúrgica, GBM1, essas substâncias foram testadas em diferentes ensaios para elucidação do seu mecanismo de funcionamento. Inicialmente foram realizados testes de viabilidade celular por MTT para determinar-se a concentração inibitória de 50% da ação (IC50) de cada uma das chalconas. Em sequência, esta concentração foi utilizada para observar e quantificar o tipo de morte, se apoptótica ou necrótica, causado. Tentando elucidar a maneira com que esses compostos causaram a morte ou a redução de viabilidade observadas, diferentes ensaios foram realizados. Primeiramente para se medir os níveis de espécies reativas de oxigênio e de oxido nitrico, foram utilizadas as sondas fluorescentes DCFDA e DAF-2, respectivamente. Além destes resultados, foi mensurada também a distribuição das células no ciclo celular. Com os dados obtidos foi possivel traçar um perfil aproximado dos mecanismos de ação de cada chalcona. Brevemente, A23 revelou-se um eficiente antioxidante e teve a maior taxa de indução de apoptose e necrose dentre as chalconas estudadas por uma via desconhecida. Contrariamente, C31 apresentou um efeito oxidativo e de aumento dos níveis de ON muito relevante, sendo por estas vias, sua provável ação de indução de apotose e consequente redução de viabilidade. Por último tem-se que J11, promoveu aumento nos níveis de apoptose apenas em GBM1 e teve uma ação antioxidativa em ambas as células testadas. Seu efeito redutor de viabilidade provavelmente se deve a indução da produção de altos níveis de ON e pelo seu efeito citostático, observado na análise do ciclo celular. Com o exposto neste estudo, foi possivel desvendar a ação de duas das três chalconas testadas e direcionar a pesquisa futura para as vias analisadas.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327819.pdf: 1712221 bytes, checksum: 45e41df5bb0ecabf3db076a4eb2c82f0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Modelo experimental de isquemia cerebral focal em camundongos C57/BL6 resultou em isquemia patológica no córtex cerebral. Neste estudo, a isquemia focal foi induzida pela oclusão da artéria cerebral média. Analisamos as camadas corticais I, II/III, V and VI nas áreas motoras caudal forelimb area (CFA) e medial agranular cortex (AGm) em Grupos controle e isquêmico. Nossos resultados demonstraram evidentes diferenças morfológicas e quantitativas em neurônios normais, neurônios isquêmicos, astrócitos e microglia-like localizados nas camadas superficial (II/III) e profunda (V). Alterações patológicas celulares foram mais proeminentes, na camada V, da CFA, mostrando picnose nuclear, fragmentação da cromatina, degeneração principalmente em neurônios, como também, evidências morfológicas de apoptose. A área cortical motora CFA, foi severamente comprometida pelo insulto isquêmico comparado a área AGm, revelando neuroinflamação no tecido pela da proliferação de astrócitos e microglia-like.Também identificamos alterações celulares nas áreas motoras AGm e CFA, após 48 horas, de isquemia focal experimental, empregando procedimento histológico padrão com as colorações de Hematoxilina?Eosina (H&E) e Nissl e imunomarcação com NeuN, GFAP e Caspase-3. Entre as alterações patológicas o edema celular foi observado em neurônios e astrócitos, devido a lesão isquêmica especialmente na CFA. O edema é uma severa complicação clínica que ocorre em muitas doenças neurovasculares, e constitui uma das maiores causas de morbidade e morte em todo o mundo. Verificamos neste modelo, que o evento hipóxico/isquêmico foi associado com edema citotóxic e edema vasogênico. A permanente oclusão vascular resultou na redução do fluxo sanguíneo para o cérebro e consequentemente acúmulo de líquido em neurônios e astrócitos principalmente no córtex motor primário (referido como CFA). Alterações vasculares foram caracterizadas por descontinuidade endotelial e evidente hipertrofia de astrócitos em torno do edema vasogênico. Gliose reativa foi caracterizada por alterações específicas na morfologia dos astrócitos e aumento na síntese de Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) e cicatriz glial. Baseados em nossos resultados, concluímos que o modelo de isquemia focal em camundongos, determinou importante astrogliose, na camada V da CFA, e a AGm não demonstrou esta alteração patológica.<br> / Abstract : Experimental focal cerebral ischemia results in cortical brain lesion followed by ischemic stroke. In this study, focal cerebral ischemia was induced in mice by occlusion of the middle cerebral artery. We studied I, II/III, V and VI cortical layers in caudal forelimb area (CFA) and medial agranular cortex (AGm) from control and ischemic motor cortex C57BL/6 mice. We observed significant differences in the extent of the neurons, ischemic neurons, astrocytes and microglia in the superficial II/III and deep V cortical layers analyzed in CFA and AGm motor cortex. We verified that the cellular changes were more prominent on V layer of primary motor cortex (CFA) with nuclear pyknosis, chromatin fragmentation, necrosis and degeneration, as well as, morphologic evidence of apoptosis mainly in neurons. As result, the caudal forelimb area (CFA) was more severity impaired than medial agranular cortex (AGm) in focal cerebral ischemic model. This was evident with proliferation of astrocytes that could result in neuroinflammation by microglia-like cells.This study described pathologic variations produced by ischemic lesion in mice, especially in the AGm and CFA, after forty-eight hours of the focal ischemia, by histologic procedure standard with Hematoxilina?Eosina (H&E) e Nissl staining and immunohistochemistry with NeuN, GFAP e Caspase-3 antybody. The results revealed pronounced edema in the neurons and astrocytes with altered nuclear volume. Brain edema is a severe clinical complication in a number of pathologies, and it is a major cause of increased morbidity and death worldwide. Cerebral hypoxia/ischemia is associated with cytotoxic edema and vasogenic edema. In a mouse model of ischemic lesion, we observed permanent vascular occlusion, resulting in reduced blood flow to the brain, swollen neurons and pronounced cytotoxic astrocyte swelling, as well as neuropathological indications of vasogenic edema, especially in the primary motor of the cortex (CFA). Vascular damage was characterized by endothelial discontinuity and evident reactive astrocyte hypertrophy around areas of vasogenic edema. Reactive astrogliosis was characterized by specific alterations of astrocyte morphology with pronounced upregulation of Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) expression and scar formation. Based on results from our mouse model of focal cerebral ischemia, it was concluded that reactive astrogliosis was prominent in layer V of CFA motor cortex, while no layer of AGm demonstrated such abnormality.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-02-05T21:22:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 330280.pdf: 2597067 bytes, checksum: 9f9337ed7a914078fa1735f7ec654096 (MD5) Previous issue date: 2014 / O objetivo geral deste trabalho foi estudar o ciclo de vida, o polimorfismo de inversão cromossômica e a possível relação dos arranjos com genes de estresse (hsps). O material de estudo foi coletado em três diferentes unidades de conservação (UCs) de Santa Catarina: Parque estadual da Serra do Tabuleiro, Reserva Biológica da Canela Preta e Reserva Biológica do Aguaí. Primeiramente foi feito o estudo do desenvolvimento de D. polymorpha, registrando a duração média do seu ciclo de vida bem como a maturidade sexual dos machos e fêmeas. A determinação dos elementos de Müller em D. polymorpha foi realizada por homologia de bandas com a espécie D. unipunctata. A fim de determinar os arranjos mais frequentes nas regiões de coleta, foi feito o estudo do polimorfismo de inversão cromossômica. Os arranjos 2RA e 2RD, já descritos anteriormente, apresentaram alta frequência nas populações. Estes arranjos provavelmente estão fixados nestas populações e possivelmente estão sendo mantidos pela ação da seleção natural. Com o auxílio de mapa cromossômico de D. polymorpha mais atualizado, a localização de um ponto de quebra de cada uma das inversões 2RA e 2RD foi reanotada. Também descrevemos uma nova inversão no cromossomo X de Drosophila neocardini (Grupo cardini). A expressão de puffs nos cromossomos politênicos de larvas de D. polymorpha, quando submetidas a estresse, permitiu estimar os possíveis genes hsps induzidos, quando comparando sua localização nos elementos de Müller em outras espécies. Esta análise revelou conservação entre D. polymorpha e D. unipunctata, que partilham grande reorganização gênica ao longo dos elementos quando comparadas a D. melanogaster. A análise comparativa dos elementos por homologia de bandas não verificou a ocorrência de puffs em resposta aos estresses testados (choque térmico, anoxia e privação alimentar) muito próximos ou dentro das regiões de inversão. Também não verificamos diferenças marcantes entre a expressão dos mesmos entre os indivíduos com ou sem os arranjos estudados. No entanto, o gene hsp70 não está tão distante das inversões no braço cromossômico 2R, e talvez fosse interessante testar sua expressão com métodos moleculares uma vez que mudanças na expressão de hsps tem sido importantes na adaptação de outras espécies.<br> / Abstract: The general objective of this work was to study the life cycle and chromosomal inversion polymorphisms, and their possible relation with heat shock genes. The object of our study was collected in three different conserved areas in the Santa Catarina: Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Reserva Biológica da Canela Preta e Reserva Biológica do Aguaí. The life cycle of D. polymorpha was described, as was the age at which sexual maturity is reached for both males and females. In order to be able to determine Müller's elements for D. polymorpha, a chromosomal homology between D. polymorpha and D. unipunctata was performed. A chromosomal polymorphism was carried out in order to establish the most frequent chromosomal arrangements in D. polymorpha from the collection sites. The arrangements 2RA and 2RD showed high frequencies in the populations. These arrangements are possibly being maintained due to natural selection. They also may have preserved the new gene configuration since they can provide a suitable combination of environmental conditions in which this species is located. Furthermore, during the study of chromosomal polymorphisms, the breakpoints of inversions 2RA and 2RD were re-evaluated. Also, a new paracentric inversion was described in chromosome X in Drosophila neocardini (cardini group). The expression of puffs in the polytene chromosomes allowed for the comparative analyses of their location and hsp genes location when they are induced in different species. The analysis showed conservation between D. polymorpha and D unipunctata elements. Also, these species have in common the extensive reorganization of their elements when compared to D. melanogaster. The comparative analysis of Müller's elements through banding homology did however not confirm occurrence of puffs in response to stressors (heat shock, hypoxi, starvation) near or inside inversion loops, neither did it produce noticeable differences between their gene expression in individuals with or without the arrangements. The hsp70 gene shows a certain proximity to the inversion loops in the chromosome 2R, and the possible intervention in its expression is not totally discarded. Its expression should be tested by means of molecular tools since changes in hsps expressions have been relevant in the adaptation reported in other species.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-09-15T04:09:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334483.pdf: 1280732 bytes, checksum: 5afacf59241ca14703bff615c0f6abbd (MD5) Previous issue date: 2015 / O aumento da incidência da radiação ultravioleta (UV) na superfície terrestre, decorrente, entre outros, da emissão de compostos poluentes na atmosfera e a existência do buraco na camada de ozônio na região Antártica, tem chamado atenção dos pesquisadores. A radiação UV mais danosa aos seres vivos é a radiação ultravioleta B (UVB). Os ambientes aquáticos, assim como os terrestres, estão sujeitos à incidência dessa radiação, porém poucos trabalhos têm elucidado os efeitos celulares provocados pela radiação UVB nos organismos que habitam estes ambientes. Dentre os muitos efeitos celulares da radiação UVB está a indução à apoptose, que no desenvolvimento embrionário desempenha um papel importante de controle do número celular. O objetivo deste trabalho foi caracterizar espacialmente e temporalmente a expressão de proteínas envolvidas no processo apoptótico induzido pela radiação UVB durante a morfogênese e organogênese iniciais, utilizando embriões do camarão de água doce Macrobrachium olfersi como modelo de estudo (autorização IBAMA - 15294/1). Assim, foi simulado, em laboratório, a irradiação UVB (310 mW/cm2) que os embriões recebem durante a época de reprodução no ambiente natural. Fêmeas ovígeras, com embriões em E6, foram irradiados usando uma lâmpada UVB 6W por 30 min. Após a irradiação, os embriões foram mantidos no escuro por 4 h, 6 h, 8 h, 12 h e 20 h. Embriões em E6 e E7 não irradiados foram utilizados como controle. Os resultados obtidos sugerem que a radiação UVB induz, em embriões de M. olfersi, a ocorrência de apoptose através do recrutamento inicial de proteínas relacionadas às vias intrínsecas, desencadeada por dano ao DNA e também pela ativação de proteína pró-apoptótica Bak, devido a alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial. Posteriormente foi observado um aumento da proteína Fas, que atua como receptor de morte na sinalização da via extrínseca. A ocorrência de apoptose não se restringiu a uma região embrionária específica. Este trabalho permitiu caracterizar espacial e temporalmente a expressão de proteínas envolvidas no processo apoptótico em embriões de M. olfersi, contribuindo assim para a compreensão deste processo em células embrionárias de invertebrados e dessa forma contribuir também para o conhecimento atual sobre o impacto da radiação UVB nos organismos aquáticos.<br> / Abstract : The increase of ultraviolet radiation (UV) on Earth?s surface, due to the emissions of pollutant compounds in the atmosphere and the existence of the ozone hole in the Antarctic region, have attracted the attention of researchers. The most harmful spectrum of UV radiation to organisms is ultraviolet B radiation (UVB). The aquatic, as well as, the terrestrial environments are subject to incidence of this radiation, but few studies have elucidated the cellular effects caused by UVB radiation in organisms that inhabit these environments. Among the multiple cellular effects of UVB radiation is the induction to apoptosis that plays an important role in embryonic development on control of the cellular number. The aim of this study was to spatially and temporally characterize the expression of proteins involved in the apoptotic process induced by UVB radiation during early morphogenesis and organogenesis, using embryos of freshwater Macrobrachium olfersi as a model (IBAMA authorization - 15294/1). Thus, the UVB irradiation (310 mW/cm2) that embryos receive during the breeding season in the natural environment was simulate in the laboratory. Ovigerous females with embryos at E6 were irradiated using a UVB lamp 6W for 30 min. After irradiation, the embryos were kept in darkness for 4 h, 6 h, 8 h, 12 h and 20 h. Non-irradiated embryos at E6 and E7 were used as controls. The obtained results suggest that UVB radiation induces in M. olfersi embryos the occurrence of apoptosis, through the initial recruitment of proteins related to intrinsic pathways, triggered by DNA damage and also by the activation of pro-apoptotic protein Bak, due to changes in permeability of mitochondrial membrane. After, was observed a increase in Fas proteins that acts a death receptor in the extrinsic pathway signaling. The occurrence of apoptosis was not restricted to a specific embryonic region. This work allows to characterize spatial and temporally the expression of proteins involved on apoptotic process in M. olfersi embryos, contributing to the understand of this process in embryonic cells of invertebrates, and thereby contribute to the current knowledge about the impact of UVB radiation on aquatic organisms.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-10-06T04:08:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334684.pdf: 2305342 bytes, checksum: b9cb002883d6321633171912bd0823eb (MD5) Previous issue date: 2015 / O aumento da radiação ultravioleta (UVB) na superfície terrestre é resultado da diminuição do ozônio estratosférico. A energia desta radiação é capaz de causar diferentes respostas nos organismos terrestres e aquáticos. Macrobrachium olfersi é um camarão de água doce que vive e se reproduz em águas claras e rasas, onde a radiação UVB pode penetrar facilmente. As fêmeas de M. olfersi carregam seus ovos até a eclosão em uma câmara incubadora externa, podendo-se supor que os embriões estão expostos às condições semelhantes de radiação UVB do ambiente, durante todos os estágios embrionários. O objetivo deste estudo foi caracterizar os efeitos da radiação UVB sobre a ultraestrutura, viabilidade celular e dinâmica mitocondrial nas células embrionárias de M. olfersi. A irradiância de 310 mW/cm2 que os embriões estão expostos nos ambientes naturais foi simulada em laboratório. Embriões no 6° dia embrionário (E6), que corresponde às fases de morfogênese e organogênese iniciais, foram irradiados com lâmpada UVB 6W, durante 30 minutos. Após 1, 12, 24 e 48 horas de exposição, os embriões foram analisados. Embriões não irradiados foram usados como controle. A análise ultraestrutural mostrou mudanças no núcleo, como a condensação da heterocromatina próxima ao envelope nuclear, bem como mudanças citoplasmáticas, como a diminuição dos ribossomos associados ao retículo endoplasmático rugoso, formação anômala de membranas, perda das cristas mitocondriais. As alterações mitocondriais foram os efeitos da radiação UVB mais evidentes. Então, a expressão das proteínas Mfn-1 e Drp-1, relacionadas à fusão e fissão mitocondrial, respectivamente, foram quantificadas. Nossos resultados mostraram que a radiação UVB induziu aumento significativo de Drp-1 em todos os tempos analisados e também diminuição significativa de Mfn-1, apenas após 24 e 48 horas de exposição à UVB. Estes resultados indicam que a radiação UVB compromete a dinâmica mitocondrial em células de M. olfersi. Analisando as mudanças observadas nas mitocôndrias, o próximo passo foi investigar a viabilidade celular utilizando um teste baseado na integridade mitocondrial. Uma diminuição significativa da viabilidade celular, em todos os tempos analisados após a radiação de UVB, foi verificada. Em resumo, este estudo revelou diferentes efeitos induzidos pela radiação UVB em embriões de M. olfersi, principalmente relacionados com a estrutura e função mitocondrial.<br> / Abstract : Increased ultraviolet B (UVB) in the Earth's surface is a result of the depletion of stratospheric ozone. The energy of this radiation is able to cause different responses in terrestrial and aquatic organisms. Macrobrachium olfersi is a freshwater prawn that lives and reproduces in clear shallow waters, where UVB radiation can easily penetrate. The females of M. olfersi carry eggs until hatching in external brood pouch, thus is reasonable to assume that the embryos are exposed to similar conditions of environmental UVB radiation during all embryonic stages. The aim of this study was to characterize the effects of UVB radiation on the ultrastructure, cell viability and mitochondrial dynamic in embryonic cells of M. olfersi. Then, the irradiance of UVB (310 mW/cm2) that embryos received in natural environment was simulated in laboratory. Embryos at 6th embryonic day (E6), which corresponds to the early morphogenesis and organogenesis stages, were irradiated with UVB 6W lamp for 30 minutes. After 1, 12, 24 and 48 hours of exposure to UVB radiation, the embryos were examined. Non-irradiated embryos were used as controls. The ultrastructural analysis showed changes in nucleus, as heterochromatin condensation near to the nuclear envelope, as well as, changes in the cytoplasm, as decrease of ribosomes associated to rough endoplasmic reticulum, formation of anomalous membrane, loss of mitochondrial crests, and disruption of mitochondrial membranes. Mitochondrial alterations were the most evident effect of UVB. Thus, the expression of Mfn-1and Drp-1 proteins, related to mitochondrial fusion and fission, respectively, was quantified. Our results showed that UVB radiation induced a significant increase in Drp-1 in all times analyzed and also a significant decrease in Mfn-1, only after 24 and 48 hours of UVB exposure. These results indicate that UVB radiation compromise the mitochondrial dynamic on embryonic cells of M. olfersi. Regarding the changes observed in the mitochondria, the next step was to investigate the cell viability using an assay based on mitochondrial integrity. A significant decrease in viability of cells, in all times analyzed after UVB irradiation, was verified. In summary, this study revealed different effects induced by UVB radiation in embryos of M. olfersi, mainly related to the mitochondrial structure and function.

Os glioblastomas multiforme (GBM), são tumores cerebrais, que por sua malignidade, aliada ao seu rápido crescimento e frequente recorrência, exigem uma maior investigação da comunidade científica. Novas terapias devem afetar as células-tronco tumorais (CSC), as quais são responsáveis pela resistência e progressão tumoral. Neste trabalho fizemos o uso da Tricostatina A (TSA), um inibidor de histonas deacetilase, para se obter a modulação epigenética, e portanto, manipulação da expressão gênica, da linhagem celular U87-MG de GBM, utilizada aqui como um modelo para a pesquisa com CSC. Observamos a redução da proliferação e sobrevivência das tumoresferas de U87, as quais são formadas por CSC, seguida de alterações morfológicas nas células tratadas. A diferenciação das U87 foi confirmada pelo aumento dos níveis de marcadores neuronais e gliais, tais como NeuN e GFAP. Além disso, mostramos evidências de senescência celular após o tratamento com TSA. Nenhum efeito sobre a migração celular foi encontrado após a modulação epigenética. Portanto, os nossos resultados mostram a influência da TSA na diferenciação, proliferação e sobrevivência de CSC de glioma e também na indução da senescência celular, demonstrando o potencial da TSA na terapia dos tumores cerebrais. / Glioblastoma multiforme (GBM), because of its fast growth and recurrence, require further investigation by the scientific community in order to find promising new therapies for these tumors, specially affecting their Cancer stem cells (CSC), which drive many tumorigenic processes. In this work we have made use of the HDAC inhibitor Trichostatin A to achieve the epigenetic modulation of the U87-MG GBM cell line, as a model for CSC research. We have observed reduction of the U87 tumorspheres, which are enriched for CSC, proliferation and survival followed by morphological changes both in the treated tumorspheres and in single cells. Enhanced on the U87 differentiation was confirmed by increased levels of neuronal and glial markers such as NeuN and GFAP. Furthermore we showed evidences of cellular senescence after the TSA treatment. No effect on cell migration was found after TSA treatment. Therefore, these results demonstrate a plethora effects on differentiation, proliferation, survival of glioma cells and induction of cellular senescence by TSA, making TSA a promising agent for glioma therapy.

Submitted by Barroso Patrícia (barroso.p2010@gmail.com) on 2014-07-25T13:47:18Z No. of bitstreams: 1 Ana Emília TESE FINAL.pdf: 8725118 bytes, checksum: ede5adb18427d4884a763776be4a73bd (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-25T13:47:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Emília TESE FINAL.pdf: 8725118 bytes, checksum: ede5adb18427d4884a763776be4a73bd (MD5) / Os materiais biomiméticos e o fármaco ranelato de estrôncio (RanSr) são promissores ao reparo ósseo pelas suas características físico-químicas, composição e comportamento bioativo. Desse modo, a presente pesquisa se propôs analisar o comportamento biológico da implantação desses biomateriais em defeitos críticos, com ou sem a administração oral do RanSr na regeneração óssea. A amostra com 105 ratos machos, adultos jovens foi avaliada aos 15, 45 e 120 dias. Os sete grupos foram os seguintes: CSDC – Controle sem defeito crítico; CCDC – Controle com defeito crítico preenchido por coágulo. Nos grupos Gel, CH e HAAlg, o defeito ósseo foi preenchido pelos respectivos biomateriais: gelatina, colágeno hidrolisado e hidroxiapatita com alginato; RanSr – Defeito preenchido por coágulo e administração de RanSr; HAAlgRanSr – Defeito preenchido por HAAlg e administração de RanSr. O reparo do defeito ósseo foi analisado por histomorfometria e análise estatística descritiva. Nos grupos com administração de RanSr, realizou-se a análise estatística das concentrações de cálcio (Ca+2) e estrôncio (Sr+2) no plasma que foram determinadas por espectrometria de absorção atômica. No grupo CCDC, a concentração de Ca+2 foi aproximadamente 5000x maior do que a concentração de Sr, para todos os pontos avaliados. Essa concentração de Ca+2 foi maior, quando comparado com os grupos experimentais, com exceção aos 120 dias no grupo HAAlgRanSr em que houve maior nível de Ca+2 plasmático, período que coincide com a fragmentação local do biomaterial. No grupo RanSr, a concentração de Sr+2 aumentou enquanto a de Ca+2 diminuiu, para todos os pontos biológicos observados. Nesse grupo, os níveis de Sr+2 foram maiores, quando comparados aos demais grupos avaliados com a maior concentração de Sr+2 aos 15 dias que reduziu nos demais pontos biológicos. No grupo HAAlgRanSr, tanto a concentração de Sr+2 quanto a de Ca+2 aumentaram progressivamente nos pontos biológicos. Porém, nesse grupo, observou-se que a concentração de Sr+2 foi menor e, neste caso, a HAAlg pode ter atuado como um absorvedor do Sr+2. Na histomorfometria, todos os materiais implantados e o fármaco apresentaram potencial osteogênico. Entretanto, as maiores médias das porcentagens de extensão linear óssea (%ELO) e de área óssea formada (%AO) foram para a Gel (%ELO= 63,88% e %AO=46,93%) e o CH (%ELO= 62,73% e %AO=41,30%). A Gel apresentou-se como um arcabouço mais biomimético e biocompatível. Os grupos com HAAlg apresentaram melhor preenchimento do defeito ósseo em espessura (C) [HAAlg: C=16722,76 μm e HAAlgRanSr: C=1868μm], entretanto, houve uma reação inflamatória intensa nesses grupos, especialmente aos 15 dias. No grupo RanSr, o potencial osteogênico foi maior, quando comparado ao grupo CCDC e à associação no grupo HAAlgRanSr. O arcabouço HAAlg associado ao RanSr não favoreceu o reparo ósseo, possivelmente, devido à intensa reação inflamatória nos grupos com HAAlg. Conclui-se que todos os biomateriais implantados atuaram como arcabouços osteocondutores bioativos, sendo a Gel e o CH mais biomiméticos, e o fármaco RanSr também apresentou potencial osteogênico no reparo ósseo.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:30:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337731.pdf: 898021 bytes, checksum: fa1c709f8c1a2c8ea3ab0c7d65f61457 (MD5) Previous issue date: 2015 / Existem evidências dos efeitos benéficos do exercício físico, tanto nos humanos como nos animais experimentais, que podem ser dependentes do nível de emocionalidade de cada um dos indivíduos. A literatura especializada também relata efeitos contraditórios associados a diferentes protocolos de exercício físico e efeitos dependentes do genótipo. Os ratos das linhagens isogênicas Lewis (LEW) e SHR (Spontaneously Hypertensive Rats) diferem em uma série de aspectos comportamentais, incluindo a ansiedade/emocionalidade. Então, nós realizamos um estudo com o objetivo de observar os efeitos do exercício físico forçado (EFF; em esteira) e voluntário (EFV; em rodinhas de correr) nos comportamentos relacionados à ansiedade/emocionalidade exibidos pelos ratos LEW e SHR no teste do campo aberto (CA) e labirinto em cruz elevado (LCE). No EFF, apenas 20% dos animais da linhagem LEW e 63% dos animais SHR completaram o treinamento. Nestes animais, nós observamos um aumento significativo de locomoção no teste do CA e um aumento de locomoção central no CA e entradas nos braços abertos do LCE. Isso sugere um aumento de atividade locomotora e uma diminuição de ansiedade/emocionalidade, nos animais das duas linhagens, após o treinamento. O EFV parece diminuir os índices de ansiedade/emocionalidade, porém apenas na linhagem SHR e no teste do CA. Entretanto, a distância total percorrida pela linhagem SHR, nas rodinhas de correr, foi significativamente maior que a percorrida pela LEW. O pré-tratamento com a talidomida, melhorou a resistência física da linhagem LEW fazendo com que 100% dos animais LEW completassem o protocolo de EFF, diminuiu o número de retrocessos na esteira, mas não afetou as medidas de ansiedade/emocionalidade. Assim, nós podemos concluir que os animais das duas linhagens exercitados em um protocolo de EFF apresentam redução de ansiedade/emocionalidade e aumento de locomoção. Também, a linhagem SHR parece ser composta de animais que correm voluntariamente, ao contrário da LEW, mas este tipo de exercício físico (EFV) não gerou alteração comportamental visível. Por fim, a talidomida parece ter aumentado a capacidade dos animais LEW em suportar todo o período de EFF em esteira, mas não causou alterações na ansiedade/emocionalidade nestes animais.<br> / Abstract : There is evidence of the beneficial effects of physical exercise, both in humans and in experimental animals that can be dependent on the level of emotionality of each individual. The literature also reports negative effects associated with different exercise protocols and genotype-related effects. Lewis (LEW) and SHR (Spontaneously Hypertensive Rats) inbred rat strains differ in a number of behavioral aspects, including anxiety/emotionality. So we carried out a study in order to observe the effects of forced (FPE; treadmill) and voluntary (VPE; on running wheels) physical exercise on the behaviors related to anxiety/emotionality exhibited by LEW and SHR rats in the open field (CA) and elevated plus maze (EPM) test. In the FPE, only 20% of the animals of the LEW strain and 63% of SHR animals completed the training. In these animals, we observed a significant increase in total and central locomotion in CA and entries into the open arms of the EPM, which suggests an increase in locomotor activity and a decrease in anxiety/emotionality in these two strains, after training. In the VPE, the results showed decreased anxiety/emotionality but only in SHR rats tested in the CA. However, the total distance traveled by the SHR, on running wheels, was significantly higher than that from LEW counterparts. Pre-treatment with thalidomide improved physical strength of the LEW strain. It made 100% of the animals LEW fulfilled the FPE protocol and diminish the number of setbacks in the treadmill, but did not affect measures of anxiety/emotionality. Thus, we can conclude that animals of both strains exercised in an FPE protocol have reduced anxiety/emotionality and increased locomotion. Also, the SHR strain seems to be composed of animals that voluntarily run, unlike LEW, but this type of exercise yielded no visible behavioral changes. Finally, the thalidomide appears to have increased physical capacity of LEW in the FPE, but did not cause changes in anxiety/emotionality in these animals.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:31:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337737.pdf: 3559818 bytes, checksum: 1d2c11521cf08f96d624d537bd15d4ba (MD5) Previous issue date: 2015 / O hepatopâncreas é um órgão digestivo presente nos crustáceos, como os camarões Macrobrachium olfersi e possui papel fundamental nos sistemas metabólicos, bem como na resposta imunológica e nos processos de maturação gonadal e reprodução, além de apresentar alta sensibilidade às mudanças ambientais. Tendo em vista as alterações celulares causadas pela radiação e que estudos analisando os efeitos da radiação UV-B no hepatopâncreas ainda não estão disponíveis na literatura, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade da radiação UV-B sobre a organização e dinâmica do epitélio dos túbulos do hepatopâncreas de juvenis de M. olfersi. Os juvenis foram expostos à radiação UV-B simulada e a organização e distribuição das células epiteliais do hepatopâncreas foram analisadas, assim como a presença celular de polissacarídeos e lipídios através de análises histoquímicas; o perfil de proliferação e morte nos túbulos do hepatopâncreas por imuno-histoquímica; a integridade de membranas e organelas celulares, por análises ultraestruturais. O epitélio do hepatopâncreas dos grupos controle e tratado apresentaram quatro tipos celulares (células E, R, F e B) e, ainda, um quinto tipo, a célula M. A célula fonte do epitélio, a célula E, mostrou a capacidade de se dividir nas três zonas do túbulo do hepatopâncreas. A radiação UV-B induziu à alteração do perfil de proliferação das células epiteliais do hepatopâncreas e levou ao aumento da expressão da caspase-3, desorganização epitelial do hepatopâncreas, diminuição da homogeneidade citoplasmática, aumento da presença de vacúolos e maior frequência e volume das células B. A produção e armazenamento de polissacarídeos aumentaram, já as dos lipídios diminuíram. Ocorreram alterações ultraestruturais nas células R e F, como: condensação da heterocromatina próxima ao envelope nuclear, perda das cristas mitocondriais, diminuição dos ribossomos associados ao retículo endoplasmático rugoso, dilatação das cisternas do complexo de Golgi, aumento de componentes autofágicos e, ainda, alteração na estrutura das microvilosidades. Diante dessas observações, foi analisada a expressão das proteínas Drp1 e PCNA, relacionadas com estresse celular. Os resultados mostraram que a radiação UV-B induziu o aumento da expressão dessas proteínas, indicando o comprometimento da dinâmica mitocondrial, das funções celulares e prejudicando a viabilidade celular. Os dados obtidos mostraram que o hepatopâncreas é um órgão adequado para estudos sobre os efeitos da radiação UV-B e que o estresse causado nas organelas das células epiteliais pela irradiação levou à formação de componentes autofágicos e à morte celular, alterando as diversas funções celulares do epitélio do hepatopâncreas.<br> / Abstract : The hepatopancreas is a digestive organ present in crustaceans such, as the prawn Macrobrachium olfersi, and have key role in various metabolic systems, as well as in the immune response and gonadal maturation and reproductive processes, showing high sensitivity to environmental changes. Considering the major changes to radiation in cells and that no studies available in the literature has verified the effects of UV-B radiation in the hepatopancreas, the objective of this work was to evaluate the toxicity of UV-B radiation on the organization and dynamics of the hepatopancreas tubules epithelium of juvenile M. olfersi. The juveniles were exposed to simulated UV-B irradiation and the organization and distribution of the epithelial cells were analyzed, as well as cellular presence of polysaccharides and lipids by histochemical analysis; regions of proliferation and death in the tubules of the hepatopancreas by immuno-histochemistry; integrity of membranes and organelles by ultrastructural analysis. The four cell types (E, R, F, and B-cell) as well as a fifth cell type, the M cell, were identified in the hepatopancreas' epithelium of control and treated groups. It was also observed that the cell source of the epithelium, the E cell, can divide itself into the three zones of the hepatopancreas tubule. UV-B radiation induced change in the profile of the epithelial cells proliferation of hepatopancreas and induced increased caspase-3 expression; epithelial disorganization of hepatopancreas; cells showed a decrease in cytoplasmic homogeneity, increased presence of vacuoles and increased frequency and volume of B cells. The production and storage of polysaccharides increased while the lipids decreased. Ultrastructural changes occurred in R and F cells, such as: heterochromatin condensation near to the nuclear envelope, loss of mitochondrial crests, and reduction of ribosomes associated with the rough endoplasmic reticulum, dilation of the Golgi cisterns, increased autophagic components and, furthermore change in the structure of the microvilli. In face of these observations, was analyzed the expression of Drp1 and PCNA, proteins related to cell stress. Results showed that UV-B radiation induced the increased expression of these proteins, indicating impairment of mitochondrial dynamics, cell functions and impairing cell viability. Data obtained in this study showed that the hepatopancreas is a suitable organ for studies on the effects of UV-B radiation and that the stress caused in the organelles of epithelial cells by irradiation led to the formation of autophagic components and cell death, impairing various cellular functions in the hepatopancreas epithelium.