Orientadora : Profª. Drª. Lucélia Donatti / Coorientador : Prof. Dr. Edson Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 20/02/2017 / Inclui referências : p. 139-169 / Resumo: O gastrópode antártico Nacella concinna habita a zona entremarés da Antártica, uma região naturalmente instável, que apresenta flutuações termo-salinas diárias, além de ser vulnerável à ação de contaminantes de origem antrópica, como o despejo de efluentes de esgoto de estações científicas e navios. Somado a isso, os organismos que habitam essa região precisam lidar com os níveis naturalmente elevados de metais pesados. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar as respostas fisiológicas de N. concinna à variações termo-salinas de curto prazo, bem como verificar o efeito do esgoto da Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF) sobre o metabolismo energético, nitrogenado e defesa antioxidante desse molusco. Também objetivamos avaliar o efeito direto de metais pesados sobre a atividade da arginase branquial e do pé muscular de N. concinna, bem como a distribuição tecidual e subcelular dessa enzima. Os bioensaios de temperatura e salinidade, ao longo do tempo, mostraram que o aquecimento e hipossalinidade modulam a defesa antioxidante, basicamente os níveis de SOD e G6PDH, de forma tecido-específica. No estresse hipossalino e térmico de curta duração, a defesa antioxidante glandular de N. concinna foi eficaz em prevenir lesões oxidativas em lipídeos e proteínas. O aquecimento é capaz de modular positivamente o metabolismo anaeróbio do pé muscular desse gastrópode. Contudo, nas brânquias, enquanto o aquecimento não modulou as enzimas do metabolismo energético, a hipossalinidade induziu resposta metabólica aeróbica. O estresse hipossalino elevou os níveis de AST e GDH no pé muscular, sugerindo a participação dessas enzimas na regulação osmótica desse tecido. Também foram observadas interações entre temperatura, salinidade e tempo, capazes de modular os níveis das enzimas analisadas nos três tecidos. Os níveis de ARG cerca de duas vezes superiores aos de ODH no pé muscular de N. concinna sugere a participação de ARG no catabolismo de L-arginina, durante a decomposição do "tampão energético" fosfo-Larginina. Apesar de ser considerado um bom biomonitor, a complexidade das respostas metabólicas de N. concinna, frente ao aquecimento e hipossalinidade, sugerem cautela na utilização dessas respostas como biomarcadores de mudanças naturais e antrópicas. Em relação ao efeito do esgoto, a indução de SOD, GST e CAT na glândula digestiva foi eficaz em prevenir danos oxidativos em lipídeos, mas não em proteínas na diluição de esgoto a 0,05% (v/v). A exposição ao esgoto foi capaz de elevar o potencial gerador de ATP aeróbio e anaeróbio das brânquias. Já no pé muscular o esgoto modulou positivamente a PFK, enzima reguladora da via glicolítica. Os estudos com metais pesados mostraram que as arginases branquial e do pé muscular de N. concinna apresentam características cinéticas distintas quanto ao KM e ação de cátions de metais pesados. Tanto a arginase branquial como a do pé muscular estão localizadas prioritariamente na fração citosólica dos tecidos. Também ficou evidente que as arginases das brânquias e do pé muscular são resistentes à inibição por cobre, o que sugere uma adaptação metabólica desse gastrópode, que pode ter contribuído para a ocupação de nichos naturalmente ricos em metais pesados. Palavras-chave: Nacella concinna. Antártica. Temperatura. Salinidade. Esgoto. Metais. / Abstract: The antarctic gastropod Nacella concinna inhabits the intertidal zone of Antarctica, a naturally unstable region that exhibits daily thermo-saline fluctuations, besides being vulnerable to the action of contaminants of anthropic origin, such as the discharge of sewage effluents from scientific stations and ships. In addition, organisms living in this region must deal with naturally high levels of heavy metals. In this context, the present study aimed to evaluate the physiological responses of N. concinna to shortterm thermo-saline variations, as well as to verify the effect of the Anarctic Station Comandante Ferraz (EACF) sewage on energy and nitrogen metabolism and antioxidant defense of this mollusk. We also aimed to evaluate the direct effect of heavy metals on the activity of the branchial and foot muscle arginase of N. concinna, as well as the tissue and subcellular distribution of this enzyme. Temperature and salinity bioassays, over time, have shown that heating and hyposalinity modulate the antioxidant defense, basically the levels of SOD and G6PDH, in a tissue-specific way. In short-term hyposaline and thermal stress, the antioxidant glandular defense of N. concinna was effective in preventing oxidative lesions in lipids and proteins. Heating is able to positively modulate the anaerobic metabolism of the foot muscle of this gastropod. However, in the gills, while heating did not modulate the enzymes of energy metabolism, hyposalinity induced an aerobic metabolic response. Hyposaline stress increased AST and GDH levels in the foot muscle, suggesting the participation of these enzymes in the osmotic regulation of this tissue. It was also observed interactions between temperature, salinity and time capable of modulating the levels of the enzymes analyzed in the three tissues. ARG levels about twice higher than that of ODH in the foot muscle of N. concinna suggest the participation of ARG in L-arginine catabolism during the decomposition of the phospho-L-arginine "energy buffer". In spite of being considered a good biomonitor, the complexity of N. concinna metabolic responses to heating and hyposalinity suggests caution in the use of these responses as biomarkers of natural and anthropogenic changes. Regarding the effect of the sewage, the induction of SOD, GST and CAT in the digestive gland was effective in preventing oxidative damage in lipids, but not in proteins in the dilution of 0.05% (v/v) of sewage. Exposure to the sewage was able to raise the aerobic and anaerobic ATP generating potential of the gills. In the foot muscle, the sewage positively modulated PFK, a glycolytic pathway regulating enzyme. Studies with heavy metals have shown that the branchial and foot muscle arginases of N. concinna have different kinetic characteristics regarding KM and action of heavy metal cations. Both the branchial and foot muscle arginases are located primarily in the cytosolic fraction of the tissues. It was also evident that the arginases of the gills and of the foot muscle are resistant to inhibition by copper, suggesting a metabolic adaptation of this gastropod, which may have contributed to the occupation of niches naturally rich in heavy metals. Keywords: Nacella concinna. Antarctica. Temperature. Salinity. Sewage. Metals.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/03/2015 / Inclui referências : f. 155-165 / Resumo: ADAM23 é uma proteína transmembrana, da família ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease), altamente expressa em células neuronais, cujo papel biológico não está bem elucidado. Sabe-se que a ADAM23 está envolvida no processo de adesão celular em neuroblastomas através da interação com integrinas. Mecanismos de adesão celular envolvendo a ADAM23 humana, informações sobre o seu processamento intracelular e as propriedades do seu ectodomínio podem servir para a compreensão do papel estrutural e biológico dessa proteína. O presente estudo visou o desenvolvimento de vetores de expressão para a produção de quimeras protéicas constituídas pelo ectodomínio de ADAM23 e a região Fc de IgG humana (domínios CH2 e CH3). As quimeras serão utilizadas como bioferramentas no estudo do processamento de ADAM23 e da sua função na adesão e proliferação celular. Os fragmentos de nucleotídeos que codificam os resíduos 60-792 (ADAM23C1) e 287-792 (ADAM23C2) da ADAM23 humana foram clonados no vetor pINFUSE-hIgG1-Fc2 (secreção através do peptídeo sinal da IL-2) enquanto a sequência 1-792 foi clonada no vetor pcDNA3.1-hIgG1-Fc2 (secreção utilizando o peptídeo sinal da ADAM23). As três construções foram transfectadas nas linhagens N2A (neuroblastoma de camundongo), HEK-293T (rim humano) e CHO-K1 (ovário de hamster) e tanto os extratos celulares como os sobrenadantes de cultura foram analisados para a expressão das quimeras. A linhagem N2A apresentou a mais eficiente secreção das três proteínas quiméricas. As quimeras ADAM23C1 e ADAM23C2, foram adequadamente expressas e recuperadas dos sobrenadantes das culturas de células N2A e HEK-293T. A quimera ADAM23C3 (full-length do ecdomínio) foi identificada sempre na forma processada, indicando que seu peptídeo sinal foi reconhecido pelas maquinarias de secreção e processamento das células utilizadas. Diferentes métodos de purificação das quimeras foram comparados, sendo que a precipitação por sulfato de amônio mostrou-se ser o mais adequado, por aliar economicidade de recursos e retenção da estrutura da proteína. Paralelamente foi avaliada a expressão de ADAM23 em diferentes linhagens e tecidos, além do estabelecimento da localização celular das formas imatura e processada da ADAM23. Com a ajuda do anticorpo monoclonal DL11C8 foi possível determinar que a forma processada de ADAM23 (70 kDa) é a mais abundante no encéfalo de camundongos e é expressa na face externa da membrana plasmática da linhagem N2A. Estes dados mostram pela primeira vez que há uma baixa expressão da forma de 100 kDa (não-processada) no sistema nervoso, ao contrário do que foi observado em linhagens tumorais. A relevância da razão de expressão entre as formas imatura e processada para a função da ADAM23 no sistema nervoso, como a sua relevância na progressão do fenótipo tumoral merecem mais investigação. Palavras-chave: ADAM23. Ectodomínio. Desintegrina. Metaloprotease. Proteínas Fc quiméricas. / Abstract: ADAM23 is a transmembrane protein, member of ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) family, highly expressed in neuronal cells, whose biological role is not yet totally elucidated. It is known that ADAM23 is involved in the cellular adhesion process in neuroblastoma. ADAM23 interacts with integrins promoting cell adhesion. However, ADAM23 full-involvement in cellular adhesion mechanisms remains to be established. The present study aimed for the development of biological tools, particularly the production of expression vectors that code for chimeric proteins containing human ADAM23 ectodomain fused to a human IgG Fc region. Nucleotide fragments coding for the residues 60-792 (ADAM23C1) and 287-792 (ADAM23C2) were cloned in the vector pINFUSE-hIgG1-Fc2 while the sequence 1-792 (ADAM23C3) was inserted onto modified plasmid pcDNA3.1-hIgG1-Fc2. Three different cell lineages (N2A, HEK-293T and CHO-K1) were transfected with the expression plasmids and the chimeric proteins detected in both cell extracts and culture supernatants by monoclonal antibody DL11C8. N2A cell lineage presented the most efficient expression/secretion of the three chimeric proteins. CHO-K1 showed chimeric ADAM23C1 and ADAM23C2 secretion, although ADAM23C3 was not observed in supernatants. The full-length construction (C3) was always detected as a processed protein, indicating that endogenous ADAM23 signal peptide and processing signals were correctly translated by cellular host machinery. Several protocols were compared for purification of chimeric proteins from culture supernatant, being ammonium sulfate salting-out the most practical and convenient. Besides, it was established that mature ADAM23 (70 kDa) is the abundant form in the mouse brain and the processed protein is located at N2A cell surface. In addition it was showed, for the first time, that non-processed ADAM23 (100 kDa) has low expression in the central nervous system when compared with the processed 70 kDa form. Interestingly, tumoral cell lines (MDA-MB-435 and N2A) presented the opposite behavior. If the non-processed/mature ratio profile is specific for each cell line or has a role in the tumoral phenotype will be further investigated in future. Key words: ADAM23. Ectodomain. Disintegrin. Metalloprotease. Fc chimeric proteins.

Orientador : Prof. Dr. Marco Aurelio Krieger / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 15/05/2009 / Inclui bibliografia / A infecção pelo vírus da hepatite C acomete cerca de 3% da população mundial e a prevalência no Brasil está próxima deste valor. Seu impacto social é enorme, tanto na morbidade e mortalidade, quanto nos custos que seu tratamento demanda. O tratamento baseado no uso de interferon é efetivo em uma fração dos casos. Uma vez que a determinação do genótipo do HCV é fundamental para a condução do tratamento, métodos diagnósticos com esta finalidade fazem-se necessários. Este trabalho publica pela primeira vez na literatura, ao menos pelo conhecimento do autor, a utilização da metodologia de microarranjo líquido na determinação do genótipo e subtipo do HCV. Na avaliação de oitenta amostras positivas para a presença do HCV, o ensaio foi capaz de determinar o genótipo em setenta e seis (76/80, sensibilidade de 95%). A avaliação de sua concordância com outros métodos: seqüenciamento da região NS5b , Versant HCV genotype 1.0 e RT-PCR "in house",foi realizada. A concordância em relação à determinação do genótipo foi total em relação aos demais métodos, sendo o de seqüenciamento o padrão ouro. A determinação do subtipo foi possível em cinqüenta e duas amostras com genótipos determinados (52/76, 68%). Uma vez que para o tratamento da hepatite somente a determinação do genótipo, e não do subtipo é necessária, conclui-se que o teste baseado em microarranjo pode ser utilizado para esta finalidade; sendo sensível, específico, de alto rendimento e de relação custo benefício favorável. / Worldwide 3% of the population is infected by hepatitis C virus, and a number next to this is believed do occur in Brazil as well. Its social impact is huge, when morbidity and mortality are considered, also treatment associated costs. Interferon based treatment is favorable in a fraction of cases. Since it was established the importance of HCV genotyping regarding treatment, diagnostics methods are in high demand. The present work is the first to publish on liquid microarray utilization for HCV genotyping, at least to the author knowledge. Eighty positive samples for HCV presence evaluated showed seventy six to have their genotypes determined by the microarray test (76/80, sensitivity of 95%). Agreement evaluation with other methods: NS5b sequencing, Versant HCV genotype 1.0 and RT-PCR "in house" was performed. When genotyping is considered, total agreement was found compared to the other methods; sequencing being considered the "gold standard" . Subtyping determination was possible in fifty two of those genotyped (52/76, 68%). Once considered that only genotyping matters to treatment decision, and not subtyping, it is concluded that microarray can be utilized to this goal; find to be sensitive, specific, of high throughput and cost effective.

Orientadora : Profª. Drª. Maritana Mela Prodocimo / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/03/2016 / Inclui referências : f. 49-59 / Resumo: A contaminação de ambientes aquáticos torna<se um problema cada vez maior à medida que o crescimento populacional humano se amplia. Assim, é necessário conhecer os diferentes tipos de contaminantes - agrícolas, industriais e urbanos -, além da fonte e da forma como esses resíduos agem no ambiente natural e nos organismos não alvos. Estressores naturais e antropogênicos são recorrentes em ambientes aquáticos e podem afetar a saúde da biota residente, assim como a saúde humana. Fontes difusas de contaminação exigem abordagens mais abrangentes, que considerem a complexidade e variabilidade de respostas biológicas frente a exposição a misturas complexas de poluentes. O biomonitoramento ativo (BMA) é uma ferramenta útil na detecção e quantificação de impactos ambientais e consiste em utilizar organismos coletados em ambientes não poluídos e translocá<los para ambientes contaminados, quantificando suas respostas, sejam elas bioquímicas, fisiológicas e/ou organísmicas. No presente estudo, múltiplos biomarcadores foram aplicados para avaliar os efeitos de um presumido gradiente de possíveis contaminantes nos reservatórios de Salto Caxias (SC), Salto Osório (SO), Salto Santiago (SS), Segredo (SG), localizados no Rio Iguaçu, utilizando a espécie Oreochromis niloticus como organismo bioindicador. Variações significativas dos bioquímicos, morfológicos e genéticos foram observadas. Os indivíduos apresentaram alterações do tecido hepático, como necrose e processos inflamatórios, entretanto o índice de lesão não indicou diferenças significativas entre reservatórios. Foi observada uma inibição da superóxido dismutase (SOD), bem como uma indução da catalase (CAT) em SO. Apenas em SG houve uma redução significativa dos níveis de glutationa reduzida (GSH). A atividade da glutationa S<transferase (GST) foi induzida em todos reservatórios, sendo apenas significativamente menor em SC. Níveis de peroxidação lipídica (LPO) foram maiores em SS, entretanto alterações morfológicas nucleares (AMN) foram menos frequentes no mesmo reservatório. Ainda em SS foram observadas grandes concentrações de metabólitos de HPAs na bile dos indivíduos. Por fim, a atividade colinesterásica do músculo foi inibida em todos os reservatórios, em relação a SS. Os resultados sugerem que não há um gradiente de contaminação, uma vez que o reservatório de SS, localizado entre os demais, apresentou respostas indicativas de maior impacto. Neste sentido, o biomonitoramento demonstra ser uma ferramenta viável no estudo dos efeitos prejudiciais de misturas complexas de poluentes para a saúde dos rios, para biodiversidade bem como para saúde humana. Com isso, é necessário que estudos futuros sejam realizados no Rio Iguaçu, principalmente nas áreas utilizadas como fontes de captação para o abastecimento urbano com o intuito de contribuir com as agências de controle ambiental para o estabelecimento de políticas públicas. Palavras<chave: biomonitoramento ativo, Rio Iguaçu, sul do Brasil, qualidade da água, ecotoxicologia, misturas complexas, biomarcadores. / Abstract: Contamination in aquatic environments has become a major problem due to population and urban expansion. Therefore, it is important to acknowledge the different classes of contaminants - agricultural, industrial and urban - as well as their sources and mode of action of these residues on natural environment and live organisms. Natural and anthropogenic stressors are recurrent in aquatic environment and can affect resident biota and human health. Diffuse sources of contamination require broader approaches that take into consideration the complexity and variability of biological responses after exposure to complex mixtures of contaminants. Active biomonitoring is a useful tool to detect and quantify environmental impact and consists of translocating organisms from a non<polluted site to a contaminated one in order to quantify their biochemical, physiological and/or organismic response. The present study used multiple biomarkers to assess the effects of a putative contamination gradient at Salto Caxias (SC), Salto Osório (SO), Salto Santiago (SS) and Segredo (SG) reservoirs, located in Iguaçu River, using Oreochromis niloticus species as a bioindicator organism. Significant variations of morphological, biochemical and genetic biomarkers were observed. Fish individuals showed hepatic tissue alterations, such as necrosis and inflammatory processes, however the lesion index did not indicate significant differences among reservoirs. Superoxide dismutase (SOD) inhibition, as well as catalase (CAT) induction was observed at SO. Only at SG there was a significant depletion of glutathione (GSH) levels. Glutathione S< transferase (GST) activity was induced at all reservoirs, with the exception of SC where it was significantly inhibited. Lipid peroxidation levels (LPO) were higher at SS, however nuclear morphological alterations (NMA) were less frequent at the same reservoir. Also at SS high concentrations of PAHs biliary metabolites were observed. Finally, muscle acetylcholinesterase activity was significantly reduced at all reservoirs when compared to SS. Results suggest that there is not a contamination gradient, since SS reservoir showed responses indicative of higher impact. Thus, active biomonitoring has proven to be a viable tool to assess deleterious effect of complex contaminant mixtures to river health status, to biodiversity as well as to human health. Additionally, further studies should be conducted in Iguaçu River, especially at areas primarily used for water supply, in order to contribute to environmental control agencies to establish public policies. Keywords: active biomonitoring, Iguaçu River, southern Brazil, water quality, ecotoxicology, complex mixtures, biomarkers.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:43:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 296293.pdf: 595442 bytes, checksum: 4a44716096b914945e724217369d1213 (MD5) / A crista neural (CN) é uma população de células originadas das margens dorsais do tubo neural durante o desenvolvimento de vertebrados. Essas células possuem um alto potencial migratório e dão origem a múltiplos fenótipos como neurônios, células gliais, melanócitos e a diversos derivados mesenquimais. Sabe-se que essa diversificação de fenótipos é espacialmente e temporalmente influenciada por fatores do microambiente. Vários fatores de crescimento, incluindo o fator de crescimento epidermal (EGF), têm sido identificados como sendo capazes de direcionar a diferenciação de progenitores multipotentes da CN para tipos celulares específicos. Segundo Garcez e colaboradores (2009), o EGF é capaz de influenciar in vitro a diferenciação melanocítica das células da CN, aumentando o número de células pigmentadas em cultura. No presente trabalho investigamos os efeitos do EGF na potencialidade e diferenciação das células da CN de codornas (Coturnix coturnix japonica). Para isso culturas de massa e clonais de CN foram tratadas com EGF (10ng/mL). Nas células da CN truncal (CNT) os tratamentos foram realizados nas primeiras 20h, fase de migração das células a partir do tubo neural. Já para as células da CN cefálica (CNC) os tratamentos foram realizados após o período de migração, durante toda a cultura secundária. As células foram então fixadas e analisadas quanto à expressão do receptor de EGF (EGFR) e dos diferentes fenótipos celulares derivados da CN. Nossos resultados demonstram a expressão do EGFR pelas células da CNT 20h após o início da migração a partir do tubo neural, na cultura primária. O possível efeito do EGF na diferenciação condrocítica foi avaliado na CNC por apresentar o potencial mesectodermal. Em nossos resultados observamos frequência, número e tamanho dos nódulos de cartilagem equivalentes entre as condições controle e após tratamento com EGF, sugerindo que o EGF não influencia a diferenciação da CN para o fenótipo condrocítico. Para avaliar um possível efeito do EGF na potencialidade dos progenitores da CN, realizamos ensaios clonais, onde as células são plaqueadas individualmente sob controle microscópico. Identificamos progenitores comprometidos com as linhagens neuronal, glial, melanocítica ou muscular lisa, assim como progenitores bi, tri e tetrapotentes para diversas combinações destes fenótipos celulares. As proporções dos progenitores assim como a eficiência clonal (cerca de 60%) foram equivalentes nas duas condições experimentais, demonstrando que o EGF não interfere na proliferação nem na potencialidade dos progenitores da CN. Em trabalho anterior verificamos que o EGF promove aumento do número de melanócitos diferenciados identificados pela presença de melanina. Investigamos, então, se EGF influencia na diferenciação final dos melanócitos, avaliando a relação entre a expressão do marcador da linhagem melanocítica (melanocyte earlier marker, MelEM), que identifica tanto melanoblastos quanto melanócitos diferenciados, e a melanina. Observamos na condição controle que cerca de 20% das células da CN positivas para MelEM também apresentavam melanina, enquanto que após o tratamento com EGF essa proporção foi de 60%, correspondendo a um aumento de 3X. Esses resultados indicam que o EGF deva estar atuando sobre a etapa final do processo de diferenciação dos melanócitos, possivelmente envolvendo o processo da síntese de melanina. Entender o papel do EGF sobre a diferenciação melanocítica certamente contribuirá para avanços nos estudos de patologias que envolvam alterações no padrão de pigmentação, e as suas consequências, em organismos vertebrados.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T05:17:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 297132.pdf: 1912112 bytes, checksum: c691c9e2fe55b7ead5cc910e948355ab (MD5) / Nas últimas décadas os pesquisadores têm voltado sua atenção para os efeitos da crescente incidência da radiação ultravioleta (UV) nos ecossistemas. A radiação UV pode causar efeitos diferenciados nos organismos, sendo conhecido o papel da radiação ultravioleta-A (UV-A) no processo de fotorreativação celular, recuperando danos causados pela radiação ultravioleta-B (UV-B). O objetivo do presente trabalho foi caracterizar o efeito das radiações UV-A e UVB sobre os embriões do camarão de água doce Macrobrachium olfersi em três idades ao longo do desenvolvimento: idade 1 (E1-E6), idade 2 (E7-E9) e idade 3 (E10-E14). As fêmeas ovígeras foram submetidas aos seguintes procedimentos de irradiação: (1) exposição à radiação UV-A por 60 min.; (2) exposição à radiação UV-B por 30 min.; (3) exposição à radiação UV-B por 30 min., seguida de exposição à radiação UV-A por 60 min. Fêmeas ovígeras não irradiadas foram utilizadas como controle. Após os procedimentos de irradiação, as fêmeas foram mantidas por 4 dias no escuro, para então serem realizadas as analises macro e microscópicas. Nossos resultados mostram um aumento no volume dos ovos e atraso no ritmo do desenvolvimento dos embriões da idade 1 expostos à radiação UV-A, UV-B e UV-B+UV-A. Alterações morfológicas externas foram observadas nos embriões das idades 2 e 3, submetidos a todos os procedimentos de radiação. As análises por imuno-histoquímica mostraram que a expressão das proteínas envolvidas nas vias apoptóticas, como caspase 8, caspase 3, Bak e Bcl2, assim como as proteínas induzidas pelo estresse celular p53 e Hsp70, foram alteradas pela radiação UV-A e UV-B. A expressão da proteína p53 foi aumentada somente nos embriões expostos à radiação UV-A na idade 1. A expressão da caspase 8 foi maior em todas as idades nos embriões irradiados com UV-A e UV-B, contudo 10 nos embriões irradiados com UV-B+UV-A foi observado aumento da expressão de caspase 8 somente na idade 3. Embriões expostos à radiação UV-B+UV-A apresentaram uma diminuição da expressão da Bcl2, p53 e Hsp70 nas idades 2 e 3. As análises por imunohistoquímica mostraram ainda que houve pouca variação na proliferação celular, identificada pela expressão da proteína fosfohistona H3. Em síntese, nossos resultados mostram que (1) os embriões de M. olfersi irradiados nas idades 1, 2 e 3 apresentaram alterações na morfologia externa e na expressão das proteínas analisadas; (2) os embriões expostos às radiações UV-A ou UV-B separamente apresentam importantes alterações morfológicas e comprometimentos na expressão das proteínas p53 e Hsp70; (3) os embriões expostos à radiação UV-B seguida pela radiação UV-A apresentam efeitos mais atenuados, quando comparados aos embriões iradiados com UV-A ou UV-B separadamente. / In recent decades, researchers have been focused their attention in the effects of increasing incidence of ultraviolet (UV) radiation on ecosystems. The UV radiation can cause diverse effects on organisms, being recognized the roles of the ultraviolet-A (UV-A) radiation on the cellular photorreactivation, recovering the damages caused by ultraviolet-B (UV-B). The aim of this study was to characterize the effects of UV-A and UV-B radiation on embryos of the freshwater prawn Macrobrachium olfersi in three ages throughout development: age 1 (from E1 to E6), age 2 (E7-E9) and age 3 (E10-E14). Ovigerous females were submitted to the irradiation procedures: (1) exposure to UV-A radiation for 60 min.; (2) exposure to UV-B radiation for 30 min.; (3) exposure to UV-B radiation for 30 min. followed by the exposure to UV-A radiation for 60 min. Non-irradiated ovigerous females were used as control. After irradiation procedures, ovigerous females were kept for 4 days in the dark, and then were realized the macro- and microscopic analyses. Our results showed an increase in the egg volume and delay in the developmental rythm of the embryos at age 1 which were exposed to UV-A, UV-B and UV-B followed by UV-A. External morphological alterations were observed in embryos of ages 2 and 3, which were submitted to all radiation procedures. Immunohistochemistry analyses showed that the expression of proteins involved on apoptotic pathways, as caspase 8, caspase 3, Bak, as well as, the proteins induced by cellular stress, p53 and Hsp70, were altered by UV-A and UV-B radiation. In embryos irradiated with UV-A on age 3, was observed an increase on expression of every studied protein. The expression of p53 protein was increased only on embryos exposed to UV-A radiation on age 1. The expression of caspase 8 was higher in all ages of the embryos exposed to UV-A and UV-B radiation, however, in embryos exposed to UV-B followed UV-A high expression of caspase 8 occurred only at age 3. Embryos exposed to UV-B followed UV-A radiation showed a decrease of expression of Bcl2, p53 and Hsp70 at ages 2 and 3. Immunohistochemistry analysis also showed slight variation on cell proliferation, identified by the expression of phosphohistone H3 protein. In general, was verified that embryos exposed to UV-B followed UV-A showed few variation on expression of analyzed proteins when compared to embryos exposed to UV-A or UV-B separately. In summary, our results showed that (1) the embryos of M. olfersi exposed at ages 1, 2 and 3 exhibited alterations on external morphology and on expression of the analyzed proteins; (2) the embryos exposed to UV-A and UV-B separately, showed important morphological alterations and impairments on the expression of p53 and Hsp70; (3) embryos exposed to UV-B followed UV-A radiation showed more attenuated effects when compares to embryos irradiated with UV-A or UV-B separately.

Resumo não disponível.

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é o principal agente envolvido na Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Na maioria dos países onde a suinocultura tem expressiva importância econômica, a SMDS vem causando sérios prejuízos. Com o objetivo de contribuir para a caracterização genética de isolados brasileiros de PCV2, duas amostras autóctones foram clonadas e seqüenciadas na íntegra. Para tanto, o genoma viral foi extraído de tecidos de animais com SMDS e amplificado pelo método denominado “amplificação em círculo rolante com múltiplos primers” (ACRMP). Ambas seqüências apresentaram 1.767 nucleotídeos e diferiram entre si em apenas um nucleotídeo. A análise filogenética destas duas seqüências mostrou maior identidade com o grupo (1A) formado por isolados holandeses, franceses e chineses. Um isolado brasileiro previamente sequenciado, de Minas Gerais, foi classificado em outro grupo e a seqüência diferiu em até 16 nucleotídeos em relação aos isolados do Rio Grande do Sul. Na etapa seguinte desses estudos, visando o futuro desenvolvimento de vacinas, um dos genomas aqui seqüenciados foi transfectado em células de testículo de suíno (ST). Antígenos virais nas células transfectadas foram detectados por imunoperoxidase, demonstrando assim a infecciosidade do clone produzido. Entretanto, o clone infeccioso obtido não foi capaz de multiplicar-se a ponto de fornecer massa antigênica que viabilizasse a produção de uma vacina. Em vista disso, realizou-se uma tentativa de criar uma linhagem celular persistentemente infectada. Para isso, o DNA de PCV2 foi novamente transfectado em células ST com um plasmídeo contendo o gene de resistência a geneticin, visando a seleção de colônias celulares resistentes. Após a transfecção, porém, observou-se um efeito negativo na formação de colônias resistentes a esta droga. Este efeito foi dose-dependente em relação à quantidade de DNA de PCV2, o que impossibilitou o estabelecimento de uma linhagem celular persistentemente infectada. Isto pode estar relacionado com a expressão da proteína da ORF3 que induz apoptose ou à indução de citocinas, como interferons, embora outros mecanismos não possam ser excluídos, como efeito tóxico do alto número de cópias de genomas de PCV2. Analisando os resultados obtidos durante a realização destes estudos, conclui-se que as amostras de PCV2 circulantes no Brasil apresentam de identidade alta (99,09 %). / Porcine circovirus type 2 is the main etiological agent implicated in the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs. In countries with considerable swine production, PMWS is a major cause of economic losses. In order to perfom a genetic analysis on Brazilian PCV2 isolates, two PCV2 isolates inform the state of Rio Grande do Sul - Brazil, were cloned and fully sequenced. Viral genomes were extracted from tissues of animals with PMWS and amplified using multiply-primed rolling circle amplification (MPRCA). Both PCV2 sequences were 1,767 nucleotides long and differed in only one nucleotide from each other. Phylogenetic analysis of both sequences showed the highest sequence identity with a group of viruses (group 1A) that also harbors many Dutch, French and Chinese isolates. This suggests that the Brazilian PCV2 isolates examineed here might have been imported from one of such countries. Interestingly, a Brazilian isolate from Minas Gerais previously sequenced by others, was observed to belong to another group of PCV2 isolates and differs at 16 different sites from the isolates from Rio Grande do Sul. In order to develop a vaccine, one of the isolates here sequenced was transfected into swine testis (ST) cells. Viral antigens were detected in the transfected ST cells by immunoperoxidase, indicating that such PCV2 clone could give rise to infectious virus. However, the cloned virus was not able to multiply to high titers, what would be a major drawback in vaccine development. In attempting to solve this problem, the development of a PCV2- persistently infected cell line was targeted. PCV2 DNA was cotransfected with a plasmid carrying the geneticin resistance gene in order to allow clone selection by identification of geneticin resistant cells. However, the PCV2 DNA had a negative effect on the number of geneticin resistant colonies. Interestingly, this negative effect of PCV2 DNA was dose dependent and for this reason, it was not possible to establishing a persistently infected cell line. This might be linked to ORF3 protein expression, which induces apoptosis or production of interferon. Analyzing the results obtained in this study, the Brazilian PCV2 isolates had high identity (99.05 %).

A caracterização das mutações nos genes katG, ahpC e inhA e sua correlação com a resistência à isoniazida em isolados de Mycobacterium tuberculosis tem sido descrita. A mutação S315T no gene katG é a mais freqüentemente encontrada e pode fornecer rápida informação para a seleção do tratamento anti-tuberculose, para a vigilância epidemiológica da resistência e, possivelmente rastrear a transmissão de linhagens resistentes. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi o desenvolvimento de um Ensaio de Hibridização Reversa (EHR) para a rápida identificação da mutação no códon 315 do gene katG em M. tuberculosis. Após a padronização da metodologia com 180 DNAs de M. tuberculosis isolados de cultura, o teste foi aplicado a 46 DNAs isolados de amostras clínicas e foram testados para a detecção de mutantes katG315 resistentes à isoniazida. Quando aplicado em DNA de cultura o teste pôde detectar com sucesso a mutação mais comum no katG315 (AGC ACC) em todas as linhagens estudadas em comparação com o seqüenciamento de DNA. Em relação às amostras clínicas, o EHR apresentou concordância com o seqüenciamento em todas as amostras com baciloscopia positiva. O teste desenvolvido apresenta um bom potencial para a rápida identificação da resistência à isoniazida em regiões com uma elevada prevalência de mutantes katG315 entre isolados de M. tuberculosis resistentes à isoniazida. / Mutations in katG, ahpC and inhA genes were identified and have been correlated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates, mutation in katG S315T being the most frequent. Rapid detection of this mutation could therefore improve the choice of an adequate anti-TB regimen, epidemiological monitoring of isoniazid resistance and, possibly to track transmission of resistant strains. Reverse Hybridization Assay (RHA) is a simple technique for the rapid identification of katG315 mutation in M. tuberculosis. The assay was standardized with 180 DNAs isolated from cultures of M. tuberculosis and was applied to 46 clinical specimens and tested for the detection of isoniazid-resistant katG315 mutants. When the test was applied to the DNA from cultured M. tuberculosis it was possible to successfully detect the most common mutation at katG315 (AGC ACC) in all isolates studied in comparison with DNA sequencing. For clinical samples, the RHA presented agreement with the sequencing in all samples with smear positive. The developed test presents a good potential for the rapid identification of isoniazid resistance in regions with a high prevalence of katG315 mutants among isoniazid-resistant M. tuberculosis isolates.

Nesse trabalho foi desenvolvido um Teste Colorimétrico de Hibridização Reversa (TCHR-TB) que verifica a presença de mutações em uma região específica do gene rpoB, que confere resistência à rifampicina. Foram analisados 156 DNAs de M. tuberculosis obtidos de cultura. Quando comparado com teste convencional de susceptibilidade às drogas, a sensibilidade e a especificidade do TCHR-TB foi 92.3% e 98.0% respectivamente. Comparando com o seqüenciamento, o qual é considerado padrão ouro, a sensibilidade e a especificidade do TCHR-TB foram 90% e 100%, respectivamente. Mutações no códon 531 seguido de mutações no códon 526 são as mutações mais comuns mundialmente, sendo responsáveis por aproximadamente 75% das amostras resistentes à RIF. O TCHR-TB detectou corretamente 100% destas mutações. O método desenvolvido pôde também detectar mutações no gene rpoB de DNA de M. tuberculosis extraídos diretamente de amostras clínicas. Trinta e três amostras clinicas foram testadas e os resultados do TCHR-TB foram 100% concordantes quando comparados com método das proporções. Os resultados do nosso estudo demonstraram uma alta taxa de concordância do TCHR-TB quando comparado com os testes de sensibilidade convencionais e com o seqüenciamento. O teste pode ser aplicado com sucesso quando se faz necessária uma rápida e sensível detecção de resistência à rifampicina e conseqüentemente um correto gerenciamento dos pacientes. / In this work a Reverse-Line Blot Hybridization (RLBH) assay was developed which allows the detection of mutation in a specific region of rpoB gene, that confer rifampicin resistance, in a panel of 156 DNAs of M. tuberculosis obtained from cultures. When compared to the conventional drug susceptibility testing (DST), sensitivity and specificity of the RLBH were 92.3% and 98.0%, respectively. Comparing to sequencing, which is considered a “gold standard” reference, sensitivity and specificity of the RLBH were 90% and 100%, respectively. Mutations at codon 531, followed by mutation at codon 526 are the most common mutations worldwide accounting for approximately 75% of RIF resistance. The RLBH assay correctly detected 100% of these mutations. The method developed could also detect rpoB mutations of M. tuberculosis in clinical specimens. Thirty-three clinical specimens were tested and the results of RLBH were 100% concordant when compared to DST. The results of our study demonstrate a high concordance rate when the RLBH results were compared to conventional methods and sequencing data. The test can be successfully applied when a rapid sensitivity testing is required for the correct management of patients.