Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000449724-Texto+Completo-0.pdf: 6148140 bytes, checksum: 12da4cf8a6d912387d56ee8f32c58f7b (MD5) Previous issue date: 2013 / The irritant contact dermatitis (ICD) is a non-allergic inflammatory reaction of the skin that occurs independently of the T cells participation. ICD is caused by exposure to low molecular weight chemicals and it is initiated by damage or activation of epidermal cells which trigger the activation of the innate immune system. The purine nucleotide adenosine triphosphate (ATP) is the universal energy molecule and appears as is an important extracellular messenger. In healthy tissues, ATP is almost exclusively localized intracellularly, whereas in pathological conditions as inflammation, the tissue injury leads to the release of large amounts of ATP to the extracellular medium. In the extracellular medium, ATP can be hydrolyzed by nucleotidases to their breakdown products ADP and AMP. These nucleotidases control the availability of nucleotides for purinergic receptors. Currently, experimental observations indicate that extracellular ATP acting via purinergic receptors plays a relevant role on skin inflammation. Several models in vitro and in vivo had been used to study the mechanisms of ICD. However, this pathology is still poor understood. This study aimed to evaluate the involvement of the purinergic receptor P2X7 in ICD using in vivo and in vitro approaches. The croton oil (CrO) is a chemical irritant that has been shown to exert its effects independent of inflammatory T cells, therefore we used the mice model of irritant contact dermatitis induced by CrO to investigate the involvement of P2X7 receptor in the immunes mechanisms of ICD. We use several pharmacological approaches, in vitro and in vivo tests and mice with gene deletion to P2X7 receptor and showed evidences that the P2X7 receptor activation by ATP in macrophages and dendritic cells (DCs) is connected with neutrophil recruitment induced by CrO. Furthermore, we demonstrated that CrO decreased the hydrolysis of ATP and ADP in the serum of mice and caused necrosis of keratinocytes in culture, both effects related to activation of P2X7. Taken together, the data obtained in this study suggested that CrO exerts its toxic effects by promoting keratinocytes necrosis and decreasing the activity of ectonucleotidades leading to an increase of ATP extracellular levels. Then, extracellular ATP promotes the P2X7 receptor activation in DCs and macrophages causing the release of IL-1β, which is partially responsible for the neutrophils recruitment observed in irritant contact dermatitis induced by croton oil. Noteworthy, the treatment with the selective P2X7 receptor antagonist A438079 decreased the edema and others proinflammatory effects induced by croton oil, pointing the P2X7 receptor as an important pharmacological target for the treatment of ICD. / A dermatite de contato irritante (ICD, irritant contact dermatitis) é uma reação inflamatória local não alérgica da pele que ocorre independentemente da participação de células T. É ocasionada pela exposição a substâncias químicas de baixo peso molecular e acredita-se que seja iniciada por dano ou ativação de células epidermais que desencadeiam a ativação do sistema imune inato. O nucleotídeo ATP é uma molécula energética que desempenha importantes funções como mensageiro extracelular. Em tecidos saudáveis, o ATP está localizado quase exclusivamente no meio intracelular, entretanto quando ocorre injúria tecidual, grandes quantidades de ATP são liberadas para o meio extracelular. No meio extracelular, o ATP pode ser hidrolisado por nucleotidases gerando ADP e AMP. As nucleotidases controlam a disponibilidade do ATP para os receptores purinérgicos. Muitas observações experimentais têm indicado que o ATP atuando via receptores purinérgicos desempenha um papel preponderante em processos inflamatórios na pele. Vários modelos in vitro e in vivo têm sido utilizados para o estudo da ICD, entretanto a fisiopatologia da doença ainda é pouco conhecida. Este estudo teve como objetivo avaliar o envolvimento do receptor purinérgico P2X7 (P2X7R) na ICD utilizando abordagens in vivo e in vitro.O óleo de cróton (CrO) é um irritante químico que tem mostrado exercer seus efeitos inflamatórios independente de células T, portanto nós utilizamos o modelo de dermatite de contato irritante induzida por CrO em camundongos para investigar o envolvimento do receptor P2X7 nos mecanismos imunopatológicos da ICD. Através da utilização de diversas abordagens farmacológicas in vitro e in vivo e do uso de camundongos com deleção gênica para o receptor P2X7, nós primeiramente mostramos evidências de que a ativação do P2X7R por ATP em macrófagos e células dendríticas (DCs) está relacionada com o recrutamento de neutrófilos induzido por CrO. Além disso, foi demonstrado que o CrO decresce a hidrólise de ATP e ADP no soro de camundongos e provoca a necrose de queratinócitos em cultura, ambos os efeitos foram relacionados com a ativação do receptor P2X7. Portanto, a partir dos dados obtidos neste estudo, nós sugerimos que o óleo de croton exerce seus efeitos tóxicos promovendo a morte celular de queratinócitos, diminuindo a atividade de ectonucleotidades e aumentando os níveis extracelulares de ATP. O ATP extracelular, via ativação de P2X7R em DCs e macrófagos, provoca a liberação de IL-1β que é parcialmente responsável pelo recrutamento de neutrófilos observado na dermatite de contato irritante induzida por óleo de cróton. Digno de nota, o tratamento com o antagonista seletivo do receptor P2X7, A438079, diminuiu o edema e outros efeitos pró-inflamatórios induzidos pelo óleo de cróton, apontando o receptor P2X7 como um alvo farmacológico importante para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento da ICD.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000399015-Texto+Parcial-0.pdf: 142110 bytes, checksum: c5ffb33c81a7c9cbade03c8428376c8e (MD5) Previous issue date: 2008 / A estable connection between the titanium surface and the surrounding tissue is the most important prerequisites for the long-term success of implants. Therefore, a strong adhesion of the cells on biomaterial surface is required. The objective of this study was to evaluate fibroblast adhesion stimulated by basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) on titanium discs. For this study 30 titanium discs with smooth surface were produced. These discs were placed on culture plates with NIH3T3 fibroblasts, stimulated by bFGF, on test group and without the growth factor on control group. The samples were obtained after 3 hours, 24 hours and 48 hours. Using SEM, 10 images were obtained from each disc, totalizing 300 micrografies. The test showed that there are more fibroblasts attached to titanium discs, with a significative difference, at all experimental analysed periods of this experiment, when bFGF was administrated. / Uma conexão estável entre a superfície de titânio e os tecidos a sua volta é um dos mais importantes pré-requisitos para o sucesso a longo prazo dos implantes. Para isso, uma forte e efetiva adesão das células na superfície do biomaterial é requerida. O objetivo desse estudo foi o de avaliar a adesão de fibroblastos estimulados por Fator de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF) em discos de titânio. Para esse estudo foram produzidos 30 discos de titânio com superfície lisa. Esses discos foram colocados em placas de cultura e sobre eles foi inserido meio com fibroblastos NIH3T3, estimulados por bFGF, no grupo teste e sem este fator de crescimento no controle. As amostras foram obtidas em 3 horas, 24 horas e 48 horas. Foram feitas 10 imagens com Microscópio Eletrônico de Varredura em cada disco, totalizando 300 micrografias. Como resultado foi encontrado que existe uma diferença significativa no crescimento de fibroblastos nos três tempos deste experimento, do grupo onde o bFGF foi administrado.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000408007-Texto+Completo-0.pdf: 7713390 bytes, checksum: bf92d92b7f1e311023e32849423ed23c (MD5) Previous issue date: 2008 / The tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous ectoparasite of bovines, widely distributed in herds from America, Asia, Africa and Oceania. The use of acaricides is the main method for tick control, however it may become unfeasible due to the cost of drugs and labor required to apply the treatment, as well as the increasing appearance of resistant ticks to various acaricides. In addition, chemical residues in food and environmental pollution are major concerns nowadays. The development of an immunological control method as an alternative for the chemical control depends on finding out antigenic molecules that generate a protective immune response. As bovines develop resistance to ticks during successive infestations, the analysis of the immune responses developed by infested bovines may become of great importance in the search for protective antigens. ELISA and Western Blot were used to investigate the pattern of antibody responses of six bovines infested twelve times with R. microplus (six heavy infestations followed by six light infestations) against salivary gland, gut and larvae extracts. During heavy infestations, bovine IgG levels were shown to be higher, and a decrease in the number and weight of ticks that completed the parasitic cycle was observed. The pattern changed starting from the seventh infestation, showing a decrease in IgG levels, and an initial increase followed by a significant decrease in the proportion of ticks that completed the parasitic cycle. The number of molecules recognized by Western Blot was higher from sera collected following heavy infestations than after light infestations, although a great variation in the profiles detected could be seen when the bovines were compared. These results indicate that IgG responses to different tick antigens may not be generally associated with bovine resistance, and that infestation levels modulate the magnitude of humoral responses and possibly the immune mechanisms in the natural acquisition of tick resistance. / O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago de bovinos, amplamente distribuído nos rebanhos da América, Ásia, África e Oceania. O uso de acaricidas é o principal método para o controle do carrapato, porém o custo das drogas e da mão-de-obra requerida para aplicar o tratamento, o aparecimento crescente de carrapatos resistentes a vários acaricidas, a permanência de resíduos químicos nos alimentos e a poluição ambiental decorrente do seu uso tornam importante o desenvolvimento de outras formas de controle. O desenvolvimento de um método de controle imunológico como uma alternativa para o controle químico depende da identificação de moléculas antigênicas que geram uma resposta imune protetora. Como bovinos desenvolvem resistência ao carrapato durante sucessivas infestações, a análise da resposta imune desenvolvida por bovinos infestados pode tornar-se de grande importância na busca por antígenos protetores. ELISA e Western Blot foram utilizados para investigar o padrão de respostas de anticorpos de seis bovinos infestados doze vezes com R. microplus (seis infestações pesadas seguidas por seis infestações leves) contra extratos de glândula salivar, intestino e larva. Durante infestações pesadas foram observados níveis maiores de IgGs reconhecendo extratos protéicos de glândula salivar, intestino e larva, e uma diminuição no número e no peso de carrapatos que completam o ciclo parasitário. O padrão mudou iniciando na sétima infestação, mostrando uma diminuição nos níveis de IgG, e um aumento inicial seguido por uma significante diminuição na proporção de carrapatos que completam o ciclo parasitário. O número de moléculas reconhecidas em Western Blot foi maior pelos soros das infestações pesadas do que das infestações leves, embora uma grande variação nos perfis detectados pode ser visto entre os bovinos. Esses resultados indicam que níveis de anticorpos contra o carrapato não estão necessariamente relacionados de forma direta com níveis de resistência. Além disso, infestações pesadas e leves parecem modular de forma diferente a magnitude da resposta humoral e possivelmente os mecanismos imunes na aquisição natural de resistência ao carrapato.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000407730-Texto+Completo-0.pdf: 978627 bytes, checksum: 207551daea7acbf96e0c911484083687 (MD5) Previous issue date: 2008 / Herpes Simplex Vírus-1 (HSV-1) is a member of Herpesrviridae family and alphaherpesvirinea subfamily widely spread among human beings. This virus begins the infection through epithelial cells from skin and mucosal surface reaching the peripheral nervous system. HSV-1 infects the oral mucosa and establishes latency in trigeminal ganglia. Sometimes by action of endogenous or exogenous factors these viruses returns to active form leading to viral reactivation. During this process the virus can relocalizes on oral mucosal (hepetial genvivostomatites), optical nerve (ocular keratites) and central nervous system (encephalitis). In case of pregnancy, the reactivation could be asymptomatic; it could be dangerous because the virus can infect the baby during the childbirth, leading to neurological conditions and sometimes death. The process of latency is governed by latency associated transcripts (LAT genes) an immunological response as T cells. The cells that block the viruses from reactivation from the nerve are the memory CD8+ T cells. These lymphocytes stay adsorbed to neuron membrane interacting with the epitope SSIEFARL from a gB glycoprotein of HSV-1 envelop. SSIEFARL CD8+ T lymphocytes produces cytokines as IFN-у that penetrates into neuron and blocks the expression of genes involved in virion assembly and formation. When the number of CD8+ T cells reduces the viruses returns to active form. The proliferation and function of CD8+ T cells is controlled by cytokines, mainly IL-15 and IL-21. Several studies have shown that this cytokines have crucial a role in homeostatic proliferation of CD8+ T cells. In this study plasmid coding to IL-15 and IL-21 were elaborated to investigate the role of these cytokine on HSV-1 memory CD8+ T cell proliferation. In vitro, pIL-21 increased the frequency of CD8+ T cells in presence or absence of TCR stimulation. When administered during effector phase of HSV-1 infection pIL-15 and pIL-21 increased the numbers of antigen specific CD8+ T cells that produce IFN-у. For memory studies an adoptive transfer system was applied. SSIEFARL transgenic cells from CD90. 2+ donor mice were transferred to CD90. 1+ holster mice. The CD90. 1+ holster was infected with HSV-1 intraperitoneally and tread with each cytokine plasmid or combination, gB coding plasmid was used as antigen source. The resulted showed the pIL-15 or pIL-21 alone can induce proliferation of HSV-1 memory CD8+ T cells and that antigen did not have significant influence when provide together with the cytokines plasmids. However, the combination of pIL-15, pIL-21 and pgB together was more efficient to cell numbers and IFN-у production. / Herpes Simplex Vírus-1 (HSV-1) é um membro da família Herpesviridae e subfamília alfaherpesvirinea bastante disseminado entre os seres humanos. Esse vírus inicia seu processo de infecção a partir das células epiteliais da superfície da pele e mucosas, atingindo o sistema nervoso periférico. O HSV-1 inicia a infecção através da mucosa oral e fica localizado na forma latente no nervo trigêmio da face, algumas vezes, pela ação de fatores endógenos ou exógenos, esse vírus volta a sua forma ativa, ocasionando a reincidiva. Nesse processo de reativação do vírus ele pode se localizar, na mucosa oral (gengivoestomatite herpética), no nervo óptico (queratite herpética) e no sistema nervoso central (encefalite). No caso da gestante, a reativação herpética pode ser assintomática, o que pode infectar o filho no momento do parto, levando a danos neurológicos irreversíveis ou a morte. O processo de latência é coordenado por dois mecanismos principais, a expressão dos genes LAT e a resposta imunológica. As células da resposta imune que bloqueiam a reativação viral a partir do nervo são os linfócitos T CD8+ de memória. Esses linfócitos ficam justapostos à membrana do corpo celular do neurônio, interagindo com o epítopo SSIEFARL de uma glicopoteína gB do envelope viral. Os linfócitos T CD8+ SSIEFARL específicos produzem citocinas, como IFN-у, que penetram no neurônio e impedem a expressão de genes que estão envolvidos na construção do capsídeo, determinantes para formação de novos vírions. Quando o número dessas células diminui, o vírus volta a sua forma ativa. A proliferação e função das células T CD8+ é controlada por citocinas, principalmente a IL-15 e a IL-21. Muitos estudos indicam que elas têm um papel na proliferação homeostática de células T CD8+.Nesse trabalho, foram elaboradas construções gênicas com o DNA da IL-15 e da IL-21 para avaliar o potencial dessas citocinas na otimização da resposta T CD8+ de memória ao HSV-1. In vitro, a IL-21 aumentou a freqüência de células T CD8+, com ou sem estimulação de TCR. Na fase efetora, a IL-15 e IL-21 aumentaram os números de células T CD8+ antígenoespecíficas produtoras de IFN-у. Para os estudos de memória foi utilizado um sistema de transferência de células SSIEFARL transgênicas de camundongos CD90. 2 doadores para camundongos CD90. 1 receptores. Os camundongos receptores foram infectados com HSV-1 pela rota intraperitoneal e tratados com o plasmídeo contendo de cada citocina ou a combinação deles, um plasmídeo que codificava a glicoproteína gB do HSV-1 foi utilizado com fonte de antígeno Os resultados mostraram que cada pIL-15 ou pIL-21 isoladamente induz a proliferação de células T CD8+ de memória ao herpes e que a administração do antígeno não teve grande influência. Por outro lado, a combinação de pIL-15, pIL-21 e pgB foi mais eficiente, tanto no aumento dos números de células T CD8+, quanto na expressão de IFN-у.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000423675-Texto+Parcial-0.pdf: 173088 bytes, checksum: 99755374f8de265672c0fc78a783ae8c (MD5) Previous issue date: 2010 / Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) is a purine-metabolizing enzyme that catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides such as (deoxy)inosine and (deoxy)guanosine (dGuo) to their respective bases and (deoxy)ribose-1- phosphate. It is a key enzyme in the purine salvage pathway of mammalian cells. Tcells rely on PNP activity to maintain its functions and are particularly sensitive to PNP deficiency. The present investigation sought to determine whether the pharmacological blockage of PNP activity with a transitIon state analog (Immucillin-H) can arrest bone loss in two models of induced periodontal disease in rats. Experimental data showed that immucillin-H inhibitted bone loss induced by ligatures and bacterial LPS, with reduced number of infiltrating osteoclasts and inflammatory cells. In vitro assays revealed that Immucillin cannot directly abrogate differentiation of osteoclast precursor cells but affects lymphocyte-mediated osteoclastogenesis. On the other hand, incubation of pre-activated T-CD4+ with Immucillin-H decreased RANKL secretion with no compromise of cell viability. Immucillin-H, an analog of the transition state of PNP activity, holds great promise as a drug in the treatment of diseases characterized by imbalances of bone metabolism. / A Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) é uma enzima envolvida no metabolismo de purinas que catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos purínicos tais como (deoxi)inosina e (deoxi)guanosina formando suas bases purínicas correspondentes e (deoxi)ribose-1-fosfato. A PNP é considerada uma enzima chave na via de salvamento de purinas de células de mamíferos. Especificamente, células T são dependentes da atividade da PNP para manter suas funções e sensíveis a alterações da mesma. O presente estudo tem como objetivo determinar se o bloqueio farmacológico da PNP com um análogo do estado de transição da enzima (lmmucillin-H) é capaz de impedir a perda óssea em dois modelos de doença periodontal induzida em ratos. Dados experimentais mostram que o lmmucillin-H inibiu a perda óssea induzida por ligaduras e por lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano assim como reduziu o número de osteoclastos e células inflamatórias. Ensaios in vitro revelaram que o lmmucillin-H não age diretamente inibindo a diferenciação de células precursoras de osteoclastos, no entanto, afeta a osteoclastogênese mediada por linfócitos. Importante, a incubação de linfócitos T CD4+ pré-ativados e tratados com lmmucillin-H diminuiu a secreção de RANKL. Desta forma, o lmmucillin-H apresenta grandes premissas como uma droga no uso de doenças caracterizadas por alterações no metabolismo ósseo.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000393359-Texto+Completo-0.pdf: 3706184 bytes, checksum: 69c5551b27d8ba08aadf9a5c582b8491 (MD5) Previous issue date: 2007 / The natural resistance of plants to disease is based not only on preformed mechanisms, but also on induced mechanisms. The defense mechanisms present in resistant plants may also be found in susceptible ones. This study attempts to analyze phenolic compounds levels, including the flavonoid group and polyphenol oxidase (PPO) and peroxidase (POX) activities in Solanum tuberosum cv. Agata, in response to inoculation of the incompatible plant pathogenic bacteria Xanthomonas axonopodis and Ralstonia solanacearum, and the compatible bacteria Erwinia carotovora. Bacteria compatibility was evaluated using tubers infiltration. Tubers infiltrated with E. carotovora suspensions exhibited disease symptoms. On the other hand, bacteria R. solanacearum and X. axonopodis did not induce disease. Leaf inoculation was performed depending on the number and location of the leaves on the stem. Multiple-leaf inoculation was performed on basal, intermediate and apical leaves and single inoculations on intermediate leaves. Leaves inoculated with bacterial suspensions of X. axonopodis and R. solanacearum showed hypersensitive response (HR) within 24 hpi, while leaves inoculated with E. carotovora showed disease symptoms. Therefore, the R. solanacearum isolate used in the experiments did not exhibit virulence to this potato cultivar. Regardless of the bacterial treatments, multiple-inoculated basal leaves presented higher PPO and POX activities and lower levels of total phenolic compounds and flavonoids, when compared to apical leaves. Basal and intermediate leaves inoculated with R. solanacearum and X. axonopodis showed an increase in total phenolic compounds and flavonoid levels. These increases were similar or higher than the levels observed in non-inoculated apical leaves. In general, multiple-leaf inoculations showed the highest levels of phenolic compounds and flavonoids, while the single inoculations presented the highest increase in PPO activity. However, with POX activities there were no significant differences between single and multipleleaf inoculations. In the present study, the plant defense metabolism in this potato cultivar was stimulated by incompatible bacteria, indicating their potential use as inducers for further plant defense against any subsequent attack by compatible pathogens. / A resistência natural das plantas a doenças é baseada tanto em mecanismos pré-formados quanto em mecanismos induzidos. Esse estudo pretendeu analisar os níveis de compostos fenólicos, incluindo o grupo dos flavonóides e as atividades das enzimas polifenoloxidases (PPOs) e peroxidases (POX) em Solanum tuberosum cv. Ágata, em resposta às inoculações com as bactérias fitopatogênicas incompatíveis Xanthomonas axonopodis, Ralstonia solanacearum, e compatíveis Erwinia carotovora. A compatibilidade das bactérias foi avaliada através da inoculação de tubérculos. Tubérculos infiltrados com E. carotovora exibiram sinais de doença e com R. solanacearum e X. axonopodis não desenvolveram doença. As inoculações nas folhas foram realizadas dependendo do número e das localizações das folhas nos ramos. As inoculações múltiplas foram realizadas nas folhas basais, intermediárias e apicais e as inoculações simples ocorreram nas folhas intermediárias. As folhas inoculadas com as suspensões de X. axonopodis e R. solanacearum exibiram a resposta de hipersensibilidade (HR) dentro de 24 hpi, enquanto que as folhas inoculadas com E. carotovora evidenciaram sintomas de doença. Portanto, o isolado de R. solanacearum utilizado nos experimentos não mostrou virulência a esta cultivar de batata. Independentemente do tratamento bacteriano, as folhas basais apresentaram nas inoculações múltiplas, as mais altas atividades das PPOs e das POX e os níveis mais baixos de compostos fenólicos totais e de flavonóides, quando comparadas com as folhas apicais. As folhas basais e as intermediárias inoculadas com R. solanacearum e com X. axonopodis mostraram um aumento nos níveis de compostos fenólicos totais e de flavonóides. Esses aumentos foram similares ou maiores que os níveis observados nas folhas apicais não inoculadas. De um modo geral, as inoculações múltiplas exibiram os maiores níveis de compostos fenólicos totais e de flavonóides, enquanto que as inoculações simples apresentaram os maiores aumentos nas atividades das PPOs. Contudo, as atividades das POX não apresentaram diferenças significativas entre as inoculações múltiplas e simples. No presente estudo, o metabolismo de defesa nesta cultivar de batata foi estimulado pelas bactérias incompatíveis, indicando a sua posterior utilização como indutoras da defesa da planta contra o ataque subseqüente de patógenos compatíveis.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000437812-Texto+Completo-0.pdf: 154195 bytes, checksum: 6d937534253a5ebf131f023920cdd572 (MD5) Previous issue date: 2011 / Background: Age related reductions in contextual memory can impair daily functioning of older adults and have an important impact on their quality of life. Thus, the understanding of the neurobiological correlates of this memory decline is important to the establishment of effective cognitive interventions in healthy older adults. Objective: The current study was aimed to investigate the effects of aging and prefrontal cortex (PFC) function on contextual memory performance under different encoding conditions in a naturalistic experimental paradigm. Methods: Young (n=34, aged 20 - 35 years) and older adult men (n=31; aged 54 - 87 years) matched for education completed a recognition memory task for context (location of objects depicted in different rooms of a house) with or without an incidental binding cue at encoding. In addition, Wisconsin Card Sorting Test (WCST) was carried out to assess PFC function. Results: Results for contextual memory performance showed significant main effects of aging and encoding condition. Older adults performed significantly poorer than young controls in the encoding condition without incidental binding cue. The introduction of the incidental binding cue at encoding significantly improved the context recognition scores in young and older adults. A significant association between WCST scores and the performance for contextual memory were found only in the task without binding cue and just for the older adult men. Conclusion: The main findings indicate that the age related deficits on contextual memory are associated to age related impairments of PFC function, as indicated by the WCST. However, contextual memory of older adults improved with cognitive support at encoding and became independent of the scores on WCST, suggesting that incidental associative binding instructions at encoding can mitigate PFC deficits. / Introdução: Reduções na memória contextual relacionadas à idade podem prejudicar o funcionamento diário dos idosos e têm um impacto importante na sua qualidade de vida. Assim, a compreensão dos correlatos neurobiológicos deste declínio da memória é importante para o estabelecimento de intervenções cognitivas eficazes em idosos saudáveis. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos do envelhecimento e da função do córtex pré-frontal (CPF) sobre o desempenho da memória contextual em condições diferentes de codificação em um paradigma experimental naturalista. Métodos: Jovens (n = 34; 26,02 ± 0,64) e idosos (n = 31; 69,09 ± 1,26) do sexo masculino pareados por nível educacional. Os voluntários foram submetidos a uma tarefa de memória de reconhecimento de contexto (localização de objetos representados em diferentes salas de uma casa) com ou sem uma estratégia de codificação associativa. Além disso, o Teste Wisconsin de Classificação de Cartas (WCST) foi realizado para avaliar a integridade funcional do CPF. Resultados: Os resultados para o desempenho da memória contextual mostrou efeitos significativos do envelhecimento e da estratégia de codificação. Os idosos tiveram um desempenho significativamente pior do que controles jovens na condição de codificação sem estratégia de codificação. A introdução da estratégia de codificação melhorou significativamente as pontuações do reconhecimento do contexto nos jovens e idosos. A associação significativa entre as pontuações WCST e o desempenho da memória contextual foram encontrados apenas nos idosos sem estratégia de codificação. Conclusão: As principais conclusões indicam que os déficits na memória contextual e distúrbios da função do CPF estão relacionados com a idade, como indicado pelo WCST. No entanto, a memória contextual dos idosos melhorou, com o a introdução da estratégia de codificação associativa e tornou-se independente da pontuação no WCST, sugerindo a estratégia de codificação associativa pode atenuar os déficits do CPF.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000444924-Texto+Completo-0.pdf: 1000917 bytes, checksum: f4d5f486dd1a714bf1f2ecdcc7d68781 (MD5) Previous issue date: 2012 / I offer this thesis, which serves the purposes of the Programa de Pós-Gradução em Biologia Celular e Molecular, PUCRS and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superiror (CAPES), in order to corroborate the routine practice in forensic genetics. Fired cartridge cases are commonly present in crime scenes with firearms and sometimes they are the only evidence available for the elucidation of a fact, which makes them investigation key players. To load a firearm the individual has to touch the ammunition, resulting in deposition of epithelial cells on the surface of the cartridges. However, in forensic genetic laboratories routine, DNA tests are not required for these signs as often as they are found. The reason for the underuse of these materials is the low concentration and high rate DNA degradation wich occurs due to overheating of the cartridge that can reach 1800oC. Besides that, the inhibition of PCR, few reports of success in obtaining genetic profiles from fired cases and the scarce verifying feasibility studies of these samples are factors that discourage this practice. In order to corroborate the genetic research routine, we have established a partnership between the sectors of Instituto–Geral de Perícias do Rio Grande do Sul (IGP/RS) Forensic Genetics and Ballistics and Laboratório de Genética Humana e Molecular da PUCRS (LGHMPUCRS). The present study developed a controlled research to obtaining and analysis of nuclear DNA from fired cartridge cases. The study was based on standard protocols and/or indicated by the Forensic Science Department of Virginia. This study demonstrated that is possible to use fired, or not, cartridge cases as source of DNA to identify individuals who involved with its handle. However, considering the limited efficiency, the restricted effectiveness and the cost-benefit, means that the DNA analysis strategy from cells left in cartridges/cases is not priority in forensics lab routine. But, in many situations it could be the only option to investigators and, at this moment, our results and protocols herein will have main importance. This study concluded that following protocols here presented it is possible to produce data for human identification. The use of these protocols and their results will be definitive when used as an additional part of a police investigation and/or as evidence in criminal proceedings. / Apresento esta dissertação, a qual atende aos propósitos do Programa de Pós- Graduação em Biologia Celular e Molecular da PUCRS e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superiror (CAPES), com o propósito de corroborar com a rotina de práticas em genética forense. Estojos resultantes da deflagração de cartuchos são vestígios comumente presentes em cenas de crime com armas de fogo e, por vezes, únicos indícios de que se dispõe para a elucidação de um fato, o que os torna peças chave em uma investigação. Ao municiar uma arma de fogo é necessário que o indivíduo toque a munição, resultando na deposição de células epiteliais na superfície dos cartuchos. Entretanto, na rotina de laboratórios de genética forense, testes de DNA não são requeridos para estes indícios com tanta frequência quanto são encontrados. A justificativa para a subutilização destes materiais é a baixa concentração e a alta taxa de degradação do DNA, que ocorre devido ao superaquecimento do cartucho que pode chegar a 1800oC, além disso, a inibição da PCR, os poucos relatos de sucesso na obtenção de perfil genético a partir de estojos deflagrados e os exíguos estudos que verificam a viabilidade de amostras como estas, são fatores que desestimulam esta prática. Com o intuito de corroborar com a rotina de investigação genética, estabeleceu-se uma parceria entre os Setores de Genética Forense e de Balística Forense do Instituto-Geral de Perícias do Rio Grande do Sul (IGP/RS) e o Laboratório de Genética Humana e Molecular da Faculdade de Biociências da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (LGHMPUCRS). O presente estudo desenvolveu uma pesquisa controlada para obtenção e análise de DNA nuclear oriundos de estojos de cartuchos deflagrados.O estudo de foi realizado adaptando-se protocolos padrão e/ou indicados pelo Departamento de Ciências Forenses da Virgínia. Este estudo demonstrou que é possível utilizar estojos deflagrados ou não, como fonte de DNA com a finalidade de identificar os envolvidos com o seu manuseio. Contudo, considerando o rendimento limitado, a eficácia restrita e, sobretudo, o custo-benefício, entende-se que a estratégia de análise de DNA oriundo de células deixadas em cartuchos/estojos não seja a prioritária na rotina do Laboratório Forense. Mas, em muitas situações, essa pode ser a única opção dos investigadores e, nesse momento, nossos resultados e protocolos aqui apresentados terão importância fundamental. Com este estudo concluímos que seguindo os protocolos aqui apresentados é possível produzir dados para fins de identificação humana. O uso destes protocolos, e de seus resultados, poderá ser definitivo quando usados como elemento adicional de um inquérito policial e/ou como prova em um processo penal.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448604-Texto+Completo-0.pdf: 1148296 bytes, checksum: ca8ff4b1f0199484ac8c3e8b70d970b8 (MD5) Previous issue date: 2013 / According to data from the World Health Organization (WHO), stress affects more than 90% of the world's population and is considered a global epidemy. Stress has become an integral part of human life and organisms are constantly subjected to stressful stimuli that change various physiological processes, representing a risk factor for many diseases, such as cancer, cardiovascular, metabolic, infectious and gastrointestinal deseases and depression. The zebrafish (Danio rerio) has many similarities with mammalian in terms of overall organization and the functioning of their stress regulatory systems. The zebrafish hypothalamic-pituitary-interrenal (HPI), analogous to the mammalian hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA), has been found in zebrafish and the activation of this pathway is essential for the maintenance of vital functions in response to stressful events. Despite extensive knowledge regarding stress responses in mammals, data on the relationship between chronic unpredictable stress and its effects on purinergic signaling is limited. Purinergic signaling is mediated by ATP and adenosine receptor activation through P2 and P1, respectively. The catabolism of extracellular ATP to adenosine is promoted by the ectonucleotidases, such as Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-5 '-nucleotidases (E-5´NT). Adenosine is deaminated by adenosine deaminase (ADA) producing inosine. Thus, these enzymes control the levels of extracellular nucleotides and nucleosides, exerting an influence on purinergic signaling. Considering some models of stress can affect the signalling systems, the objective of this study was to verify whether the unpredictable chronic stress changes ectonucleotidases and adenosine deaminase activities in zebrafish brain. In addition, we analyzed the metabolism of ATP as well as the expression of genes related to ADA, ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi and the effects of agonists and antagonists of adenosine receptors in an unpredictable chronic stress model in zebrafish. Our results demonstrated that there are no changes on ATP (P = 0. 1499), ADP (P = 0. 3615) and AMP (P = 0. 8987) hydrolysis in zebrafish brain membranes submitted to unpredictable chronic stress. In contrast, ecto-ADA activity significantly decreased (26. 8%; 8,164 ± 0. 78 NH3 min − 1 mg− 1 of protein; p 0. 05; n = 5 <) in brain membranes of animals exposed to the unpredictable chronic stress when compared to the control group (11. 15 ± 2. 16 NH3 min − 1 mg − 1 of protein; p 0. 05; n = 5). However, the activity of cytosolic ADA was not changed after the unpredictable chronic stress. Quantitative analysis by RT-qPCR did not show significant changes after chronic unpredictable stress exposure on gene expression in the genes ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi. ATP metabolism in brain membrane preparations of zebrafish in the control group and stressed was measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) and showed a significant increase of adenosine in stressed animals. Considering adenosine A1 receptor agonists have an anxyolitic activity and the A2A receptor antagonists can exert neuroprotective effects, we investigated the effect of administration of an agonist of A1 receptor, N⁶-ciclopentiladenosine (CPA), and an antagonist of A2A receptors, (ZM241385) on behavioral parameters of animals submitted to unpredictable chronic stress to check a possible relationship between the adenosinergic system and the stress. As a result we showed that these compounds have not been able to reverse the anxiogenic effect caused by unpredictable chronic stress. Since adenosine has neuromodulatory and anxiolytic effects, changes in its levels could play a role in counteracting the stress, which could be related to a compensatory mechanism in order to restore the homeostasis. / De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), atualmente o estresse afeta mais de 90% da população mundial, sendo considerado uma epidemia global. O estresse tornou-se parte integrante da vida humana e os organismos são constantemente submetidos a estímulos estressantes que alteram vários processos fisiológicos, sendo um fator de risco para diversas patologias, como câncer, doenças cardiovasculares, metabólicas, infecciosas, gastrointestinais e depressão. O peixe-zebra (Danio rerio) tem muitas semelhanças com mamíferos em termos de organização geral e o funcionamento dos respectivos sistemas reguladores do estresse. O eixo hipotálamo-pituitária-interrenal (HPI), um sistema análogo ao eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), foi descrito em zebrafish e a ativação desta via é essencial para a manutenção das funções vitais como resposta a eventos estressantes. Apesar do amplo conhecimento das respostas do estresse em mamíferos, os dados sobre a relação entre o estresse crônico imprevisível e seus efeitos na sinalização purinérgica são limitados. A sinalização purinérgica é mediada por ATP e adenosina por meio da ativação dos receptores P2 e P1, respectivamente. O catabolismo de ATP extracelular até adenosina é promovido pelas ectonucleotidases, como as Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e Ecto-5’- nucleotidases (E-5´NT). A adenosina produzida pode ser desaminada pela adenosina desaminase (ADA), produzindo inosina. Assim, estas enzimas controlam os níveis de nucleosídeos e nucleotídeos extracelulares, exercendo uma influência na sinalização purinérgica. Considerando que alguns modelos de estresse podem afetar os sistemas de sinalização, o objetivo deste estudo foi verificar se o estresse crônico imprevisível altera as atividades ectonucleotidásicas e adenosina desaminase em cérebro de zebrafish. Além disso, analisamos o metabolismo do ATP, bem como a expressão de genes relacionados à ADA, ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi e os efeitos de agonistas e antagonistas de receptores de adenosina em zebrafish submetidos a um modelo de estresse crônico imprevisível. Nossos resultados demonstraram que não há alterações na hidrólise de ATP (P = 0. 1499), ADP (P = 0. 3615) e AMP (P = 0. 8987) em membranas cerebrais de zebrafish submetidos ao estresse crônico imprevisível. Em contraste, a atividade da ecto- ADA diminuiu significativamente (26,8%; 8. 164 ± 0,78 NH3 min−1 mg−1 de proteína; p < 0,05; n = 5) em membranas de cérebro de animais expostos ao estresse crônico imprevisível quando comparado ao grupo controle (11. 15 ± 2,16 NH3 min−1 mg−1 de proteína; p < 0,05; n = 5). No entanto, a atividade da ADA citosólica não foi alterada. A análise quantitativa por RT-qPCR não apresentou alterações significativas após a exposição do estresse crônico imprevisível na expressão gênica nos genes ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi. O metabolismo do ATP em preparações de membrana de cérebro de zebrafish no grupo controle e estressado foi medido por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e mostrou um aumento significativo de adenosina nos animais estressados. Considerando que os agonistas de receptores A1 têm uma atividade ansiolítica e os antagonistas dos receptores A2A podem exercer efeitos neuroprotetores, investigamos o efeito da administração de um agonista do receptor A1, N⁶-ciclopentiladenosina (CPA), e de um antagonista de receptores A2A, (ZM241385) em parâmetros comportamentais de animais submetidos ao estresse crônico imprevisível, para verificar uma possível relação entre o sistema adenosinérgico e o estresse. Como resultado, observamos que esses compostos não foram capazes de reverter o efeito ansiogênico causado pelo estresse crônico imprevisível. Uma vez que a adenosina tem efeitos neuromodulatórios, as alterações nos níveis de adenosina podem desempenhar um papel nos mecanismos relacionados ao estresse, representando um mecanismo de compensação a fim de restaurar a homeostase.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000434409-Texto+Completo-0.pdf: 489532 bytes, checksum: 6d9ad85140ac1052e70482873df7cc50 (MD5) Previous issue date: 2011 / The 2,3,7,8-tetrachlorodibenzeno-p-dioxin (TCDD) is a member of a group of environmental contaminants known as polychlorinated aromatic hydrocarbon and can be formed during the chlorine bleaching process used by pulp and paper and as a byproduct of the manufacture of certain chemicals. Once associated with ligands such as TCDD, the aryl hydrocarbon receptor (AHR) is translocated into the nucleus where it will form a dimer with nuclear translocator aryl hydrocarbon receptor (ARNT). The heterodimer AHR/ARNT formed, regulates the expression of a number of genes involved in cellular response to environmental changes and development conditions. Among the genes, is the coding for an ecto-ATPase (NTPDase2). Thus, it becomes important to assess the acute exposure (in vivo) of TCDD on the hydrolysis of ectonucleotidases in zebrafish brain membranes. The ectonucleotidases are enzymes capable of hydrolyzing the nucleotides and inactivating the signaling mediated by extracellular nucleotides. Among the ectonucleotidases, there are the NTPDase and ecto-5'-nucleotidase. The NTPDase activity showed no significant difference in the hydrolysis of ATP and ADP, as well as in AMP in menbranes of zebrafish. These findings seem to be important to reinforce the idea that NTPDase2 gene induction cannot be a general pathogenic factor in TCDD toxicity. However, further studies using either higher doses of TCDD and long-term exposure are required. / A 2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-dioxina (TCDD) é membro de um grupo de contaminantes ambientais conhecido como hidrocarboneto aromático policlorinato e pode ser formada durante o processo de branqueamento com cloro, utilizado por fábrica de celulose e papel e como um subproduto da fabricação de determinados produtos químicos. Uma vez associado a ligantes como a TCDD, o receptor de hidrocarboneto arila (AHR) é translocado para o núcleo onde irá formar um dímero com o translocador nuclear do receptor hidrocarboneto arila (ARNT). O heterodímero AHR/ARNT formado regula a expressão de uma série de genes envolvidos na resposta celular a mudanças ambientais e a condições de desenvolvimento. Entre os genes, está o que codifica para NTPDase2 (previamente conhecida como ecto-ATPase). Com isso, torna-se importante avaliar a exposição aguda (in vivo) da TCDD sobre a hidrólise de ectonucleotidases em membranas cerebrais de zebrafish. As ectonucleotidases são enzimas capazes de hidrolisar os nucleotídeos e inativar a sinalização mediada pelos nucleotídeos extracelulares. Entre as ectonucleotidases, destacam-se as NTPDases e a ecto-5’-nucleotidase. A atividade de NTPDase demonstrou que não houve diferença significativa na hidrólise de ATP e de ADP, bem como de AMP em membranas cerebrais de zebrafish. Estas descobertas parecem ser importantes para reforçar a idéia de que a indução do gene que codifica à NTPDase2 pode não ser um fator geral da toxicidade de TCDD. No entanto, mais estudos utilizando doses mais elevadas de TCDD e exposição a longo prazo são necessárias.