Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-07-08T21:47:56Z No. of bitstreams: 1 471802 - Texto Parcial.pdf: 3735530 bytes, checksum: 4d5d2bdf0acc100c891cf110e11d4904 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-08T21:47:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 471802 - Texto Parcial.pdf: 3735530 bytes, checksum: 4d5d2bdf0acc100c891cf110e11d4904 (MD5) Previous issue date: 2015-03-23 / Biomolecular recognition processes are intrinsically related to protein flexibility. To understand how ligands interact with its partners, how proteins can cooperate with each other, or why aggregation process occurs, are particularly important, not only to biophysics, but also in the rational drug design process. X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance, and molecular dynamics simulations are broadcasted approaches used to try to comprehend flexibility in biological macromolecules, although, this is not an easy task. This Ph.D. thesis will discuss the role of the flexibility using two different systems, (i) Mycobacterium tuberculosis EPSP synthase and (ii) Calmodulin from Mus musculus. Our main goal with this first system was to analyse in detail the structural information of the EPSP synthase, using molecular dynamics simulation. As a result, we have hypothesised how EPSP synthase flexibility could affect its activity, as well as its implications in the process of molecular docking experiments. Calmodulin project was developed during a ten month internship at the University of Cambridge. Our main goal was to study the influence of peptide mutated sequences in the process of molecular recognition, using nuclear magnetic resonance and isothermal titration calorimetry. As a product of this work, we have observed the impact of the linker domain to the peptide recognition, as well as, we have presented the importance of the entropy? enthalpy balance in the association with Calmodulin. / O reconhecimento biomolecular est? diretamente ligado ? capacidade de uma prote?na a suportar mudan?as conformacionais, ou seja sua plasticidade. Compreender como ocorre a associa??o de ligantes com seus receptores, como prote?nas se interrelacionam, porque ocorrem os processos de agrega??o, s?o de extrema import?ncia, n?o apenas para a ?rea da biof?sica, como tamb?m para o desenho racional de f?rmacos. T?cnica como cristalografia por difra??o de raios X, resson?ncia magn?tica nuclear e din?mica molecular, s?o algumas das principais abordagens para o estudo da flexibilidade em macromol?culas biol?gicas. No entanto, esta n?o ? uma tarefa simples. Esta tese de doutorado versar? sobre o papel da flexibilidade em dois sistemas distintos, (i) a enzima EPSP sintase de Mycobacterium tuberculosis e (ii) a prote?na Calmodulina de Mus musculus. A Parte 1 trar? como modelo de estudo a enzima EPSP sintase de Mycobacterium tuberculosis. O nosso objetivo com esta parte foi analisar em detalhes as informa??es estruturais desta enzima, por meio da t?cnica de din?mica molecular. Como resultados, propomos como a flexibilidade pode atuar na modula??o da atividade enzim?tica, a hip?tese dos cinco m?nimos locais de energia, bem como, suas implica??es para o processo de docagem molecular a partir de uma estrutura. A Parte 2 foi desenvolvida durante o per?odo de doutorado sandu?che e teve como alvo a prote?na Calmodulina de Mus musculus. O objetivo na Parte 2 desta tese foi estudar a influ?ncia de muta??es no processo de reconhecimento molecular com a Calmodulina, por meio das t?cnicas de resson?ncia magn?tica nuclear e calorimetria por titula??o isot?rmica. Como resultados, observamos a influ?ncia da regi?o de dobradi?a para o reconhecimento dos pept?deos avaliados, bem como, um processo de balan?o entr?pico?ent?lpico na associa??o destas mol?culas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 450257.pdf: 1851494 bytes, checksum: 45b94fe1b9cb73399670961f3d6d6798 (MD5) Previous issue date: 2013-03-25 / Human tuberculosis (TB), an illness that results from Mycobacterium tuberculosis infection, remains a major health problem worldwide, accounting for an estimated 8.7 million new cases globally in 2011. Problems related to treatment of M. tuberculosis infection are related to its ability to persist latently in host tissues, getting protection against drug treatment and creating a reservoir of disease. Addictionaly, the emergence of multi, extensively and totally drug-resistant strains, TB-HIV co-infection and the complexity of the treatment currently used, underline the need of new antitubercular drugs, with novel mechanisms of action. The enzyme adenylosuccinate lyase (ASL) is involved in both de novo and salvage pathways of purine biosynthesis. Here we describe M. tuberculosis ASL (MtASL) cloning and expression in Escherichia coli. N-terminal amino acid sequencing and electrospray ionization mass spectrometry analyses confirmed the identity of homogeneous MtASL. Size exclusion chromatography showed that the protein is a homotetramer in solution. Steady-state kinetics revealed that MtASL exhibits hyperbolic kinetics and confirmed that the recombinant enzyme indeed catalyses the cleavage of S-AMP in AMP and fumarate. The pH-rate profile showed that MtASL follows an overall acid-basic mechanism of catalysis and these studies, combined with multiple sequence alignment analysis led us to propose what amino acid residues are involved in the MtASL chemical reaction. In addition, product inhibition studies and isothermal titration calorimetry of binding products allowed us to propose the MtASL kinetic mechanism. The results here reported could lead to the identification of nucleoside analogs that potently inhibit M. tuberculosis viability, with minor damages to the human host. / A tuberculose humana (TB) ? uma doen?a infectocontagiosa provocada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis e permanece sendo um importante problema mundial de sa?de. Estima-se que 8,7 milh?es de novos casos tenham ocorrido em 2011. Problemas relacionados ao tratamento da infec??o ocorrem devido ? sua habilidade de persistir de forma latente no hospedeiro criando um reservat?rio da doen?a. Adicionalmente, a emerg?ncia de cepas multi, extensivamente e totalmente resistentes, a coinfec??o TB-HIV e a complexidade do tratamento utilizado atualmente, alertam para a necessidade de novos medicamentos, que possuam novos mecanismos de a??o. A enzima adenilossuccinato liase (ASL) est? envolvida em ambas as vias de bioss?ntese de purinas. Neste trabalho, n?s descrevemos a amplifica??o, clonagem da ASL de M. tuberculosis (MtASL) e express?o em Escherichia coli. O sequenciamento N-terminal juntamente com an?lises por espectrometria de massas confirmaram a identidade da MtASL homog?nea. Foi demonstrado atrav?s de cromatografia de exclus?o por tamanho que a prote?na ? um homotetr?mero em solu??o. Ensaios de cin?tica no estado estacion?rio revelaram que a MtASL exibe um modelo de cin?tica hiperb?lica e que catalisa a clivagem de S-AMP a AMP e fumarato. Estudos de perfil de pH demonstraram que a MtASL realiza um mecanismo catal?tico ?cido-b?sico e, tais estudos, combinados ao alinhamento m?ltiplo de sequ?ncias, permitiram propor os res?duos de amino?cidos envolvidos na rea??o. Adicionalmente, estudos de inibi??o pelos produtos somados a estudos de calorimetria de titula??o isot?rmica da liga??o dos mesmos, permitiram propor o mecanismo cin?tico da MtASL. Os resultados deste trabalho podem auxiliar na posterior identifica??o de an?logos de nucleot?deos que sejam capazes de inibir a viabilidade do M. tuberculosis, com poucos danos ao hospedeiro humano.

A caracterização das mutações nos genes katG, ahpC e inhA e sua correlação com a resistência à isoniazida em isolados de Mycobacterium tuberculosis tem sido descrita. A mutação S315T no gene katG é a mais freqüentemente encontrada e pode fornecer rápida informação para a seleção do tratamento anti-tuberculose, para a vigilância epidemiológica da resistência e, possivelmente rastrear a transmissão de linhagens resistentes. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi o desenvolvimento de um Ensaio de Hibridização Reversa (EHR) para a rápida identificação da mutação no códon 315 do gene katG em M. tuberculosis. Após a padronização da metodologia com 180 DNAs de M. tuberculosis isolados de cultura, o teste foi aplicado a 46 DNAs isolados de amostras clínicas e foram testados para a detecção de mutantes katG315 resistentes à isoniazida. Quando aplicado em DNA de cultura o teste pôde detectar com sucesso a mutação mais comum no katG315 (AGC ACC) em todas as linhagens estudadas em comparação com o seqüenciamento de DNA. Em relação às amostras clínicas, o EHR apresentou concordância com o seqüenciamento em todas as amostras com baciloscopia positiva. O teste desenvolvido apresenta um bom potencial para a rápida identificação da resistência à isoniazida em regiões com uma elevada prevalência de mutantes katG315 entre isolados de M. tuberculosis resistentes à isoniazida. / Mutations in katG, ahpC and inhA genes were identified and have been correlated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates, mutation in katG S315T being the most frequent. Rapid detection of this mutation could therefore improve the choice of an adequate anti-TB regimen, epidemiological monitoring of isoniazid resistance and, possibly to track transmission of resistant strains. Reverse Hybridization Assay (RHA) is a simple technique for the rapid identification of katG315 mutation in M. tuberculosis. The assay was standardized with 180 DNAs isolated from cultures of M. tuberculosis and was applied to 46 clinical specimens and tested for the detection of isoniazid-resistant katG315 mutants. When the test was applied to the DNA from cultured M. tuberculosis it was possible to successfully detect the most common mutation at katG315 (AGC ACC) in all isolates studied in comparison with DNA sequencing. For clinical samples, the RHA presented agreement with the sequencing in all samples with smear positive. The developed test presents a good potential for the rapid identification of isoniazid resistance in regions with a high prevalence of katG315 mutants among isoniazid-resistant M. tuberculosis isolates.

Nesse trabalho foi desenvolvido um Teste Colorimétrico de Hibridização Reversa (TCHR-TB) que verifica a presença de mutações em uma região específica do gene rpoB, que confere resistência à rifampicina. Foram analisados 156 DNAs de M. tuberculosis obtidos de cultura. Quando comparado com teste convencional de susceptibilidade às drogas, a sensibilidade e a especificidade do TCHR-TB foi 92.3% e 98.0% respectivamente. Comparando com o seqüenciamento, o qual é considerado padrão ouro, a sensibilidade e a especificidade do TCHR-TB foram 90% e 100%, respectivamente. Mutações no códon 531 seguido de mutações no códon 526 são as mutações mais comuns mundialmente, sendo responsáveis por aproximadamente 75% das amostras resistentes à RIF. O TCHR-TB detectou corretamente 100% destas mutações. O método desenvolvido pôde também detectar mutações no gene rpoB de DNA de M. tuberculosis extraídos diretamente de amostras clínicas. Trinta e três amostras clinicas foram testadas e os resultados do TCHR-TB foram 100% concordantes quando comparados com método das proporções. Os resultados do nosso estudo demonstraram uma alta taxa de concordância do TCHR-TB quando comparado com os testes de sensibilidade convencionais e com o seqüenciamento. O teste pode ser aplicado com sucesso quando se faz necessária uma rápida e sensível detecção de resistência à rifampicina e conseqüentemente um correto gerenciamento dos pacientes. / In this work a Reverse-Line Blot Hybridization (RLBH) assay was developed which allows the detection of mutation in a specific region of rpoB gene, that confer rifampicin resistance, in a panel of 156 DNAs of M. tuberculosis obtained from cultures. When compared to the conventional drug susceptibility testing (DST), sensitivity and specificity of the RLBH were 92.3% and 98.0%, respectively. Comparing to sequencing, which is considered a “gold standard” reference, sensitivity and specificity of the RLBH were 90% and 100%, respectively. Mutations at codon 531, followed by mutation at codon 526 are the most common mutations worldwide accounting for approximately 75% of RIF resistance. The RLBH assay correctly detected 100% of these mutations. The method developed could also detect rpoB mutations of M. tuberculosis in clinical specimens. Thirty-three clinical specimens were tested and the results of RLBH were 100% concordant when compared to DST. The results of our study demonstrate a high concordance rate when the RLBH results were compared to conventional methods and sequencing data. The test can be successfully applied when a rapid sensitivity testing is required for the correct management of patients.

Gliomas apresentam um prognóstico precário apesar das múltiplas modalidades terapêuticas como ressecção neurocirúrgica, radioterapia e quimioterapia, possivelmente pelo seu alto nível de invasividade e resistência aos tratamentos. Estudos recentes demonstraram que o peptídeo liberador de gastrina (GRP), assim como seu receptor, possui efeitos importantes no desenvolvimento de muitos tumores, inclusive de gliomas. O receptor de GRP está super expresso em linhagens celulares de glioblastomas tendo sua função relacionada com a proliferação celular, estimulando o crescimento tumoral. No presente estudo, foi investigado o efeito do RC-3095, um antagonista seletivo do receptor de GRP, como mono terapia e em associação à temozolamida (TMZ), um agente citotóxico alquilante de DNA, em modelos experimentais de células de glioma da linhagem C6 de rato in vitro e in vivo. A proliferação celular foi reduzida tanto por RC-3095 quanto por TMZ, porém quando ambos os agentes foram administrados em associação, a redução da proliferação foi significativamente mais efetiva. Nos experimentos in vivo, o grupo controle apresentou os tumores maiores (52 ± 15.5 mm3), enquanto RC-3095 reduziu o tamanho tumoral, tendo um efeito mais efetivo na dose 0.3 mg/kg (21 ± 9.7 mm3). Porém, a combinação dos dois agents produziu a maior redução no tamanho tumoral (10 ± 7.5 mm3), assim como, apresentou índices histológicos menos agressivos. Nossos resultados demonstram que a combinação de RC-3095 e temozolamida produz uma maior redução tumoral em modelos experimentais de glioma de rato indicando que RC-3095 pode ser um forte candidato para associação à temozolamida potencializando os efeitos de agentes alquilantes de DNA no tratamento de gliomas multiformes. / Malignant gliomas have a dismal prognosis despite multi-modality treatments like neurosurgical resection, radiation therapy and chemotherapy, mainly due to their high level of invasion. Recent studies demonstrated that gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptors play a role in the development of a variety of cancers including gliomas. The GRP receptor was shown to be over-expressed on glioblastoma cell lines and its function is related with cellular growth. In the present study, we investigated the effects of RC-3095, a selective antagonist of the GRP receptor, alone and in combination with temozolomide (TMZ), a DNA alkylating agent, in vitro and in vivo using experimental rat C6 glioma models. Cellular proliferation was reduced in all treatments (TMZ, RC-3095 and TMZ + RC-3095) with the administration of TMZ together with RC-3095 being the most effective. In in vivo experiments, the control group displayed the largest tumors (52 ± 15.5 mm3), whereas RC-3095 reduced the tumor size, with the most significant effect observed at the dose of 0.3mg/kg (21 ± 9.7 mm3). The combined therapy produced the largest reduction in tumor size (10 ± 7.5 mm3), greater than with either treatment alone. Ours results show that the combination of RC-3095 and TMZ have additive effects on the in vitro and in vivo glioma growth therefore making RC-3095 a candidate drug to potentiate the effects of the DNA alkylanting agent temozolomide in the treatment of malignant gliomas.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-12-23T13:17:24Z No. of bitstreams: 1 DIS_BRUNO_DALLAGNOL_PARCIAL.pdf: 1004622 bytes, checksum: f24e6bdb92018aba52853bc890c3dc2c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-23T13:17:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_BRUNO_DALLAGNOL_PARCIAL.pdf: 1004622 bytes, checksum: f24e6bdb92018aba52853bc890c3dc2c (MD5) Previous issue date: 2015-03-18 / Anaplasma marginale is a vector-borne pathogen that causes a disease known as anaplasmosis. To date, there are no sequenced genomes of Brazilian strains available. The aim of this work was to compare whole genomes of Brazilian strains of A. marginale (Palmeira and Jaboticabal) with genomes of strains from other regions (North-American and Australian strains). Genome sequencing was performed by next-generation sequencing. Reads were mapped using the genome of the Florida strain of A. marginale as a reference sequence. Identification of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions (INDELs) was performed. Data showed significant differences between the two Brazilian strains, and their comparison with North-American strains (Florida and St. Maries) revealed more nucleotide differences than with Australian strains (Gypsy Plains and Dawn). These results shed light into the evolutionary history of A. marginale and provide the first genome information of South American isolates. Assessing sequences of the genomes of strains from different regions is essential to increase knowledge of the pan-genome of this rickettsia. / Anaplasma marginale ? um pat?geno transmitido por vetores que causa uma doen?a conhecida como anaplasmose. At? o momento, n?o h? genomas sequenciados de cepas brasileiras dispon?veis. O objetivo deste trabalho foi comparar genomas completos de cepas brasileiras de A. marginale (Palmeira e Jaboticabal) com genomas de cepas de outras regi?es (cepas norte-americanas e australianas). O sequenciamento do genoma foi realizado por sequenciamento de alto rendimento. As reads foram mapeadas utilizando o genoma da cepa Florida de A. marginale como uma sequ?ncia de refer?ncia. A identifica??o de polimorfismos de nucleot?deo ?nico (SNPs) e inser??es/dele??es (INDELs) foi realizada. Os dados mostraram diferen?as significativas entre as duas cepas brasileiras, e sua compara??o com as cepas norte-americanas (Fl?rida e St. Maries) revelou mais diferen?as de nucleot?deos do que com as cepas australianas (Gypsy Plains e Dawn). Esses resultados lan?am luz sobre a hist?ria evolutiva de A. marginale e fornecem a primeira informa??o gen?mica de isolados da Am?rica do Sul. Avaliar sequ?ncias dos genomas de cepas de diferentes regi?es ? essencial para aumentar o conhecimento do pangenoma desta rickettsia.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 383071.pdf: 1037097 bytes, checksum: 64845ab6c2bfb968dc78afc6dab91fc8 (MD5) Previous issue date: 2006-06-28 / A avalia??o da citotoxicidade dos materiais dentais ? de grande import?ncia na Odontologia. O formocresol (FC) e o tricresol formalina (TC) s?o duas medica??es utilizadas na odontologia para desinfec??o do canal radicular, que cont?m formalde?do na sua formula??o. Estes produtos s?o considerados bons antimicrobianos, mas pesquisas a respeito da toxicidade destes medicamentos ainda s?o necess?rias. O presente estudo avaliou in vitro a citotoxicidade do formalde?do, do FC e do TC, utilizando tr?s linhagens celulares estabelecidas, as c?lulas HeLa, NIH3T3 e Hep2, cultivadas em condi??es padr?o. As c?lulas foram deixadas em contato com cada produto durante 1, 2, 3, 4 ou 5 minutos, sendo ent?o incubadas por 24 horas, 48 horas ou 7 dias. O teste de citotoxicidade utilizado foi o ensaio MTT. Os resultados deste estudo mostraram que os produtos testados foram t?xicos ?s diferentes linhagens celulares estabelecidas, em todas as condi??es testadas. O formocresol foi o produto que apresentou menor citotoxicidade, sendo este resultado estatisticamente significante quando comparado com o tricresol formalina e o formalde?do.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000404135-Texto+Completo-0.pdf: 1490615 bytes, checksum: b5509cc2d05c00816334141421e9d2b2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Introduction: Recently, adipose tissue harvested by liposuction has been identified as a source of adult stem cells. This material is abundant and easy to obtain, which facilitates the isolation of adult stem cells for not only research purposes but moreover clinical use. Knowing the concentration of these cells in different parts of the body is essential for the use of this material, but this information is not yet available. Objective: The aim of this study was to determine the effect of liposuction donor site on the concentration of stem cells obtained from adipose tissue. Method: A prospective cross-sectional study was conducted in 25 women with indication for liposuction in 4 or more different areas in the same procedure. After selective liposuction, the material was sent to the laboratory where it was processed for extraction of adult stem cells which were separated from the adipose tissue and quantified. The following harvest regions were evaluated: upper abdomen, lower abdomen, trochanteric region, crural region, knee and flank region. The cell concentration obtained from each site was compared by analysis of variance for mixed models. Results: A significant difference in cell concentration was found for the different harvest sites. The cell concentration in the lower abdomen was greater than in other areas, but no significant difference was found in relation to the crural region. Conclusion: The lower abdomen and the inner thigh appear to have higher concentrations of adipose-derived stem cells. / Introdução: Recentemente, o tecido adiposo obtido através da lipoaspiração foi identificado como uma fonte alternativa de células-tronco adultas. A facilidade de obtenção e a abundância de material facilitam não só a pesquisa, mas principalmente a aplicação clínica destas células. Os estudos que tratam deste assunto não avaliam de forma precisa a existência ou não de diferença na concentração destas células nas diferentes possíveis zonas de coleta do corpo. Objetivo: Avaliar a influência da zona doadora na concentração de células-tronco derivadas do tecido adiposo em mulheres. Método: Estudo transversal prospectivo. Foram incluídos no estudo 25 pacientes com indicação de lipoaspiração em 4 ou mais zonas diferentes em um mesmo procedimento cirúrgico. Após a lipoaspiração seletiva, o material foi processado para a dissociação do tecido e extração das células-tronco adultas para posterior quantificação. Foram avaliadas as seguintes zonas de coleta: abdome superior, abdome inferior, zona trocantérica, zona crural, joelho e flanco. A concentração celular obtida em cada zona foi comparada através de análise de variância para modelos mistos. Resultados: Verificou-se diferença significativa na concentração celular obtida nas diferentes zonas doadoras. A concentração celular no abdome inferior foi superior às demais; porém, não apresentou diferença significativa em relação à zona crural. Conclusão: O abdome inferior e a zona crural parecem ter maiores concentrações de células-tronco derivadas do tecido adiposo.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000411926-Texto+Completo-0.pdf: 537628 bytes, checksum: ad84cc7d4a6b34220ad5f86256433b5f (MD5) Previous issue date: 2009 / Cadherins play a crucial role in tissue homeostasis by maintaining cell-cell adhesion, and therefore have been implicated in cancer progression. The synthetic antagonist of the gastrin-releasing peptide receptor RC-3095 have been shown to inhibit tumor growth by repressing cell proliferation, motility and morphogenesis, and is pointed as a promising anti-cancer drug. This work aimed to evaluate the effect of RC-3095 treatment on colorectal adenocarcinoma HT-29 cell line upon E and N cadherin expression. Our results corroborate previous findings demonstrating the negative effect of RC-3095 on cell viability, reinforcing its potential anti-cancer effect. However, our results failed to establish a correlation between RC-3095 treatment and cadherin expression, suggesting that modulation of cell adhesiveness is not a target of RC-3095 under these conditions. N cadherin was not detected while E cadherin expression decreased progressively along the 48h period tested. / As caderinas desempenham um papel-chave na manutenção das adesões célula-célula e alterações em sua expressão tem implicações significativas na homeostasia tecidual, estando envolvidas na progressão do câncer. O RC-3095 e um antagonista sintético do receptor do peptídeo liberador de gastrina capaz de restringir o crescimento de tumores pela ação inibitória sobre proliferação, aumento da motilidade e morfogênese de células tumorais, representando uma nova e promissora estratégia farmacológica no tratamento anti-tumoral. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do tratamento com RC-3095 durante a progressão tumoral da linhagem de adenocarcinoma colorretal HT-29 sobre a expressão de caderinas dos tipos E e N. Nossos resultados corroboram achados prévios que demonstraram o efeito negativo do RC-3095 sobre a viabilidade celular, reforçando seu potencial no tratamento do câncer colorretal. O tratamento com RC-3095, contudo, não alterou o perfil de expressão de caderinas durante o período de 48h estudado. Neste período não foi detectada expressão de caderina do tipo N, enquanto a expressão de caderina E diminui progressivamente independente do tratamento com RC-3095, sugerindo que a adesividade celular não e alvo do antagonista do receptor do peptídeo liberador de gastrina nas condições estudadas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000426212-Texto+Completo-0.pdf: 638472 bytes, checksum: ea98899a1819c8c97f6081d821d52bc4 (MD5) Previous issue date: 2010 / Sepsis is a syndrome caused by uncontrolled systemic inflammatory response of the individual, which represents a serious epidemiological problem worldwide. Since inflammatory cytokines represent a central part in the septic shock pathogenesis. The aim of this study was to investigate the effect of two drugs, Nacetylcysteine (NAC), a thiol-compound precursor of glutathione and fructose-1,6- bisphosphate (FBP), a high energy glycolytic metabolite, in the treatment of experimental sepsis. by evaluating the immunomodulatory effect (in vitro) and therapeutic (in vivo), in order to obtain alternative drugs for the treatment of septic shock. The experimental model chosen for the in vitro study was to culture of peripheral blood mononuclear cells were isolated from healthy humans through gradient centrifugation. T-Lymphocytes were stimulated for 96 h with phytohemagglutinin, being isoled from NAC used in concentrations of 1,5,10,15 mM or associated with 1. 25 mM FBP were tested. The results suggest that either NAC itself or association with FBP inhibits cellular proliferation, acting as potent immunomodulatory agents, suggesting their use in inflammatory diseases. For in vivo experiments, we used male Wistar rats that were divided into five experimental groups: (i) normal control (not induced), (ii) septic control (induced using a capsule with non sterile fecal content and E. coli (1,5 x 109 CFU), (iii) induced and treated with FBP (500 mg/kg IP), (iv) induced and treated with NAC (150 mg/kg IP), (v) induced and treated with the combination of FBP (500 mg/kg IP) with NAC (150 mg/kg IP).In attempting to explain the possible mechanism of action, mainly the results of the septic group and treated with NAC, complete blood analysis, biochemical measurements were performed, besides the verification of tissue oxidative stress. Were also performed blood cultures and in the different groups in order to check whether there was induction septic. Our results show that NAC prevented the mortality of animals after septic induction. These data confirm the validity of the use of NAC in the treatment of sepsis, possibly due to its property to be a precursor to glutathione, by their hepatoprotective ability and possible renal protection. Our data also show that the synergistic action with FBP does not improve the picture, and this can be partly explained by heightened activation of the immune (defense) or a decrease of hepatic glutathione. / A sepse é uma síndrome complexa ocasionada pela resposta inflamatória sistêmica descontrolada do indivíduo, que representa um grave problema epidemiológico em todo mundo. Sendo que, as citocinas inflamatórias representam o papel central na patogênese do choque séptico. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito de duas drogas, N-acetilcisteína (NAC), um tiol-composto precursor da glutationa e a Frutose-1,6-bisfosfato (FBP), um metabólito glicolítico de alta energia, no tratamento da sepse experimental, através da avaliação do efeito imunomodulador (in vitro) e efeito terapêutico (in vivo), com o intuito de se obter drogas alternativas para o tratamento do choque séptico. O modelo experimental escolhido para o estudo in vitro, foi à cultura de células mononucleares do sangue periférico isoladas de humanos saudáveis através de gradiente de centrifugação, Os linfócitos T foram estimulados durante 96 h com fitohemaglutinina, sendo utilizadas concentrações isoladas de NAC nas concentrações de 1, 5, 10 e 15 mM e associadas à FBP na concentração de 1,25 mM. Os resultados sugerem que tanto a NAC como sua associação com a FBP inibem a proliferação celular, agindo como potentes agentes na imunomodulação, sugerindo o uso destas contra doenças inflamatórias. Para a experimentação in vivo, utilizaram-se ratos Wistar machos, divididos em cinco grupos experimentais: (i) controle normal (não induzidos); (ii) controle séptico (induzidos com uma cápsula com conteúdo fecal não estéril e E. coli (1,5 x 109 C. F. U. ); (iii) induzidos e tratados com FBP (500 mg/kg I. P. ); (iv) induzidos e tratados com NAC (150 mg/kg I. P. ); (v) induzidos e tratados com a associação da FBP (500 mg/kg I. P. ) com NAC (150 mg/kg I. P. ).Na tentativa de se explicar o mecanismo de ação, principalmente o resultados do grupo séptico e tratado com NAC, foram realizadas análises hematológicas, dosagens bioquímicas, além da verificação do estresse oxidativo tecidual. Também foram realizadas hemoculturas, a fim de se verificar se houve indução séptica. Nossos resultados sugerem que a NAC impediu a mortalidade dos animais após a indução séptica. Estes dados comprovam a validade do uso da NAC no tratamento da sepse, possivelmente pela sua propriedade de ser um precursor da glutationa, pela sua capacidade hepatoprotetora e possível proteção renal. Nossos dados também demonstram que a ação sinérgica com FBP não melhora o quadro, esta em parte explicada pelo aumento do TBARS renal e pela diminuição da glutationa hepática.