La qualité de l'eau est une préoccupation majeure pour la santé publique et la préservation de l'environnement. Nous proposons d’utiliser les phages comme des biosenseurs pour détecter les pathogènes humains ou animaux présents dans les eaux de surface, un outil nommé Phagosensor.La mise au point d’un phagosensor prototype a permis d’optimiser la détection des bactéries par cytométrie en flux. Les résultats montrent que cet outil est extrêmement rapide, sensible, et très spécifique. L’outil phagosensor permet de détecter des bactéries cibles présentes dans un environnement complexe tel que l’eau de mer.Le prototype fonctionnel a servi de base à la construction de phagosensors spécifiques de bactéries pathogènes. Les résultats montrent que la stratégie développée à partir du prototype peut être rapidement transposée à la détection de pathogènes tel que Salmonella. Le séquençage de novo et l’annotation des génomes de trois phages isolés de l’environnement permettront la construction de nouveaux phagosensors spécifiques de souches d’E. coli pathogènes.Cette stratégie a été adaptée à la détection d’un signal luminescent post-infection en utilisant les phages recombinants portant l’opéron luxCDABE. Les bactéries infectées sont rapidement détectables.L’ensemble de ces résultats démontre que la stratégie développée est applicable à la construction de phagosensor sur demande pour une détection rapide, sensible et spécifique des bactéries d’intérêt que ce soit en fluorescence ou en luminescence. La détection dans l’eau de mer suggère, qu’à terme, des outils pourront être conçus pour la détection de bactéries pathogènes dans d’autres matrices telles que le sang ou les aliments. / Water quality is a major concern for public health and natural environment preservation. We propose to use phages to develop biosensor tools able to detect human and animal pathogens present in water. The construction of a phagosensor prototype using an optimized genetic engineering strategy, infection and detection conditions, allowed the specific detection of bacteria. The results show that detection is fast, specific and highly sensitive. Moreover, the phagosensor tool detects target bacteria in a complex environment such as seawater. Phagosensors specific of pathogenic bacteria were constructed following the strategy developed for the prototype. Results show that the strategy we designed can be successfully transposed to detect pathogens such as Salmonella. De novo sequencing and genomes annotation of three phages isolated from the environment were carried out to develop phagosensors that are specific of pathogenic E. coli. This technology was then adapted to detect a luminescent signal arising post-infection using genetically modified phages carrying the entire luxCDABE operon. The bacteria infected with the lux recombinant phages were rapidly detected by luminescence emission. Together, these results demonstrate that our technology can be applied to construct various phagosensors adapted to the detection of different bacterial species of interest and using at least two output signals. These tools allow a rapid, specific and highly sensitive detection that are close to the European guideline. Efficient bacterial detection in seawater suggests that phagosensors could be developed to detect pathogenic bacteria in other matrices such as blood or food.

Le complexe Burkholderia cepacia (Bcc) englobe 17 espèces retrouvées dans les infections pulmonaires d'individus atteints de mucoviscidose. Les bactéries de ce complexe sont présentes dans les sols, la rhizosphère de grandes cultures, les eaux usées et peuvent également être rencontrées dans le cadre d'infections nosocomiales. En France, les espèces B. multivorans et B. cenocepacia (Bcen) sont les espèces majoritaires au niveau des infections de patients atteints de mucoviscidose. Divers clones épidémiques ont été décrits au sein de l'espèce Bcen dont le clone ET12 associé au "syndrome cepacia". En 2004, une épidémie nosocomiale impliquant un clone du Bcc est survenue dans un hôpital de l'Ain. Durant ce travail, l'origine de ce clone (B&B), sa classification au sein du Bcc et certains phénomènes génétiques liés à son émergence ont été étudiés. Cela a permis d'identifier ce clone comme appartenant à l'espèce Bcen et une forte proximité de celui-ci avec la lignée ET12. L'étude des facteurs transcriptionnels de la famille σ70 au sein du Bcc a mis en évidence une structure génétique similaire entre la lignée ET12 et ce clone, mais différente de celle observée chez les autres espèces du Bcc. L'analyse d'éléments génétiques répétés de la famille des séquences d'insertion (IS) a cependant permis d'observer une organisation génomique distincte de la lignée ET12. Celle-ci a été reliée à des phénomènes d'instabilité génétique notamment à des phénomènes d'acquisition d'éléments génétiques mobiles de type îlot génomique. L'ensemble de ce travail a permis de caractériser un ensemble de phénomènes génétiques pouvant expliquer l'émergence de clones épidémiques tels que le clone B&B.

Récemment, le système de sécrétion de type VI (SST6) a été identifié comme un nouvel acteur clé dans la compétition inter-bactérienne parmi le large arsenal dont dispose les bactéries. L’une des particularités du SST6 est de cibler à la fois des cellules eucaryotes et procaryotes. Le T6SS est un complexe protéique formé par l’assemblage de deux ‘sous-complexes’. Le premier sert à l’ancrage de la machinerie au sein de l’enveloppe bactérienne et le second agit comme une arbalète moléculaire. Le mécanisme d’action du SST6 est très similaire à celui d’autres machineries contractiles telles que celui des bactériophages : la contraction d’un fourreau propulse une flèche, composée d’un tube avec une aiguille à son extrémité, directement dans la cellule cible afin de délivrer les différentes toxines. Mon projet de thèse consiste à comprendre quelles sont la structure et la biogénèse des deux différents complexes et de comprendre comment ils sont assemblés. Nous utilisons comme modèle la bactérie pathogène à Gram négatif Escherichia coli entéroagrégative. J’ai pu démontrer que le complexe membranaire est assemblé en premier, avec l’adressage de la lipoprotéine de membrane externe TssJ, puis le recrutement séquentiel de TssM et TssL, deux protéines de membrane interne. Le complexe membranaire recrute ensuite une plateforme d’assemblage, appelée ‘baseplate’. Nous avons identifié et caractérisé les composants de cette ‘baseplate’ qui sert de plateforme d’assemblage pour le recrutement du reste de la machinerie (fourreau et flèche). Enfin, nous avons identifié et déterminé le rôle de la protéine TssA, une protéine qui coordonne la polymérisation du fourreau et de la flèche. / Among the broad weaponry of bacteria, the recently identified type VI secretion system (T6SS) emerges as one of the key player in bacterial competition. T6SS is a versatile machinery that targets both eukaryotic and prokaryotic cells. This molecular weapon assembles two evolutionarily different sub-assemblies. One complex anchors the machinery to the cell envelope while the second acts as a molecular crossbow. The mechanism of action of the T6SS is similar to other known contractile machineries such as bacteriophages: the contraction of a sheath propels an arrow, constituted of a tail tube capped by a cell-puncturing device, directly into the prey cell to deliver effector toxins. My Ph.D project was to provide mechanistic details on the structure and biogenesis of the two T6SS sub-complexes and to understand how they are connected, using entero-aggregative Escherichia coli as model bacterium. I have demonstrated that the membrane complex is assembled first and starts with the positioning of the outer membrane TssJ lipoprotein and proceeds inward, from the outer to the inner membrane, through the sequential recruitment of the TssM and TssL subunits. After assembly, the membrane complex recruits an assembly platform called the baseplate. We identified and characterized the components of this baseplate, which serves as assembly platform for the tail. We further demonstrated that the functional and physical interaction between the T6SS membrane complex and the baseplate is mediated by multiple contacts. Finally, we identified and deciphered the role of TssA, a protein that coordinates the polymerizations of the tail tube and sheath.

Les ARNs non-codants régulateurs (ARNnc) regroupent des acteurs majeurs de la régulation de l'expression des gènes, retrouvés de manière ubiquitaire dans l'ensemble des domaines du vivant. Chez les bactéries ils sont également appelés sRNAs, jouent des rôles clefs dans de nombreuxprocessus physiologiques et adaptatifs. Ces sRNAs ont été mis en évidence par des méthodes expérimentales haut-débit (microarray, tilling-array...) dans plusieurs espèces bactériennes d'intérêt. Ils agissent majoritairement au niveau post-transcriptionnel via une interaction physique avec un ou plusieurs ARNs messagers(s) cibles(s). Cependant, les informations sur les ARNmet les fonctions potentielles de ces sRNAs restent très parcellaires à ce jour. De plus, les profils d'évolution des sRNAs ont été peu étudiés chez les bactéries pathogènes. Le travail réalisé dans cette thèse repose sur l'hypothèse que l'évolution des sRNAs et leur coévolution avec d'autres éléments fonctionnels dans un ensemble de génomes, peut permettre de mieux comprendre leurs histoires évolutives, mais également de caractériser leurs fonctions potentielles et peut-être d'aider à identifier le ou les ARNm cibles avec lesquels ils interagissent. Dans ce but, nous avons conçu et implémenté une stratégie de phylogénomique robuste et géné- rique permettant d'analyser l'évolution et la coévolution des sRNAs et des ARNm cibles dans un ensemble de génomes bactériens annotés, à partir de leur profil de présence-absence. Cette méthode a été appliquée à l'analyse de l'évolution et de la coévolution de 154 sRNAs trans régulateurs de Listeria monocytogenes EGD-e. Elle nous a permis d'identifier 52 sRNAs accessoires dont la majo- rité étaient présents dans l'ancêtre commun des souches de Listeria et ont été perdus au cours de l'évolution. Nous avons ensuite détecté une coévolution significative entre 23 sRNAs et 52 ARNm et nous avons reconstruit le réseau de coévolution des sRNAs et ARNm de Listeria. Ce réseau contient un hub principal de 12 sRNAs qui coévoluent avec des ARNm codant pour des protéines de la paroi ainsi que des facteurs de virulence. Parmi eux nous avons pu identifier 4 sRNAs coévoluant avec 7 gènes codant pour des internalines qui sont connues pour regrouper d'importants facteurs de virulence chez Listeria. De plus, l'ARN rli133, qui coévolue avec plusieurs gènes impliqués dans le pouvoir pathogène de Listeria, contient des régions compatibles avec des interactions physiques directes inhibitrices pour la majorité de ses partenaires de coévolution. / Non coding RNAs (ncRNA) are main actors of gene expression regulation and are found ubiquitously in all domains of life. In bacteria, ncRNAs play key roles in a wide range of physiological and adaptive processes. These "small non coding RNAs" (sRNAs) are identified by high-throughput experimental methods (microarray, tilling-array, ...) in several bacteria species of interest. They mainly act at post-transcriptional level through physical interactions with one or several mRNA(s). Nevertheless, the available informations about mRNA targets and sRNAs functions, remain very limited. In addition, evolutionary patterns of sRNAs have been poorly studied in pathogenic bacteria. The main hypothesis of my PhD work is therefore that analysis of evolution and coevolution between sRNAs and other functional elements in a given genomes set, may allow to understand their evolutionary histories, to better characterize their putative functions, and may also help to identify their potential mRNA(s) target(s). For this purpose, we designed and developed a robust and generic phylogenomic approach to analyze evolution and coevolution between sRNAs and mRNA from their presence-absence profiles, in a set of annotated bacterial genomes. This method was thereafter used to analyze evolution and coevolution of 154 Listeria monocytogenes EGD-e trans regulatory sRNAs in 79 complete genomes of Listeria. This approach allowed us to discover 52 accessory sRNAs, the majority ofwhich were present in the Listeria common ancestor and were subsequently lost during evolution of Listeria strains. We then detected significant coevolutions events between 23 sRNAs and 52 mRNAs and reconstructed the coevolving network of Listeria sRNA and mRNA. This network contains a main hub of 12 sRNAs that coevolves with mRNA encoding cell wall proteins and virulence factors. Among them, we have identified 4 sRNAs coevolving with 7 internalin-coding genes that are known to group important virulence factors of Listeria. Additionaly, rli133, a sRNA that coevolve with several genes involved in Listeria pathogenicity, exhibits regions compatible with direct translational inhibitory physical interactions for most of its coevolution partners.

Le complexe Burkholderia cepacia (Bcc) englobe 17 espèces retrouvées dans les infections pulmonaires d'individus atteints de mucoviscidose. Les bactéries de ce complexe sont présentes dans les sols, la rhizosphère de grandes cultures, les eaux usées et peuvent également être rencontrées dans le cadre d'infections nosocomiales. En France, les espèces B. multivorans et B. cenocepacia (Bcen) sont les espèces majoritaires au niveau des infections de patients atteints de mucoviscidose. Divers clones épidémiques ont été décrits au sein de l’espèce Bcen dont le clone ET12 associé au "syndrome cepacia". En 2004, une épidémie nosocomiale impliquant un clone du Bcc est survenue dans un hôpital de l’Ain. Durant ce travail, l’origine de ce clone (B&B), sa classification au sein du Bcc et certains phénomènes génétiques liés à son émergence ont été étudiés. Cela a permis d’identifier ce clone comme appartenant à l’espèce Bcen et une forte proximité de celui-ci avec la lignée ET12. L’étude des facteurs transcriptionnels de la famille σ70 au sein du Bcc a mis en évidence une structure génétique similaire entre la lignée ET12 et ce clone, mais différente de celle observée chez les autres espèces du Bcc. L’analyse d’éléments génétiques répétés de la famille des séquences d’insertion (IS) a cependant permis d’observer une organisation génomique distincte de la lignée ET12. Celle-ci a été reliée à des phénomènes d’instabilité génétique notamment à des phénomènes d’acquisition d’éléments génétiques mobiles de type îlot génomique. L’ensemble de ce travail a permis de caractériser un ensemble de phénomènes génétiques pouvant expliquer l’émergence de clones épidémiques tels que le clone B&B. / The Burkholderia cepacia complex (Bcc) comprises 17 species found in lung infections of individuals with cystic fibrosis. The bacteria of this complex are present in the soil, the rhizosphere of field crops, wastewater and may also be encountered in nosocomial infections. In France, the B. multivorans and B. cenocepacia species are the major species in infections of cystic fibrosis patients. Various epidemic clones have been described within the B. cenocepacia species whose ET12 clone associated with "cepacia syndrome". In 2004, a nosocomial outbreak involving a clone of Bcc occurred in a French hospital. During this outbreak, origin of this clone (B&B clone), its classification within the Bcc and several genetic events associated with its emergence have been studied. These investigations have identified this clone as belonging to the species B. cenocepacia with a strong proximity with the ET12 lineage. The study of transcriptional factors of σ70 family within the Bcc has revealed a similar genetic structure between the ET12 lineage and this clone, but different from that observed in other species of Bcc. Analysis of genetic elements repeated family of insertion sequences (IS), however, allowed to observe a distinct genomic organization of the ET12 lineage. It has been linked to phenomen of genetic instability including acquisition of mobile genetic elements like genomic island (GI). All of this work has helped to characterize a set of genetic events may explain the emergence of epidemic clones such as clone B&B.