L’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse (AIDA-I) est une adhésine bactérienne présente chez certaines souches d’Escherichia coli qui, associée aux toxines Stx2e ou STb, contribue à l’apparition de la maladie de l’œdème ou de la diarrhée post-sevrage chez les porcelets. AIDA-I est un autotransporteur qui confère des capacités d’autoaggrégation, de formation de biofilms et d’adhésion. L’objectif principal du projet de recherche consistait en la recherche de récepteur(s) potentiel(s) d’AIDA-I. Les bactéries pathogènes adhèrent aux cellules-cibles soit en liant directement des molécules à la surface cellulaire ou en utilisant des molécules intermédiaires qui permettent de diminuer la distance séparant la bactérie de la cellule-cible. Puisque le sérum est un fluide qui contient de nombreuses molécules, celui-ci a été utilisé comme matériel de départ pour l’isolement de récepteur(s) potentiels. Nous avons isolé un récepteur potentiel à partir du sérum porcin : l’apolipoprotéine A-I. L’interaction entre l’apolipoprotéine A-I et AIDA-I a été confirmée par ELISA et microscopie à fluorescence. La capacité à envahir les cellules épithéliales offre aux pathogènes la possibilité d’établir une niche intracellulaire qui les protègent contre les attaques du milieu extérieur. La présente étude a démontré que la présence d’AIDA-I en tant que seul facteur de virulence chez une souche de laboratoire permet de conférer la capacité d’envahir les cellules sans promouvoir la survie intracellulaire. L’étude de la souche sauvage 2787, exprimant AIDA-I en association avec d’autres facteurs de virulence, a démontré une différence significative pour les phénotypes d’invasion et de survie intracellulaire face à la souche de laboratoire exprimant AIDA-I. / The adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) is a bacterial adhesin associated with some Escherichia coli strains that might, when associated with toxin Stx2e or STb, contribute to the development of edema disease or post-weaning diarrhea in piglets. AIDA-I is an autotransporter that mediates various phenotypes such as adhesion, autoaggregation and biofilm formation. The main aim of our project was to find potential receptor(s) for AIDA-I. Pathogens can either bind cell directly by targeting exposed cell surface molecules or use an intermediate molecule as a bridge to lessen the space separating them from their target cell. Serum is known to contain a wide range of molecules so it has been used as raw material for the isolation of a putative receptor for AIDA-I. We isolated a putative receptor for AIDA-I: the apolipoprotein A-I. The interaction between the apolipoprotein A-I and AIDA-I was confirmed by ELISA and fluorescent microscopy. The capacity to invade epithelial cell enables pathogens to create an intracellular niche that protects them against attacks from the extracellular environment. The present report has shown that the presence of AIDA-I as the sole virulence factor in a laboratory strain, enable bacteria to invade cultured cells but does not promote intracellular survival. Studies conducted on wild-type strain 2787, which express AIDA-I in association with other virulence factors, has shown a significant difference in invasion and intracellular survival phenotypes compared to the laboratory strain expressing AIDA-I.

Pour la climatisation de bâtiments ou d'installations industrielles, les nappes d'eaux superficielles représentent une source de frigories très convoitée. Leurs exploitations intensives depuis plusieurs dizaines d'années conjuguées au redéploiement de la filière géothermique ces dernières années, soulèvent des préoccupations quant à la préservation des ressources en eau. Dans ce contexte, la présente étude vise à évaluer l'impact de variations locales de température sur la qualité physico-chimique et microbiologique des eaux souterraines sur la base (i) de suivis in-situ au niveau de 3 installations réelles exploitant les nappes d'eaux superficielles et, (ii) d'expérimentations sur un pilote (BIOTHERMEX) permettant de reproduire, en conditions parfaitement maitrisées, l'effet de la propagation d'un panache thermique dans un modèle réduit d'aquifère. Dans la gamme de température relevée sur site, les principaux résultats obtenus montrent que les impacts thermiques sont circonscrits au voisinage immédiat de l'installation, pouvant altérer jusqu'à plus d'une dizaine de degrés la sténothermie des nappes. Le suivi des paramètres physico-chimiques n'ont pas fait apparaitre de perturbations significatives sur la période de surveillance, constat étayé par des modélisations hydrogéochimiques. En revanche, une influence significative a été relevée au niveau des principaux descripteurs microbiologiques (activité, diversité de la microflore totale). Enfin, les expériences menées à l'échelle du laboratoire ont permis d'appréhender finement le comportement réactionnel du système et de définir une température de réinjection critique, au-delà de laquelle des désordres potentiels sont attendus.

L'objectif de mon travail fut de valider et d'optimiser la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF pour l'identification et la classification d'un ensemble de bactéries pathogènes ou opportunistes chez l'homme, en enrichissant une base de données et en testant la robustesse de la méthode, afin d'obtenir une méthode rapide fixe et fiable d'acquisition de résultats. Les différents résultats obtenus ont permis la validation de la technique comme outil d'identification bactérienne fiable en routine. Elle permet désormais de caractériser les mélanges de deux bactéries voir même la différentiation d'espèces très proches comme les Shigella spp et E. coli. Nous avons montré que la technique sera encore améliorée par un outil supplémentaire de comparaison des souches pour une veille épidémiologique "en temps réel", sans investissement supplémentaire, en permettant plusieurs types d'économie. Elle apporte un gain réel dans la prise en charge du patient et le choix éclairé des antibiotiques testés pour l'antibiogramme. La technique peut aussi constituer un outil alternatif de sérotypage.

Nous nous proposons d'étudier la gestion du bruit stochastique d'expression génique. On s'intéresse plus particulièrement à la dynamique du bruit lors de la réponse cellulaire. Comment évolue le bruit? Quels sont les mécanismes en jeux? Quelle est l'importance du bruit dans le fonctionnement cellulaire? Pour répondre à ces questions, nous nous appuyons sur le réseau de régulation génétique qui gère la réponse au stress nutritionnel chez E. Coli. L'étude du comportement dynamique de ce réseau, au niveau d'une population de bactéries, a été initiée et est portée par la forte collaboration de deux équipes de la région : une de bio-informaticiens (l'équipe de Hidde de Jong de l'INRIA Rhône-Alpes) et la deuxième de biologistes (l'équipe de Hans Geiselmann, Laboratoire d'Adaptation et Pathogénie des Micro-organismes). En profitant donc de l'expérience et de la compréhension acquise par ces équipes, nous étudions les réponses individuelles de chaque bactérie lors de la transition entre état de stress nutritionnel, et état de croissance exponentielle. Le bruit d'expression génique est quantifié dans des nœuds clés du réseau de régulation. Pour ce faire, les bactéries sont suivies individuellement par microscopie de fluorescence sur plusieurs générations. Les données de fluorescence collectées sur cellules uniques permettent d'étudier la variabilité inter-cellulaire. Cette variabilité est quantifiée tout le long de la réponse: à chaque instant, on connaît la distribution des densités de fluorescence cellulaire dans la population de cellules. Et le suivi des lignées individuelles permet de travailler sur une population de cellules saines: les individus malades ou morts qui ne se divisent pas, sont écartés. En réduisant ainsi les phénomènes cellulaires en jeux, on réduit le nombre de paramètres. Les sources de bruit sont moins nombreuses, et il est plus facile de comprendre les mécanismes en jeux. Les informations de lignage cellulaire permettent aussi d'étudier la variabilité introduite par la phase du cycle cellulaire: les événements de division cellulaire peut être artificiellement synchronisés. Le bruit est alors étudié sur une population en phase lors de la division. Cette étude montre que le bruit sondé n'est pas dominé par les différences dans la phase du cycle cellulaire. On peut donc modéliser nos cellules sans tenir compte des différences introduites par le cycle cellulaire. Le modèle testé est simplifié aux étapes de transcription-traduction-maturation. Les paramètres du modèle sont inférés de nos données expérimentales, et le modèle est testé à travers des simulations.

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Escherichia coli O157:H7 est le sérotype le plus souvent incriminé lors de toxi-infection alimentaire par les E. coli entérohémorragiques (EHEC). Il peut être associé, dans les cas les plus graves, à des colites hémorragiques mortelles et au syndrome hémolytique et urémique (SHU), touchant essentiellement les jeunes enfants. Le vecteur alimentaire le plus courant lors de ces contaminations est le boeuf haché. L’étape primaire de la contamination bactérienne se situe lors de l'abattage où les bactéries peuvent être transférées de la peau à la carcasse. Une gaine conjonctive entoure les muscles, sa composition protéique, similaire à la matrice extracellulaire (ECM), pourrait jouer un rôle dans l'adhésion bactérienne. Dans un premier temps, l’étude de l'adhésion et de la colonisation des bactéries aux protéines majeures de l’ECM musculaire, a révélé une forte influence des conditions de croissances sur l’adhésion, l'adhésion étant maximale à 25°C et pH7, en particulier aux collagènes I et III. Chez les EHEC, diverses protéines de surfaces peuvent être potentiellement impliquées dans l’adhésion à l’ECM. Le rôle d'un autotransporteur, l'antigène 43 (Ag43), dans l'autoagrégation, l'adhésion et la formation de biofilm, a été établit chez E. coli O157:H7 EDL933. Par la suite, les interactions entre E. coli O157:H7 et la viande ont été étudiées sur deux muscles modèles de types métabolique et contractile opposés (Soleus oxidatif lent et EDL, glycolytique rapide), caractérisés par microspectroscopie de fluorescence UV couplée au rayonnement synchrotron. Les différents types de fibres musculaires ainsi que l’effet d’une anoxie prolongée simulant la maturation des viandes ont été discriminés par leurs réponses spectrales après une excitation à 275 nm. Un tropisme bactérien plus élevé pour le muscle soleus que pour le muscle EDL a été clairement observé. Bien qu'E. coli O157:H7 adhère de manière similaire aux différents types de fibres musculaires, l'adhésion des bactéries se fait essentiellement au niveau de l'ECM, mettant en évidence le rôle clé de l'ECM et du tissu conjonctif musculaire dans l’adhésion des E. coli O157:H7 à la viande. Ces travaux de recherche sur l’adhésion bactérienne aux muscles squelettiques aux niveaux moléculaires, cellulaires et tissulaires fournissent les premières connaissances sur la physiologie des EHEC lors de la contamination de la viande et constituent un pré-requis indispensable au développement de pratiques et de stratégies innovantes afin de réduire le risque de contamination des viandes. / Escherichia coli O157:H7 is the most prevalent serotype involved in foodborne infection by enterohemorrhagic E. coli (EHEC). It is associated with life-threatening hemorrhagic colitis and the hemolyticuremic syndrome (HUS), which essentially affect young children. The major food vector of EHEC contamination is ground beef. The primary bacterial contamination occurs during the slaughter, essentially at dehiding stage where bacteria can be transferred from hides to carcasses. The connective tissue surrounding the muscle, highly similar to extracellular matrix (ECM) could potentially be a support for bacterial adhesion. When investigating the adhesion and colonization to the main muscle fibrous ECM proteins, the great influence of growth conditions on subsequent bacterial attachment was shown. Maximal adhesion to ECM proteins occurred at 25°C and pH 7, especially to collagens I and III. In EHEC, various surface-exposed protein determinants can be expressed and potentially involved in ECM adhesion. Investigating the autoaggregation, bacterial adhesion and biofilm formation, the involvement of Antigen 43 (Ag43), an autotransporter protein, was demonstrated in E. coli O157:H7 EDL933. Then, the attachment of E. coli O157:H7 to the meat was determined on two different model muscles, with different contractile and metabolic characteristic (Soleus oxidative, slow and EDL glycolytic, fast), previously characterized by UV microspectroscopy coupled to synchrotron radiation fluorescence. The different of muscle fiber types and the effect of a prolonged anoxia simulating maturing meat were discriminated by their spectral responses after excitation at 275 nm. It clearly appeared that bacteria displayed differential tropism as function of the muscle types, higher for the Soleus than the EDL muscles. While E. coli O157:H7 adhered similarly to the different types of muscle fibers, bacterial adherence essentially occurred at the ECM, pinpointing the key role of connective tissue for E. coli O157:H7 adhesion to meat. This first comprehensive investigation of bacterial adhesion to skeletal muscles at molecular, cellular and tissue levels provides new insight in the physiology of the colonization of meat by EHEC and constitutes a prerequisite for the development of innovative practices and strategies to minimize the risk of meat contamination.

Nous nous proposons d'étudier la gestion du bruit stochastique d'expression génique. On s'intéresse plus particulièrement à la dynamique du bruit lors de la réponse cellulaire. Comment évolue le bruit? Quels sont les mécanismes en jeux? Quelle est l'importance du bruit dans le fonctionnement cellulaire? Pour répondre à ces questions, nous nous appuyons sur le réseau de régulation génétique qui gère la réponse au stress nutritionnel chez E. Coli. L'étude du comportement dynamique de ce réseau, au niveau d'une population de bactéries, a été initiée et est portée par la forte collaboration de deux équipes de la région : une de bio-informaticiens (l'équipe de Hidde de Jong de l'INRIA Rhône-Alpes) et la deuxième de biologistes (l'équipe de Hans Geiselmann, Laboratoire d'Adaptation et Pathogénie des Micro-organismes). En profitant donc de l'expérience et de la compréhension acquise par ces équipes, nous étudions les réponses individuelles de chaque bactérie lors de la transition entre état de stress nutritionnel, et état de croissance exponentielle. Le bruit d'expression génique est quantifié dans des nœuds clés du réseau de régulation. Pour ce faire, les bactéries sont suivies individuellement par microscopie de fluorescence sur plusieurs générations. Les données de fluorescence collectées sur cellules uniques permettent d'étudier la variabilité inter-cellulaire. Cette variabilité est quantifiée tout le long de la réponse: à chaque instant, on connaît la distribution des densités de fluorescence cellulaire dans la population de cellules. Et le suivi des lignées individuelles permet de travailler sur une population de cellules saines: les individus malades ou morts qui ne se divisent pas, sont écartés. En réduisant ainsi les phénomènes cellulaires en jeux, on réduit le nombre de paramètres. Les sources de bruit sont moins nombreuses, et il est plus facile de comprendre les mécanismes en jeux. Les informations de lignage cellulaire permettent aussi d'étudier la variabilité introduite par la phase du cycle cellulaire: les événements de division cellulaire peut être artificiellement synchronisés. Le bruit est alors étudié sur une population en phase lors de la division. Cette étude montre que le bruit sondé n'est pas dominé par les différences dans la phase du cycle cellulaire. On peut donc modéliser nos cellules sans tenir compte des différences introduites par le cycle cellulaire. Le modèle testé est simplifié aux étapes de transcription-traduction-maturation. Les paramètres du modèle sont inférés de nos données expérimentales, et le modèle est testé à travers des simulations. / We aim to investigate the management of the stochastic noise in gene expression and more precisely the study of noise in dynamical cellular responses. How the noise varies following a perturbation? What mechanisms are at play? How important is noise in the cellular function? To answer these questions, we are interested in the genetic regulatory network that handles the nutritional stress response in E. Coli. The noise of gene expression is quantified in a key node of the network control. For that bacteria are followed individually by fluorescence and phase contrast microscopy over several generations. This variability between cells is quantified throughout the response to the nutritional perturbation: at every moment, we know the density distribution of cellular fluorescence in the cell population. And monitoring of individual lines allows us to take into account only the population of healthy cells: individuals that do not divide neither grow, are discarded. Thereby reducing other sources of variability (e.g. cellular phenomena) we reduce the number of parameters. Noise sources are less numerous, and it is easier to understand the mechanisms at play. Also the information on cell lineage allow to study the variability introduced by the phase of the cell cycle: the events of cell division can be artificially synchronized. This study shows that the noise sounded is not dominated by differences in the phase of the cell cycle. We can therefore model our cells regardless of the differences introduced by the cell cycle. The tested model is simplified to the steps of transcription-translation-maturation. The model parameters are inferred from our experimental data and the model is tested through simulations.

Dans les génomes bactériens, les fréquents transferts horizontaux de gènes (HGT) introduisent des innovations génomiques qui peuvent entraîner la diversification des populations bactériennes. À l'inverse, la recombinaison homologue (RH) au sein des populations homogénéise leurs génotypes, et ainsi renforce leur cohésion. Ces processus d'échange génétique, et la fréquence à laquelle ils interviennent au sein et entre les populations, doivent avoir un grand impact sur la cladogénèse bactérienne. Au-delà de la configuration des échanges qui se sont réellement produits entre les bactéries, les traces de RH et de HGT que nous observons dans leurs génomes reflètent les événements qui ont été fixés tout au long de leur histoire. Ce processus de fixation peut être biaisé en ce qui concerne la nature des gènes ou allèles qui ont été introduits. La sélection naturelle peut notamment conduire à la fixation des gènes transférés qui apportent de nouvelles adaptations écologiques. En outre, des biais mécaniques dans le processus de recombinaison lui-même peuvent conduire à la fixation d'allèles non-adaptatifs. Nous avons cherché à caractériser certains de ces processus adaptatifs et non-adaptatifs qui façonnent les génomes bactériens. À cette fin, plusieurs aspects de l'évolution des génomes, comme les variations de leurs répertoires de gènes, de leur architecture et de leur composition en nucléotides ont été examinés à la lumière de leur histoire de transfert et de recombinaison / In bacterial genomes, the frequent horizontal gene transfers (HGT) introduce genomic novelties that can promote the diversification of bacterial populations. In opposition, homologous recombination (HR) within populations homogenizes their genotypes, enforcing their cohesion. These processes of genetic exchange, and their patterns of occurrence among and within lineages, must have a great impact on bacterial cladogenesis. Beyond the pattern of exchanges actually occurring between bacteria, the traces of HR and HGT we observe in their genomes reflect what events were fixed throughout their history. This fixation process can be biased regarding the nature of genes or alleles that were introduced. Notably, natural selection can drive the fixation of transferred genes that bring new ecological adaptations. In addition, some mechanical biases in the recombination process itself may lead to the fixation of non-adaptive alleles. We aimed to characterize such adaptive and non-adaptive processes that are shaping bacterial genomes. To this end, several aspects of genome evolution, such as variations of their gene repertoires, of their architecture and of their nucleotide composition were examined in the light of their history of transfer and recombination

Together with the current antibiotic resistance crisis, bacterial persistence appears to play an increasingly important role in the frequent failure of antibiotic treatments. Persister cells are rare bacteria that transiently become drug tolerant, allowing them to survive lethal concentrations of bactericidal antibiotics. Upon antibiotic removal, persister cells are able to resume growth and give rise to a new bacterial population as sensitive to the antibiotic as the original population. Interest in persister cells seriously increased in the past few years as these phenotypic variants were shown to be involved in the recalcitrance of chronic infections, such as tuberculosis and pneumonia and in the well-known biofilm tolerance to antibiotics. Persistence has therefore been extensively studied throughout the last decade, which led to the discovery of large variety of different molecular mechanisms involved in persisters formation. However, the specific physiology of bacterial persisters remains elusive up to now, mainly because of the transient nature and the low frequencies of persister cells in growing bacterial cultures. This work aims to gain a better understanding of the physiology of Escherichia coli persisters by combining population analyses with single-cell observations.In the first part of this thesis, we developed an experimental method allowing for measuring persistence with increased reproducibility. The method was further refined, which allowed us to observe four distinct phases in the ofloxacin time-kill curve, suggesting the existence of a tolerance continuum at the population level at treatment time. Characterization of these four phases notably revealed that the growth rate and the intrinsic antibiotic susceptibility of the strain define the number of surviving cells at the onset of the persistence phase, while persister cells survival mainly relies on active stress responses (SOS and stringent responses in particular).We next investigated the molecular mechanisms underlying the well-known correlation between persistence and the growth rate. Interestingly, we showed that the growth rate determines the number of survival cells at the onset of the persistent phase, whereas it does not affect the death rate of persister cells during antibiotic treatment. Furthermore, slow growth was shown to influence survival to ofloxacin independently of the replication rate, thereby suggesting that target inactivation solely cannot explain this correlation. However, our preliminary data indicate that ppGpp induction upon ofloxacin exposure substantially increases in slow growing bacterial populations, supporting a model in which slow growth would allow bacteria to respond faster to the antibiotic treatment, thereby generating more persisters than fast growing bacterial populations.Finally, both population and single-cell analyses were performed to assess the influence of the SOS response on persistence to ofloxacin. Firstly, population analyses revealed that the SOS response is required for survival of both sensitive and persister cells, but only during recovery, after ofloxacin removal, presumably allowing cells to induce SOS-dependent DNA repair pathways, required to deal with the accumulated ofloxacin-induced DNA lesions. The SOS response therefore appears as a good target for anti-persisters strategies, as shown by the 100-fold decrease in persistence upon co-treatment of a bacterial population with an SOS-inhibitor and ofloxacin. Secondly, single-cell analyses revealed that persister cells sustain similar DNA damages than sensitive cells upon ofloxacin treatment and induce SulA- and SOS-independent filamentation upon antibiotic removal, probably reflecting the presence of remaining cleaved complexes, formed during ofloxacin exposure. Importantly, we showed filamentation to occur in persister cells upon ampicillin treatment as well, thereby suggesting these filaments to be part of a more general survival pathway, which molecular basis remains unknown. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les vasières intertidales sont le siège d’une forte production primaire sous la forme d’un biofilmmicrophytobenthique qui se développe en surface à marée basse. Ce biofilm se compose principalement de diatomées et de bactéries hétérotrophes. Ces deux composantes sécrètent des substances polymériques extracellulaires (EPS) qui jouent différents rôles dans le biofilm. Le travail présenté s’est basé sur différentes échelles d’observation (in situ à 2 saisons, mésocosme en laboratoire, et échelle fine du biofilm en microscopie confocale) et a permis de mettre en évidence les interactions des diatomées et des bactéries à différents moments de la marée et du nycthémère. L’utilisation d’une nouvelle méthode d’extraction des EPS a permis d’éclaircir leur rôle en évitant les contaminations par les substances internes provoquées par les méthodes classiques. Les EPS colloïdales particulièrement riches en glucose s’associent au déplacement des diatomées, notamment lors d’un stress (sursalure, carence en nutriments) et sont préférentiellement consommées par les bactéries, après leur dégradation par les enzymes ou leur hydrolyse dans l’eau interstitielle. Les EPS liées au frustule, et plus particulièrement les sucres, inhiberaient le développement bactérien à proximité de la cellule algale. Elles sont surtout sécrétées lors de la mise en place du biofilm et pour protéger la cellule quand les conditions sont osmotiquement défavorables et leur richesse en protéine leur confère un potentiel intéressant pour les bactéries qui peuvent les utiliser comme substrat azoté en cas de carence. D’autres substances ont été plutôt sécrétées parles bactéries telles que les N-acétylglucosamines et les protéines colloïdales de bas poids moléculaire,certainement des enzymes bactériennes, ainsi que le glucose qui semble être associé au EPS colloïdaux des diatomées mais aussi aux EPS bactériens selon l’analyse en microscopie confocale en utilisant des lectines comme marqueurs d’EPS. / Microphytobenthic biofilms that develop at the intertidal mudflat surface are responsible of a substantialprimary production. These biofilms are composed of diatoms and heterotrophic bacteria, both excretingextracellular polymeric substances (EPS) that have various functions into the biofilm. The present thesis is basedon different observation scales that have highlighted the complex interactions between diatoms and bacteria fordifferent moment of the biofilm development (in situ at 2 seasons, in laboratory mesocosm and at the scale of thebiofilm at confocal microscopy). Furthermore, a new extraction method that avoids contamination with internalsubstances was used and provides new insights about the role of EPS. Colloidal EPS are excreted during thediatom migrations, notably in case of environmental stress (nutrient depletion, high salinity). They arepreferentially consumed by bacteria, after hydrolysis or enzymatic cleavage. Bound EPS are associated to abacterial inhibition, especially sugars. These EPS are mainly excreted during biofilm formation and also in caseof osmotic stress, if diatoms cannot migrate toward favorable slices. Some substances are associated to bacterialdevelopment, such as N-acetylglucosamine, low molecular weight proteins that probably consist of bacterialenzymes and also glucose that seems to be associated to colloidal EPS secreted by diatoms as well as bacterialEPS, when analyzing the biofilm with confocal microscopy by using lectins as EPS biomarkers.