En réanimation, les facteurs de risque d’infection à bactéries résistantes sont nombreux et il est nécessaire d’instaurer une antibiothérapie rapide et adéquate. Cela conduit donc souvent au choix empirique d’antibiotiques à large spectre. Ce travail de thèse regroupant quatre études porte sur les éléments de ce choix. Dans la première étude, les critères de "pneumopathie associée aux soins" sont discutés. Dans la seconde, il est rapporté que le traitement antibiotique prescrit au début du séjour en réanimation est associé à l’acquisition de Pseudomonas aeruginosa. Dans le diagnostic d’une pneumopathie acquise sous ventilation, la troisième étude décrit une technique rapide d’antibiogramme permettant une désescalade antibiotique plus précoce. La néphrotoxicité des aminoglycosides dans le traitement empirique des patients en sepsis sévère est présentée dans la dernière étude. Ces travaux participent à la bonne gestion des antibiotiques à la phase empirique du traitement des infections sévères en réanimation. / Intensive care units (ICU) are a niche for risk factors of infection due to multidrug resistant bacteria. ICU patients are in a need for a rapid and adequate antibiotic therapy. This leads ICU physicians to use empirical broad spectrum antibiotics. This thesis comprises four studies which focus on the empirical step of the treatment. In the first study, the criteria for "health-care-associated pneumonia" are discussed. The second shows that the antibiotic selection pressure administered early during the ICU stay could lead to Pseudomonas aeruginosa acquisition. In the third study, a rapid direct specimen testing method was assessed for ventilator-associated pneumonia diagnosis in order to hasten antibiotic de-escalation. Finally, a review on aminoglycosides’ nephrotoxicity in the severe sepsis setting represents the fourth study. These studies bring a loop forward into the understanding of the antibiotic stewardship of patients with severe sepsis, with particular focus on the empirical antibiotic treatment.

La transformation naturelle bactérienne permet aux micro-organismes d'échanger des informations génétiques pour promouvoir leurs réponses adaptatives pour faire face aux changements environnementaux. De l'ADN extracellulaire est incorporé et recombiné au génome de l'hôte. Ce processus augmente la plasticité des bactéries. Chez S. pneumoniae, un pathogène majeur chez l'Homme engendrant des infections pouvant être mortelles, la transformation bactérienne accentue la transmission de gènes de résistance aux antibiotiques. Chez les bactéries à Gram positif, l'opéron comF encode l'expression de deux protéines. L'une est démontrée comme étant essentielle à la transformation, est décrite pour être membranaire. La seconde n'a pas été étudiée. Cependant ces protéines n'ont pas été étudiées d'un point de vue structural ou fonctionnel. Des mutagenèse et le double hybride bactérien ont permis de mettre en évidence que ses protéines sont indispensables pour l'expression de la compétence et interagissent avec de nombreuses protéines du transformasome. De plus, l'expression des deux protéines de manière hétérologue prouve qu'elles sont solubles et forment des oligomères. L'analyse structurale de ComFA, atteste de la conformation atypique de cette helicase trimerique et hexamerique. En outre, l'activité ATPasique simple brin DNA-dépendant de cette protéine est démontrée. Finalement un complexe protéique a été révélé entre ComFA et ComFC dont l'étude microscopique à hautes résolutions prouve l'apparition d'un anneau via l'assemblage de deux hexamères. Ces résultats suggèrent que ComFA est le moteur tirant l'ADN dans la cellule. Quant à ComFC, elle semble aider à la stabilisation de ComFA. / Bacterial natural transformation allows microorganisms to exchange genetic information to promote their adaptive responses to cope with environmental changes. The extracellular DNA is incorporated and recombined with the genome of the host. This phenomenon increases the plasticity of Gram positive and negative bacteria. S. pneumoniae is a major pathogen for humans, which is causing infections that can be deadly. In this specie, bacterial transformation increases the transmission of antibiotic resistance.In Gram-positive bacteria, comF operon encodes the expression of two proteins. One of them, shown to be essential for natural transformation, is expected to be a membrane protein. The second is not described. However, up to now neither protein has been studied from a structural or functional point of view. Mutagenesis technique and double hybrid bacterial assay allowed to show that both proteins are essential for the expression of the competence and interact with many proteins of the transformasome. In addition, heterologous expresion of both proteins have shown their solubility and the formation of oligomers. Structural analysis of ComFA demonstrates the unique conformation of this hexameric and trimeric helicase. Furthermore, the ATPase single stranded DNA-dependent activity of this protein could be detected. Finally, a protein complex is formed between ComFA and ComF, and high-resolution microscopic study proves the occurrence of a ring via a two-hexamers. These results suggest that ComFA is the engine pulling the DNA in the cell. As for ComFC, this protein seems to help stabilizing of ComFA.

L’émergence des bactéries photosynthétiques oxygéniques (BPO), ou cyanobactéries, est probablement l’évènement le plus important de l’histoire de la Terre, depuis l’apparition de la vie elle-même. Par la libération d’O2 dans l’environnement, les BPO ont conduit à l’oxygénation de notre planète, jusqu’alors anoxique, et au développement de la vie complexe. Cependant, cette évolution n’est toujours pas datée. Dans cette étude, j’ai cherché à identifier des signatures chimiques spécifiques aux BPO, in situ à l’échelle du μm, dans des tapis microbien fossiles datant de 3,45 à 1,88 Ga, recouvrant ainsi une période allant de la Terre anoxique à la Terre oxygénée après le « Great Oxidation Event » (GOE). Nous avons utilisé la microscopie optique, la spectroscopie Raman, le MEB/EDX, l’EPMA, la μ-XRF à rayonnement synchrotron (SR-XRF), et des analyses isotopiques. Une nouvelle méthode de quantification élémentaire pour SR-XRF, ainsi qu’une nouvelle méthodologie de préparation d’échantillons ont été developpés. Les résultats obtenus par EPMA et μ-XRF montrent que, dans certains contextes de déposition, un enrichissement en lanthanides (par exemple La, Sm, Gd) de cellules fossiles, et un enrichissement en Cu de pyrites diagénétiques formées en association avec des BPO, pourraient représenter des signatures chimiques spécifiques aux BPO. Suite à ces résultats, je propose que les BPO ont évolué entre 3,33 et 2,98 Ga. Je propose que les techniques élémentaires telles que l’EPMA et la μ-XRF sont les techniques les plus appropriées pour trouver des signatures chimiques spécifiques aux BPO et contraindre leur émergence dans le temps. / The evolution of oxygenic photosynthetic bacteria (OPB) is probably the most important biological event of Earth’s history since the emergence of life itself. The release of their by-product O2 in the environment, which was globally anoxic, fundamentally changed the face of the Earth and led to the development of complex life. However, the specific timing of this evolutionary step remains unclear. This study is based on the search for in situ chemical signatures of OPB at the microbial (μm) scale, within fossilized microbial photosynthetic mats in Archean and Paleoproterozoic sediments dated between 3.45 Ga and 1.88 Ga, i.e. spanning the anoxic Earth to the aftermath of the GOE. We used optical microscopy, Raman spectroscopy, SEM/EDS, EPMA, synchrotron radiation μ-XRF, and isotope analytical techniques. The μXRF results were improved by the use of a new sample preparation method and a new quantification method, both developed during this study.Results obtained by EPMA and μXRF show that, under certain depositional contexts, enrichment in lanthanides (such as Sm, La and Gd) in individual OPB cells, as well as a Cu enrichment in diagenetic pyrites formed in association with OPB, may represent chemical signatures of OPB. I propose that OPB evolved sometime between 3.33 Ga and 2.98 Ga. Also, I argue that elemental techniques such as EPMA and μ-XRF are the most suitable techniques to find chemical signatures of OPB and constrain the timing of their emergence.

Cette thèse s'est attachée à décrire le concept dynamique d'une activité microbiologique viable et durable en conditions de stockage géologique profond et à évaluer son impact sur les propriétés de confinement et les composants du stockage. Ainsi, dans cette étude, un modèle bactérien basé sur la ferriréduction a été choisi pour ses critères de viabilité dans le système et sa capacité à altérer les matériaux dans les conditions du stockage. Les principaux résultats de ce travail de thèse ont permis de démontrer la capacité du milieu à supporter l'activité bactérienne ferriréductrice et les conditions de son développement dans les environnements argileux profonds. Il a été clairement montré la biodisponibilité du Fe(III) structural des matériaux argileux et des oxydes de fer produits lors des processus de corrosion métallique. Dans ce système, la corrosion paraît être un facteur positif pour les activités bactériennes notamment en produisant une source énergétique, l'hydrogène. Les activités bactériennes ferriréductrices peuvent entraîner une reprise de la corrosion métallique via la consommation des oxydes de fer de la couche passivante. La conséquence directe pourrait être une diminution de la durée de vie des enveloppes métalliques de colisage. Dans le cas des matériaux argileux ferrifères, les conséquences d'une telle activité sont telles qu'elles peuvent avoir un impact sur l'ensemble de l'édifice poreux que ce soit en termes de réactivité chimique des matériaux ou de comportement physique de la barrière argileuse. Un des résultats les plus marquants est la cristallisation de nouvelles phases argileuses à des températures très basses, inférieures à 40°C, témoignant de l'influence considérable de l'activité microbienne anaérobie dans les transformations minéralogiques des minéraux argileux. De plus, il faut noter que ces expériences ont permis de visualiser pour la première fois un mécanisme de respiration bactérienne à distance via une extension de la disponibilité d'éléments essentiels, ici le Fe3+. En conclusion, ces résultats ont clairement démontré l'impact du facteur microbiologique sur la réactivité des matériaux argileux et métalliques tout en s'appuyant sur des paramètres de contrôle de l'activité bactérienne. La pertinence de la prise en compte de ces activités microbiologiques dans le cas des évaluations de sûreté d'un stockage est ainsi établie. / This thesis sought to describe the dynamic concept of a viable and sustainable microbiological activity under deep geological disposal conditions and to assess its impact on containment properties and storage components. Thus, in this study, a model based on the bacterial ferric reduction was chosen for its sustainability criteria in the system and its ability to alter the materials in storage conditions. The main results of this work demonstrated the capability of the environment to stand the iron-reducing bacterial activity and the conditions of its development in the deep clay environments. The bio-availability of structural Fe (III) in clay minerals and iron oxides produced during the process of metal corrosion was clearly demonstrated. In this system, the corrosion appears to be a positive factor on bacterial activities by producing an energy source, hydrogen. The iron-reducing bacterial activities can lead to a resumption of metallic corrosion through the consumption of iron oxides in the passive film. The direct consequence would be a reduction of the lifetime of metal containers. In the case of ferric clay minerals, the consequences of such an activity are such that they can have an impact on the overall porous structure both in terms of chemical reactivity of the materials or physical behavior of the clayey barrier. One of the most significant results is the crystallization of new clay phases at very low temperatures, below 40°C, highlighting the influence of the anaerobic microbial activity in the mineralogical transformations of clay minerals. Furthermore, these experiments also allowed to visualize, for the first time, a mechanism of bacterial respiration at distance, this increases the field of the availability of essential elements as Fe3+ for bacterial growth in extreme environment. In conclusion, these results clearly showed the impact of the microbiological factor on the reactivity of clay and metal minerals, while relying on control parameters on bacterial activity. The relevance of taking into account these microbiological activities in the case of safety assessments of a repository is then established.

Depuis quelques années, des Toxi-Infections Alimentaires Collectives causées par la contamination de produits frais, comme les laitues, par des bactéries pathogènes entériques (Salmonella, Escherichia coli productrice de shigatoxines -ou STEC-) apparaissent de plus en plus nombreuses. La présence de ces bactéries dans cet environnement inhabituel est un risque sanitaire émergent majeur, d'autant plus que les bactéries entériques, pathogènes ou non, présentent fréquemment des résistances aux antibiotiques. Afin d’étudier la persistance des bactéries antibiorésistantes ou pathogènes sur des laitues, la caractérisation de plasmides de résistance portés par des souches de E. coli issues d’environnements aquatiques contaminés a été réalisé pour, par la suite, étudier leur implication potentielle dans l’adhésion des souches-hôtes sur différentes variétés de laitues. L’étude de la survie et de l’adhésion de souches de E. coli environnementales et de laboratoire, transformées avec les plasmides d’intérêt, sur de jeunes plants de laitues a permis de mettre en évidence trois points : 1) plus le temps de contact entre bactéries et feuilles augmente et moins la survie bactérienne est importante ; 2) il existe une différence de survie et d’adhésion selon les variétés de laitues étudiées ; 3) il existe une différence de survie et d’adhésion entre les souches de laboratoire et les souches environnementales, ces dernières étant en meilleur état métabolique et montrant une adhésion plus importante durant les 11-12 jours d’expérimentation. Après ces constatations de persistance des E. coli antibiorésistantes en conditions contrôlées, des études en champs sur 4 exploitations maraîchères normandes, possédant des itinéraires techniques différents, ont été réalisées. La recherche de pathogènes entériques, Salmonella et STEC, a été effectuée sur les laitues et une recherche de E. coli, témoin de contamination fécale, a été réalisée sur les laitues ainsi que dans l’eau d’irrigation d’un des sites. Les résultats révèlent une qualité microbiologique satisfaisante des parcelles étudiées (selon l’arrêté européen N°2073/2005) bien que des E. coli aient été régulièrement retrouvées au niveau des laitues, dont certaines antibiorésistantes. L’analyse de l’eau d’irrigation a montré la présence continue de E. coli, dont des souches présentant des profils d’antibiorésistance communs à ceux retrouvés sur les laitues, montrant que l’eau d’irrigation est l’une des sources critiques de contamination des végétaux en champs. / In recent years, foodborne diseases caused by fresh products contaminated, such as lettuce, with enteric pathogenic bacteria (Salmonella, Shigatoxin-producing Escherichia coli-or STEC-) increasingly. The presence of these bacteria in this unusual environment is a major emerging health risk, especially since enteric bacteria, whether pathogenic or not, are frequently resistant to antibiotics. To study the persistence of antibiotic-resistant or pathogenic bacteria on lettuce, the characterization of resistance plasmids carried by E. coli strains from contaminated aquatic environments was carried out in order to study their potential involvement in adhesion of host strains on different varieties of lettuce. The study of the survival and adhesion of environmental and laboratory E. coli strains, transformed with the plasmids of interest, on young lettuce plants allowed to highlight three points: 1) more time contact between bacteria and leaves increases and less bacterial survival is important; 2) there is a difference in survival and adhesion depending on the varieties of lettuce studied; 3) there is a difference in survival and adhesion between laboratory strains and environmental strains, the latter being in better metabolic state and showing greater adhesion during the 11-12 days of experimentation. After the persistence of antibiotic-resistant E. coli strains under controlled conditions, field studies on 4 Normandy vegetable farms, with different technical itineraries, were carried out. The search for enteric pathogens, Salmonella and STEC, was carried out on lettuce and a search for E. coli, a control of fecal contamination, was realized on the lettuce as well as in the irrigation water of one of the sites. The results reveal a satisfactory microbiological quality of the agricultural plots studied (according to the European decree N ° 2073/2005) although E. coli strains were regularly found at the lettuce level, including some antibiotic resistant. Analysis of the irrigation water showed the continued presence of E. coli strains, including strains with common antimicrobial resistance profiles to those found on lettuce, showing that irrigation water is one of the critical sources of plant contamination in the field.

Les Streptomyces sont des bactéries de la rhizosphère qui contribuent à la fertilité des sols (recyclage de la matière organique), et à la croissance et la santé des plantes. Elles possèdent parmi les plus grands génomes bactériens (12 Mb) et présentent une variabilité génétique importante. Cette variabilité connue au niveau interspécifique n’a jamais été abordée à l’échelle de la population, c’est-à-dire entre individus sympatriques appartenant à la même espèce (souches sœurs) au sein de la même niche écologique. L’objectif de ce travail est de rechercher cette diversité dans les populations de l’écosystème sol forestier, d’approcher sa dynamique et son rôle fonctionnel. Après séquençage et comparaison des génomes complets, nous avons observé une grande diversité génomique en termes de taille, de présence/absence d’éléments extrachromosomiques, mais également en terme de présence/absence de gènes le long du chromosome. Un grand nombre d’événements d’insertions et délétions (indels) comprenant de 1 à 241 gènes différencient les individus de la population. Au vu des liens phylogénétiques étroits entre les individus, l’ancêtre commun de la population est récent, aussi la diversité génomique résulterait d’un flux massif et rapide de gènes. La forte prévalence d’éléments conjugatifs intégrés dans la population suggère que la conjugaison est le moteur prépondérant de cette diversité génomique. La production différentielle de métabolites spécialisés (antibiotiques) a également été utilisée pour estimer l’impact de la diversité génétique sur le fonctionnement de la population. Nous avons pu montrer que cette production était liée à des gènes spécifiques de souches et qu’elle pouvait constituer un bien commun pour la population. Nous proposons que l’évolution rapide du génome participe au maintien des mécanismes de cohésion sociale chez ces bactéries du sol. / Streptomyces are rhizospheric bacteria that contribute to soil fertility (recycling of organic matter), plant growth and health. They have among the largest bacterial genomes (12 Mb) with a high genetic variability. The genome variability, observed at the interspecific level has never been addressed within a population, i.e. between sympatric individuals belonging to the same species (Conspecific strains) within the same ecological niche. The objective of this work was to investigate this diversity in the forest soil ecosystem, to estimate its dynamics and its potential functional roles. After sequencing and comparison of the complete genomes, we observed a wide genomic diversity in terms of size, presence/absence of extrachromosomal elements, but also in terms of presence/absence of genes along the chromosome. A large number of insertion and deletion events (indels) from 1 to 241 genes differentiate individuals in the population. Given the close phylogenetic relationship of these strains, the common ancestor of the population is recent, hence the genomic diversity would result from a massive and rapid gene flux. The high prevalence of integrative and conjugative elements in the population suggests that conjugation could act as a driving force of this diversity. Differential production of specialized metabolites (antibiotics) was also used to estimate the impact of genetic diversity on population’s ecology. We were able to show that this production was linked to strain specific genes and that it may constitute a « public good » for the population. We propose that the rapid evolution of the genome contributes to the maintenance of social cohesion mechanisms within these soil bacteria.

Chez les bactéries, l’undécaprényl-phosphate (C55-P) est utilisé comme transporteur lipidique de sous-unités glycanes à travers la membrane plasmique. Après la synthèse de son précurseur (C55-PP) par UppS, ce dernier doit être déphosphorylé. Le transfert final des sous-unités glycanes sur une molécule acceptrice du côté périplasmique libère également du C55-PP qui va être déphosphorylé pour être recyclé. Quatre C55-PP phosphatases membranaires ont été identifiées chez E. coli : trois enzymes appartenant à la famille des PAP2 (PgpB, YbjG et LpxT) et une protéine appartenant à une nouvelle famille de phosphatases (BacA). Au cours de cette étude, nous avons caractérisé les propriétés biochimiques et la topologie membranaire de BacA. Les conditions optimales de son activité (pH, détergent, cations, température) ont été déterminées et une étroite spécificité de substrats, avec une préférence pour le C55-PP, a été observée. Trois résidus essentiels à son activité, Glu21, Ser27 et Arg174, ont été identifiés par mutagénèse, nous permettant de proposer un mécanisme catalytique basé sur l’attaque nucléophile du C55-PP par un résidu sérine. La topologie membranaire de BacA, déterminée expérimentalement à l’aide de fusions de protéines, n’a validé aucun des modèles in silico précédemment proposés. Ainsi, BacA comprend 7 segments transmembranaires et présente deux larges boucles périplasmiques portant les résidus hautement conservés du site actif. Nos résultats démontrent que toutes les C55-PP phosphatases d’E. coli identifiées à ce jour (BacA et PAP2) catalysent la déphosphorylation du C55-PP du même côté de la membrane plasmique (côté périplasmique), nous interrogeant sur l’identité de l’enzyme catalysant la déphosphorylation du C55-PP synthétisé de novo. LpxT est une PAP2 qui possède une activité kinase assurant le transfert du phosphate β du C55-PP sur une molécule de lipide A, pour former du lipide A-1-PP. Nous avons cartographié par mutagénèse dirigée le site actif de LpxT et mis en évidence l’importance d’une triade catalytique caractéristique des PAP2 (His150, His190, Asp194) et d’autres résidus spécifiques à LpxT et ses proches homologues. L’activité de LpxT est inhibée par un petit peptide, PmrR, dont l’expression est sous contrôle du système à deux composants PmrA-PmrB. Notre étude a montré que cette inhibition intervenait via une interaction directe entre ces deux partenaires. Nous montrons que l’induction du système PmrA-PmrB conduit à une résistance à la polymyxine B (peptide antimicrobien cationique) et à une sensibilité au déoxycholate (composant majeur de la bile) et que la modification catalysée par LpxT produit un effet opposé. La résistance à la polymyxine B est corrélée à la force des signaux induisant le système PmrA-PmrB, mais également le système PhoP-PhoQ et nous avons clairement identifié les signaux nécessaires à cette résistance chez E. coli. / In bacteria, the undecaprenyl-phosphate (C55-P) is used as a lipid carrier of glycans subunits across the plasma membrane. After synthesis of its precursor (C55-PP) by UppS, this latter must be dephosphorylated. The transfer of the glycans subunit onto a final acceptor molecule at the periplasmic side also releases C55-PP that will be dephosphorylated to be recycled. Four C55-PP membrane phosphatases have been identified in E. coli : three enzymes belonging to the PAP2 family (PgpB, YbjG and LpxT) and a protein belonging to a new family of phosphatases (BacA).In this study, we characterized the biochemical properties and membrane topology of BacA. The optimal conditions for its activity (pH, detergent, cation, temperature) were determined and narrow substrate specificity, with a preference for the C55-PP, was observed. Three essential residues to its activity, Glu21, Ser27 and Arg174 were identified by mutagenesis, allowing us to propose a catalytic mechanism based on the nucleophilic attack of the C55-PP by a serine residue. The membrane topology of BacA determined experimentally using protein fusions did not validated previous in silico models. Thus, BacA has 7 transmembrane segments and contains in particular two large periplasmic loops carrying the highly-conserved active site residues. Our results demonstrate that all C55-PP phosphatases of E. coli identified to date (BacA and PAP2) catalyze the dephosphorylation of C55-PP on the same side of the plasma membrane (periplasmic side), questioning us about the identity of the enzyme catalyzing the dephosphorylation of C55-PP synthesized de novo. LpxT is a PAP2 enzyme with a specific kinase activity, transferring the β-phosphate group of C55-PP on a molecule of lipid A, to generate lipid A-1-PP. We mapped, by directed mutagenesis, the active site of LpxT and highlighted the importance of a catalytic triad characteristic to the PAP2 enzymes (His150, His190, Asp194) and other specific residues of LpxT and its closer homologues. The activity of LpxT is inhibited by a small membrane peptide, called PmrR, whose expression is under the control of the two-component system PmrA-PmrB. Our study showed that this inhibition occurred via a direct interaction between these two partners. We showed that the induction of PmrA-PmrB system leads to resistance to the polymyxin B (cationic antimicrobial peptide) and sensitivity to deoxycholate (component major bile) and that the modification catalyzed LpxT produces an opposite effect. The robustness of the resistance to the polymyxin B is connected to the force of the signals inducing PmrA-PmrB system, but also the system PhoP-PhoQ and we clearly identified the signals needed to this resistance in E. coli.

L’organisation mondiale de la santé estime que le choléra entraîne 100, 000 décès par an pour environ 4 millions de cas recensés, plaçant ainsi cette maladie comme un enjeu de santé publique majeur. Cette infection est causée par Vibrio cholerae, une bactérie à Gram négatif vivant en milieu aquatique. Face à cette agression, l’épithélium intestinal et les bactéries du microbiote agissent comme une barrière, en exprimant notamment des peptides antimicrobiens (PAM). V. cholerae, comme de nombreux pathogènes, montre une résistance accrue aux PAM. Malgré une avancée constante sur la compréhension des mécanismes de résistances bactériens aux PAM, de nombreuses inconnues demeurent, principalement en raison des techniques de mutagénèse aléatoire utilisées pour leur identification. L’objectif de cette étude est d’identifier de nouveaux mécanismes de résistance impliqués dans la résistance de V. cholerae aux PAM. Grâce à des expériences de séquençage par spectrométrie masse suivi d’études bio-informatiques, nous avons identifié les protéines OmpV et Lap comme des candidates intéressantes pour être impliquées dans la résistance de V. cholerae. Alors que la souche V. cholerae A1552 délétée du gène ompV (DompV) ne semble pas présenter de défaut de croissance ou de perméabilité, nos résultats ont montré une diminution des concentrations minimales inhibitrices en différents PAM tels que LL-37. Les tests fonctionnels semblent suggérer l’implication des vésicules de sécrétion dans le mécanisme de d’OmpV face à LL-37 chez V. cholerae. / According to the World Health Organization, cholera remains a significant health problem, causing 100,000 death per 4 millions infections per year. V. cholerae, the etiologic agent of cholera and a Gram-negative bacterium, is generally transmitted via contaminated food or water. During infection, the microbiota and intestinal epithelium acts as a barrier by producing antimicrobial peptides (AMP). Resistance to AMP has emerged as a virulence factor in pathogens and specifically in V. cholerae. As AMP are considered as novel molecular therapeutic agents, it is truly important to better understand strategies of resistance of V. cholerae. The aim of this study is to identify unknown mechanisms involved in V. cholerae resistance to AMP. For this purpose, after protein sequencing by mass spectrometry (MS-MS) and bioinformatics, we identified the OmpV porin, member of the outer membrane protein family and the Lap protease as new protein candidates for strategies of resistance. We characterized the V. cholerae A1552 strain deleted for ompV (DompV). We confirmed OmpV implication in AMP resistance by minimum inhibitory concentration and did not observed any differences in growth or permeability in the presence of AMP between the wild-type (wt) and the (DompV) strains. The work presented here suggest an implication of outer membrane vesicules in V. cholerae resistance mechanisms to some AMP as LL-37.

En ville, les parcs de stationnement couverts représentent un milieu confiné dans lequel s'accumule une pollution importante et complexe. Ils constituent également une source de pollution pour leurs abords puisqu'aucune obligation de traitement n'est imposée sur la qualité de l'air rejeté dans l'atmosphère par les systèmes de ventilation. Dans le cadre du traitement de l'air, l'utilisation d'un biofiltre végétalisé, faisant intervenir des bactéries et des plantes en association, constitue une solution innovante contribuant à l'amélioration de la qualité de l'air en ville en réduisant la dispersion de polluants gazeux dans l'atmosphère. Dans un contexte de « recherche et développement », l'objectif est de comprendre le fonctionnement biologique et physico-chimique du biofiltre dans le but d'en améliorer la maitrise opérationnelle. Le caractère innovant de l'étude porte sur le traitement d'importants volumes d'air viciés contenant de faibles concentrations de polluants, tels que les NOx et les COV (de l'ordre de 100 à 200 µg/m3), par un biofiltre planté d'épaisseur modeste. L'utilisation d'une unité pilote de biofiltration a permis d'évaluer l'influence de la présence de plante, ainsi que la nécessité d'un apport d'engrais, sur les capacités d'épuration d'un tel système. Afin d'optimiser les volumes d'air traités tout en limitant l'empreinte au sol des biofiltres végétalisés, la vitesse de passage de l'air a été augmentée et l'épaisseur de garnissage réduite. Le rôle des bactéries indigènes a été caractérisé par une étude fonctionnelle des communautés bactériennes impliquées dans la dégradation des NOx et des TEX d'une part, et par une étude quantitative et qualitative de la communauté bactérienne totale, en utilisant des approches de biologie moléculaire, telles que l'amplification par PCR en temps réel et le pyroséquençage à partir de l'ADN métagénomique / In town, underground car parks are confined spaces in witch large and complex pollution are accumulated. They are also a source of contamination of the external environment since the treatment of the air pumped out by ventilation system sis not regulated. In the framework of air treatment, using planted biofilter, combining bacteria and plants, is an innovative solution contributing to the improvement of urban air quality by reducing the dispersion of gaseous pollutants in the atmosphere. In a « research and development » context, the objective is to understand the biological and physico-chemical operation for improving operational control. This innovative study focuses on the treatment of high volumes of air containing a low concentrations of pollutants, such as NOx, VOCs (about 100 à 200 µg.m-3) through a thin planted biofilter. The use of a pilot-scale unit of biofiltration allowed to evaluate the influence of the plant, as well as the necessity of a fertilization, on the removal efficiency of such a system. In order to maximize the volumes of treated air while limiting the footprint of the planted biofilters, the superficial gas velocity has been increased and the thickness of the packing material decreased. The indigenous bacteria have been characterized by a functional study of the bacterial communities involved in the degradation of NOx and TEX on one part, and by a quantitative and qualitative study of the total bacterial community on the other part, by using molecular biology approaches, such a real-time PCR amplification, and pyrosequencing from metagenomic DNA. Results on pilot-scale unit have shown a removal efficiency greater than 97%, in all environmental conditions tested. Consequently, it seems possible to treat high volumes of air containing low concentrations of TEX through a thin planted biofilter. The presence of plants does not seem to have short-term impacts on the removal efficiency when a fertilizer promotes the nitrogen availability in the packing material. The evaluation of the global microbiological functioning showed the potential of microbial communities in the biodegradation of NOx and TEX in planted biofilters. The indigenous bacterial communities of the packing material and the mound of soil are rapidly able to adapt to the functioning conditions of such a system

L’usage excessif d’antibiotiques a provoqué l’émergence de résistance, constituant un problème sanitaire mondial. L’antibiotique triméthoprime (TMP) inhibe l’enzyme dihydrofolate réductase (FolA) des bactéries, interrompant la production d’un précurseur essentiel dans la synthèse des purines et empêchant ainsi la croissance bactérienne. Cependant, certaines bactéries produisent une seconde dihydrofolate réductase : une DfrB, appartenant à une famille d’enzymes hautement résistantes au TMP. Actuellement, dix membres de la famille DfrB ont été identifiés, qui partagent une identité de séquence élevée (74 – 98 %). Les enzymes DfrB sont constituées de domaines identiques de 78 acides aminés, de type ‘SH3-like’, qui s’homotétramérisent afin de former l’enzyme active. Les DfrB ne partagent aucune homologie de séquence ou de structure avec les FolA et aucun antibiotique n’a encore été développé pour contourner la résistance au TMP causée par les DfrB. Afin de mieux comprendre le domaine SH3-like, des homologues (DfrB-H) partageant 10 à 80 % d’identité avec la DfrB1 ont été identifiés et caractérisés. Ils possèdent une activité dihydrofolate réductase (Dfr) et confèrent de la résistance au TMP. De plus, afin de vérifier si les gènes dfrB se retrouvent dans divers environnements, une recherche dans une base de données métagénomiques a été entreprise, permettant de caractériser 10 nouvelles séquences homologues aux DfrB connues. En 2012, le groupe Pelletier a rapporté le premier inhibiteur spécifique d’une DfrB, et plusieurs autres depuis. Seule la DfrB1 a été caractérisée concernant son profil d’inhibition ainsi que sa thermostabilité inhabituelle. Ici, une méthode semi-automatisée sera développée pour caractériser les profils d’inhibition, de thermostabilité, de résistance au TMP et d’activité enzymatique de toutes les DfrB et des homologues identifiés, afin de les comparer à ceux de la DfrB1. Pour atteindre ces objectifs, des nouvelles méthodes à haut débit de détermination d’activité ainsi que des tests de concentration minimale inhibitrice (CMI) furent développés. Ces méthodes ont permis de déterminer que les profils de thermostabilité et d’inhibition de plusieurs DfrB et DfrB-H sont comparables aux profils de la DfrB1. De plus, le criblage de dizaines de composés potentiellement inhibiteurs a été effectué afin de poursuivre la recherche d’inhibiteurs spécifiques aux DfrB. En outre, nous signalons 10 nouvelles séquences homologues de DfrB qui confèrent une résistance élevée au TMP et possèdent une activité Dfr. La caractérisation de tous les membres DfrB et les homologues nous permettra d’acquérir une meilleure connaissance de leur mécanisme de résistance, de leur prévalence dans divers environnements et de soutenir notre développement de nouveaux inhibiteurs des DfrB. / The intensive usage of antibiotics has provoked the emergence of antibiotic resistance, causing a worldwide health issue. The antibiotic trimethoprim (TMP) targets the microbial dihydrofolate reductase enzyme (FolA), abrogating the production of an essential precursor in the synthesis of purines and thus preventing bacterial proliferation. However, some bacteria produce an additional dihydrofolate reductase: the highly TMP-resistant DfrB. Currently, ten DfrB family members have been identified, that share high sequence identity (74 – 98 %). DfrB enzymes consist of identical, 78 amino acid-long SH3-like domains, that homotetramerize to form the active enzyme. DfrB share no sequence or structural homology with FolA and no antibiotic has yet been developed to circumvent the TMP resistance caused by DfrB. In order to gain insight into the SH3-like domain of DfrB, homologues (DfrB-H) sharing 10 to 80 % identity with DfrB1 were identified and characterized, which displayed dihydrofolate reductase (Dfr) activity and conferred high TMP resistance. Also, to investigate if dfrB genes are identified in various environments, a metagenomic database search was undertaken to characterize ten new DfrB1 homologue sequences. In 2012, the Pelletier group reported the first specific inhibitor of a DfrB, and several others since. Only DfrB1 has been characterized regarding its inhibition profile as well as its unusual thermostability. Here, semi-automated methods will be developed to compare the inhibition, thermostability, TMP-resistance and enzymatic activity profiles of all DfrB and DfrB homologues to those of DfrB1. To address this objective, new high-throughput activity assays as well as Minimal Inhibitory Concentration (MIC) assays were developed. Using those methods, we determined that thermostability and inhibition profiles of several DfrB and DfrB-H were comparable to those of DfrB1. Also, a screen of several dozen potential inhibitory compounds was performed, to attempt to identify further specific DfrB inhibitors. In addition, we report 10 new DfrB homologues that confer high TMP resistance and possess Dfr activity. The characterization of all DfrB members and DfrB homologues will allow us to acquire greater knowledge on their antimicrobial resistance mechanism, their prevalence in different environments and support our development of new DfrB-specific inhibitors.