La bactérie pathogène, Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque), produit une sérinethréonine-kinase membranaire, StkP, et une tyrosine-kinase, CpsD, qui sont respectivement des régulateurs importants de la division cellulaire et de la synthèse de la capsule polysaccharidique. Ces observations ont été directement la base de mon projet de thèse. Au cours de mon étude, j'ai participé à la mise en évidence du mécanisme par lequel CpsD coordonne la synthèse de la capsule polysaccharidique avec le cycle cellulaire du pneumocoque, en contrôlant via son autophosphorylation la mobilité de la protéine ParB de la ségrégation du chromosome. Pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire sous jacent, j'ai caractérisé un nouveau partenaire de CpsD et de ParB appelé RocS. J'ai montré que cette protéine est indispensable pour la ségrégation du chromosome. J'ai ensuite identifié que CpsD et RocS constituent un nouveau mécanisme de protection du nucléoïde, qui était jusque-là inconnu chez le pneumocoque. D'autre part, j'ai contribué à la caractérisation du rôle des sousdomaines PASTA du domaine extracellulaire de StkP dans la régulation de l'épaisseur de la paroi cellulaire septale ainsi que dans le degré d'activation de StkP. Plus particulièrement j'ai mis en évidence que le quatrième sous-domaine PASTA de StkP contrôle la fonction de l'hydrolase de la paroi cellulaire LytB, qui est nécessaire pour les étapes finales de la division cellulaire. Mon travail suggère donc l'existence de réseaux de régulation interconnectés du cycle cellulaire du pneumocoque impliquant ces deux protéine-kinases / The pathogenic bacterium, Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus), produces a membrane serine threonine kinase, StkP, and a tyrosine kinase, CpsD, which are important regulators of cell division and polysaccharide capsule synthesis, respectively. These observations were directly at the basis of my thesis project. During my thesis, I participated in the identification of the mechanism by which CpsD coordinates the synthesis of the polysaccharide capsule with the cell cycle of the pneumococcus. Indeed, CpsD autophosphorylation controls the mobility of the chromosome partioning protein ParB protein of the chromosome segregation. To better understand the underlying molecular mechanism, I characterized a new CpsD and ParB partner that we called RocS. I showed that this protein is required for chromosome segregation. I also identified that CpsD and RocS form an atypical nucloied occlusion system, which was previously unknown in pneumococcus. On the other hand, I have contributed to the characterization of the role of the PASTA sub-domains of the StkP extracellular domain in the regulation of the septal cell wall thickness as well as in the degree of activation of StkP. More specifically I showed that the fourth PASTA sub domain of StkP controls the function of the cell wall hydrolase LytB, which is required for the final steps of cell division. My work therefore suggests the existence of interconnected regulation networks of the pneumococcal cell cycle and involving these two protein kinases

Variation et sélection sont au coeur de l'évolution Darwinienne. Cependant, ces deux mécanismes dépendent de processus eux-mêmes façonnés par l'évolution. Chez les micro-organismes, qui font face à des environnements souvent variables, ces propriétés adaptatives sont particulièrement bien exploitées, comme le démontrent de nombreuses expériences en laboratoire. Chez ses organismes, l'évolution semble donc avoir optimisé sa propre capacité à évoluer, un processus que nous nommons évolution de l'évolution (EvoEvo). La notion d'évolution de l'évolution englobe de nombreux concepts théoriques, tels que la variabilité, l'évolvabilité, la robustesse ou encore la capacité de l'évolution à innover (open-endedness). Ces propriétés évolutives des micro-organismes, et plus généralement de tous les organismes vivants, sont soupçonnées d'agir à tous les niveaux d'organisation biologique, en interaction ou en conflit, avec des conséquences souvent complexes et contre-intuitives. Ainsi, comprendre l'évolution de l'évolution implique l'étude de la trajectoire évolutive de micro-organismes — réels ou virtuels —, et ce à différents niveaux d'organisation (génome, interactome, population, …). L'objectif de ce travail de thèse a été de développer et d'étudier des modèles mathématiques et numériques afin de lever le voile sur certains aspects de l'évolution de l'évolution. Ce travail multidisciplinaire, car impliquant des collaborations avec des biologistes expérimentateur•rice•s, des bio-informaticien•ne•s et des mathématicien•ne•s, s'est divisé en deux parties distinctes, mais complémentaires par leurs approches : (i) l'extension d'un modèle historique en génétique des populations — le modèle géométrique de Fisher — afin d'étudier l'évolution du bruit phénotypique en sélection directionnelle, et (ii) le développement d'un modèle d'évolution in silico multi-échelles permettant une étude plus approfondie de l'évolution de l'évolution. Cette thèse a été financée par le projet européen EvoEvo (FP7-ICT-610427), grâce à la commission européenne. / Variation and selection are the two core processes of Darwinian Evolution. Yet, both are directly regulated by many processes that are themselves products of evolution. Microorganisms efficiently exploit this ability to dynamically adapt to new conditions. Thus, evolution seems to have optimized its own ability to evolve, as a primary means to react to environmental changes. We call this process evolution of evolution (EvoEvo). EvoEvo covers several aspects of evolution, encompassing major concepts such variability, evolvability, robustness, and open-endedness. Those phenomena are known to affect all levels of organization in bacterial populations. Indeed, understanding EvoEvo requires to study organisms experiencing evolution, and to decipher the evolutive interactions between all the components of the biological system of interest (genomes, biochemical networks, populations, ...). The objective of this thesis was to develop and exploit mathematical and numerical models to tackle different aspects of EvoEvo, in order to produce new knowledge on this topic, in collaboration with partners from diverse fields, including experimental biology, bioinformatics, mathematics and also theoretical and applied informatics. To this aim, we followed two complementary approaches: (i) a population genetics approach to study the evolution of phenotypic noise in directional selection, by extending Fisher's geometric model of adaptation, and (ii) a digital genetics approach to study multi-level evolution. This work was funded by the EvoEvo project, under the European Commission (FP7-ICT-610427).

Ces dernières années, l’OMS a émis un signal d’alarme à propos de l’occurrence majeure de résistance bactérienne qui constitue un problème de santé publique global. A ce titre, la recherche de nouvelles cibles enzymatiques et le développement de nouveaux antibactériens ciblant ces dernières de manière sélective constitue alors un enjeu actuel impératif. La mise en évidence d’une nouvelle enzyme de la famille des thymidylates synthases par l’équipe de Myllykallio en 2002 et son étude a permis de faire de cette dernière une cible de choix pour la conception de nouveaux antibactériens par sa présence exclusive chez des bactéries pathogènes pour l’Homme, sa non-similarité structurelle avec l’enzyme thymidylate synthase classique et son mécanisme particulier mettant en jeu un couple de cofacteurs oxydo-réducteurs(NADPH/FAD). Ce manuscrit, divisé en trois grandes parties, s’intéresse dans un premier temps à la synthèse métallo-catalysé de nouveaux analogues nucléotidiques du FAD substitué sur l’azote centrale par une chaîne acyclique de type alkényle phosphonate. Dans un second temps, le manuscrit traite de la translation de cette même chaîne latérale sur l’azote N1 couplée à un large panel de base hétéroaromatiquebicyliques ou tricycliques par deux réactions clés : une alkylation régiosélective en conditions deVorbrüggen et une étape de métathèse croisée. Enfin, la troisième partie porte sur la préparation d’acyclonucléosides comportant un motif d’intérêt de type gem-difluoromethylphosphonate connu comme étant un mime isostérique et isoélectronique du groupement phosphate. L’incorporation de ce motif a permis la synthèse de petite librairie d’ANPs inédits à visée anti-FDTS et anti-virales. / In recent years, WHO has warned against the major occurrence of bacterial resistance as a global public health problem. As such, the search for new enzymatic targets and the development of new antibacterials targeting them selectively is therefore an imperative challenge. The discovery of a new enzyme among the family of thymidylate synthases by Myllykallio’s team in 2002 and its study has made it a prime target for the design of new antibacterials by its sole presence in pathogenic bacteria, its structural dissimilarity with the classical thymidylate synthase enzyme and its singular mechanism involving a pair of oxido-reducingcofactors (NADPH / FAD).This manuscript, divided into three main parts, is initially interested in the metallocatalytic synthesis of new nucleotide analogues of FAD substituted on the central nitrogen by analkenyl phosphonate acyclic chain. In the second part, the manuscript deals with the translation of this same side chain on nitrogen N1 on a large panel of bicylic or tricyclic heteroaromatic base through two keyreactions: a regioselective alkylation under Vorbrüggen conditions and a cross metathesis step. Finally, th ethird part relates to the preparation of acyclonucleosides comprising a gem-difluoromethylphosphonatefunctional group which is known to be an isosteric and isoelectronic mimic of the phosphate group. The incorporation of this moeitie has allowed the synthesis of a small library of novel ANPs for anti-FDTS andanti-viral purposes.

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Le cuivre, souvent utilisé pour gérer les bactérioses en agriculture, est largement utilisé dans la lutte contre Xanthomonas citri pv. citri (Xcc), agent responsable du chancre asiatique des agrumes. La récente détection d’un phénotype résistant au cuivre (CuR) chez Xcc dans deux territoires ultramarins français a motivé une étude génomique qui a révélé, dans les génomes de souches CuR, la présence d’un plasmide conjugatif portant un transposon adaptatif de type Tn3. Sa conservation chez plusieurs espèces de Xanthomonas phytopathogènes suggère le rôle des transferts horizontaux (HGT) dans l’adaptation de Xcc. Nous avons donc analysé, dans l’océan Indien, les relations phylogénétiques de souches sensibles et CuR en prenant en compte à la fois les SNP et les variations de contenu en gènes. La datation de la phylogénie a permis de formuler des scenarii d’introduction de la bactérie dans la région. La phylogénie a montré une structure géographique forte à l’échelle de l’océan Indien, qui s’estompe à l’échelle de la Réunion et disparaît à l’échelle du verger. Au sein des vergers, l’admixture est un élément favorable aux HGT entre souches génétiquement différentes. Ils sont pourtant peu caractérisés chez les bactéries du genre Xanthomonas. Nous avons ainsi analysé la dispersion de l’ensemble des gènes plasmidiques connus de la famille des Xanthomonadaceae dans l’ensemble des génomes bactériens de NCBI, mettant en évidence à la fois la forte prévalence des gènes plasmidiques au sein des Xanthomonadaceae mais aussi la limite taxonomique forte à leur échange par conjugaison. L’importance du mosaïsme plasmidique, en partie lié aux éléments mobiles a aussi été illustrée. L’ensemble de nos résultats souligne l’importance des HGT dans l’évolution des bactéries du genre Xanthomonas, et la nécessité de caractériser finement le contenu et le fonctionnement du génome environnemental des Xanthomonadaceae pour appréhender au mieux l’adaptation de ces bactéries phytopathogènes. / Copper, frequently used in agriculture to control bacterial diseases, is commonly used against Xanthomonas citri pv. citri (Xcc), the bacterial agent of Asiatic citrus canker. The recent detection of a copper-resistant phenotype in two French overseas regions motivated a genomic study which revealed, in copper-resistant (CuR) strains, a conjugative plasmid encoding an adaptive transposon of the Tn3 family. Its conservation in several Xanthomonas species suggested the role of horizontal gene transfer (HGT) in Xcc adaptation. We therefore analyzed the evolutionary history of susceptible and CuR Xcc strains in the Indian Ocean using both SNP and gene content variations. The dating of the obtained phylogeny allowed us to hypothesize the history of Xcc introduction into the region. The phylogeny showed a strong geographic structure among islands of the Indian Ocean region, which faded at the Réunion scale and disappeared at the grove scale. Among the groves, admixture is a factor favoring HGT between genetically distinct strains. This form of evolution is however largely uncharacterized in the Xanthomonas genus. To fill this gap, we searched genetic homology between the whole known plasmid gene content of the Xanthomonadaceae family and the complete set of genomes hosted in NCBI databases. We highlighted both the ubiquity of plasmid genes in the Xanthomonadaceae family and the taxonomical barrier of their sharing by conjugation. The small fraction of genes that were exchanged through the complete sharing of plasmids also revealed the importance of plasmid mosaicism, partly due to mobile genetic elements. Taken together, our results highlight the importance of bacterial communities in the evolution of phytopathogenic bacteria of the Xanthomonas genus, and the need for a precise characterization of the content and the functioning of the Xanthomonadaceae environmental genome in order to fully apprehend the adaptation of these phytopathogenic bacteria.

Dans les écosystèmes forestiers, la décomposition du bois est un processus majeur, notamment impliqué dans le cycle du carbone et des nutriments. Les champignons basidiomycètes saprotrophes, incluant les pourritures blanches, sont les principaux agents de cette décomposition dans les forêts tempérées. Bien que peu étudiées, des communautés bactériennes sont également présentes dans le bois en décomposition et cohabitent avec ces communautés fongiques. L'impact des interactions bactéries-champignons sur le fonctionnement d'une niche écologique a été décrit dans de nombreux environnements. Cependant, leur rôle dans le processus de décomposition du bois n'a été que très peu investigué. A partir d'expériences en microcosme et en utilisant une approche non cultivable, il a été démontré que la présence du champignon Phanerochaete chrysosporium influençait significativement la structure et la diversité des communautés bactériennes associées au processus de décomposition du hêtre (Fagus sylvatica). Par une approche cultivable, cet effet mycosphère a été confirmé, se traduisant par une augmentation de la densité des communautés bactériennes en présence du champignon ainsi que par une modification de la diversité fonctionnelle de ces communautés. Enfin, une approche polyphasique a été développée, combinant l'analyse des propriétés physico-chimiques du bois et des activités enzymatiques extracellulaires. Les résultats de cette expérience ont révélé que l'association de P. chrysosporium avec une communauté bactérienne issue de la mycosphère de ce dernier aboutissait à une dégradation plus importante du matériau bois par rapport à la dégradation par le champignon seul, démontrant pour la première fois des interactions bactéries-champignons synergiques dans le bois en décomposition / Wood decomposition is an important process in forest ecosystems in terms of their carbon and nutrient cycles. In temperate forests, saprotrophic basidiomycetes such as white-rot fungi are the main wood decomposers. While they have been less studied, bacterial communities also colonise decaying wood and coexist with these fungal communities. Although the impact of bacterial-fungal interactions on niche functioning has been highlighted in a wide range of environments, little is known about their role in wood decay. Based on microcosm experiments and using a culture-independent approach, we showed that the presence of the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium significantly modified the structure and diversity of the bacterial communities associated with the degradation of beech wood (Fagus sylvatica). Using a culture-dependent approach, it was confirmed that in the presence of the fungus the mycosphere effect resulted in increased bacterial abundance and modified the functional diversity of the fungal-associated bacterial communities. Lastly, a polyphasic approach simultaneously analysing wood physicochemical properties and extracellular enzyme activities was developed. This approach revealed that P. chrysosporium associated with a bacterial community isolated from its mycosphere was more efficient in degrading wood compared to the fungus on its own, highlighting for the first time synergistic bacterial-fungal interactions in decaying wood

L’objectif de mon travail fut de valider et d’optimiser la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF pour l’identification et la classification d'un ensemble de bactéries pathogènes ou opportunistes chez l’homme, en enrichissant une base de données et en testant la robustesse de la méthode, afin d’obtenir une méthode rapide fixe et fiable d'acquisition de résultats. Les différents résultats obtenus ont permis la validation de la technique comme outil d’identification bactérienne fiable en routine. Elle permet désormais de caractériser les mélanges de deux bactéries voir même la différentiation d’espèces très proches comme les Shigella spp et E. coli. Nous avons montré que la technique sera encore améliorée par un outil supplémentaire de comparaison des souches pour une veille épidémiologique "en temps réel", sans investissement supplémentaire, en permettant plusieurs types d'économie. Elle apporte un gain réel dans la prise en charge du patient et le choix éclairé des antibiotiques testés pour l'antibiogramme. La technique peut aussi constituer un outil alternatif de sérotypage. / The aim of this work was to validate and optimize MALDI-TOF mass spectrometry for the identification and classification of a set of pathogens or opportunistic bacteria, by enriching a database and testing the robustness of the method, in order to obtain a quick and reliable fixed acquisition results. The different results obtained allowed the validation of the technique as a reliable tool for bacterial identification in hospital routine. In addition, we have shown that it can characterize mixtures of two bacteria and differentiate closely related species such as Shigella spp and E. coli. We demonstrate that MALDI-TOF/MS will be further enhanced by an additional tool for comparison of strains for epidemiological monitoring in "real time". The technique can also be an alternative tool for serotyping. MALDI-TOF/MS identification provides a real benefit in terms of patient care and the choice of antibiotics tested for sensitivity, without additional investment, which allows different types of economy.

La matrice extracellulaire (MEC) intervient dans de nombreux processus biologiques tels que la migration, la différentiation ou l’adhésion cellulaire. Elle est également associée à plusieurs évènements pathologiques. La cohésion de la MEC est assurée par un réseau organisé et complexe de protéines présent au voisinage immédiat des cellules. Ce projet a pour objectif de contribuer à la caractérisation structurale et fonctionnelle de certaines de ces complexes protéiques. Le Gelatin Binding Domain (GBD) (⁶FI¹²FII ⁷⁸⁹FI), localisé dans la région N-terminale de la fibronectine est connu pour interagir avec la transglutaminase 2 (TG2), le collagène de type I, ou encore des protéines d’adhésion bactériennes tel que la FNE (protéine de Streptococcus equi). Mes travaux de thèse portent donc sur la caractérisation fonctionnelle et structurale de ces interactions par des approches biophysiques et biochimiques. Ce travail a permis de cartographier les régions d’interactionentre la TG2 et le GBD d’une part et la FNE et le GBD d’autre part. Nous avons par la suite entrepris une étude par SAXS des complexes TG2/GBD et FNE/GBD et réussi à établir des modèles structuraux d’interaction entre (1) le GBD et le domaine N-terminal de la TG2 et (2) entre la FNE et le sous fragment ⁷⁸⁹FI du GBD. La structure tridimensionnelle de la protéine FNE a été résolue par cristallographie aux rayons X grâce à l’utilisation d’un outil original facilitant l’obtention de cristaux. / The extracellular matrix (ECM) is involved in a number of biological pathways associated with the cell migration, differentiation, adhesion and is also implicated in several pathological events. The cohesion of the ECM is accomplished by a highly organized protein complex network on the cell surface. The Gelatin Binding Domain (GBD) (⁶FI¹²FII ⁷⁸⁹FI) of the N-terminal region of fibronectin is found to interact with the transglutaminase 2 (TG2), collagen type I and the bacterial adhesion protein FNE. In this study, we conducted the structural and functional characterization of the protein complexes involved in the cohesion of ECM. The interactions between either TG2 or FNE and GBD have been characterized and the regions responsible for the interactions have also been mapped. Furthermore, we studied TG2/GBD and FNE/GBD complex by SAXS and built two models underscoring the interactions between (1), the GBD and the Nterminus of TG2 and (2), FNE and the sub-fragment ⁷⁸⁹FI of GBD providing insights on mechanistically elucidating the protein interactions during the cohehsion of ECM. The X-ray structure of the protein FNE of Streptococcus equi has been determined at 1.8 Å, by using an original tool that facilitates obtaining crystals.

Dans de nombreux pays, l’aquaculture de pectinidés dépend aujourd’hui du succès de la production contrôlée de juvéniles. Néanmoins, les fortes variations des taux d’éclosion des oeufs et de la survie larvaire, enregistrées à ce jour, rendent cette production imprévisible. Les élevages larvaires en flux ouvert de coquilles Saint-Jacques (Pecten maximus) ont été développés en Norvège et présentent des résultats prometteurs. Malheureusement, les rendements de production encore faibles et l’impossibilité de travailler à fortes densités restent un frein majeur au développement de cette technique. En France, une technique en flux-ouvert, en petit volume (5 L), et à forte densité (≤ 300 larves mL-1) a été développée pour les ostréidés. Des expériences préliminaires visant à décliner ce système d’élevage aux larves de P. maximus se sont avérées infructueuses : retard de croissance et forte mortalité en quelques jours. Il est reconnu que les larves de pectinidés doivent faire face à des contraintes diverses en écloserie : bactériologiques, physiologiques et environnementales. Elles sont également plus sensibles que les larves des autres espèces de bivalves comme par exemple l’huître japonaise (Crassostrea gigas). Il apparait donc nécessaire aujourd’hui d’identifier plus clairement l’origine des phénomènes perturbant le bon développement des larves en flux ouvert afin d’améliorer la qualité des élevages et les rendements larvaires. Grâce à l’étude et à la compréhension des mécanismes physiologiques impliqués dans la lutte contre le stress des larves de P. maximus en flux ouvert, ce projet de doctorat donne des clés permettant d’améliorer cette technique d’élevage tout en limitant l’utilisation de produits chimiques en milieu contrôlé. / In many countries, aquaculture of pectinids depends on the success of artificial spat production in hatchery. This production is always unpredictable due to the variability of hatching rate and larval survival. Flow-through larval rearing systems were developed in Norway for the King scallop Pecten maximus and showed promising results. Unfortunately the system needs to be optimized since the larval yields and the densities used are still relatively low. In France, a small-scale (5 L) and high-density (≤ 300 larva mL-1) flow-through larval rearing system was successfully developed for oysters. First trials in such system and in similar conditions with P.maximus failed as we registered slower growth and high mortality rate in only a few days. It is known that pectinids larvae are more sensitive to environmental conditions than the oyster Crassostrea gigas, for example.Nowadays, it is important to identify and to understand the phenomena disturbing larval development in flowthrough system to improve larval quality and production yields. This doctoral project provided some indications how improving P. maximus flowthrough rearing system while limiting the use of antibiotic through a better understanding the physiological mechanisms involved in the larval response to a stressful environment

L'adhésion bactérienne est la première étape du processus de formation d'un biofilm et est un enjeu majeur de la recherche depuis plusieurs dizaines d'années. Les biofilms ont des conséquences parfois dramatiques dans des domaines comme la santé, l'agroalimentaire ou la purification des eaux usées. Toutefois, l'adhésion bactérienne reste un phénomène mal compris. Dans cette thèse, l'adhésion bactérienne est étudiée sur des surfaces modèles très bien organisées et structurées, de chimie de surface variable à l'échelle moléculaire. Une méthodologie de caractérisation adaptée aux monocouches déposées sur wafers de silicium est proposée. Des surfaces modèles composées de monocouches mixtes auto-assemblées de densités variables de NH2 dans un continuum de CH, sont développées et optimisées. Ces surfaces contrôlées, de densités de 0% NH2 à 100% NH2 dans CH3, sont utilisées comme outil pour étudier l'adhésion bactérienne en conditions de culture « batch »et « temps réel ». Les résultats montrent un impact significatif sur l'adhésion bactérienne de faibles différences chimiques à l'échelle moléculaire. Les résultats des expériences menées en conditions « batch » permettent de déterminer deux zones « plateau » dans lesquelles l'adhésion bactérienne ne varie pas significativement malgré des variations importantes de la concentration en groupements amine sur la surface. Une zone de transition entre les zones « plateau » est mise en évidence, dans laquelle une faible modification de la concentration en groupement amine mène à l'augmentation / diminution significative du nombre de bactéries adhérées. Cette tendance est montrée pour deux souches différentes de bactérie. / Bacterial adhesion is the first step of biofilm formation and in the focus of research interest since several decades. Biofilms cause many problems, sometimes dramatic, for example in health, food packing or waste water purification. Despite of high interest, bacterial adhesion process is only poorly understood yet. In this work, bacterial adhesion was investigated on well-organized and structured model surfaces with various chemistries at molecular scale. For that purpose a characterization methodology was developed to sufficiently analyze monolayers on silicon wafers, and controlled mixed monolayers surfaces with different densities of NH 2 backfilled with CH3 were developed and optimized. These controlled surfaces with different densities of 0 % NH2 up to 100% NH2 were eventually used as tool to study bacterial adhesion in batch and real time conditions. The results demonstrate a significant impact on bacterial adhesion of weak difference in the surface chemistry at molecular scale. In the batch experiments, two so-called "plateaus" zones were determined, in which bacterial adhesion is not significantly different despite the change of the amine concentration on the surface. On the contrary, one transition zone exists between the "plateaus" in which a slight chunge.in the amine concentration leads to a significant increase / decrease of the bacterial adhesion. The same trend of bacteria behavior was observed for different bacterial strains.