Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4607_1.pdf: 1997478 bytes, checksum: a597005ed147a9e3dd65d44c6ef1581d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Espécies do gênero Beauveria são bastante estudadas e apresentam importância no controle biológico, são de ocorrência cosmopolita podendo ser isolados de insetos e do solo, onde podem subsistir por longo período. A patogenicidade de fungos a artrópodes está relacionada à atividade enzimática e variabilidade genética, como também condições ambientais favoráveis, podendo ser utilizados no controle de várias ordens de insetos de importância econômica. Este trabalho teve como objetivo avaliar linhagens do gênero quanto à morfologia, diversidade genética através de marcadores de ISSR e análise da seqüência da região ITS1-5.8S-ITS2, como também a ação patogênica e viabilidade destas linhagens sobre larvas de Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae), importante praga da cana-de-açúcar, visando novas perspectivas para o controle de insetos-praga. A partir dos resultados obtidos foi possível verificar que as linhagens apresentam características morfológicas compatíveis com as descritas para o gênero, a alta variabilidade genética, bem como ação patogênica sobre a broca da cana-de-açúcar, sugerindo que as mesmas possuem potencial para serem utilizadas em programas de controle da praga

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-12-03T20:21:41Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rayssa Fátima Hubner-Campos - 2011.pdf: 2511470 bytes, checksum: ee6ac73ef51b071c0cfb2f0afc90bff9 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2014-12-05T14:27:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rayssa Fátima Hubner-Campos - 2011.pdf: 2511470 bytes, checksum: ee6ac73ef51b071c0cfb2f0afc90bff9 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-05T14:27:59Z (GMT). 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In present study the pathogenicity of 11 fungal strains belonging to seven different genera was evaluated in nymphs of P. americana. Fungi that caused mortality > 90% in nymphs in the first test, were assayed in oothecae of P. americana. For the test with adults the fungus that caused higher mortality in nymphs and oothecae was selected. Conidia were formulated in oil-in-water (Graxol® 10%) at 108 conidia/ml. Nymphs, oothecae and adults were then treated topically with 0.5 µl, 2.5 µl and 50 µl of the formulate, at a final dose of 5 x 104 conidia/nymph, 2,5 x 105 conidia/oothecae and 5x103, 104, 5x104, 105 or 5x105 conidia/adult, respectively, and incubated in a humid chamber at 25 ± 1ºC and 12 h photophase. The mortality of nymphs and adults was checked daily for 25 days and the growth of fungi on the surface of the cadavers evaluated for up to 15 days. The development of the inoculated fungus on the ootheca was assessed daily during 45 days and subsequent hatching of nymphs monitored for another 15 days. Control nymphs, adults and oothecae were treated with the emulsion without conidia. Adults and nymphs whether treated as adults and nymphs or nymphs hatched from treated oothecae, were fed with dry cat food (0.5 g) (Whiskas®) and water through moistened cotton (0.1 ml) arranged in small containers. First dead nymphs were observed two days after treatment with Beauveria bassiana IP 361, Metarhizium robertsii IP 34, M. anisopliae sensu lato IP 46, B. bassiana IP 3, M. frigidum ARSEF 4561 and Purpureocillium lilacinum IP 320. Beauveria bassiana IP 361, M. robertsii and M. anisopliae caused mortality in more than 80% of the tested nymphs. The other fungi tested caused less than 20% mortality in nymphs. In adults mortality depended on the dose and did not differ between the sexes. The inoculated fungus began to grow distinctly on the cadavers three days after incubation of dead nymphs and adults in a humid chamber. Testing activity of IP 34 and IP 46 in oothecae, mycelium grew on the surface of the treated ootheca 11 days after incubation and new conidia were formed at ≥ 20 days. In 31% of oothecae treated with IP 46 and 23% treated with IP 34, oothecae had shrunk and no nymphs had hatched. In all controls and oothecae treated with conidia, nymphs began to hatch 33 days after incubation. All hatched nymphs survived for the following 25 days. M. anisopliae, M. robertsii and B. bassiana IP 361 were pathogenic to nymphs and have potential for biological control of P. americana. / Periplaneta americana é uma barata sinantrópica que veicula patógenos, contamina ambientes e alimentos e provoca graves problemas de saúde, como episódios recorrentes de asma e outras alergias especialmente em crianças. Atualmente, o controle desta praga é difícil devido à resistência adquirida a vários inseticidas químicos e a ineficácia destes produtos sobre a fase de ooteca. Fungos entomopatogênicos são usados para o controle biológico de insetos de importância médica e veterinária. Entretanto, há poucas informações sobre a eficiência e o potencial de fungos entomopatogênicos para combater P. americana. O presente estudo avaliou a patogenicidade de 11 fungos pertencentes a sete diferentes gêneros, sobre P. americana. Os fungos que causaram mortalidade > 90% em ninfas, em um primeiro experimento, foram testados também em ootecas desta espécie. Em adultos, selecionou-se o fungo que causou maior mortalidade em ninfas e ootecas. Conídios foram formulados em óleo-água (Graxol® a 10%) a 108 conídios/ml. Ninfas, ootecas e adultos foram tratados topicamente com 0,5 µl, 2,5 µl e 5,0 µl do formulado, numa dose final de 5x104 conídios/ninfa, 2,5x105 conídios/ooteca e 5x103, 104, 5x104, 105 ou 5x105 conídios/adulto, respectivamente, e incubados em câmara úmida a 25 + 1º e 12 h de fotofase. A mortalidade de ninfas e adultos foi verificada diariamente por 25 dias e o crescimento do fungo sobre a superfície dos cadáveres acompanhado por até 15 dias. Durante 45 dias foram avaliados diariamente o desenvolvimento do fungo inoculado sobre a ooteca e a eclosão de ninfas, e a sobrevivência destas após a eclosão, foi acompanhada por mais 15 dias. As ninfas, ootecas e adultos do grupo controle foram tratados com a emulsão sem conídios. Os adultos e as ninfas tratadas ou eclodidas de ootecas tratadas foram alimentadas com ração para gatos (0,5 g) (Whiskas®) e água através de algodão umedecido (0,1 ml) oferecidos em pequenos containers. Primeiras ninfas mortas foram observadas dois dias após o tratamento com Beauveria bassiana IP 361, Metarhizium robertsii IP 34, M. anisopliae sensu lato IP 46, B. bassiana IP 3, M. frigidum ARSEF 4561 e Purpureocillium lilacinum IP 320. B. bassiana IP 361, M. robertsii e M. anisopliae causaram mortalidade em mais de 80% das ninfas. Os demais fungos testados causaram mortalidade em ninfas inferior a 20%. Em adultos a mortalidade dependeu da dose e não diferiu entre os sexos. O fungo inoculado iniciou crescimento distinto sobre os cadáveres após o terceiro dia de incubação das ninfas e adultos mortos em câmara úmida. Micélio cresceu sobre a superfície das ootecas tratadas com fungos IP 34 e IP 46 após 11 dias de incubação e os novos conídios foram visualizados com ≥ 20 dias. 31% das ootecas tratadas com IP 46 e 23% com IP 34 tornaram-se ressecadas e abauladas e nenhuma ninfa eclodiu dessas ootecas. Em ootecas do grupo controle e em ootecas tratadas com conídios, a eclosão de ninfas iniciou após 33 dias de incubação. Todas as ninfas eclodidas dessas ootecas sobreviveram durante 25 dias. M. anisopliae, M. robertsii e B. bassiana IP 361 foram patogênicos para ninfas e apresentam potencial para o controle biológico de P. americana.

Sabe-se que micro-organismos são vistos como promissoras fontes de moléculas bioativas, incluindo-se nesse grupo fungos endofíticos e também entomopatogênicos. Desse modo, foram selecionados o fungo entompatogênico Beauveria bassiana e o fungo endofítico Mycoleptodiscus indicus. Numa primeira etapa foram prospectadas condições de cultivo favoráveis à obtenção de metabólitos secundários com atividade biológica. Este trabalho foi guiado por ensaios biológicos e análises cromatográficas. As frações obtidas nos cultivos de escala ampliada foram submetidas a ensaios biológicos (leishmanicida, antimalárico, antimcrobiano e citotóxico). As frações diclorometânicas e em acetato de etila de ambos os fungos apresentaram resultados promissores em ensaios antitumorais e leishmanicidas. Em seguida, estas frações foram submetidas a processos cromatográficos que permitiram o isolamento de substâncias, cujas estruturas químicas foram elucidadas por meio do uso de técnicas de RMN, espectrometria de massas, UV, IV, rotação óptica (?D) e difração de raio-X. A partir de cultivos de B. bassiana foram obtidos compostos da classe das piridonas: piridovericina, piridovericina-N-O-(4-O-metil-?-D-glucopiranosídeo) e 15-desóxi-piridovericina, sendo os dois últimos inéditos; e das aloxazinas: 7,8-dimetilaloxazina (lumicromo) e 1-metil-11-hidróxilumicromo, sendo este inédito. A partir dos cultivos de M. indicus foram obtidas substâncias de duas classes: cromenos e azafilonas. Neste trabalho foram isolados derivados cromenos: eugenitina, 6-metóxieugenina e 9-hidróxieugenina, os quais têm sido isolados de uma ampla variedade de plantas e fungos. As azafilonas são uma classe estruturalmente diversa de metabólitos fúngicos, conhecidos pigmentos com estrutura pirano-quinona que contêm um núcleo bicíclico altamente oxigenado e um centro quiral quaternário. Foram obtidas duas azafilonas conhecidas: austidiol e austidiol diacetato (produto de acetilação); e três azafilonas inéditas: dímero de austidiol, austidiol diidroisocumarina e austidiol cromeno. As três azafilonas inéditas de M. indicus apresentam um padrão não usual de conexão entre dois policetídeos aromáticos, uma ponte metilênica. O isolamento de tais moléculas reforça a hipótese de que a biossíntese ocorra com a participação de uma molécula de formaldeído. As substâncias purificadas foram submetidas aos ensaios biológicos para confirmar o potencial de suas frações geradoras. No ensaio citotóxico as azafilonas austidiol e austdiol diacetato e a piridona piridovericina mostraram-se ativas contra as linhagens tumorais avaliadas, embora em concentrações superiores aos padrões utilizados. Além disso, apresentaram algum grau de seletividade (não tóxicas para linfócitos humanos). Também nos ensaios leishmanicidas, austidiol, austidiol diacetato e piridovericina mostraram-se ativos, embora em níveis inferiores aos leishmanicidas padrões. De modo que, pode-se considerar que as azafilonas e piridonas são bons compostos líderes para a busca de agentes citotóxicos e leishmanicidas, uma vez que estas classes de compostos possuem dinamicidade biológica. Por fim, o isolamento e elucidação de novos metabólitos das classes azafilonas e piridonas contribuem para o enriquecimento destas importantes classes de metabólitos fúngicos, ao mesmo tempo, que evidenciam a importância dos fungos endofíticos e entomopatogênicos na química de produtos naturais. / It is known that microorganisms are considered as promising source of bioactive molecules and endophytic and entomopathogenic fungi are included in this group. Therefore, we selected the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana and the endophytic fungus Mycoleptodiscus indicus to initiate the prospection aiming to determine the favorable growing conditions to obtain secondary metabolites with biological activity. This work was guided by biological assays and chromatographic analysis. The fractions obtained in the cultivation in a large scale were subjected to biological tests (leishmanicidal, antimalarial, antimicrobial and cytotoxic). The dichloromethane and ethyl acetate fractions of both fungi showed promising results in antitumor and leishmanicidal assays. Then, these fractions were subjected to chromatographic processes that allowed the isolation of compounds whose chemical structures were elucidated through the use of NMR techniques, mass spectrometry, UV, IR, ?D, and X-ray diffraction. From cultures of B. bassiana were obtained compounds from the pyridone class: pyridovericin, pyridovericin-N-O-(4-O-methyl-?-D-glucopyranoside) and pyridovericin-15-deoxy, being the latter two novel compounds; and alloxazine class: 7,8-dimethylalloxazine (lumichrome) and 1-methyl-11-hydroxylumichrome, being this last one unprecedented. From M. indicus cultures were obtained compounds from two classes: azaphilone and chromene. In this thesis we report the derivatives eugenitin, 6-methoxyeugenin and 9-hydroxyeugenin, which have been isolated from a wide variety of plants and fungi. Azaphilones are a class of structurally diverse fungal metabolites, known pigments with pyran-quinone structure and contains a highly oxygenated bicyclic core and a chiral quaternary center. Then, we obtained two known azaphilones: austdiol and austdiol diacetate (product of acetylation), and three unprecedent azaphilones: austdiol dimer, austdiol dihydroisocoumarin and austdiol chromen. The three new azaphilones from M. indicus have an unusual pattern of connection between two aromatic polyketides, a methylene bridge. The isolation of these molecules reinforces the hypothesis that the biosynthesis occurs with the participation of one formaldehyde molecule. The purified compounds were submitted to biological assays. In the cytotoxic assay the azaphilones austdiol and austdiol diacetate, and the pyridone pyridovericin displayed activity against tumor cell lines, although at higher concentrations than the standard compounds used. Moreover, there was some degree of selectivity, since the assayed compounds were not toxic to human lymphocytes. Also in leishmanicidal assays, austdiol, austdiol diacetate and pyridovericin displayed activity, although at levels lower than leishmanicidal standards. Thereby, it can be considered that azaphilone and pyridone compounds are good leader compounds to search for cytotoxic and leishmanicidal agents, since these classes of compounds have biological dynamicity. Finally, the isolation and elucidation of new metabolites belonging to azaphilone and pyridone classes contribute to the enrichment of these important fungal metabolites and, likewise, this study demonstrates the importance of endophytic and entomopathogenic fungi in natural products chemistry.

Sabe-se que micro-organismos são vistos como promissoras fontes de moléculas bioativas, incluindo-se nesse grupo fungos endofíticos e também entomopatogênicos. Desse modo, foram selecionados o fungo entompatogênico Beauveria bassiana e o fungo endofítico Mycoleptodiscus indicus. Numa primeira etapa foram prospectadas condições de cultivo favoráveis à obtenção de metabólitos secundários com atividade biológica. Este trabalho foi guiado por ensaios biológicos e análises cromatográficas. As frações obtidas nos cultivos de escala ampliada foram submetidas a ensaios biológicos (leishmanicida, antimalárico, antimcrobiano e citotóxico). As frações diclorometânicas e em acetato de etila de ambos os fungos apresentaram resultados promissores em ensaios antitumorais e leishmanicidas. Em seguida, estas frações foram submetidas a processos cromatográficos que permitiram o isolamento de substâncias, cujas estruturas químicas foram elucidadas por meio do uso de técnicas de RMN, espectrometria de massas, UV, IV, rotação óptica (?D) e difração de raio-X. A partir de cultivos de B. bassiana foram obtidos compostos da classe das piridonas: piridovericina, piridovericina-N-O-(4-O-metil-?-D-glucopiranosídeo) e 15-desóxi-piridovericina, sendo os dois últimos inéditos; e das aloxazinas: 7,8-dimetilaloxazina (lumicromo) e 1-metil-11-hidróxilumicromo, sendo este inédito. A partir dos cultivos de M. indicus foram obtidas substâncias de duas classes: cromenos e azafilonas. Neste trabalho foram isolados derivados cromenos: eugenitina, 6-metóxieugenina e 9-hidróxieugenina, os quais têm sido isolados de uma ampla variedade de plantas e fungos. As azafilonas são uma classe estruturalmente diversa de metabólitos fúngicos, conhecidos pigmentos com estrutura pirano-quinona que contêm um núcleo bicíclico altamente oxigenado e um centro quiral quaternário. Foram obtidas duas azafilonas conhecidas: austidiol e austidiol diacetato (produto de acetilação); e três azafilonas inéditas: dímero de austidiol, austidiol diidroisocumarina e austidiol cromeno. As três azafilonas inéditas de M. indicus apresentam um padrão não usual de conexão entre dois policetídeos aromáticos, uma ponte metilênica. O isolamento de tais moléculas reforça a hipótese de que a biossíntese ocorra com a participação de uma molécula de formaldeído. As substâncias purificadas foram submetidas aos ensaios biológicos para confirmar o potencial de suas frações geradoras. No ensaio citotóxico as azafilonas austidiol e austdiol diacetato e a piridona piridovericina mostraram-se ativas contra as linhagens tumorais avaliadas, embora em concentrações superiores aos padrões utilizados. Além disso, apresentaram algum grau de seletividade (não tóxicas para linfócitos humanos). Também nos ensaios leishmanicidas, austidiol, austidiol diacetato e piridovericina mostraram-se ativos, embora em níveis inferiores aos leishmanicidas padrões. De modo que, pode-se considerar que as azafilonas e piridonas são bons compostos líderes para a busca de agentes citotóxicos e leishmanicidas, uma vez que estas classes de compostos possuem dinamicidade biológica. Por fim, o isolamento e elucidação de novos metabólitos das classes azafilonas e piridonas contribuem para o enriquecimento destas importantes classes de metabólitos fúngicos, ao mesmo tempo, que evidenciam a importância dos fungos endofíticos e entomopatogênicos na química de produtos naturais. / It is known that microorganisms are considered as promising source of bioactive molecules and endophytic and entomopathogenic fungi are included in this group. Therefore, we selected the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana and the endophytic fungus Mycoleptodiscus indicus to initiate the prospection aiming to determine the favorable growing conditions to obtain secondary metabolites with biological activity. This work was guided by biological assays and chromatographic analysis. The fractions obtained in the cultivation in a large scale were subjected to biological tests (leishmanicidal, antimalarial, antimicrobial and cytotoxic). The dichloromethane and ethyl acetate fractions of both fungi showed promising results in antitumor and leishmanicidal assays. Then, these fractions were subjected to chromatographic processes that allowed the isolation of compounds whose chemical structures were elucidated through the use of NMR techniques, mass spectrometry, UV, IR, ?D, and X-ray diffraction. From cultures of B. bassiana were obtained compounds from the pyridone class: pyridovericin, pyridovericin-N-O-(4-O-methyl-?-D-glucopyranoside) and pyridovericin-15-deoxy, being the latter two novel compounds; and alloxazine class: 7,8-dimethylalloxazine (lumichrome) and 1-methyl-11-hydroxylumichrome, being this last one unprecedented. From M. indicus cultures were obtained compounds from two classes: azaphilone and chromene. In this thesis we report the derivatives eugenitin, 6-methoxyeugenin and 9-hydroxyeugenin, which have been isolated from a wide variety of plants and fungi. Azaphilones are a class of structurally diverse fungal metabolites, known pigments with pyran-quinone structure and contains a highly oxygenated bicyclic core and a chiral quaternary center. Then, we obtained two known azaphilones: austdiol and austdiol diacetate (product of acetylation), and three unprecedent azaphilones: austdiol dimer, austdiol dihydroisocoumarin and austdiol chromen. The three new azaphilones from M. indicus have an unusual pattern of connection between two aromatic polyketides, a methylene bridge. The isolation of these molecules reinforces the hypothesis that the biosynthesis occurs with the participation of one formaldehyde molecule. The purified compounds were submitted to biological assays. In the cytotoxic assay the azaphilones austdiol and austdiol diacetate, and the pyridone pyridovericin displayed activity against tumor cell lines, although at higher concentrations than the standard compounds used. Moreover, there was some degree of selectivity, since the assayed compounds were not toxic to human lymphocytes. Also in leishmanicidal assays, austdiol, austdiol diacetate and pyridovericin displayed activity, although at levels lower than leishmanicidal standards. Thereby, it can be considered that azaphilone and pyridone compounds are good leader compounds to search for cytotoxic and leishmanicidal agents, since these classes of compounds have biological dynamicity. Finally, the isolation and elucidation of new metabolites belonging to azaphilone and pyridone classes contribute to the enrichment of these important fungal metabolites and, likewise, this study demonstrates the importance of endophytic and entomopathogenic fungi in natural products chemistry.

O fungo entomopatogênico Beauveria felina produz as destruxinas, hexadepsipeptídeos cíclicos que apresentam diversas atividades biológicas, como por exemplo: atividade inseticida, fitotóxica, citotóxica contra células tumorais, atividade antiviral contra o vírus da hepatite B, dentre outras. Devido à atividade inseticida das destruxinas, os fungos que as produzem têm grande importância econômica. Assim, o objetivo deste trabalho foi realizar a otimização das condições de crescimento e produção das destruxinas pelo fungo Beauveria felina utilizando diferentes meios de cultivo, a fim de se isolar destruxinas em maiores quantidades para a avaliação de seu potencial tóxico. Foram utilizados métodos de planejamento experimental e análise multivariada para a otimização das condições de crescimento, resultando em três condições ótimas de cultivo para cada um dos meios de cultura MF, PDB e SBD. Em todas as condições ótimas de cultivo foram observadas destruxinas conhecidas, desconhecidas e destruxinas que não foram isoladas anteriormente de Beauveria felina. O cultivo de Beauveria felina no meio PDB foi o que mais apresentou destruxinas desconhecidas (5). Em seguida foi realizada uma otimização das condições de análise cromatográfica de destruxinas por CLAD-DAD-DELE-EM e a validação deste método. Uma das frações obtidas do meio de cultura de Beauveria felina apresentou atividade vermífuga contra Haemonchus contortus. Duas de suas frações purificadas, P1 (destruxina Ed1 - m/z 625 e pseudodestruxina B ou pseudodestruxina C - isobáricas, m/z 669) e P7 (destruxina D ou hidroxihomodestruxina B ou roseotoxina C - isobáricas, m/z 623), foram ativas contra o carrapato bovino Rhipicephalus microplus. / The entomopathogenic fungus Beauveria felina produces destruxins, cyclic hexadepsipeptides which have several biological activities, such as insecticidal, phytotoxic, cytotoxic against tumor cells, antiviral activity against hepatitis B virus, among others. Because of the insecticidal activity of destruxins, fungi that produce them have a considerable economic importance. Therefore the aim of this study was to optimize the conditions for the growth of Beauveria felina and its production of destruxins by using different culture media, in order to isolate larger quantities for the evaluation of their toxic potential. Experimental design and multivariate analysis were used for the optimization of growth conditions, resulting in three conditions for optimum growth for each of the culture media MF, PDB and SBD. Both known and unknown destruxins were observed in each of the optimal conditions, along with destruxins that were not previously isolated from Beauveria felina. The cultivation of Beauveria felina in PDB was the one that showed the largest amount of unknown destruxins (5). We then carried out an optimization of the chromatographic analysis of destruxins by HPLC-PDA-ELSD-MS and the validation of this method. One of the fractions obtained from the culture medium of Beauveria felina showed anthelmintic activity against Haemonchus contortus, while two of its purified fractions, P1 (destruxin Ed1 - m/z 625 and pseudodestruxin B or pseudodestruxin C - isobaric m/z 669) and P7 (destruxin D or hydroxyhomodestruxin B or roseotoxin C - isobaric m/z 623), were active against the cattle tick Rhipicephalus microplus.

Plutella xylostella, commonly known as diamondback moth, causes great damages in collard greens and broccolis crops of Itabaiana municipality in Sergipe State-BR. Alternative control techniques are being researcher s goals because the intensive use of chemicals has enhancing resistance problems, intoxication of workers, beside the pollution of environment and residues in the products, making difficult their commercialization. Entomogenous fungi have been used widespread in biological control of agriculture pests and have a remarkable role among micro-organisms as an alternative method to control the moth. This work aims to evaluate the pathogenicity of ten isolates of Beauveria and Paecilomyces, from different research institutions, on diamondback moth and also to identify and quantify extra cell enzyme patterns made by the mentioned fungi. The rearing of the moths will be at lab conditions starting from young crawlers and pupae picked up in field crops of collard and broccolis. The enzyme activities will be evaluated in extra cell fluids filtrated from entomogenous fungi reared in aqueous medium. The results obtained from the bioassays will give contribution in the identification of the most efficient genera or isolates to be used in IPM of diamondback moth. Moreover, it is expected that the relationship pathogenicity x enzyme activity be one other tool to characterizing these micro-organisms. / A traça-das-crucíferas tem causado grandes danos a produtores de couve e brócolis do município de Itabaiana-SE. O uso indiscriminado de agrotóxicos para o controle desta praga tem causado problemas quanto à resistência a determinados ingredientes ativos, além de comprometer a saúde dos aplicadores e o consumo dos produtos pela veiculação de resíduos desses produtos. Os fungos entomopatogênicos são uma alternativa de controle para a traça. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a patogenicidade de fungos entomopatogênicos sobre a traça-das-crucíferas (Plutella xylostella), observando sua interação com a quantificação e tipos de enzimas proteases produzidas pelos isolados. Foi realizado no Laboratório de Controle Biológico da Embrapa Tabuleiros Costeiros usando 9 isolados de Beauveria bassiana e 1 isolado de Paecilomyces fumosoroseus, provenientes de diferentes instituições para o controle da traça-das-crucíferas. Foi realizado um bioensaio, com os 10 isolados em uma mesma concentração (1x108 conídios/ml). Folhas de couve foram banhadas com a solução de conídios dos fungos e oferecidas como alimentação as lagartas. Análises da atividade enzimática de duas proteases degradadoras de cutícula, Pr1 e Pr2, enzimas relacionadas diretamente com o processo de infecção do inseto pelo patógeno foram realizadas no Laboratório de Enzimologia da Universidade Federal de Sergipe. Os isolados 447© e 1213 apresentaram as maiores médias de mortalidade, sendo o 447© o mais virulento. Não foi confirmada uma correlação entre patogenicidade e atividadade enzimática para os isolados de fungos entomopatogênicos estudados. Este resultado não contradiz a influencia da atividade enzimática no processo de infecção e patogenicidade destes microrganismos, porém, confirma o quanto é complexo o estudo desta relação na interação patógeno hospedeiro. Os períodos de avaliação de 96 e 144 horas apresentaram os maiores valores de atividade para as duas enzimas avaliadas, coincidindo com o período de maior número de lagartas mortas.

O fungo entomopatogênico Beauveria felina produz as destruxinas, hexadepsipeptídeos cíclicos que apresentam diversas atividades biológicas, como por exemplo: atividade inseticida, fitotóxica, citotóxica contra células tumorais, atividade antiviral contra o vírus da hepatite B, dentre outras. Devido à atividade inseticida das destruxinas, os fungos que as produzem têm grande importância econômica. Assim, o objetivo deste trabalho foi realizar a otimização das condições de crescimento e produção das destruxinas pelo fungo Beauveria felina utilizando diferentes meios de cultivo, a fim de se isolar destruxinas em maiores quantidades para a avaliação de seu potencial tóxico. Foram utilizados métodos de planejamento experimental e análise multivariada para a otimização das condições de crescimento, resultando em três condições ótimas de cultivo para cada um dos meios de cultura MF, PDB e SBD. Em todas as condições ótimas de cultivo foram observadas destruxinas conhecidas, desconhecidas e destruxinas que não foram isoladas anteriormente de Beauveria felina. O cultivo de Beauveria felina no meio PDB foi o que mais apresentou destruxinas desconhecidas (5). Em seguida foi realizada uma otimização das condições de análise cromatográfica de destruxinas por CLAD-DAD-DELE-EM e a validação deste método. Uma das frações obtidas do meio de cultura de Beauveria felina apresentou atividade vermífuga contra Haemonchus contortus. Duas de suas frações purificadas, P1 (destruxina Ed1 - m/z 625 e pseudodestruxina B ou pseudodestruxina C - isobáricas, m/z 669) e P7 (destruxina D ou hidroxihomodestruxina B ou roseotoxina C - isobáricas, m/z 623), foram ativas contra o carrapato bovino Rhipicephalus microplus. / The entomopathogenic fungus Beauveria felina produces destruxins, cyclic hexadepsipeptides which have several biological activities, such as insecticidal, phytotoxic, cytotoxic against tumor cells, antiviral activity against hepatitis B virus, among others. Because of the insecticidal activity of destruxins, fungi that produce them have a considerable economic importance. Therefore the aim of this study was to optimize the conditions for the growth of Beauveria felina and its production of destruxins by using different culture media, in order to isolate larger quantities for the evaluation of their toxic potential. Experimental design and multivariate analysis were used for the optimization of growth conditions, resulting in three conditions for optimum growth for each of the culture media MF, PDB and SBD. Both known and unknown destruxins were observed in each of the optimal conditions, along with destruxins that were not previously isolated from Beauveria felina. The cultivation of Beauveria felina in PDB was the one that showed the largest amount of unknown destruxins (5). We then carried out an optimization of the chromatographic analysis of destruxins by HPLC-PDA-ELSD-MS and the validation of this method. One of the fractions obtained from the culture medium of Beauveria felina showed anthelmintic activity against Haemonchus contortus, while two of its purified fractions, P1 (destruxin Ed1 - m/z 625 and pseudodestruxin B or pseudodestruxin C - isobaric m/z 669) and P7 (destruxin D or hydroxyhomodestruxin B or roseotoxin C - isobaric m/z 623), were active against the cattle tick Rhipicephalus microplus.

Catalysts are utilized in 80% of all chemical synthesis operations. The industrial catalysts primarily used in oxidation reactions are highly polluting and expensive metal catalysts. Enzymes and whole cell biocatalysts are used to a lesser extent. Nowadays, several industrial sectors are developing bio-based technologies to reduce the high costs and environmental impact of traditional chemical processes. However, these applications are limited by the challenge of developing economically competitive biologically based systems. The key for adopting these sustainable advancements is the development of novel process designs, which assure robustness, simplicity, and sustainabile operations compatible with the current development of chemical reactions. In this regard, filamentous fungi may be considered good biocatalysts due to their natural biodiversity and their broad heterogeneous enzymatic pattern. The great selectivity of fungal catalysis is now well recognized for the production of commercially valuable steroids in the pharmaceutical industry. Although this inherent capacity is mainly used for functionalization of unactivated carbons, it can be further exploited for the oxidiation of heteroatoms, such as sulfur. Focusing on the oxidation of sulfur compounds, the widely used industrial processes are produced by an organometallic catalyst. This PhD project aims to overcome low substrate conversion and enzymatic expression by proving that exposure of cells to insecticides and hydrocarbons increases cell's oxidative capacity expressed as higher substrate conversion and CYP450 content. This study is focused in the application of pest management strategies, designed to enhance the biopesticide's efficacy, to induce and improve Beauveria bassiana oxidation. B. bassiana has a very flexible metabolism and is widely used as a biocontrol agent. It can metabolize hexadecane as a sole carbon source. In addition, it shows a synergistic effect over pest control efficacy when it is applied with low pesticides (carbaryl and/or imidacloprid) concentrations. A biocatalytic system was optimized to increase the conversion of organosulfur compounds under different fermentation conditions. Phenothiazine was used as our model substrate. Phenothiazine conversion was followed by GC-MS and HPLC. By NMR and MS fragmentation pattern product, phenothiazine metabolites were identified as (R)-hydroxyl metabolites (63% enatiomeric excess) and sulfoxide, the latter being the main metabolite. Phenothiazine conversions with growing cells resulted in 65±1.4% conversion with initial phenothiazine concentration of 500 ppm and final 325 ppm after 7 days. The highest conversion, 74±1 % was achieved with resting cells at the lowest cell concentration, 0.78 mg cell dry weight (cdw) /mL. Furthermore, the use of insecticides as inducers was an effective way to increase phenothiazine conversion from 47% to 64±3%. The major enzymes involved in catalysis of xenobiotic are heme-binding monooxygenases, in particular cytochrome P450. Heme positive proteins were identified by an SDS benzidine assay as well as the content of CYP450 by the CO difference spectrum. The P450 enzymes content was 12.3±1 pmol/µg protein for hexadecane adapted cells and 8.1± 1 pmol/µg protein for insecticides, respectively. The heme-positive proteins were characterized by MALDI-ToF and their peptide mass fingerprint compared to the available sequences on the SwissProt/Universal Protein Resource catalog of information on proteins (UniProtKB). Hemoproteins were found, including a cluster of catalase-peroxidase, alkane hydroxylase, and chloroperoxidase. The results from this project helped bridge the progress from agricultural biotechnology strain development into industrial biotechnology biocatalyst improvement. The success of this project helps us expand B. bassiana's catalysis and make it a better candidate for industrial biocatalysis.

Zugl.: Hohenheim, Univ., Diss., 2006

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-18T17:55:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 367298 bytes, checksum: b649be35d1d2a5a68ae2778092338d9f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T17:55:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 367298 bytes, checksum: b649be35d1d2a5a68ae2778092338d9f (MD5) Previous issue date: 2002-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os programas de erradicação de pragas têm dado maior ênfase ao controle biológico como alternativa para minimizar o uso de agentes químicos e se reduzir a destruição de inimigos naturais no agroecossistema cafeeiro, a resistência em insetos-praga e a contaminação ambiental por resíduos químicos. Este trabalho foi dividido em duas etapas, com a primeira abordando a penetração da broca (Hypothenemus hampei) (Coleoptera: Scolytidae) em frutos de café em diferentes fases de crescimento e a segunda etapa a seletividade de defensivos agrícolas ao fungo entomopatogênico Beauveria bassiana. A primeira etapa foi conduzida em cafezal de três anos de idade, com duas variedades de café Coffea arabica (catuaí vermelho e mundo novo) e uma de Coffea canephora (conilon), na área experimental do aeroporto da Universidade Federal de Viçosa (UFV) em Viçosa, Minas Gerais. Determinou-se os tempos fisiológicos (graus-dia) em que os frutos da florada principal de cada uma das três variedades de café atingiram estágio fenológico adequado para a penetração da broca-do-café Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae). Além disso, determinou-se, também o intervalo durante o trânsito dessa praga, quando suas fêmeas adultas saem à procura de novos frutos e têm capacidade de penetrá-los para se reproduzir, e, consequentemente, aumentar sua população. Foram feitas considerações para a utilização dos tempos fisiológicos (graus-dia) para a tomada de decisão em programas de manejo integrado da broca do café. O inseto penetrou no mesocarpo de 50% dos frutos brocados com percentuais de umidade de 78,5; 77,4 e 75,6% e peso da matéria seca acumulada de 18,1; 28,5 e 4,8 mg. Isto equivaleu ao tempo fisiológico em graus-dia acumulados de 1825, 1943 e 1176 graus-dia para o catuaí vermelho, mundo novo e conilon, respectivamente e constitui o período de maior trânsito da broca nas variedades testadas, sendo, portanto, o momento ideal para realização de amostragem e eventuais intervenções com inseticidas. A broca tem capacidade de penetrar grãos mais jovens da variedade conilon, provavelmente devido aos menores percentuais de umidade de seus frutos durante os primeiros estágios de desenvolvimento e pode determinar maior número de gerações da broca e, consequentemente maiores percentuais de infestação nesta variedade. A utilização de faixas com vegetação nativa entre variedades de café pode ser importante para o manejo da broca H. hampei, pois variedades com floradas tardias ficam expostas a maiores populações dessa broca, que se reproduzem em frutos de variedades precoces. Além disto, essas faixas podem aumentar as populações de inimigos naturais e impedir a movimentação da praga entre talhões de café. Na segunda etapa, avaliou-se a toxicidade relativa dos inseticidas organofosforados clorpirifós-metílico, dissulfotom, etiom, paratiom-metílico; do organoclorado endosulfam; da mistura do fungicida + inseticida triadimenol + dissulfotom e dos fungicidas inibidores da demetilação de esteróis: triadimenol e tebuconazole, ao fungo Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin, patógeno da broca do café, foi estudada em laboratório. As concentrações dos pesticidas que inibiram 99% do crescimento micelial desse fungo, em miligramas de ingrediente ativo por mL, foram: tebuconazole= 0,42; paratiom-metílico= 1,69; triadimenol= 6,53; triadimenol + dissulfotom= 14,42; clorpirifós-metílico= 31,75; etiom= 7.028,96; endosulfam= 10.326,76 e dissulfotom= 763.959,86. As equações de regressão da inibição do crescimento micelial (%), em função da concentração obtidas por ensaios in vitro, em meio batata-dextrose-ágar (BDA), impregnado com os ingredientes ativos destes compostos, foram usadas para se estimar a seletividade das concentrações de pesticidas prescritas para cafezais, pelos seus respectivos fabricantes. Tebuconazole, paratiom-metílico e clorpirifós- metílico foram altamente tóxicos ao fungo B. bassiana; endosulfam e triadimenol + dissulfotom apresentaram seletividade moderada e o triadimenol, etiom e dissulfotom foram seletivos para B. bassiana. / This research was developed in a three years old coffee plantation formed by two varieties of Coffee arabica “ (catuaí vermelho and novo mundo)” and one of Coffea canephora “(conilon)” in an experimental area of the Universidade Federal de Viçosa (UFV), in the Municipality of Viçosa, State of Minas Gerais, Brasil. The period (degree-days) when fruits of the main bloom of each one of these three coffee varieties reached appropriate phenological stage for penetration of the borer Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) was calculated. The period of movement of this pest when its adult females come out to search for new fruits to be colonized and consequently this borer can increase its population were also evaluated. Considerations were made aiming to use the physiological time (degree-day) for decision making in integrated management programs of the coffee borer. This insect penetrates into the mesocarpo of about 50% of coffee fruits sampled with humidity of 78.5; 77.4 and 75.6% and accumulated dry weight of 18.1; 28.5 and 4.8 equivalent mg with an accumulated degree-day at the physiological time of 1,825, 1,943 and 1,176 degree-day for the catuaí vermelho, novo mundo and conilon coffee varieties, respectively. This represents the period of movement of this borer and the ideal moment of sampling and eventual control of this pest with insecticides. H. hampei penetrates into younger coffee fruits of the conilon variety probably due to their lower humidity during initial development stages. For this reason this borer can have a higher number of cycles in this coffee variety and, consequently a higher percentage of infestation. Management H. hampei populations in coffee plantations should include different varieties per plantation and the use of strips of native vegetation between them. This is necessary because later bloom coffee varieties are exposed to higher populations of this pest which reproduce in precocious ones. Besides, strips of native vegetation can increase populations of natural enemies and to difficult movement of this pest between areas planted with coffee. Studies about relative toxicity of the organofosforate insecticides methyl clorpiriphos, dissulfoton, ethion, methyl parathion and the organoclorinated endosulfan, besides a mixture of the fungicide + insecticide (triadimenol + dissulfoton) and a fungicide which inhibits sterol demetilation: triadimenol and tebuconazole to the fungi Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin pathogen of the coffee borer was evaluated in laboratory. Concentrations of pesticides with inhibition of 99% of micelial growth of this fungi in milligrams of active ingredient per mL were: tebuconazole= 0.42; methyl parathion= 1.69; triadimenol= 6.53; triadimenol + dissulfotom= 14.42; methyl clorpiriphos= 31.75; ethion= 7,028.96; endosulfam= 10,326.76 and dissulfotom= 763,959.86. Regression equations of micelial growth (%) as function of concentration obtained in vitro in half potato-destroxe-agar (BDA) impregnated with active ingredients of these compounds were used to estimate the selectivity of their concentrations prescribed for coffee plantations. Tebuconazole, methyl parathion and methyl clorpiriphos were highly toxic to B. bassiana; endosulfan and triadimenol + dissulfoton presented moderate selectivity and triadimenol, ethion and dissulfotom were selective to this fungi. / Dissertação importada do Alexandria