This thesis deals with the application of BEAS-2B cell line for micronucleus assay in genetic toxicology. It is divided into two main parts: a) theoretical introduction to the analysis and search for suitable models for testing the impact of air pollution and manufactured nanoparticles, b) practical part that describes the results of micronuclei induction by polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), extractable organic matter (EOM) from diesel exhaust particles obtained from emissions of three types of fuel and engineered nanoparticles. BEAS-2B cell line is a nonmalignant human model of lung epithelium which seems to be suitable for micronucleus assay. This assay is commonly used for determining the genotoxicity of various substances to wide variety of cell cultures and also in human studies. In this thesis, the following substances were tested: benzo[a]pyrene, 3-nitrobenzanthrone and 1-nitropyrene as carcinogenic PAHs commonly found in polluted air; EOMs from exhaust particles of 100 % diesel fuel, a blend of diesel fuel and 30 % of biodiesel, 100 % biodiesel and two types of engineered nanoparticles (TiO2 and Ag). The cells were treated with the compounds for 28, 48 and 72 hours. The results confirm the suitability of BEAS-2B cell line as a model for testing the genotoxicity of substances under...

La stéatose est la pathologie hépatique la plus répandue dans le monde, touchant environ 25 % de la population générale et jusqu’à 80 % des personnes en surpoids ou obèses. Cette maladie se traduisant par l’enrichissement des hépatocytes en triglycérides, est considérée comme bénigne. Cependant, environ 20 % des personnes atteintes de stéatose développent une stéatohépatite, pathologie caractérisée par une mort cellulaire et une inflammation et représentant un stade favorable au développement du carcinome hépatocellulaire. Les causes et mécanismes impliqués dans la progression de la stéatose vers la stéatohépatite sont encore à préciser. L’obésité, l’exposition aux contaminants environnementaux et la consommation d’alcool sont trois facteurs participant au développement des pathologies hépatiques. Pourtant, l’effet de l’interaction entre ces différents facteurs sur les pathologies hépatiques n’est pas connu. Dans ce contexte, cette thèse a eu pour objectif d’étudier l’impact d’une co-exposition au benzo[a]pyrène (B[a]P), un contaminant carcinogène environnemental, et à l’éthanol, utilisé à de faibles doses, sur les cellules hépatiques WIF-B9, présentant une stéatose préalable. Les résultats obtenus ont permis de démontrer qu’une telle exposition induit une progression de la stéatose hépatique vers un stade apparenté à une stéatohépatite, marquée par une augmentation de la mort cellulaire et de l’inflammation. Nous avons mis en évidence que la mort cellulaire résulterait de l’activation de p53 et d’une peroxydation lipidique. Une activation du récepteur aux hydrocarbures aromatiques et une production de monoxyde d’azote sont à l’origine de ces évènements via une modification du métabolisme de l’éthanol et du B[a]P conduisant à des dommages à l’ADN dépendants de la formation d’anion peroxynitrite. / Steatosis is the most common form of liver disease in the world, affecting around 25 % of the general population and up to 80 % of obese people. The disease is defined by the accumulation of triglycerides in hepatocytes and is generally considered as a benign condition. However, around 20 % of people with steatosis develop steatohepatitis, a disease characterized by cell death and inflammation, a condition that favors the development of hepatocellular carcinoma. The causes and mechanisms involved in the progression from steatosis to steatohepatitis are yet not fully understood. Obesity, exposure to environmental contaminants and alcohol consumption are three major factors contributing to the development of liver diseases. However, is still not yet clear what is the effect of the interaction between these different factors on liver diseases. In this context, the aim of this study was to evaluate the impact of a co-exposure to benzo[a]pyrene (B[a]P), an environmental carcinogenic contaminant, and ethanol, used at low doses, in WIF-B9 hepatic cell line, with a prior steatosis . The results demonstrate that this type of co-exposition induces a progression of hepatic steatosis to a steatohepatitis-like stage, marked by an increased cell death and an inflammation. We have shown that in this condition, cell death results from the activation of p53 and lipid peroxidation. Activation of the aromatic hydrocarbon receptor and production of nitric oxide are the origin of these events by a modification of both ethanol and B[a]P metabolism leading to peroxynitrite-dependent DNA damage.

This dissertation presents experimental and instrumentation developments that take full advantage of the multidimensional nature of line narrowing spectroscopy at liquid nitrogen (77 K) and liquid helium (4.2 K) temperatures. The inconvenience of sample freezing procedures is eliminated with the aid of cryogenic fiber optic probes. Rapid collection of multidimensional data formats such as wavelength time matrices, excitation emission matrices, time-resolved excitation emission matrices and time resolved excitation emission cubes is made possible with the combination of a pulsed tunable dye laser, a spectrograph and an intensifier-charged coupled device. These data formats provide unique opportunities for processing vibrational luminescence data with second order multivariate calibration algorithms. The use of cryogenic fiber optic probes is extended to commercial instrumentation. An attractive feature of spectrofluorimeters with excitation and emission monochromators is the possibility to record synchronous spectra. The advantages of this approach, which include narrowing of spectral bandwidth and simplification of emission spectra, were demonstrated with the direct analysis of highly toxic dibenzopyrene isomers. The same is true for the collection of steady-state fluorescence excitation-emission matrices. These approaches provide a general solution to unpredictable spectral interference, a ubiquitous problem for the analysis of organic pollutants in environmental samples of unknown composition. Since commercial spectrofluorimeters are readily available in most academic institutions, industrial settings and research institutes, the developments presented here should facilitate the widespread application of line-narrowing spectroscopic techniques to the direct determination, no chromatographic separation, of highly toxic compounds in complex environmental matrixes of unknown composition.

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Le benzo-a-pyrène (BaP) est un hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP) cancérogène pour l’homme, qui contamine toutes les sphères de notre environnement. Son métabolite, le BaP-7,8-diol-9,10-époxyde (BPDE) est considéré comme son cancérogène ultime. Le BPDE se lie à l’ADN, formant des adduits qui doivent être réparés et qui seraient responsables des dommages à l’ADN et de la cancérogenèse induite par le BaP. Les adduits BPDE-ADN et les dommages à l’ADN (bris simple-brin [BSB] à l’ADN, aberrations chromosomiques [AC], échanges entre chromatides-sœurs [ÉCS] et micronoyaux [MN]) ont été mesurés dans les lymphocytes humains exposés à de faibles concentrations de BaP, provenant de jeunes volontaires non-fumeurs et en santé. Suite à l’exposition au BaP, le niveau d’adduits BPDE-ADN et la fréquence des AC et des MN augmentent significativement, puis diminuent aux concentrations les plus élevées de BaP testées, suggérant une induction du métabolisme de phase II du BaP. Lors de la mesure des ÉCS, nous obtenons une courbe dose-réponse linéaire, indiquant la production d’un autre type de lésions devant être réparées par le système de réparation par recombinaison homologue. Ces lésions pourraient être des bris à l’ADN ou des bases oxydées (8-OH-dG), ce qui est suggéré par l’analyse des corrélations existant entre nos biomarqueurs. Par ailleurs, la comparaison de la courbe dose-réponse des hommes et des femmes montre que des différences existent entre les sexes. Ainsi, les ÉCS, les AC et les MN sont significativement augmentés chez les hommes à la plus faible concentration de BaP, alors que chez les femmes cette augmentation, quoique présente, est non significative. Des différences interindividuelles sont également observées et sont plus importantes pour les adduits BPDE-ADN, les MN et les AC, alors que pour les ÉCS elles sont minimes. Les analyses statistiques effectuées ont permis d’établir que quatre facteurs (niveau d’exposition au BaP, adduits BPDE-ADN, fréquence des AC et nombre de MN par cellule micronucléée) expliquent jusqu’à 59 % de la variabilité observée dans le test des ÉCS, alors qu’aucun facteur significatif n’a pu être identifié dans le test des AC et des MN. L’analyse du mécanisme de formation de nos biomarqueurs précoces permet de suggérer que les bris à l’ADN et les bases oxydées devraient être classées comme biomarqueurs de dose biologique efficace, au sein des biomarqueurs d’exposition, dans le continuum exposition-maladie du BaP, étant donné qu’ils causent la formation des biomarqueurs de génotoxicité (ÉCS, AC et MN). Par ailleurs, le test des AC et des MN ont permis de confirmer l’action clastogénique du BaP en plus de mettre en évidence des effets aneugènes affectant surtout la ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire. Ces effets aneugènes, reliés à l’étape de progression dans la cancérogenèse, pourraient être particulièrement importants puisque l’exposition au BaP et aux HAP est chronique et dure plusieurs années, voire des décennies. La compréhension des mécanismes régissant la formation des biomarqueurs étudiés dans cette étude, ainsi que des relations existant entre eux, peut être appliquée à de nombreux contaminants connus et émergents de notre environnement et contribuer à en évaluer le mode d’action. / Benzo-a-pyrene (BaP) is a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) classified as carcinogenic to human, and is present throughout our environment. Metabolic activation of BaP leads to production of BaP-7,8-diol-9,10-epoxide (BPDE), considered as its ultimate carcinogenic metabolite. BPDE can bind to DNA, forming BPDE-DNA adducts at the origin of BaP-induced DNA damage and carcinogenesis. BPDE-DNA adducts and DNA damages (DNA single-strand breaks [SSBs], chromosomal aberrations [CAs], sister chromatid exchanges [SCEs] and micronuclei [MNs]) are measured in human lymphocytes exposed to low BaP concentrations, taken from non-smoking healthy young subjects. Following BaP exposure, BPDE-DNA adduct levels, as well as CA and MN frequencies raise significantly, and then decrease to the higher BaP concentrations tested, suggesting metabolic enzyme saturation or induction of BaP phase II metabolism. As for SCEs test, a linear dose response curve is obtained, suggesting that production of additional DNA lesions requiring homologous recombination repair may occur. These lesions could be DNA breaks or oxidized DNA bases (8-OH-dG), as indicated by correlation analysis performed between our biomarkers. Additionally, when comparing the dose-response curves for men and women separately, some differences show up. Indeed, SCEs, CAs, and MNs are significantly increased in men at the lowest BaP concentration tested, while in women, this increase is present but not significant. Interindividual differences are also present and are more considerable for BPDE-DNA adducts, MNs and CAs, whereas they are very low for SCEs. Statistical analysis showed that four factors (BaP exposure level, BPDE-DNA adducts, CA frequency and number of MN per micronucleated cell) significantly explained up to 59 % of observed variability in SCE test, while no such factors could explain the observed variability in CA and MN test. Following analysis of mechanisms underlying the formation of early biomarkers, we suggest a modification of the Exposure-Disease Continuum of BaP. We propose that DNA breaks and oxidized DNA bases should be classified as biomarkers of biologically effective dose (part of the exposure biomarkers), as their presence are at origin of early biomarkers of genotoxicity (SCEs, CAs and MNs). On the other hand, CA and MN tests confirmed clastogenic properties of BaP, and highlighted aneugenic effects influencing mostly chromosome segregation during cell division. These aneugenic effects, linked to the progression step of carcinogenesis, could be of particular importance given that exposure to BaP and other PAHs (smoking, occupational exposure) are chronic and may last for decades. Understanding the mechanisms playing a role in early biomarkers formation, as well as the relations existing between them, can be largely applied in our environment to many known and emerging contaminants, thus contributing to characterize their mode of action.

Existeix certa controvèrsia sobre els efectes del b-carotè com a promotor o protector del càncer de pulmó. A més, el b-carotè, com a precursor de l'àcid retinoic, podria estimular la termogènesi i regular l'adipositat corporal. La fura representa un bon model per estudiar els efectes de la ingesta de b-carotè ja que l'absorbeix de manera pràcticament intacta (semblant als humans). Hem demostrat que el b-carotè ingerit amb altres antioxidants no sembla tenir efectes inductors del càncer ja que no augmenta la proliferació cel·lular al pulmó i a més prevé els efectes del carcinogen benzo[a]pirè. D'altra banda, dosis farmacològiques de b-carotè fan a la fura efectes contraris als de l'àcid retinoic, ja que augmenten l'adipositat i resulten en una menor capacitat termogènica, principalment al teixit adipós retroperitoneal que, a la fura, presenta certes característiques de teixit adipós marró, ja que té un percentatge considerable d'adipòcits multiloculars i expressa quantitats significatives d'UCP1. / Existe controversia sobre los efectos del b-caroteno como promotor o protector del cáncer de pulmón. Además, el b-caroteno, como precursor del ácido retinoico, podría estimular la termogénesis y regular la adiposidad corporal. El hurón representa un buen modelo para estudiar los efectos de la ingesta de b-caroteno pues lo absorbe de manera prácticamente intacta (similar a los humanos). Hemos demostrado que el b-caroteno ingerido con otros antioxidantes no parece tener efectos inductores del cáncer puesto que no aumenta la proliferación celular del pulmón y además previene los efectos del carcinógeno benzo[a]pireno. Por otra parte, dosis farmacológicas de b-caroteno producen en el hurón efectos contrarios a los del ácido retinoico, ya que aumentan la adiposidad y reducen la capacidad termogénica, principalmente del tejido adiposo retroperitoneal que, en el hurón, presenta ciertas características de tejido adiposo marrón, al contener un porcentaje considerable de adipocitos multiloculares y expresar cantidades significativas de UCP1. / The effects of b-carotene promoting or protecting against lung cancer are unclear. Furthermore, b-carotene, as retinoic acid precursor, could induce thermogenesis and regulate body adiposity. The ferret represents a good model to study the effects of oral administration of b-carotene because it absorbs it almost intact (similarly to humans). We have shown that the intake of b-carotene together with other antioxidants does not seem to inducecancer as it does not increase cellular proliferation in lung and prevents the effects of the carcinogen benzo[a]pyrene. In addition, pharmacological b-carotene doses in ferrets have different effects from retinoic acid, increasing adiposity and decreasing thermogenic capacity, especially in the retroperitoneal adipose tissue which, in ferrets, resembles brown adipose tissue, since it has an important percentage of multilocular adipocytes and expresses significant amount of UCP1.

Le benzo-a-pyrène (BaP) est un hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP) cancérogène pour l’homme, qui contamine toutes les sphères de notre environnement. Son métabolite, le BaP-7,8-diol-9,10-époxyde (BPDE) est considéré comme son cancérogène ultime. Le BPDE se lie à l’ADN, formant des adduits qui doivent être réparés et qui seraient responsables des dommages à l’ADN et de la cancérogenèse induite par le BaP. Les adduits BPDE-ADN et les dommages à l’ADN (bris simple-brin [BSB] à l’ADN, aberrations chromosomiques [AC], échanges entre chromatides-sœurs [ÉCS] et micronoyaux [MN]) ont été mesurés dans les lymphocytes humains exposés à de faibles concentrations de BaP, provenant de jeunes volontaires non-fumeurs et en santé. Suite à l’exposition au BaP, le niveau d’adduits BPDE-ADN et la fréquence des AC et des MN augmentent significativement, puis diminuent aux concentrations les plus élevées de BaP testées, suggérant une induction du métabolisme de phase II du BaP. Lors de la mesure des ÉCS, nous obtenons une courbe dose-réponse linéaire, indiquant la production d’un autre type de lésions devant être réparées par le système de réparation par recombinaison homologue. Ces lésions pourraient être des bris à l’ADN ou des bases oxydées (8-OH-dG), ce qui est suggéré par l’analyse des corrélations existant entre nos biomarqueurs. Par ailleurs, la comparaison de la courbe dose-réponse des hommes et des femmes montre que des différences existent entre les sexes. Ainsi, les ÉCS, les AC et les MN sont significativement augmentés chez les hommes à la plus faible concentration de BaP, alors que chez les femmes cette augmentation, quoique présente, est non significative. Des différences interindividuelles sont également observées et sont plus importantes pour les adduits BPDE-ADN, les MN et les AC, alors que pour les ÉCS elles sont minimes. Les analyses statistiques effectuées ont permis d’établir que quatre facteurs (niveau d’exposition au BaP, adduits BPDE-ADN, fréquence des AC et nombre de MN par cellule micronucléée) expliquent jusqu’à 59 % de la variabilité observée dans le test des ÉCS, alors qu’aucun facteur significatif n’a pu être identifié dans le test des AC et des MN. L’analyse du mécanisme de formation de nos biomarqueurs précoces permet de suggérer que les bris à l’ADN et les bases oxydées devraient être classées comme biomarqueurs de dose biologique efficace, au sein des biomarqueurs d’exposition, dans le continuum exposition-maladie du BaP, étant donné qu’ils causent la formation des biomarqueurs de génotoxicité (ÉCS, AC et MN). Par ailleurs, le test des AC et des MN ont permis de confirmer l’action clastogénique du BaP en plus de mettre en évidence des effets aneugènes affectant surtout la ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire. Ces effets aneugènes, reliés à l’étape de progression dans la cancérogenèse, pourraient être particulièrement importants puisque l’exposition au BaP et aux HAP est chronique et dure plusieurs années, voire des décennies. La compréhension des mécanismes régissant la formation des biomarqueurs étudiés dans cette étude, ainsi que des relations existant entre eux, peut être appliquée à de nombreux contaminants connus et émergents de notre environnement et contribuer à en évaluer le mode d’action. / Benzo-a-pyrene (BaP) is a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) classified as carcinogenic to human, and is present throughout our environment. Metabolic activation of BaP leads to production of BaP-7,8-diol-9,10-epoxide (BPDE), considered as its ultimate carcinogenic metabolite. BPDE can bind to DNA, forming BPDE-DNA adducts at the origin of BaP-induced DNA damage and carcinogenesis. BPDE-DNA adducts and DNA damages (DNA single-strand breaks [SSBs], chromosomal aberrations [CAs], sister chromatid exchanges [SCEs] and micronuclei [MNs]) are measured in human lymphocytes exposed to low BaP concentrations, taken from non-smoking healthy young subjects. Following BaP exposure, BPDE-DNA adduct levels, as well as CA and MN frequencies raise significantly, and then decrease to the higher BaP concentrations tested, suggesting metabolic enzyme saturation or induction of BaP phase II metabolism. As for SCEs test, a linear dose response curve is obtained, suggesting that production of additional DNA lesions requiring homologous recombination repair may occur. These lesions could be DNA breaks or oxidized DNA bases (8-OH-dG), as indicated by correlation analysis performed between our biomarkers. Additionally, when comparing the dose-response curves for men and women separately, some differences show up. Indeed, SCEs, CAs, and MNs are significantly increased in men at the lowest BaP concentration tested, while in women, this increase is present but not significant. Interindividual differences are also present and are more considerable for BPDE-DNA adducts, MNs and CAs, whereas they are very low for SCEs. Statistical analysis showed that four factors (BaP exposure level, BPDE-DNA adducts, CA frequency and number of MN per micronucleated cell) significantly explained up to 59 % of observed variability in SCE test, while no such factors could explain the observed variability in CA and MN test. Following analysis of mechanisms underlying the formation of early biomarkers, we suggest a modification of the Exposure-Disease Continuum of BaP. We propose that DNA breaks and oxidized DNA bases should be classified as biomarkers of biologically effective dose (part of the exposure biomarkers), as their presence are at origin of early biomarkers of genotoxicity (SCEs, CAs and MNs). On the other hand, CA and MN tests confirmed clastogenic properties of BaP, and highlighted aneugenic effects influencing mostly chromosome segregation during cell division. These aneugenic effects, linked to the progression step of carcinogenesis, could be of particular importance given that exposure to BaP and other PAHs (smoking, occupational exposure) are chronic and may last for decades. Understanding the mechanisms playing a role in early biomarkers formation, as well as the relations existing between them, can be largely applied in our environment to many known and emerging contaminants, thus contributing to characterize their mode of action.

Magister Scientiae - MSc (Chemistry) / Pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are known for their toxic effects which may lead to the cause of degenerative diseases in both humans and animals. PAHs are widespread in the environment, and may be found in water, food, automotive industry and petrochemical industries to name but a few sources. Literature reports have highlighted industrial workplace exposure to PAHs as a leading cause for development of cancer in workers. Particularly, workers in the petrochemical industry are adversely affected and the incidence of skin and lung cancer in this population group is high. The United States of America in its guidelines developed by environmental protection agency (EPA) has identified 18 PAHs as priority pollutants. Among these are anthracene, benzo[a]pyrene and pyrene which have been selected as the focal point of this study due to their significance in the petrochemical industry. Due to the carcinogenic and mutagenic properties reported in literature for certain PAHs, there have been monitoring procedures taken in most countries around the world. The commonly used analytical methods for the detection of PAHs from industrial samples are high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to fluorescence detection, membrane filtration, ozonation and reverse osmosis. Analysis of PAHs from the petrochemical industry is typically performed by HPLC method as well as sono-degredation in the presence of oxygen and hydrogen peroxide.

L’exposition prénatale à différents agents toxiques est généralement étudiée en considérant le placenta comme une barrière entre la mère et le fœtus ; nous le considérons en tant qu’organe cible des agents toxiques. Pour ce faire, nous avons sélectionné un modèle cellulaire de trophoblastes adapté aux études toxicologiques. En clinique, des pathologies de la grossesse sont associées à des modifications de la sécrétion de l’hormone placentaire lactogène hPL et de l’hormone gonadotrope chorionique hCG. Nos travaux in vitro ont permis de faire le lien entre une exposition à des micropolluants (le mono(2-ethylhexyl) phtalate, un perturbateur endocrinien, et le benzo(a)pyrene, un carcinogène) et ces observations cliniques. Les biomarqueurs de sécrétion hormonale (hPL et hCG hyperglycosylée) et de dégénérescence (activation du purinorécepteur P2X7) que nous avons identifiés permettent de détecter l’exposition et le risque suite à une exposition à des polluants. / Prenatal exposure to pollutants is commonly evaluated using placenta as a barrier between mother and fetus. Here, we consider placenta as a target organ for toxic agents. To achieve this, we selected a trophoblastic cell model, which is adapted to toxicological studies. In clinical studies, pregnancy pathologies are associated to changes in human placental lactogen (hPL) and human chorionic gonadotropin (hCG) secretions. Our in vitro work links exposure to micropollutants (mono(2-ethylhexyl)phthalate, an endocrine disruptor, and benzo(a)pyrene, a carcinogen) and clinical observations. We identified biomarkers of hormonal secretion (hPL and hyperglycosylated hCG) and degeneration (P2X7 receptor activation), which enable the evaluation of exposure and risk attached to exposure to pollutants.