Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-11T19:15:47Z No. of bitstreams: 2 TESE Dyana Leal Veras.pdf: 6559035 bytes, checksum: 43988c4ed7fb791a6e593067fb17b1eb (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T19:15:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Dyana Leal Veras.pdf: 6559035 bytes, checksum: 43988c4ed7fb791a6e593067fb17b1eb (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-24 / O objetivo deste trabalho foi determinar a ação in vitro de antibióticos β-lactâmicos em isolados de Klebsiella pneumoniae portadores dos genes blaKPC, blaSHV, blaTEM ou blaCTX-M, desenvolvendo embasamento teórico para futura proposição de novas combinações terapêuticas. Sete isolados de K. pneumoniae foram utilizados, sendo 3 clínicos, 2 de comunidade e 2 de microbiota. Os isolados clínicos e de comunidade são portadores de genes codificantes de ESBL ou KPC e os de microbiota de -lactamases clássicas. Os genes de resistência foram identificados por PCR e seqüenciados utilizando primers específicos. A primeira fase deste estudo identificou os efeitos ultra-estruturais causados por -lactâmicos in vitro nos isolados clínicos e de microbiota de K. pneumoniae. Os isolados clínicos foram submetidos a concentrações clinicamente relevantes de ceftazidima, cefotaxima, aztreonam e/ou imipenem e os isolados de microbiota a ampicilina e amoxicilina, para análise pela Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e Varredura (MEV). Diferentes alterações morfológicas e ultra-estruturais foram identificadas, como filamentação celular, perda de material citoplasmático e deformação dos septos de divisão, após submissão aos antibióticos, tanto nos isolados clínicos de K. pneumoniae como nos obtidos de microbiota. A segunda fase deste estudo determinou a influência destes antibióticos na produção de cápsula polissacarídica (CPS) nos isolados clínicos e de comunidade de K. pneumoniae. Os isolados foram submetidos a concentrações clinicamente relevantes de cefotaxima, ceftazidima, aztreonam e/ou imipenem para analise pela MET, utilizando citoquímica de carboidratos. Todos os isolados tiveram confirmação da presença da região promotora do operon envolvido na produção de CPS, identificado através de PCR e sequenciamento. A ceftazidima e o aztreonam foram capazes de inibir a produção de CPS nos isolados de K. pneumoniae produtores de ESBLs mas não no isolado produtor de KPC, o qual teve sua síntese fortemente inibida apenas pelo imipenem. A cefotaxima não interferiu na produção de CPS em nenhum dos isolados analisados. Nossos resultados demonstraram que antibióticos -lactâmicos possuem ação residual in vitro nos isolados analisados, sugerindo que a produção de ESBL e KPC por isolados de K. pneumoniae não são capazes de evitar completamente a interação de antibióticos β-lactâmicos com as PBPs bacterianas. Podemos concluir ainda que a ceftazidima, o aztreonam e o imipenem, podem ser capazes de inibir a produção de CPS em isolados clínicos e de comunidade de K. pneumoniae, contribuindo para diminuir a expressão do fator de virulência mais importante desta espécie bacteriana.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-06-10T18:51:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Natália Final.pdf: 1682940 bytes, checksum: 561b828b32fcd807e7f34e4daee835f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-10T18:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Natália Final.pdf: 1682940 bytes, checksum: 561b828b32fcd807e7f34e4daee835f6 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / Staphlylococcus desenvolveu a resistência aos betalactâmicos através de dois principais mecanismos, a expressão das betalactamases e a produção de PBP2a, codificadas pelos genes blaZ e mecA, respectivamente. Apesar da detecção do gene mecA por técnicas moleculares ser considerado o padrão ouro para a identificação das cepas de Staphlylococcus resistentes à meticilina (MRS), alguns estudos têm verificado discrepância entre a apresentação fenotípica da resistência à meticilina nessas cepas e a presença do gene mecA.O presente estudo teve como objetivo verificar se existe diferença de frequência do gene blaZ entre isolados clínicos de Staphylococcus spp. resistentes à meticilina portadores do gene mecA e os não portadores do gene. Foram estudados 47 isolados provenientes de amostras clínicas de hospital universitário da cidade do Recife. Essas amostras foram submetidas aos testes de susceptibilidade antimicrobiana, detecção do gene mecA para separação dos grupos de comparação e posterior detecção da presença de betalactamase através dos testes de cefinase em disco, Clover-Leaf e detecção do gene blaZ por PCR. Desta forma, foram observadas diferenças na frequência quando utilizados os testes fenotípicos para detecção. No teste de cefinase em disco, foram positivos 33,3% dos isolados portadores do gene mecA e 56,25% dos não portadores. No teste de Clover-Leaf, foi detectada a produção de betalactamase em 33,3% dos isolados portadores do gene mecA e 65,62% dos não portadores. Na pesquisa do gene blaZ, no entanto, não foi verificada diferença significativa nas frequências de detecção entre os grupos. Desta forma, indica-se o uso dos testes fenotípicos de detecção de produção de betalactamase, por apresentarem baixo custo e fácil operação, além de demonstrarem boa sensibilidade. / Staphlylococcus developed resistance to beta-lactam via two major mechanisms of beta-lactamase expression and production of PBP2a encoded by gene mecA and blaZ, respectively. Although the detection of the mecA gene by molecular techniques be considered the gold standard for identifying Staphlylococcus of methicillin-resistant strains (MRS), some studies have found discrepancies between the phenotypic presentation of methicillin resistance in these strains and the presence of the mecA gene. This study aimed to verify if there is frequency difference of blaZ gene among clinical isolates of Staphylococcus spp. methicillin-resistant carriers of mecA gene and non-carriers of the gene.47 isolates from clinical samples of University Hospital in Recife were studied.These samples were subjected to antimicrobial susceptibility tests and subsequent detection of mecA gene by PCR for separation of the comparison groups. After this, was performed to detect the production of beta-lactamase using the disk Cefinase tests, Clover Leaf and detection of blaZ gene by PCR. Thus, diferences in frequency were observed when phenotypics tests were used for detection. In Cefinase test disk,were positive 33.3% of the isolates carrying the mecA gene and 56.25% of non-carriers. In Clover-Leaf assay, the production of beta-lactamase was detected in 33.3% of isolates carrying the mecA gene and 65.62% of non-carriers.In search of blaZ gene, however, there was no significant difference in the frequency detection between groups. In this way, it indicates the use of phenotypic tests for detection of beta-lactamase production for having low cost and easy operation as well as demonstrating good sensitivity.

Multidrug resistant (MDR) extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing and carbapenem-resistant Gram-negative bacteria have become an international health issue limiting treatment options. The objective of this study was to determine the prevalence of carbapenem-susceptible (CS) and carbapenem-resistant (CR) Enterobacteriaceae, Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa and investigate clinical isolates for their resistant genes/ determinants. A total of 98 bacterial isolates (59 CS and 39 CR) were collected between February 2012 and February 2013 at NHLS, after being recovered from various clinical specimens from PE hospital complex. Antimicrobial susceptibility testing was performed using the VITEK 2® system, E-test and microbroth dilution method. PCR and DNA sequencing were used to investigate: (i) ESBLs: CTX-M, TEM, SHV and OXA-1; (ii) plasmidmediated quinolone resistance (PMQR) genes: qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, qepA and aac(6’)-lb-cr; (iii) Escherichia coli sequence type 131 (ST131); (iv) carbapenemases: NDM, VIM, IMP, KPC, BIC, SME, IMI, NMC-A, GES, OXA-23, OXA-24, OXA-48, OXA-51 and OXA-58; and (v) insertion sequence ISAba1 upstream blaOXA-23/-24/-51/-58 genes. Porin loss in CR isolates was determined by SDSPAGE while genetic relatedness between E. coli ST131 isolates was determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). MDR ESBL-producing Enterobacteriaceae (mainly K. pneumoniae) and CR A. baumannii isolates were recovered from neonatal/ infant specimens. The majority of CS and CR isolates were MDR, possessing multiple ESBL genotypes (CTX-M, TEM, SHV and OXA-1). ESBL variants identified included: CTX-M-1, CTX-M-3, CTX-M-15, CTX-M-22, CTX-M-9, CTX-M-14, TEM-1, SHV-1, SHV-11 and OXA-1. PMQRs identified included: aac(6’)- lb-cr, qnrB1, qnrB2, qnrB13 and qnrS1. Twelve of 21 (57.1 percent) E. coli isolates belonged to the ST131 clonal complex and were genetically diverse, mainly producing CTX-M-15. Carbapenem resistance mechanisms identified included: (i) OXA-23 preceded by ISAba1 in 10 A. baumannii and 2 P. aeruginosa isolates; (ii) IMI-2 carbapenemase in an E. asburiae isolate; and (iii) combination of porin loss and ESBL production in 1 K. pneumoniae and 1 E. coli isolate. This is the first report in South Africa describing the occurrence of CTX-M-9, CTX-M-22 and IMI-2 among Enterobacteriaceae; CTX-M-15 in A. baumannii; and OXA-23 in combination with OXA-51 in P. aeruginosa. However, resistance determinants could not be detected for 24 carbapenem-resistant isolates which requires further investigation.

A retrospective study (1990-1994) of the activities of ampicillin, unisyn, augmentin, ticarcillin, tinentin, piperacillin, and zosyn against several thousand isolates belonging to 8 species of bacteria (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Serratia marcensens, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus) in the Stockton area was reviewed. In addition, 233 isolates of the same species examined in 1994 were tested against the six penicillins and zosyn (in-house). The study shows that clavulanic acid 1 amoxicillin (Augmentin) combination has better activity than sulbactam 1 ampicillin combination (Unisyn) against E. coli, equal efficacy against K. pneumoniae, P. mirabilis, s. aureus but lesser active against E. cloacae, S. marcensens and ~ morganii. A comparison between the combination-drugs of clavulanic acidlticarcillin (Timentin) and tazobactaml piperacillin (Zosyn) generally indicates that they are equally effective on s. marcensens, M. morganii, ~ mirabilis, and s. aureus. Zosyn shows slightly better activity against E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae, and ~ aeruginosa.

No description available.

Membros da família Enterobacteriaceae podem causar meningite associada com infecções hospitalares e/ou secundárias. A terapia empírica utilizada em pacientes com suspeita de meningite é, às vezes, ineficiente, devido à produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL), que é o mecanismo mais comum de resistência às cefalosporinas de amplo espectro em enterobactérias. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de ESBL e AmpC por enterobactérias isoladas de líquido céfalo-raquidiano e sangue de pacientes com suspeita de meningite da região de Ribeirão Preto, no período de 2000 a 2005. O teste do disco combinado foi utilizado para a detecção fenotípica e a PCR foi utilizada para amplificar genes codificadores de ESBL e AmpC. Três (6,52 %) das 46 enterobactérias isoladas no período estudado foram produtoras de ESBL e abrigavam o gene blaCTX-M-2. As enterobactérias produtoras de ESBL foram: S. marcescens IAL 19, (isolada em Araraquara, 2002), P. mirabilis IAL 29 e E. coli IAL 45 (isoladas em Franca, respectivamente, 2003 e 2004). O gene blaCTX-M-2 foi detectado em três gêneros diferentes, sugerindo que o gene blaCTX-M é endêmicos na região de Ribeirão Preto. Os dados obtidos por este trabalho são importantes porque existem poucos relatos sobre a produção de ESBL por enterobactérias isoladas de líquido céfalo-raquidiano e sangue de pacientes com suspeita de meningite. / Members of Enterobacteriaceae family are cause of cause meningitis associated with nosocomial or secondary infection. The empiric therapy used in patients with suspicion of meningitis is, sometimes, inefficient due to extended-spectrum beta-lactamases (ESBL)- producing, that is the most common mechanism of resistance to cephalosporins in enterobacteria. The main objective of this study was to evaluate ESBL and AmpC-producing Enterobacteriaceae isolated of cerebrospinal fluid and blood from patients with suspicion of meningitis from the region of Ribeirão Preto city, during 2000 to 2005. Combination disk method was used for phenotypic detection and PCR was used to amplify genes encoding ESBL and AmpC. Three (6.52 %) out of 46 enterobacteria isolated in the period studied were detected as ESBL-producing and harbored the blaCTX-M-2 gene. The ESBL-producing enterobacteria were: S. marcescens IAL 19, (isolated in Araraquara city SP - Brazil, 2002), P. mirabilis IAL 29 e E. coli IAL 45 (isolated in Franca city SP- Brazil, respectively, 2003 e 2004). The blaCTX-M-2 gene was detected in three different genera isolated for a long time, suggesting that the blaCTX-M-2 gene is endemic in the region of Ribeirão Preto city. The data generated by this study are important because there are low reports about ESBL-producing enterobacteria isolated of cerebrospinal fluid and blood from patients with suspicion of meningitis.

INTRODUÇÃO: Cepas de Pseudomonas aeruginosa (PA) produtoras de Metalo-b- lactamase (MBL) tem sido reportadas como sendo uma importante causa de infecções nosocomiais assim como um grande problema terapêutico mundial. No complexo HC-FMUSP, o maior hospital universitário do Brasil, a prevalência de PA resistente aos carbapenêmicos também se apresenta de forma crítica. No entanto, a prevalência de MBL em nossa instituição e a padronização para detecção fenotípica deste mecanismo de resistência ainda não foram estabelecidos. OBJETIVOS: Determinar a prevalência de MBL em cepas de PA resistentes ao imipenem; comparar métodos fenotípicos e moleculares na detecção de MBL; avaliar a clonalidade dos isolados produtores de MBL e determinar o perfil de suscetibilidade de todos os isolados incluídos no estudo. MÉTODOS: Foi realizado um estudo retrospectivo com 69 cepas de PA resistentes ao imipenem isoladas de hemoculturas de pacientes do HC-FMUSP no ano de 2005. Os isolados foram submetidos ao teste de suscetibilidade pelo método de microdiluição e Etest® para colistina. Estes foram testados para a produção de MBL pelos métodos fenotípicos de Disco Aproximação (DA), Etest® MBL e Teste de Hodge Modificado (THM). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada para detecção dos seguintes genes: (blaSPM-1, blaIMP-1, blaIMP-2, blaVIM-1 e blaVIM-2). A clonalidade dos isolados produtores de MBL foi avaliada por Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE). RESULTADOS: Cinqüenta e três cepas (76.8%) foram positivas pelos métodos de DA e Etest® MBL, e 19 cepas (27.5%) foram positivas pelo THM. Vinte e um isolados (30.4%) demonstraram o gene blaMBL por PCR, sendo que 17 (81%) foram positivos para o gene blaSPM-1 e 4 (19%) para o gene blaVIM-2. Os genes blaIMP-1, blaIMP-2 e blaVIM-1 não foram detectados. O inibidor ácido 2-mercaptoacético (MAA) e o THM mostram a melhor concordância com a PCR, com índices de kappa variando de 0.81 a 0.86 e 0.79, respectivamente O ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), demonstrou alta sensibilidade (100%), baixa especificidade (33.3%), e pobre concordância com a PCR. Entre os isolados positivos para o gene blaSPM-1, 5 foram indistinguíveis, 11 foram estreitamente relacionados e 1 possivelmente relacionado. Entre os isolados positivos para o gene blaVIM-2, 2 foram indistinguíveis, 1 foi estreitamente relacionado e 1 diferente. Entre os isolados produtores de MBL, a colistina e o aztreonam foram as drogas mais ativas com 90.5% e 85.7% de sensibilidade, respectivamente. CONCLUSÃO: Este é o primeiro relato de PA produtora de MBL no HC-FMUSP, reforçando a epidemiologia brasileira onde a enzima SPM-1 é a mais prevalente entre isolados de PA. Os métodos de DA com o inibidor MAA e o THM mostraram-se boas opções para detecção fenotípica de MBL em laboratórios de microbiologia. Os produtores de MBL demonstraram fenótipo multiresistente com um padrão clonal, enfatizando a necessidade de práticas de controle de infecções em nossa instituição / INTRODUCTION: Pseudomonas aeruginosa (PA) strains Metallo-b-lactamase (MBL) producing have been reported as an important cause of nosocomial infection, also becoming a critical therapeutic problem worldwide. At HC-FMUSP complex, the largest teaching hospital in Brazil, the prevalence of PA resistant to carbapenems is also presented as a critical problem. However, MBL prevalence and the standardization for phenotypical detection of this resistance mechanism still had not been established. PURPOSE: To determine MBL prevalence in PA resistant to imipenem; to compare phenotypic and molecular methods to detect MBL; to evaluate the clonality of the MBL producers strains and to determine the susceptibility profile of all isolates included in this study. METHODS: A retrospective study was carried analyzing 69 PA strains resistant to imipenem isolated from blood cultures of patients at HC-FMUSP during 2005. They were submitted to the susceptibility profile test by microdilution method and Etest® to colistin. The isolates were also tested for MBL production by phenotypic methods like Double Disk Synergy (DDS), Etest® MBL, Modified Hodge Test (MHT). The Polimerase Chain Reaction (PCR) was used to detect the following genes: (blaSPM-1, blaIMP-1, blaIMP-2, blaVIM-1 and blaVIM-2). The clonality of the MBL producers was evaluated by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). RESULTS: Fifty-three isolates (76.8%) had positive results with DDS and Etest® MBL, and 19 isolates (27.5%) were positive by MHT. Twenty-one isolates (30.4%) had a blaMBL gene by PCR, being 17 (81%) positive for blaSPM-1 and 4 (19%) for blaVIM-2. The blaIMP-1, blaIMP-2 and blaVIM-1 genes had not been detected. Mercaptoacetic acid (MAA) inhibitor and MHT showed the best agreement with PCR, with kappa value ranging from 0.81 to 0.86 and 0.79, respectively. Etilenodiaminotetracetic acid (EDTA) inhibitor showed high sensibility (100%), low specificity (33.3%), and poor agreement with PCR. Among isolates producing blaSPM-1 gene, 5 were indistinguishable, 11 were closely related and 1 was possibly related. Among isolates producing blaVIM-2 gene, 2 were indistinguishable, 1 closely related and 1 was different. Among MBL-producing strains, colistin and aztreonam were the most active drugs with 90.5% and 85.7% of sensitivity, respectively. CONCLUSION: This is the first report of PA MBL producers at HCFMUSP, reinforcing the Brazilian epidemiology where SPM-1 enzyme is the most prevalent among PA isolates. The DDS method with MAA inhibitor and MHT had the best agreement with PCR, showing themselves as good options for MBL phenotypical detection in microbiology laboratories. The MBL producers had shown multiresistant phenotype with a clonal standard, reinforcing the necessity of infection control practices in our institution

A resistência aos carbapenêmicos em amostras de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp aumentou na última década. Vários surtos causados por esses agentes já foram descritos no Brasil. O presente estudo comparou métodos fenotípicos de triagem de carbapenemase em P. aeruginosa e Acinetobacter spp. isolados de hemoculturas de pacientes internados no HC-FMUSP. Foram estudados 108 isolados de P. aeruginosa identificados por sistema automatizado Vitek® e 50 isolados Acinetobacter spp. identificados pelo método miniaturizado API20NE. A determinação inibitória mínima dos carbapenêmicos foi realizada pela técnica de microdiluição em caldo e a tipagem molecular pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE). Os genes codificadores de carbapenemase foram identificados por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e foi avaliada a hidrólise de imipenem de todos os isolados positivos para esses genes. Sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo e positivo dos testes fenotípicos foram calculados usando como padrão-ouro a detecção dos genes codificadores das carbapenemases por PCR. Nos isolados de Acinetobacter spp, foram pesquisados os genes das oxacilinases, dos quais quarenta e nove (98%) apresentaram pela técnica de PCR genes codificadores da enzima Oxa-51-like, sendo que um isolado não apresentou essa enzima e após sequenciamento do gene codificador da porção 16S do RNA ribossomal, foi considerado da espécie A. calcoaceticus. Em trinta e oito (76%) dos isolados foi detectado o gene blaOXA-143, em nove (18%) foi detectado o gene blaOXA-23, sendo que sete desses isolados pertenciam ao mesmo clone. Apenas cinco (10%) isolados de Acinetobacter spp apresentaram o gene blaIMP-1. Para os isolados de P. aeruginosa o gene blaSPM-1 foi o mais frequente sendo identificado em vinte e um (19,4%) dos isolados e quatro (3,7%) foi identificado com o gene blaVIM-2. Nove dos vinte e um isolados positivo para gene blaSPM-1, apresentaram a mesma clonalidade. O gene codificador blaGES-5 foi encontrado em quatro (3,7%) dos isolados de P. aeruginosa. Dos vinte quatro isolados P. aeruginosa que apresentaram gene codificador da M?L, apenas um isolado não hidrolisou IMI entre os Acinetobacter spp e apenas dois dos cincos isolados positivos para o gene codificador de M?L, hidrolisaram o IMI e apresentaram inibição com o EDTA. Dos vários testes fenotípicos realizados, os melhores resultados foram observados com Etest® M?L para ambos microrganismos com sensibilidade de 100%, mas esse teste foi pouco específico. Para os isolados de Acinetobacter spp o melhor resultado foi observado com o teste de aproximação de disco de IMI com disco de ABM, que apresentou sensibilidade de 100% e especificidade de 71% e para P. aeruginosa foi a aproximação de disco de CAZ com um disco de EDTA, que apresentou sensibilidade de 48% e especificidade de 93%. O presente estudo verificou que não existe um único teste fenotípico que consiga identificar carbapenemases nesses isolados e que a performace dos testes varia de acordo com as carbapenemases encontradas / Carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp increased in the last decade. Several outbreaks caused by these agents resistant to carbapenems have been reported in Brazil. This study compared several phenotypic methods for screening of carbapenemase in P. aeruginosa and Acinetobacter spp isolated from blood cultures of hospitalized patients in HCFMUSP. One hundred and eight isolates were studied of P. aeruginosa identified by the automated system Vitek® and fifty isolates Acinetobacter spp identified by the API20NE method miniaturized. The determination of cabapenem minimum inhibitory was performed by the microdilution broth. Molecular typing was performed using the technique of pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Genes encoding carbapenemase were identified by the technique of polymerase chain reaction (PCR) and was evaluated by hydrolysis of imipenem of all the positives isolates. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive value of phenotypic tests were calculated using as the gold standard the detection of genes encoding carbapenemases by PCR. Oxacilinases genes were evaluated in isolates of Acinetobacter spp, of which forty-nine (98%) exhibited by PCR enzyme- encoding gene OXA-51-like, and the one isolate that did not show this enzyme, after gene sequencing encoding portion 16S ribosomal RNA was considered the species A. calcoaceticus. In thirty-eight (76%) isolates the gene OXA-143- like was detected and seven belonged to the same clone. Only five (10%) isolates of Acinetobacter spp showed the gene blaIMP-1. For the isolates of P. aeruginosa, gene blaSPM-1 was the most frequent being present in twenty-one (19,4%) isolates and four (3,7%) was identified with the gene blaVIM-2. Nine of the twenty-one isolates positive for gene blaSPM-1, showed the same clonality. The gene encoding blaGES-5 was found in four (3,7%) isolates of P. aeruginosa. Among the twenty-four isolates P. aeruginosa harboring M?L, not only one isolated hydrolyzed IMI, between Acinetobacter spp two of five isolates harboring M?L hydrolyzed IMI that was inhibited by EDTA. Of the various phenotypic tests conducted, the best results were observed for Etest® for both micro-organisms with sensitivity 100%, but this test was not specific. For the isolates of Acinetobacter spp best result was observed in the nearest IMI disk a disk of ABM, which had a sensitivity of 100% and specificity of 71% and for P. aeruginosa was approaching CAZ disk with a disk EDTA which had a sensitivity of 48% and specificity of 93%. This study verified that there is no single phenotypic test which can identify those isolates carbapenemases and that the performance of the tests various according to carbapenemases found

A resistência aos carbapenêmicos em amostras de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp aumentou na última década. Vários surtos causados por esses agentes já foram descritos no Brasil. O presente estudo comparou métodos fenotípicos de triagem de carbapenemase em P. aeruginosa e Acinetobacter spp. isolados de hemoculturas de pacientes internados no HC-FMUSP. Foram estudados 108 isolados de P. aeruginosa identificados por sistema automatizado Vitek® e 50 isolados Acinetobacter spp. identificados pelo método miniaturizado API20NE. A determinação inibitória mínima dos carbapenêmicos foi realizada pela técnica de microdiluição em caldo e a tipagem molecular pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE). Os genes codificadores de carbapenemase foram identificados por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e foi avaliada a hidrólise de imipenem de todos os isolados positivos para esses genes. Sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo e positivo dos testes fenotípicos foram calculados usando como padrão-ouro a detecção dos genes codificadores das carbapenemases por PCR. Nos isolados de Acinetobacter spp, foram pesquisados os genes das oxacilinases, dos quais quarenta e nove (98%) apresentaram pela técnica de PCR genes codificadores da enzima Oxa-51-like, sendo que um isolado não apresentou essa enzima e após sequenciamento do gene codificador da porção 16S do RNA ribossomal, foi considerado da espécie A. calcoaceticus. Em trinta e oito (76%) dos isolados foi detectado o gene blaOXA-143, em nove (18%) foi detectado o gene blaOXA-23, sendo que sete desses isolados pertenciam ao mesmo clone. Apenas cinco (10%) isolados de Acinetobacter spp apresentaram o gene blaIMP-1. Para os isolados de P. aeruginosa o gene blaSPM-1 foi o mais frequente sendo identificado em vinte e um (19,4%) dos isolados e quatro (3,7%) foi identificado com o gene blaVIM-2. Nove dos vinte e um isolados positivo para gene blaSPM-1, apresentaram a mesma clonalidade. O gene codificador blaGES-5 foi encontrado em quatro (3,7%) dos isolados de P. aeruginosa. Dos vinte quatro isolados P. aeruginosa que apresentaram gene codificador da M?L, apenas um isolado não hidrolisou IMI entre os Acinetobacter spp e apenas dois dos cincos isolados positivos para o gene codificador de M?L, hidrolisaram o IMI e apresentaram inibição com o EDTA. Dos vários testes fenotípicos realizados, os melhores resultados foram observados com Etest® M?L para ambos microrganismos com sensibilidade de 100%, mas esse teste foi pouco específico. Para os isolados de Acinetobacter spp o melhor resultado foi observado com o teste de aproximação de disco de IMI com disco de ABM, que apresentou sensibilidade de 100% e especificidade de 71% e para P. aeruginosa foi a aproximação de disco de CAZ com um disco de EDTA, que apresentou sensibilidade de 48% e especificidade de 93%. O presente estudo verificou que não existe um único teste fenotípico que consiga identificar carbapenemases nesses isolados e que a performace dos testes varia de acordo com as carbapenemases encontradas / Carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp increased in the last decade. Several outbreaks caused by these agents resistant to carbapenems have been reported in Brazil. This study compared several phenotypic methods for screening of carbapenemase in P. aeruginosa and Acinetobacter spp isolated from blood cultures of hospitalized patients in HCFMUSP. One hundred and eight isolates were studied of P. aeruginosa identified by the automated system Vitek® and fifty isolates Acinetobacter spp identified by the API20NE method miniaturized. The determination of cabapenem minimum inhibitory was performed by the microdilution broth. Molecular typing was performed using the technique of pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Genes encoding carbapenemase were identified by the technique of polymerase chain reaction (PCR) and was evaluated by hydrolysis of imipenem of all the positives isolates. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive value of phenotypic tests were calculated using as the gold standard the detection of genes encoding carbapenemases by PCR. Oxacilinases genes were evaluated in isolates of Acinetobacter spp, of which forty-nine (98%) exhibited by PCR enzyme- encoding gene OXA-51-like, and the one isolate that did not show this enzyme, after gene sequencing encoding portion 16S ribosomal RNA was considered the species A. calcoaceticus. In thirty-eight (76%) isolates the gene OXA-143- like was detected and seven belonged to the same clone. Only five (10%) isolates of Acinetobacter spp showed the gene blaIMP-1. For the isolates of P. aeruginosa, gene blaSPM-1 was the most frequent being present in twenty-one (19,4%) isolates and four (3,7%) was identified with the gene blaVIM-2. Nine of the twenty-one isolates positive for gene blaSPM-1, showed the same clonality. The gene encoding blaGES-5 was found in four (3,7%) isolates of P. aeruginosa. Among the twenty-four isolates P. aeruginosa harboring M?L, not only one isolated hydrolyzed IMI, between Acinetobacter spp two of five isolates harboring M?L hydrolyzed IMI that was inhibited by EDTA. Of the various phenotypic tests conducted, the best results were observed for Etest® for both micro-organisms with sensitivity 100%, but this test was not specific. For the isolates of Acinetobacter spp best result was observed in the nearest IMI disk a disk of ABM, which had a sensitivity of 100% and specificity of 71% and for P. aeruginosa was approaching CAZ disk with a disk EDTA which had a sensitivity of 48% and specificity of 93%. This study verified that there is no single phenotypic test which can identify those isolates carbapenemases and that the performance of the tests various according to carbapenemases found

The prevalence of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) and carbapenemases is increasing worldwide. Therapeutic options for infections with these bacteria are limited not only by the production of ESBLs and carbapenemases, which confer resistance to cephalosporins and carbapenems, but also by frequent co-resistance to other antibiotics. The overall aim of this thesis was to obtain a better understanding of multidrug-resistant E. coli and K. pneumoniae in relation to epidemiology, selection and susceptibility to antibiotic therapy. In a prospective study ESBL-producing E. coli was found to spread easily through international travel. Twenty-four of 100 Swedes travelling outside Northern Europe acquired ESBL-producing E. coli in the intestinal flora. The risk was highest for travelers visiting India and those suffering from gastroenteritis during travel. To minimize selection of ESBL-producing K. pneumoniae during a hospital outbreak with these bacteria, an educational antibiotic intervention was performed at Uppsala University Hospital in 2006. The primary aim of the intervention was to reduce the consumption of parenteral cephalosporins. An immediate and radical reduction of cephalosporins was demonstrated with interrupted time series analysis. The outbreak declined during 2007 and no increased resistance to replacement antibiotics was detected. The impact of ESBL production on the antibacterial activity of ertapenem was studied in time-kill experiments. It was shown that porin-deficient subpopulations with reduced susceptibility to ertapenem frequently emerged in ESBL-producing E. coli during exposure to ertapenem at concentrations simulating human pharmacokinetics. Further, the antibacterial effects of antibiotic combinations against four strains of K. pneumoniae producing carbapenemases of the metallo-beta-lactamase type were studied in time-kill experiments. Double and triple combinations of aztreonam, fosfomycin, meropenem, rifampin and colistin at clinically relevant static concentrations were effective despite that the bacteria were frequently resistant to the individual drugs. These results indicate that there is a largely unexplored potential of antibiotic combination therapy for multidrug-resistant K. pneumoniae.