Im Blutplasma und auf Zelloberflächen bildet H-Kininogen entweder mit dem Blutgerinnungsfaktor XI oder Plasmakallikrein Komplexe. Die beiden Proteasenvorstufen binden über ihre homologen schweren Ketten, die jeweils aus vier Apple Domänen bestehen (F1-F4 bei Faktor XI und P1-P4 bei Kalllikrein), an HK. Die Kalllikrein/Kininogen Interaktion wird über Domäne P2 vermittelt. Im Gegensatz dazu soll FXI über F1 an Kininogen binden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Lokalisation der Kininogen-Bindungsstelle des Faktors XI und ein funktioneller Vergleich der Kalllikrein/Kininogen und Faktor XI/Kininogen Komplexe. Es zeigt sich, dass die relative Bindungsaffinität von HK an rekombinante Faktor XI-Einzeldomänen in der Reihenfolge F2 >> F4 > F1 >> F3 abfällt. Die Bedeutung der F2 Domäne für die Kininogen Bindung wird durch den monoklonale Antikörper αP2 unterstrichen, der die Faktor XI/Kininogen und die Kalllikrein/Kininogen Bindung mit einem apparenten IC50 von 8 nM blockiert und dessen Epitop auf die F2 Domäne kartiert wird. Eine Thrombozyten-spezifische Faktor XI-Splicevariante, der die N-terminale Hälfte der F2 Domäne fehlt, bindet 5-fach schlechter als Faktor XI an Kininogen. Nach Aktivierung wird Kallikrein und ein chimäres Faktor XI-Protein, bei dem F2 durch P2 ersetzt wurde, in P2 gespalten, was zur Verlust der Bindungsaffinität zu Kininogen führt. Im Gegensatz bleibt die Bindung von aktiviertem Faktor XI oder einem chimärem Kalllikrein-Protein, bei dem die P2 Domäne durch F2 ersetzt wurde, nach Aktivierung an Kininogen gebunden. Diese Daten zeigen, dass Faktor XI und Kallikrein über ihre Domänen 2 an Kininogen binden. Trotz homologer Bindungsmotive unterscheiden sich Faktor XI/Kininogen und Kallikrein/Kininogen Komplexe in ihrer Stabilität nach Aktivierung. Die Daten tragen dazu bei, die Regulation der Kallikrein-vermittelten Bradykininbildung bei Entzündungsprozessen und die Faktor XI-getriebene Fibrinbildung besser zu verstehen. / Factor XI (FXI), the zymogen of the blood coagulation protease FXIa, and the structurally homologous protein plasma prekallikrein circulate in plasma in non-covalent complexes with H-kininogen (HK). HK binds to the heavy chains of FXI and of prekallikrein. Each chain contains four apple domains (F1 - F4 for FXI; P1 - P4 for prekallikrein). Previous studies had indicated that the HK binding site on FXI is located in F1, while the major HK binding site on prekallikrein is on P2. To determine the contribution of each FXI apple domain to FXI/HK complex formation, we examined binding of recombinant single apple domain-tPA fusion proteins to HK. The order of affinity from highest to lowest is F2 >> F4 > F1 >> F3. Monoclonal antibodies against F2 are superior to F4 or F1 antibodies as inhibitors of HK binding to FXI. Antibody αP2, raised against prekallikrein, cross-reacts with FXI F2 and inhibits FXI/HK binding with an IC50 of 8 nM. HK binding to a platelet specific FXI variant lacking the N-terminal half of F2 is reduced > 5-fold compared to full-length FXI. A chimeric FXI molecule in which F2 is replaced by P2, is cleaved within P2 during activation by factor XIIa, resulting in greatly reduced HK binding capacity. In contrast, wild-type FXI is not cleaved within F2, and its binding capacity for HK is unaffected by factor XIIa. Our data show that HK binding to FXI involves multiple apple domains, with F2 being most important. The findings demonstrate a similarity in mechanism for FXI and prekallikrein binding to HK. Although the zymogens complex HK via homologous binding motives the stability of FXI/HK and kallikrein/HK complexes is largely diffent following activation. The data may help to understand kallikrein-driven bradykinin formation in inflammation and FXI-mediated fibrin generation in thrombosis.

Ziel der Dissertation „Neue künstliche Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren zur Komplexierung von Oxo-Anionen in Wasser“ war die Weiterentwicklung dieser Rezeptoren nach Schmuck für die Komplexierung insbesondere von Carboxylaten, um sie hinsichtlich Bindungsaffinität und Substratspezifität zu optimieren. Dazu wurde zunächst die Synthese zweier wichtiger Grundbausteine in einzelnen Schritten vollständig überarbeitet, wobei veränderte Reaktionsbedingungen und Aufarbeitungsschritte zu gesteigerten Ausbeuten führten. Dadurch ist es nun möglich, diese Bausteine effizienter zu synthetisieren und im Multigramm-Maßstab für die Darstellung von Rezeptoren zur Oxo-Anionen-Erkennung einzusetzen. Weiterhin wurde die Verbesserung der Komplexierungseigenschaften gegenüber Carboxylaten auf zwei Arten untersucht: zum einen durch das Anbringen eines zusätzlichen Seitenarms an der Guanidinio-Einheit zur Bildung von Guanidiniocarbonylpyrrol-Tweezer-Rezeptoren, zum anderen durch das Einführen einer zweiten positiven Ladung neben der Carboxylat-Bindungsstelle (CBS) zur Darstellung biskationischer Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren. Zur Darstellung von Tweezer-Rezeptoren wurde ein zusätzlicher Seitenarm an der N’-Position der Guanidinio-Einheit angebracht. Die beiden Arme sollten ein Substrat pinzettenartig von zwei Seiten, mit der CBS als Kopfgruppe, komplexieren können. Durch zusätzliche Wechselwirkungen des neuen Seitenarms sollte neben einer stärkeren Komplexierung vor allem eine höhere Substratspezifität erzielt werden. Die experimentell ermittelten Bindungskonstanten lagen allerdings im Bereich der N’-unsubstituierten Rezeptoren. Somit stellen die Tweezer-Modifikationen daher keine Verbesserung der Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren dar. In einem weiteren Projekt zur Rezeptor-Optimierung wurden, durch Einführung einer zweiten positiven Ladung in Form einer terminalen Ammonium-Gruppe, biskationische Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren erfolgreich synthetisiert. Die Komplexierungseigenschaften dieser biskationischen Rezeptoren wurden in Bindungsstudien vornehmlich mit Aminosäurecarboxylaten mittels UV- und Fluoreszenz-Spektroskopie, Massenspektrometrie, NMR-Spektroskopie, ITC und Molecular Modeling Berechnungen untersucht. Anhand der Substratspezifität der biskationischen Rezeptoren wurde deutlich, dass die Spacerlänge, an der die zusätzliche positive Ladung angebracht ist, eine entscheidende Rolle bei der Komplexierung spielte. Galten eigentlich starre, präorganisierte, kurze Linker als vorteilhaft hinsichtlich der Entropie, so ist hier zu erkennen, dass längere, flexiblere Linker zu einer besseren Komplexierung führen können, wenn geeignete zusätzliche nichtkovalente Wechselwirkungen möglich sind. Die biskationischen Rezeptoren stellen damit eine Optimierung des Carboxylat-Bindungsmotivs der Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren nach Schmuck in der Anionen-Erkennung dar. / The main focus of the thesis “New artificial guanidiniocarbonyl pyrrole receptors for the complexation of oxo-anions in water” is the optimization of these receptors introduced by Schmuck for the oxo-anion recognition, especially carboxylates, in aqueous solution. Therefore, the details of the synthesis of two important building blocks were completely revised and yields increased by changing reaction conditions, workup and isolation steps. The new optimized, facile and efficient synthetic route to these N-protected guanidinocarbonyl pyrrole derivatives allows now a multi-gram synthesis of these versatile compounds as needed for the synthesis for a variety of supramolecular anion binding motifs. Furthermore two strategies to optimize the anion recognition have been pursued: On the one hand tweezer receptors were developed by connecting an additional side chain to the head group at the N’-position of the guanidino group. On the other hand another second positive charge was introduced into the receptor besides the carboxylate binding site (CBS) by an ammonium group to get bis-cationic receptors The tweezer receptors were developed in order to complex the guest from more than one side. A second side chain, connected to the N’-position of the guanidinio motif, leads to this kind of receptor, with the CBS as a head group. By using additional non covalent interactions in both side chains, the association constant as well as the specificity should be increased. In case of the optimization of the binding properties, the tweezer receptors have showen binding properties similar to the N’-unsubstituted guanidiniocarbonyl pyrrole receptors with respect to association constants and specificity. For this reason the tweezer receptors were no improvement of the guanidiniocarbonyl pyrrole receptors. In another project for optimization of the binding properties several bis-cations were synthesized, with a simple primary ammonium cation attached via flexible linkers of varying length to a guanidiniocarbonyl pyrrole. In UV-binding studies in aqueous buffer these bis-cations have shown efficient binding of various N-acetyl amino acid carboxylates. Further investigations by fluorescence spectroscopy, mass spectrometry, NMR spectroscopy, ITC as well as molecular mechanics calculations confirm the complexation by participation of the second charge in the complexation of the carboxylic function and therefore an increasing in complex stability. It is generally assumed, that short and rigid linkers are better for complexation due to the entropy and that a steady decrease of a linker length increase the complex stability. However, this case shows, that complex stability can increase while increasing the flexibility of a linker until other non covalent interactions are possible. Hence, the bis-cationic receptors indeed represent an optimisation of the guanidiniocarbonyl pyrrole receptors for oxo-anion-binding.

Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen waren das retinaspezifische palmitoylierte Membranprotein 4 (engl. membrane palmitoylated protein 4, MPP4) und das ubiquitär exprimierte MPP5, die beide zur großen Familie der Membran-assoziierten Guanylatkinasen (engl. membrane-associated guanylate kinases, MAGUKs) gehören. Beide Proteine haben wichtige organisatorische Funktionen als Adapterproteine in der Netzhaut. MPP4 ist am Aufbau von präsynaptischen Proteinkomplexen in den Photorezeptor-Ribbonsynapsen beteiligt. Ein Fehlen von MPP4 in Mäusen führt zum Verlust von einigen präsynaptischen Proteinen von der Ribbonsynapse, was eine wichtige Rolle von MPP4 für die Organisation dieses Komplexes indiziert. Um neue Komponenten dieses Multiproteinkomplexes zu identifizieren, wurde in der vorliegenden Arbeit ein proteomischer Ansatz etabliert. Dazu wurde der MPP4-assoziierte Proteinkomplex aus Proteinextrakten der bovinen Retina durch Immunaffinitätschromatographie isoliert, mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt und resultierende Protein-spots massenspektrometrisch analysiert. Diese Untersuchungen identifizierten 18 kopräzipitierte Proteine. Darunter waren der bekannte Interaktionspartner Veli3 und das MAGUK-Protein PSD95. Für letzteres konnte gezeigt werden, dass speziell die β-Isoform von PSD95 mit MPP4 über die N-terminalen L27-Domänen heterodimerisiert. Daneben konnte die Assoziation von MPP4 mit Hsc70 und Recoverin durch unabhängige Bindungs-assays verifiziert werden, wobei diese Interaktionen indirekt waren und möglicherweise von retinaspezifischen Proteinen vermittelt werden. Diese Ergebnisse unterstützen die herausragende Rolle von MPP4 als Gerüstprotein für die Organisation eines Proteinkomplexes der Photorezeptorsynapse, der an der Regulierung der Ca2+-Homöostase in den präsynaptischen Enden, sowie vermutlich auch an der Exozytose der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Die übrigen kopräzipitierten Proteine waren Bestandteile des Zytoskeletts und verschiedener Signalwege und wahrscheinlich unspezifische Kontaminanten. Das MPP5-Protein ist Teil eines evolutionär konservierten Proteinkomplexes, der für die Entstehung und Aufrechterhaltung der apikobasalen Polarität in Epithelzellen eine wichtige Rolle spielt und in der Netzhaut für die speziellen Zellverbindungen zwischen Müller-Gliazellen und Photorezeptoren in der externen limitierenden Membran essentiell ist. Mutationen, die zu Störungen in der Funktion dieses Proteinkomplexes führen, verursachen retinale Defekte bei Mensch (z.B. Retinitis Pigmentosa, Lebersche kongenitale Amaurose), Maus, Zebrafisch und Fruchtfliege. Die PDZ-Domäne von MPP5 bindet an den C-Terminus der CRB-Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung einer Punktmutation in der PDZ-Domäne von MPP5 (V301N), funktionell untersucht. Diese hat im Zebrafisch eine fehlende Photorezeptoradhäsion und die Zerstörung der retinalen Architektur zur Folge. Es wurde gezeigt, dass die V301N-Mutation die Interaktion zwischen MPP5 und den drei CRB-Isoformen verhindert. Außerdem führt sie zu einer Fehllokalisierung von heterolog exprimiertem MPP5V301N in MDCK-Zellen, die zudem einen erhöhten transepithelialen Widerstand aufweisen. Über quantitative real-time PCR wurde in diesen Zellen eine verminderte Genexpression von Untereinheiten des apikalen epithelialen Natriumkanals ENaC und der basolateralen Na+/K+-ATPase festgestellt, was die Ursache für einen verminderten Ionenfluss durch die Zellschicht darstellen könnte. Somit übt heterolog exprimiertes MPP5V301N in MDCK-Zellen einen dominanten Effekt aus, der möglicherweise über einen Einfluss auf die Genregulation bestimmter Proteine vermittelt wird. Zur Untersuchung welche Auswirkungen die MPP5V301N-Mutation in vivo hat, wurde eine MPP5V301N-knock-in-Mauslinie generiert. Die bisherige Charakterisierung der Mäuse zeigte bei heterozygoten Tieren keinen äußerlich erkennbaren Phänotyp, wohingegen homozygote Mäuse nicht lebensfähig waren. Vermutlich führt das Vorkommen beider mutanter Allele in frühen embryonalen Stadien zum Abstoßen der Embryos. Das Mausmodell bietet die Basis für weitere Untersuchungen über die molekularen Konsequenzen einer Expression von MPP5V301N in der Netzhaut und anderen Geweben und wird Beiträge zur Aufklärung von Entstehungsmechanismen CRB1-MPP5-assoziierter Netzhauterkrankungen liefern. / The objects of the present study were the retina specific membrane palmitoylated protein 4 (MPP4) and the ubiquitous expressed MPP5 protein which belong to the large family of the membrane-associated guanylate kinase homologs (MAGUKs). Both proteins have important organizational functions as adaptor proteins in the retina. MPP4 is involved in the assembly of presynaptic protein complexes in the photoreceptor synapses. The absence of MPP4 in mice leads to the loss of several presynaptic proteins from the ribbon synapse indicating an important role for MPP4 in organizing this complex. This work was aimed to identify new components of this multiprotein complex by establishing a proteomic approach. More precisely, the MPP4-associated protein complex was isolated with immunoaffinity chromatography from bovine retinal protein extracts followed by two-dimensional electrophoresis and analysis of the resulting protein spots by mass spectrometry. This analysis identified 18 co-precipitated proteins. Among these molecules the known interacting partner Veli3 and the MAGUK protein PSD95 were detected. For the latter, a selective association between MPP4 and the PSD95-β isoform was demonstrated showing specific heterodimerization of their N-terminal L27 domains. Additionally independent binding assays verified the association of MPP4 with recoverin and Hsc70. These interactions seem to be indirect and are presumably mediated by retina specific proteins in vivo. In summary, these findings support a protruding role for MPP4 as scaffolding protein for the organization of a protein complex of the photoreceptor synapses, which is involved in the regulation of Ca2+ homeostasis within the presynaptic terminals and eventually plays a role in synaptic vesicle exocytosis. The remaining co-precipitated proteins represented cytoskeletal constituents and components of different pathways and were probably unspecific contaminants. The MPP5 protein, a member of the evolutionarily conserved CRB protein complex, plays an important role in establishing and maintaining the apicobasal polarity of epithelial cells. Furthermore, this complex is essential for specific cell junctions between Müller glia cells and photoreceptors in the outer limiting membrane of the retina. Mutations that disrupt the function of this protein complex were reported to cause retinal defects in human (e.g. retinitis pigmentosa, Leber’s congenital amaurosis), mouse, zebrafish and fruit fly. The PDZ domain of MPP5 binds to the C-terminus of the CRB proteins. The present study aimed to analyze the consequences of a point mutation within the PDZ domain of MPP5 (V301N). In zebrafish, this mutation resulted in the loss of photoreceptor adhesion and in the disruption of retinal layers. It was demonstrated that the V301N mutation prevents the interaction between MPP5 and the three CRB isoforms. Additionally, heterologously expressed MPP5V301N mislocalizes in MDCK cells which furthermore develop an increased transepithelial resistance. Quantitative real-time PCR revealed decreased gene expression levels for subunits of the apical epithelial sodium channel (ENaC) and the basolateral Na+/K+-ATPase, supposedly causing the reduced ion movement through the cell layer. Thus, heterologously expressed MPP5V301N apparently has a dominant effect in MDCK cells which might be mediated by an influence on the gene expression of other yet unknown proteins. To further elucidate the MPP5V301N mutation in vivo, a knock in mouse line was generated. So far the characterization of these mice revealed no apparent phenotype for heterozygous animals, whereas homozygous mice were not viable. The presence of both mutant alleles presumably results in a rejection at early embryonic stages. The mouse model provides the basis to further analyze molecular consequences of MPP5V301N expression in the retina and other tissues and will contribute to enlighten the development of CRB1-MPP5-associated retinal diseases.

Wassermoleküle spielen oft eine entscheidende Rolle bei der Bindung von Liganden an Proteine. Zum einen ist dies in ihrer Eigenschaft als Wasserstoffbrückendonor und -akzeptor begründet, die es ermöglicht Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor zu vermitteln. Zum anderen stellen die Desolvatisierungsenthalpie und -entropie einer Bindetasche während der Ligandbindung einen entscheidenden Anteil der Bindungsaffinität dar. Obwohl man sich dieser Einflüsse seit langem bewusst ist, sind aktuelle Methoden des computerbasierten Wirkstoffdesigns nur in sehr begrenztem Umfang in der Lage, die entsprechenden Effekte zu erfassen und vorherzusagen. Da experimentelle Daten über die Effekte von Wassermolekülen in Protein-Ligand Komplexen von Natur aus schwierig zu erhalten sind, untersucht die vorliegende Arbeit eine Modellbindetasche einer Cytochrom c Peroxidase Mutante (CCP W191G) mit Hilfe von Molecular Modeling Techniken. Diese polare und solvatisierte Kavität ist strukturell sehr gut charakterisiert und bindet kleine, kationische Heterozyklen zusammen mit unterschiedlichen Mengen an Wassermolekülen. Für die Untersuchungen wurden strukturell ähnliche Liganden mit einem unterschiedlichen Wechselwirkungsmuster ausgewählt. Davon ausgehend wurde die Möglichkeit zweier Docking-Programme, den Grad der Wasserverdrängung durch den Liganden zusammen mit dem Bindungsmodus vorherzusagen, untersucht. Die dynamischen Eigenschaften der Bindetaschenwassermoleküle wurden mittels Molekulardynamiksimulationen studiert. Schließlich wurden diese rein strukturellen Betrachtungen durch eine energetische/thermodynamische Analyse komplettiert. Die Anwendung dieser unterschiedlichen Verfahren liefert einige neue Erkenntnisse über die untersuchte Modellbindetasche. Trotz der relativen Einfachheit der kleinen Kavität der CCP W191G Mutante war die vollständige Charakterisierung und eine korrekte (retrospektive) Vorhersage des Wasser-Wechselwirkungsmuster der Ligand-Komplexe nicht trivial. Zusammenfassend kann man festhalten, dass insgesamt eine gute Übereinstimmung zwischen den durch Computersimulationen erhaltenen Ergebnissen und den kristallographischen Daten erzielt wurde. Unerwartete Befunde, die auf den ersten Blick mit den kristallographischen Beobachtungen nicht übereinstimmen, können ebenso durch Limitationen in den Kristallstrukturen bedingt sein. Darüber hinaus gaben die Ergebnisse auch eine Hilfestellung, welches Verfahren zur Beantwortung einer Fragestellung im Rahmen von Wassermolekülen im Wirkstoffdesign geeignet sind. Schließlich wurden ebenso die Begrenzungen der jeweiligen Methoden aufgezeigt. / Water molecules play an important role for the binding of small molecule ligands to proteins. One of the reasons for this is their ability to act as a hydrogen bond donor and acceptor at the same time. Additionally, the enthalpy and entropy of desolvation of the pocket is one large contribution to the overall binding affinity. Although this is long known, prediction of these effects by current methods of computer-aided drug design is rather limited. Since experimental information about water effects in protein-ligand complexes are inherently difficult to obtain, in the present work a well-suited model binding site of a mutant of the cytochrome c peroxidase (CCP W191G) is studied using molecular modeling techniques. This polar and solvated cavity is structurally very well characterized and several small, cationic heterocycles bind together with a different amount of water molecules. For this study structurally similar ligands which have a different interaction pattern where chosen. First, the ability of two docking programs to predict cavity desolvation upon ligand binding was investigated. The dynamic properties of the binding site water molecules where studied by means of molecular dynamic simulations. Ultimately, the pure structural considerations addressed in this work were complemented by an energetic/thermodynamic analysis. The application of the different methods offered some new insights into the studied model binding site. Despite the relative simplicity of the small cavity of the CCP W191G mutant, a complete characterization and a correct (retrospective) prediction of the water interaction network in ligand complexes of this model binding site is not trivial. In summary, an overall good agreement between computational results and crystallographic data is obtained. Unexpected findings, which at first sight disagree with crystallographic observations, may also be due to limitations of the crystal structures. In addition, the results help to decide which method is appropriate to address a certain question in the context of water molecules in drug design. Also, the limitations of the respective methods are exposed.

BAD (Bcl-2 antagonist of cell death, Bcl-2 associated death promoter) is a pro-apoptotic member of the Bcl-2 protein family that is regulated by phosphorylation in response to survival factors. Although much attention has been devoted to the identification of phosphorylation sites in murine BAD (mBAD), little data are available with respect to phosphorylation of human BAD (hBAD) protein. In this work, we investigated the quantitative contribution of BAD targeting kinases in phosphorylating serines 75, 99 and 118 of hBAD (Chapter 3.1). Our results indicate that RAF kinases phosphorylate hBAD in vivo at these established serine residues. RAF-induced phosphorylation of hBAD was not prevented by MEK inhibitors but could be reduced to control levels by use of the RAF inhibitor Sorafenib (BAY 43-9006). Consistently, expression of active RAF suppressed apoptosis induced by hBAD and the inhibition of colony formation caused by hBAD could be prevented by RAF. In addition, using surface plasmon resonance technique we analyzed the direct consequences of hBAD phosphorylation by RAF with respect to complex formation of BAD with 14-3-3 proteins and Bcl-XL. Phosphorylation of hBAD by active RAF promotes 14-3-3 protein association, whereby the phosphoserine 99 represents the major binding site. Furthermore, we demonstrate in this work that hBAD forms channels in planar bilayer membranes in vitro. This pore-forming capacity is dependent on phosphorylation status and interaction with 14-3-3 proteins. Additionally, we show that hBAD pores possess a funnel-shaped geometry that can be entered by ions and non-charged molecules up to 200 Da (Chapter 3.2). Since both lipid binding domains of hBAD (LBD1 and LBD2) are located within the C-terminal region, we investigated this part of the protein with respect to its structural properties (Chapter 3.3). Our results demonstrate that the C-terminus of hBAD possesses an ordered β-sheet structure in aqueous solution that adopts helical disposition upon interaction with lipid membranes. Additionally, we show that the interaction of the C-terminal segment of hBAD with the BH3 domain results in the formation of permanently open pores, whereby the phosphorylation of serine 118 proved to be necessary for effective pore-formation. In contrast, phosphorylation of serine 99 in combination with 14-3-3 association suppresses formation of channels. These results indicate that the C-terminal part of hBAD controls hBAD function by structural transitions, lipid binding and phosphorylation. Using mass spectrometry we identified in this work, besides the established in vivo phosphorylation sites at serines 75, 99 and 118, several novel hBAD phosphorylation sites (serines 25, 32/34, 97, 124 and 134, Chapter 3.1). To further analyze the regulation of hBAD function, we investigated the role of these newly identified phosphorylation sites on BAD-mediated apoptosis. We found that in contrast to the N-terminal phosphorylation sites, the C-terminal serines 124 and 134 act in an anti-apoptotic manner (Chapter 3.4). Our results further indicate that RAF kinases and PAK1 effectively phosphorylate BAD at serine 134. Notably, in the presence of wild type hBAD, co-expression of survival kinases, such as RAF and PAK1, leads to a strongly increased proliferation, whereas substitution of serine 134 by alanine abolishes this process. Furthermore, we identified hBAD serine 134 to be strongly involved in survival signaling in B-RAF-V600E containing tumor cells and found phosphorylation of this residue to be crucial for efficient proliferation in these cells. Collectively, our findings provide new insights into the regulation of hBAD function by phosphorylation and its role in cancer signaling. / BAD (Bcl-2 antagonist of cell death, Bcl-2 associated death promoter) ist ein pro-apoptotisches Mitglied der Bcl-2 Proteinfamilie und wird in Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren durch Phosphorylierung reguliert. Obwohl der Identifizierung von Phosphorylierungsstellen in murinem BAD (mBAD) in den vergangenen Jahren viel Aufmerksamkeit gewidmet wurde, ist die Phosphorylierung des humanen BAD (hBAD) Proteins kaum charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wird der quantitative Beitrag unterschiedlicher Kinasen in Bezug auf die Phosphorylierung der etablierten Phosphorylierungsstellen Serin 75, 99 und 118 von hBAD dargestellt (Kapitel 3.1). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass RAF-Kinasen hBAD in vivo an diesen etablierten Stellen phosphorylieren. Die RAF-bedingte Phosphorylierung konnte nicht durch MEK-Inhibitoren beeinflusst werden, dagegen bewirkte die Gabe des RAF-Inhibitors Sorafenib (BAY 43-9006) eine Reduktion der Phosphorylierung auf das Niveau der Kontrollproben. Übereinstimmend konnte durch die Expression von aktiven RAF-Kinasen die BAD-induzierte Apoptose sowie die BAD-bedingte Inhibierung der Koloniebildung unterdrückt werden. Zusätzlich verwendeten wir Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie um die Auswirkungen der RAF-bedingten BAD-Phosphorylierung auf die Komplexbildung von hBAD mit 14-3-3-Proteinen und Bcl-XL zu analysieren. Dabei wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung von hBAD durch aktive RAF-Kinasen die Assoziierung von 14-3-3 begünstigt, wobei Phosphoserin 99 die Hauptbindungsstelle darstellt. Weiterhin gelang der Nachweis, dass hBAD in vitro Poren in Lipid-Doppelschicht-Membranen bilden kann. Wir wiesen nach, dass die Fähigkeit von hBAD Poren zu bilden phosphorylierungsabhängig ist und durch die Interaktion mit 14-3-3-Proteinen beeinflusst wird. Außerdem demonstrieren wir in dieser Arbeit, dass die BAD-Poren eine zylinderförmige Geometrie aufweisen und sowohl für Ionen als auch für ungeladene Moleküle mit einer Größe von bis zu 200 Da zugänglich sind (Kapitel 3.2). Da beide Lipid-Bindungsstellen (LBD1 und LBD2) am C-Terminus des hBAD lokalisiert sind, charakterisierten wir des Weiteren diesen Teil des Proteins in Hinblick auf seinen strukturellen Aufbau (Kapitel 3.3). Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass der hBAD-C-Terminus in wässriger Lösung eine geordnete β-Faltblattstruktur aufweist und bei Eintritt in eine Lipidumgebung helikale Elemente ausbildet. Zusätzlich zeigen wir in dieser Arbeit, dass die Interaktion des C-terminalen hBAD-Segments mit der BH3-Domäne zur Ausbildung von permanent offenen Poren führt, wobei die Phosphorylierung an Serin 118 eine Notwendigkeit für effektive Porenbildung darstellt. In Gegensatz dazu bewirkte die Phosphorylierung von Serin 99 in Kombination mit der Assoziierung von 14-3-3-Protein eine Inhibierung der Porenbildung. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der C-terminale Teil von hBAD durch strukturelle Veränderungen, Lipidbindung und Phosphorylierung entscheidend die Funktion von hBAD reguliert. Mit Hilfe von Massenspektroskopie konnten wir im Rahmen dieser Arbeit, zusätzlich zu den etablierten Phosphorylierungsstellen Serin 75, 99 und 118, einige neue in vivo Phosphorylierungsstellen von hBAD identifizieren (Serin 25, 32/34, 97, 124 und 134, Kapitel 3.1). Um die Regulierung der Funktion von hBAD weiter zu analysieren, untersuchten wir die Rolle dieser neu identifizierten Phosphorylierungsstellen in Bezug auf die BAD-induzierte Apoptose (Kapitel 3.4). Wir fanden heraus, dass im Gegensatz zu den N-terminalen Phosphorylierungsstellen, die Phosphorylierungsstellen am C-Terminus an der Apoptoseregulation mitwirken. Weiterhin weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass RAF-Kinasen, neben PAK1, an der Phosphorylierung von Serin 134 von hBAD beteiligt sind. Interessanterweise bewirkte die Co-Expression von RAF oder PAK1 mit dem wildtypischen hBAD eine erhebliche Verstärkung der Zellproliferation. Diese verstärkte Proliferation konnte durch einen Serin-zu-Alanin-Austausch in hBAD an der Stelle 134 vollständig verhindert werden. Weiterhin entdeckten wir, dass die Phosphorylierung dieser Stelle in B-RAF-V600E enthaltenden Tumorzellen bei der Regulation der Zellproliferation mitwirkt und für eine effiziente Proliferation entscheidend ist. Zusammenfassend gewähren unsere Ergebnisse neue Einblicke in die Regulierung der Funktion von hBAD durch Phosphorylierung sowie in die Rolle von hBAD bei der Krebsentwicklung.

Die heterotetramere Proteinkinase CK2 nimmt aufgrund der großen Anzahl und Diversität ihrer Substrate, sowie aufgrund ihrer Eigenschaft Signalwege miteinander zu vernetzen eine Sonderstellung innerhalb der Kinasen ein. CK2 beeinflusst Proliferation, Differenzierung und Apoptose, Prozesse an denen auch Polyamine und der MAPK-Signalweg beteiligt sind. Eine vor kurzem durchgeführte Arbeit beschreibt die Bindung von CK2 an das Gerüstprotein KSR und die Verstärkung des MAPK-Signalwegs durch Phosphorylierung von Raf-Proteinen in Vertebraten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CK2 auch in Drosophila mit KSR interagiert und das einzige in Drosophila vorhandene Raf-Potein (DRaf) in vitro phosphoryliert. Im Gegensatz zur Phosphorylierung der humanen B-Raf und C-Raf Proteine an Serin 446 bzw. Serin 338 innerhalb der „negative charge regulatory region“ (N-Region), führten Kinasereaktionen und Massenspektrometrische Untersuchungen zur Identifizierung von Serin 11 als CK2 Phosphorylierungsstelle in DRaf, während ein zu Serin 446 in B-Raf äquivalentes Serin in der N-Region in Drosophila nicht durch CK2 phosphoryliert wird. Durch Überexpression von DRaf sowie von zwei DRaf-Varianten bei denen Serin 11 durch Alanin oder Aspartat substituiert wurde (DRafS11A und DRafS11D) konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, dass die Ladung an der Aminosäureposition 11 die Funktion von DRaf beeinflusst, wobei eine negative Ladung an dieser Stelle zur Phosphorylierung und Aktivierung der Effektorkinase Erk führt. Die Phosphorylierung durch CK2 ist unabhängig von regulatorischen Botenstoffen ("second messengers"), wird aber durch Bindung von Polyaminen moduliert. Intrazelluläre Polyamine entstammen zum grossen Teil dem zellulären Aminosäurekatabolismus und beeinflussen die Phosphorylierung von DRaf durch CK2 in vitro, wobei Spermin ein effizienter Inhibitor der Reaktion ist, während die Effekte von Putrescin und Spermidin gering sind. Auch in Drosophila Schneider S2 Zellen und in adulten weiblichen Fliegen hat Spermin einen inhibitorischen, CK2-abhängigen Effekt auf die Aktivierung von Erk. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass Putrescin und Spermidin in der Lage sind die Aktivierung von Erk, im Vergleich zu Zellen die nur mit Spermin behandelt wurden, zu erhöhen. Das spricht dafür, dass die Phosphorylierung von DRaf und die davon abhängige Aktivierung von Erk durch CK2 von der Menge und Relation der verschiedenen Polyamine zueinander abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass der Polyaminmetabolismus über CK2 mit dem MAPK-Signalweg verknüpft ist. Nachdem Polyamine durch Aminosäurekatabolismus enstehen, kann auf diese Weise der MAPK-Signalweg in Abhängigkeit der Verfügbarkeit zellulärer Aminosäuren reguliert werden. Vorversuche zeigten eine Beeinflussung von Proliferation und Apoptose durch CK2 und Polyamine. Weitere Untersuchungen sind aber nötig um spezifische Einflüsse von Polyaminen und CK2 auf zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose aufzudecken. / Because of its high number and diversity of substrates, as well as its ability to cross-link signalling pathways, the heterotetrameric protein kinase CK2 has an exceptional position within kinases. CK2 influences proliferation, differentiation and apoptosis, processes in which also polyamines and the MAPK-signalling pathway are involved. A recent publication delineates binding of CK2 to the scaffold protein KSR and the enhancement of the MAPK-signalling pathway by phosphorylation of Raf-proteins in vertebrates. In my thesis I could show that CK2 also interacts with KSR in Drosophila and phosphorylates the only existing Raf protein in Drosophila (DRaf) in vitro. In contrast to the phosphorylation of human B-Raf- and C-Raf-proteins on serine 446 respectively serine 338 within the "negative charge regulatory region" (N-region), kinase reactions and mass spectrometric analyses led to the identification of serine 11 as phosphorylation site in DRaf, whereas a serine in the N-region, which corresponds to serine 446 of B-Raf, is not phosphorylated by CK2 in Drosophila. In cell culture experiments overexpression of DRaf and two DRaf-variants, in which serine 11 was substituted by alanine or aspartate (DRafS11A and DRafS11D), revealed the charge at amino acid position 11 to affect the function of DRaf, with a negative charge leading to phosphorylation and activation of the effector kinase Erk. Phosphorylation by CK2 is independent of second messengers, whereas it is modified by binding of polyamines. Intracellular polyamines mainly derive from cellular amino acid catabolism and modulate the phosphorylation of DRaf by CK2 in vitro with spermine being an efficient inhibitor of the reaction, whereas the effects of putrescine and spermidine are minor. In Drosophila Schneider S2 cells and adult flies spermine inhibits the activation of Erk in a CK2-dependent way. Furthermore administration of putrescine and spermidine in combination with spermine leads to enhanced Erk activation in cells compared to cells that are treated with spermine. These results suggest that phosphorylation of DRaf and the subsequent activation of Erk by CK2 are dependent on the amount and relative concentrations of polyamines. Altogether the results of this work demonstrate a role for CK2 in linking polyamine metabolism to the MAPK-signalling pathway. Since polyamines derive from amino acid catabolism, the MAPK-signalling pathway can be regulated dependent on the availability of cellular amino acids. Preliminary experiments point to CK2- and polyamine-dependent effects on proliferation and apoptosis. Further investigations are necessary to reveal specific effects of polyamines and CK2 on cellular processes like proliferation, differentiation and apoptosis.

The transmission of proliferative and developmental signals from activated cell-surface receptors to initiation of cellular responses in the nucleus is synergically controlled by the coordinated action of a diverse set of intracellular signalling proteins. The Ras/Raf/MEK/MAPK signalling pathway has been shown to control the expression of genes which are crucial for the physiological regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Within this signalling cascade, the Raf protein family of serine/threonine kinases serves as a central intermediate which connects to many of other signal transduction pathways. To elucidate the signalling functions of the different Raf kinases in motoneurons during development, the expression, distribution and subcellular localization of Rafs in the spinal cord and the facial nucleus in brainstem of mice at various embryonic and postnatal stages were investigated. Moreover, we have investigated the intracellular redistribution of Raf molecules in isolated motoneurons from 13 or 14 day old mouse embryos, after addition or withdrawal of neurotrophic factors to induce Raf kinases activation in vitro. Furthermore, in order to investigate the potential anti-apoptotic function of Raf kinases on motoneurons, we isolated motoneurons from B-raf-/- and c-raf-1-/- mouse embryos and analysed the survival and differentiation effects of neurotrophic factors in motoneurons lacking B-Raf and c-Raf-1. We provide evidence here that all three Raf kinases are expressed in mouse spinal motoneurons. Their expression increases during the period of naturally occurring cell death of motoneurons. In sections of embryonic and postnatal spinal cord, motoneurons express exclusively B-Raf and c-Raf-1, but not A-Raf, and subcellularly Raf kinases are obviously colocalized with mitochondria. In isolated motoneurons, most of the B-Raf or c-Raf-1 immunoreactivity is located in the perinuclear space but also in the nucleus, especially after activation by addition of CNTF and BDNF in vitro. We found that c-Raf-1 translocation from the cytosol into the nucleus of motoneurons after its activation by neurotrophic factors is a distinct event. As a central finding of our study, we observed that the viability of isolated motoneurons from B-raf but not c-raf-1 knockout mice is lost even in the presence of CNTF and other neurotrophic factors. This indicates that B-Raf but not c-Raf-1, which is still present in B-raf deficient motoneurons, plays a crucial role in mediating the survival effect of neurotrophic factors during development. In order to prove that B-Raf is an essential player in this scenario, we have re-expressed B-Raf in mutant sensory and motor neurons by transfection. The motoneurons and the sensory neurons from B-raf knockout mouse which were transfected with exogenous B-raf gene revealed the same viability in the presence of neurotrophic factors as primary neurons from wild-type mice. Our results suggest that Raf kinases have important signalling functions in motoneurons in mouse CNS. In vitro, activation causes redistribution of Raf protein kinases, particularly for c-Raf-1, from motoneuronal cytoplasm into the nucleus. This redistribution of c-Raf-1, however, is not necessary for the survival effect of neurotrophic factors, given that B-raf-/- motor and sensory neurons can not survive despite the presence of c-Raf-1. We hypothesize that c-Raf-1 nuclear translocation may play a direct role in transcriptional regulation as a consequence of neurotrophic factor induced phosphorylation and activation of c-Raf-1 in motoneurons. Moreover, the identification of target genes for nuclear translocated c-Raf-1 and of specific cellular functions initiated by this mechanism awaits its characterization. / Die Vermittlung von wachstumsfördernden und entwicklungsspezifischen Signalen von aktivierten Zelloberflächenrezeptoren führt zur Initiation von Transkriptionsprogrammen im Zellkern, die durch das koodinierte Zusammenwirken von intrazellulären Signalproteinen synergistisch gesteuert werden. Der Ras/Raf/MEK/MAPK-Weg steuert die Expression von Genen für die physiologische Regulation der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Innerhalb dieser Signalkaskade stellen die Serin/Threonin Kinasen der Raf Familie eine zentrale Zwischenstufe dar, die Verbindungen zu vielen anderen Signaltransduktionswegen herstellt. Um die Funktionen der verschiedenen Raf-Kinasen in Motoneuronen während der Entwicklung aufzuklären, wurden die Expression, Verteilung und subzelluläre Lokalisation der Raf-Isoformen in spinalen Motoneuronen und im Nucleus Fazialis der Maus während der Embryonalentwicklung und postnatal untersucht. Desweiteren haben wir die intrazelluläre Umverteilung der Raf-Moleküle in isolierten Motoneuronen von 13 oder 14 Tage alten Mäusembryonen untersucht. Um die Rolle der Raf-Kinasen nach Zugabe oder Entzug von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen zu untersuchen, analysierten wir die Überlebens-und Differenzierungseffekte von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen von B-raf oder c-raf-1 defizienten Mäusen. Wir zeigen in dieser Arbeit, daß alle drei Raf-Kinasen in spinalen Motoneuronen der Mäuse exprimiert sind. Ihre Expression steigt während der Zeit des natürlich auftretenden Zelltods. An Schnitten von embryonalem und postnatalem Rückenmark exprimieren Motoneurone ausschließlich B-Raf and c-Raf-1, aber nicht A-Raf. Raf-Kinasen sind offensichtlich an Mitochondrien lokalisiert. In isolierten Motoneuronen findet man B-Raf und c-Raf-1, Immunreaktivität vor allem im perinukleären Bereich, aber auch im Zellkern, vor allem nach Aktivierung durch Zugabe von CNTF und BDNF in vitro. Wir haben gefunden, daß die Translokation von c-Raf-1 vom Zytosol in den Nukleus von Motoneuronen nach Aktivierung durch neurotrophe Faktoren ein spezifischer Vorgang ist. Als zentralen Befund dieser Arbeit beobachteten wir, daß Motoneurone von B-raf-/-, aber nicht von c-raf-1-/-, Embryonen nicht lebensfähig sind, auch nicht in Gegenwart von CNTF oder anderer neurotropher Faktoren. Dies bedeutet, daß B-Raf und nicht c-Raf-1, welches noch immer in B-raf defizienten Motoneuronen präsent ist, eine entscheidende Rolle als Vermitter des Überlebenseffektes von neurotrophen Faktoren spielt. Um zu beweisen, daß B-Raf hierbei eine essentielle Komponente darstellt, haben wir in B-raf defizienten sensorischen und Motoneuronen B-Raf durch Transfektion exprimiert. Erfolgreich mit B-raf Plasmid transfizierte B-raf-/- sensorische und Motoneurone zeigten dieselbe Überlebensfähigkeit in Gegenwart von neurotrophen Faktoren wie primäre Neurone von Wildtyp-Mäusen. Diese Arbeit zeigt daher, daß Raf-Kinasen wichtige Funktionen in Motoneuronen der Maus haben. Die Aktivierung von Raf-Kinasen in vitro führt zur Änderung ihrer subzellulären Verteilung, vor allem von c-Raf-1 vom Zytoplasma in den Kern. Diese Umverteilung von c-Raf-1 ist jedoch nicht notwendig für den Überlebenseffekt von neurotrophen Faktoren, vor allem, wenn man in Betracht zieht, daß B-raf defiziente sensorische und Motoneuronen trotz der Gegenwart von c-Raf-1 nicht überleben. Wir nehmen an, daß die nukleäre Translokation von c-Raf-1 eine direkte Rolle bei der transkriptionellen Regulation durch neurotrophe Faktoren spielt. Die Indentifizierung von c-Raf-1 regulierten Zielgenen und von durch diese beeinflussten zellulären Funktionen ist eine Aufgabe für die Zukunft.

Diese Arbeit untersucht zelluläre Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu müssen zunächst Proteindomänen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht für regulatorische Elemente in Nukleinsäuren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender Nähe zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Domänenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Domänen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen über das Netzwerkverhalten führen, andererseits für konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel wählten wir hier Redoxnetzwerke und die Bekämpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode für dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verstärkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit möglichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu können. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und führt zu einer vereinfachten Darstellungsmöglichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindomänenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Domänen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bedürfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit über die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen über das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine Übersicht über die Schwerpunkte der Bioinformatik in Würzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zugänglich gemacht werden können (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bekämpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte Störungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszulösen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann. / The objective of this thesis is to obtain information, which may be advantageous for biotechnical and medical purposes. In order to achieve this aim it is first necessary to identify protein domains and essential regulatory RNA elements. In case of regulatory RNA elements this is accomplished by investigating Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylocuccus aureus as a model. In this case these elements are found in much promising vicinity to open reading frames coding for proteins (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Even more significant for the purpose of developing pharmaceuticals against parasites are differences of structure and sequence in protein domains (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Their identification is shown in a potential transport protein in Plasmodium falciparum. Subsequently the interaction of regulatory elements and domains in networks is considered (including experimental data). The resulting observations may lead to general conclusions concerning network reaction, as well as specific applications. Our example and field of interest are redox networks and Plasmodia causing malaria. It is not possible to cover the redox network state of a living cell using only pH measurements. Therefore small crystals of glutathione reductase are employed as a more suitable indicator, whose signal is digitally amplified (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). In order to bioinformatically modulate complex redox networks techniques of metabolic flux analysis are presented. They are also improved particularly to advance the understanding of interdependences and to facilitate the correct comprehension of such networks with as few elementary flux modes as possible. In this thesis the reduction of the number of elementary modes of large and intertwined metabolic networks succeeds with various methods. This leads to a simpler model of complex metabolic functions. For each of the methods used in this process the biochemically justified definition of external and internal metabolites constitutes the basis (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). In a more general sense methods of protein domain classification and new strategies for the control of microbial pathogens are considered. In reference to automated classification of protein domains a new system by Taylor (2002b) is compared with traditional systems, which require a varying degree of human intervention (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). In addition different methods of acquiring information on the cellular metabolic network from genomic data is discussed (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11). Furthermore a survey of the main fields of bioinformatic research in Würzburg is given (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Finally it is outlined how pathogenicity and virulence of bacteria may be made accessible to bioinformatic analysis (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). In the conclusion metabolic flux analysis is used for the identification of new strategies in the battle against Plasmodia: The comparison of metabolic pathways with glutathione and thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles and man aims at raising planned dysfunctions in the metabolism of Plasmodium or Anopheles without harming the human host. Valuable suggestions for medical applications and pharmacological targets are obtained.

In the last decades, both the incidence and the severity of asthma have steadily increased. Furthermore, available therapies only treat the symptoms but do not cure the disease. Immune modulation induced by TLR agonists may be a promising novel approach to effectively treat asthma as it targets the underlying immunopathology directly rather than one mediator alone. The aim of this thesis was to investigate if the immunostimulatory properties of Toll-like receptor (TLR) agonists can be utilized to develop novel therapeutic intervention strategies for the treatment of asthma using murine models of allergic inflammation. For this purpose five different TLR agonists were tested in preclinical mouse models of acute and chronic asthma, both in preventive and therapeutic settings. Firstly, TLR-2, 3, 4, 7/8 and 9 agonists were delivered intratracheally at different doses before pulmonary allergen exposure in the asthma model of acute inflammation. TLR9 agonist CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG) > TLR7 agonist Resiquimod (R848) > TLR3 agonists poly(I:C) strongly reduced allergen induced airway eosinophilia and IL-4 levels in a dose-dependent manner. All TLR agonists increased neutrophil numbers, TLR4 agonist lipopolysaccharide (LPS) > TLR2 agonist lipoteichonic acid (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848 and, with the exception of R848, the amount of pro-inflammatory cytokines in the airways. Suppressive effects were not dependent upon IFN-γ and IL-10 or associated with increased numbers of regulatory T cells in the airways. All TLR agonists, except LTA, similarly reduced airway eosinophilia and IL-4 levels when applied therapeutically after allergen challenge. These results show that the TLR agonists have different suppressive effects on TH2 responses in the airways which further depend on the dose and the experimental setup in which they were tested. Interestingly, all agonists induced airway neutrophilia, albeit to different degrees, raising the question if TLR ligands are safe for human use when applied directly into the lung. Different TLR agonists are also being developed for human use as adjuvants combined with allergen in specific immunotherapy. Recent clinical data suggest that this may be achieved by induction of allergen-specific TH1 responses. For this reason, the ability of different TLR agonists to induce allergen-specific TH1 and suppress allergen-specific TH2 responses in a preclinical setting was investigated in this thesis. Different doses of the TLR agonists were applied together with allergen, then mice were exposed to allergen aerosol. CpG > LPS >LTA dose-dependently strongly suppressed the development of airway eosinophilia with poly(I:C) and R848 having no effect. The decrease in eosinophilic numbers was associated withincreased neutrophils present in the airways. IL-4 and IL-5 levels in the bronchoalveolar lavage fluid were also decreased when poly(I:C), LPS, and CpG were used. All TLR agonists increased allergen-specific IgG2a, and with the exception of poly(I:C), reduced allergen-specific IgE levels in the serum. Cutaneous anaphylaxis to allergen was completely prevented when LPS or CpG were given as adjuvant. The strongest TH1 responses were induced by CpG and poly(I:C), characterized by the presence of IFN-γ in the bronchoalveolar lavage and the highest allergen-specific IgG2a levels in the serum. This data supports approaches to use TLR9 or TLR4 agonists for human therapy as adjuvant in combination with allergen in novel specific immunotherapy formulations. In the last part of the thesis, it was investigated if TLR activation can also affect the pathology of severe chronic asthma. Therapeutic administration of R848 or CpG reduced features of inflammation and remodeling. Both agonists showed superior effects to dexamethasone, with CpG being more efficient than R848. This result again supports a TLR9-based therapy as a viable option for the treatment of severe chronic asthma which may present a potential alternative for anti-inflammatory therapy with steroids. Taken together, the results of this thesis support the use of TLR agonists to treat asthma. The most favorable efficacy/safety ratio is to be expected from TLR-based therapies combining TLR4 or TLR9 agonists with allergen in specific immunotherapy. In regard to TLR agonist monotherapy, R848 and CpG showed the most promising profiles, CpG particularly in a model of severe chronic asthma. However, since all TLR agonists used in this study also showed pro-inflammatory potential, the safety aspect of such an approach needs to be taken into account. / In den letzten Jahrzehnten wurde für Asthma ein Anstieg der Neuerkrankungen und der schweren Krankheitsverläufe verzeichnet. Des Weitern kontrollieren angewandte Therapien zwar Symptome, bieten aber keine Heilung. Ein vielversprechender Ansatz, mit dem Ziel den ursächlichen Krankheitsmechanismus zu inhibieren, ist die TLR Agonisten induzierte Immunmodulation. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Eignung von immunstimulatorischen Toll-like Rezeptor (TLR) Agonisten für neue Therapieansätze in allergischen Entzündungsmodellen zu untersuchen. Hierfür wurden fünf verschiedene TLR Agonisten in murinen Modellen von akutem oder chronischem Asthma, sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch verabreicht. Als erstes wurden in einem Modell mit akuter Entzündungsreaktion verschiedene Konzentrationen der Agonisten für TLR 2, 3, 4, 7 und 9, vor der pulmonalen Allergenexposition intratracheal appliziert. Hier verminderten TLR9 Agonist CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG) > TLR7 Agonist Resiquimod (R848) > TLR3 Agonist poly(I:C) konzentrationsabhängig die allergen-induzierte Eosinophilie in den Atemwegen. Alle TLR Agonisten erhöhten die Anzahl an Neutrophilen, am stärksten TLR4 Agonist Lipopolysaccharid (LPS) > TLR2 Agonist Lipoteichon Säure (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848. Weiterhin erhöhten, bis auf R848, alle TLR Agonisten die Menge an pro-inflammatorischen Zytokinen in den Atemwegen. Die hierbei beobachteten suppressiven Effekte waren weder IFN-γ noch IL-10 abhängig und korrelierten auch nicht mit einer Erhöhung der pulmonalen regulatorischen T Zellen. Die therapeutische Gabe von TLR Agonisten nach Allergenexposition reduzierte ebenfalls die Eosinophilie sowie IL-4 in den Atemwegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die TLR Agonisten in ihrer suppressiven Wirkung stark unterscheiden, und dass ihre Wirkung zum einen von der verabreichten Konzentration und zum anderen von dem experimentellen Aufbau abhängig ist. Auffällig war, dass alle Agonisten, wenngleich in unterschiedlicher Ausprägung, eine Neutrophilie in den Atemwegen induzierten. Dies wirft die Frage auf, ob eine wiederholte pulmonale Gabe für den Menschen verträglich wäre. Ein anderer Ansatz verwendet TLR Agonisten als Adjuvanzien für die Kombination mit Allergenen in der spezifischen Immuntherapie. Aktuelle klinische Ergebnisse deuten darauf hin, dass die TLR vermittelte Erhöhung der allergen-spezifischen TH1Antwort die Effektivität der Therapie steigern kann. Deswegen wurden in der vorliegenden Arbeit die verschieden TLR Agonisten auf ihre Fähigkeit hin untersucht allergen-spezifische TH1 Antworten auszulösen und allergen-spezifische TH2 Antworten zu unterdrücken. Hierfür wurde Allergen zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der TLR Agonisten appliziert und anschließend die Mäuse Allergen-Aerosol ausgesetzt. Hier konnte eine starke, konzentrationsabhängige Unterdrückung der Atemwegseosinophilie, begleitet von einer Neutrophilie, bei CpG > LPS >LTA beobachten werden. Poly(I:C) und R848 zeigten keine Effekte. Auch wurde die Menge von IL-4 und IL-5 in der bronchoalveolaren Lavage durch poly(I:C), LPS, und CpG erniedrigt. Weiterhin reduzierten alle TLR Agonisten, mit der Ausnahme von poly(I:C), die Menge an allergen-spezifischem IgE im Serum. Die kutane anaphylaktische Reaktion gegen das Allergen wurde durch CpG- oder LPS-Adjuvans komplett verhindert. Die stärkste TH1 Antwort, charakterisiert durch erhöhtes IFN-γ in der Lavage und die größte Menge an allergen-spezifischem IgG2a, wurde durch CpG und poly(I:C) ausgelöst. Diese Resultate unterstützen den klinischen Ansatz CpG als erfolgsversprechenden Adjuvants-Kandidaten für die Kombinationstherapie mit Allergen in der spezifischen Immuntherapie einzusetzen. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht ob die Aktivierung von TLRs auch den Krankheitsverlauf von schwerem chronischem Asthma beeinflussen kann. Die beiden TLR Agonisten CpG und R848 reduzierten Faktoren des Atemwegumbaus und der Entzündung effektiver als das Steroid Dexamethasone, wobei CpG die höchste Effektivität aufwies. Dieses Ergebnis unterstützt ebenfalls eine auf TLR9 Agonisten basierende Therapie als einen vielverspechenden Ansatz für die Behandlung von schwerem chronischem Asthma auch als eine potentielle Alternative zur antiinflammatorischen Therapie mit Steroiden. Zusammenfassend unterstützen die Resultate die Verwendung von TLR Agonisten für die Behandlung von Asthma. Die höchste Effektivität und Verträglichkeit ist für eine TLR Allergen Kombinationstherapie mit TLR4 oder TLR9 Agonisten in der spezifischen Immuntherapie zu erwarten. Für eine mögliche TLR Monotherapie zeigten R848 und CpG die besten Wirkungsprofile, für schwereres chronisches Asthma bevorzugt CpG. Hierbei muss jedoch stets berücksichtigt werden, dass TLR Agonisten auch selbst entzündliche Reaktionen hervorrufen können.

Techniken des computergestützten Wirkstoffdesigns spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Die vorliegende Arbeit befasst sich sowohl mit der Entwicklung als auch mit der praktischen Anwendung von Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Arbeit glieder sich daher in zwei Teile. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Entwicklung von empirischen Scoring-Funktionen, die eine Schlüsselrolle im strukturbasierten computergestützen Wirkstoffdesign einnehmen. Grundlage dieser Arbeiten sind die empirischen Deskriptoren und Scoring-Funktionen aus dem SFCscore-Programmpaket. Dabei wurde zunächst untersucht, wie sich die Zusammensetzung der Trainingsdaten auf die Vorhersagen von empirischen Scoring-Funktionen auswirkt. Durch die gezielte Zusammenstellung eines neuen Trainingsdatensatzes wurde versucht, die Spannweite der Vorhersagen zu vergrößern, um so vor allem eine bessere Erkennung von hoch- und niedrig-affinen Komplexen zu erreichen. Die resultierende Funktion erzielte vor allem im niedrig-affinen Bereich verbesserte Vorhersagen. Der zweite Themenkomplex beschäftigt sich ebenfalls mit der verbesserten Separierung von aktiven und inaktiven Verbindungen. Durch den Einsatz der Machine Learning-Methode RandomForest wurden dazu Klassifizierungsmodelle abgeleitet, die im Unterschied zu den klassischen Scoring-Funktionen keinen genauen Score liefern, sondern die Verbindungen nach ihrer potentiellen Aktivität klassifizieren. Am Beispiel des mykobakteriellen Enzyms InhA konnte gezeigt werden, dass derartige Modelle den klassischen Scoring-Funktionen im Bezug auf die Erkennung von aktiven Verbindungen deutlich überlegen sind. Der RandomForest-Algorithmus wurde im nächsten Schritt auch verwendet, um eine neue Scoring-Funktion zur Vorhersage von Bindungsaffinitäten abzuleiten. Diese Funktion wurde unter dem Namen SFCscoreRF in das SFCscore-Programmpaket implementiert. Die Funktion unterschiedet sich in einigen wesentlichen Punkten von den ursprünglichen SFCscore-Funktionen. Zum einen handelt es sich beim RF-Algorithmus um eine nicht-lineare Methode, die im Unterschied zu den klassischen Methoden, die zur Ableitung von Scoring-Funktionen eingesetzt werden, nicht von der Additivität der einzelnen Deskriptoren ausgeht. Der Algorithmus erlaubt außerdem die Verwendung aller verfügbaren SFCscore-Deskriptoren, was eine deutlich umfassendere Repräsentation von Protein-Ligand-Komplexen als Grundlage des Scorings ermöglicht. Für die Ableitung von SFCscoreRF wurden insgesamt 1005 Komplexe im Trainingsdatensatz verwendet. Dieser Datensatz ist somit einer der größten, die bisher für die Ableitung einer empirischen Scoring-Funktion verwendet wurden. Die Evaluierung gegen zwei Benchmark-Datensätze ergab deutlich bessere Vorhersagen von SFCscoreRF im Vergleich zu den ursprünglichen SFCscore-Funktionen. Auch im internationalen Vergleich mit anderen Scoring-Funktion konnten für beide Datensätze Spitzenwerte erreicht werden. Weitere ausgiebige Testungen im Rahmen einer Leave-Cluster-Out-Validierung und die Teilnahme am CSAR 2012 Benchmark Exercise ergaben, dass auch SFCscoreRF Performanceschwankungen bei der Anwendung an proteinspezifischen Datensätzen zeigt - ein Phänomen, dass bei Scoring-Funktionen immer beobachtet wird. Die Analyse der CSAR 2012-Datensätze ergab darüber hinaus wichtige Erkenntnisse im Bezug auf Vorhersage von gedockten Posen sowie über die statistische Signifikanz bei der Evaluierung von Scoring-Funktionen. Die Tatsache, dass empirische Scoring-Funktionen innerhalb eines bestimmten chemischen Raums trainiert wurden, ist ein wichtiger Faktor für die protein-abhängigen Leistungsschwankungen, die in dieser Arbeit beobachtet wurden. Verlässliche Vorhersagen sind nur innerhalb des kalibrierten chemischen Raums möglich. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze untersucht, mit denen sich diese ``Applicability Domain'' für die SFCscore-Funktionen definieren lässt. Mit Hilfe von PCA-Analysen ist es gelungen die ``Applicability Domain'' einzelner Funktionen zu visualisieren. Zusätzlich wurden eine Reihe numerischer Deskriptoren getestet, mit den die Vorhersageverlässlichkeit basierend auf der ``Applicability Domain'' abgeschätzt werden könnte. Die RF-Proximity hat sich hier als vielversprechender Ausgangspunkt für weitere Entwicklungen erwiesen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer Inhibitoren für das Chaperon Hsp70, welches eine vielversprechende Zielstruktur für die Therapie des multiplen Myeloms darstellt. Grundlage dieser Arbeiten war eine Leitstruktur, die in einer vorhergehenden Arbeit entdeckt wurde und die vermutlich an einer neuartigen Bindestelle in der Interface-Region zwischen den beiden großen Domänen von Hsp70 angreift. Die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Leitstruktur, eines Tetrahydroisochinolinon-Derivats, stand zunächst im Vordergrund. Anhand detaillierter Docking-Analysen wurde der potentielle Bindemodus der Leitstruktur in der Interfaceregion von Hsp70 untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Substanzbibliothek erstellt, die von Kooperationspartnern innerhalb der KFO 216 synthetisiert und biologisch getestet wurde. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen, die sich aus diesen experimentellen Daten ableiten lassen, konnten teilweise gut mit den erstellten Docking-Modellen korreliert werden. Andere Effekte konnten anhand der Docking-Posen jedoch nicht erklärt werden. Für die Entwicklung neuer Derivate ist deswegen eine umfassendere experimentelle Charakterisierung und darauf aufbauend eine Verfeinerung der Bindungsmodelle notwendig. Strukturell handelt es sich bei Hsp70 um ein Zwei-Domänen-System, dass verschiedene allostere Zustände einnehmen kann. Um die Auswirkungen der daraus folgenden Flexibilität auf die Stabilität der Struktur und die Bindung von Inhibitoren zu untersuchen, wurden molekulardynamische Simulationen für das Protein durchgeführt. Diese zeigen, dass das Protein tatsächlich eine überdurchschnittlich hohe Flexibilität aufweist, die vor allem durch die relative Bewegung der beiden großen Domänen zueinander dominiert wird. Die Proteinkonformation die in der Kristallstruktur hscaz beobachtet wird, bleibt jedoch in ihrer Grundstruktur in allen vier durchgeführten Simulationen erhalten. Es konnten hingegen keine Hinweise dafür gefunden werden, dass die Mutationen, welche die für die strukturbasierten Arbeiten verwendete Kristallstruktur im Vergleich zum Wildtyp aufweist, einen kritischen Einfluss auf die Gesamtstabilität des Systems haben. Obwohl die Interface-Region zwischen NBD und SBD also in allen Simulationen erhalten bleibt, wird die Konformation in diesem Bereich doch wesentlich durch die Domänenbewegung beeinflusst und variiert. Da dieser Proteinbereich den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der Tetrahydroisochinolinone darstellt, wurde der Konformationsraum detailliert untersucht. Wie erwartet weist die Region eine nicht unerhebliche Flexibilität auf, welche zudem, im Sinne eines ``Induced-Fit''-Mechanismus, durch die Gegenwart eines Liganden (Apoptozol) stark beeinflusst wird. Es ist daher als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass die Dynamik der Interface-Region auch einen wesentlichen Einfluss auf die Bindung der Tetrahydroisochinolinone hat. Molekuardynamische Berechnungen werden deswegen auch in zukünftige Arbeiten auf diesem Gebiet eine wichtige Rolle spielen. Die Analysen zeigen zudem, dass die Konformation der Interface-Region eng mit der Konformation des gesamten Proteins - vor allem im Bezug auf die relative Stellung von SBD und NBD zueinander - verknüpft ist. Das untermauert die Hypothese, dass die Interface-Bindetasche einen Angriffspunkt für die Inhibtion des Proteins darstellt. / Methods of computational drug design play a crucial role in the development of new pharmaceutical drugs. The work presented here comprises the methodological development and the practical application of structure-based techniques in computational drug design. The first part of this dissertation focuses on the development of empirical scoring functions, which play an essential part in structure-based computer-aided drug design. The basis for this work are the empirical descriptors and scoring functions of the SFCscore software package. First, the influence of the training data composition on the prediction of empirical scoring functions was analyzed. A new training data set was created to spread the prediction range of the function and thus achieve a better separation of high and low affinity binders. The resulting function indeed yielded better predictions in the low affinity area compared to the original functions. In another approach, which also addresses the issue of discriminating active and inactive compounds, the Machine Learning method RandomForest (RF) was used to derive a classification model. Different to classical empirical scoring functions, this model no longer predicts a precise value but classifies the compounds according to their potential affinity as 'active' or 'inactive'. The example of the mycobacterial enzyme InhA showed that such models are clearly superior to different classical scoring function in terms of separating active and inactive compounds. The RandomForest algorithm was also used to derive a new scoring function for the prediction of binding affinities. This new function was implemented into the SFCscore software package under the name SFCscoreRF. This new function differs from the original SFCscore functions in several essentials points. On the one hand, the RF-algorithm is a non-linear method, which - in contrast to classical methods used for the derivation of empirical scoring functions - does not assume the additivity of the single descriptors. On the other hand, the algorithm allowes for using the whole set of available SFCscore descriptors and is therefore able to utilize a more comprehensive representation of a protein ligand complex as the basis for the prediction. Additionally, the training data set used to derive SFCscoreRF comprised 1005 complexes. This training set is one of the largest data sets used to train an empirical scoring function. The evaluation against two widely-used benchmark sets confirmed that SFCscoreRF yields superior predicitons as compared to the original functions. The comparison with other functions tested for these benchmarks shows that SFCscoreRF also achieves top results on an international level. Further analyses using a leave-cluster-out validation scheme and the participation in the CSAR 2012 Benchmark Exercise revealed that - similar to other scoring functions - SFCscoreRF shows varying performances when applied to protein-specific data sets. Additionally, by analysing the results of the CSAR 2012 data sets, valuable insight were gained regarding the prediction of docking poses and the statistical significance for the evaluation and comparison of scoring functions. The fact that empirical scoring functions are trained within a certain chemical space, is an important reason for the target-dependent performance observed in this work. Reliable predictions can only be expected within the calibrated area. Different approaches for the definition of this ``applicability domain'' are presented in this work. PCA analyses have been used to create a two dimensional representation of the ``applicability domain''. Additionally, different numerical descriptors have been tested to estimate the reliability of SFCscore predicitons. The RF-proximity has been found to be a promising starting point for future research. The development of new inhibitors for the molecular chaperone Hsp70 - a promising target in the therapy of multiple myeloma - comprises the second part of this dissertation. The basis for this work was a lead structure that was found in a previous work and attacks a novel binding pocket in the interface between the two domains of the Hsp70 protein. The optimization and development of that lead structure - a tetrahydroisochinolinone - was the primary focus of the present work. Potential binding poses in the interface were elucidated by detailed docking analyses. Based on that information, a compound library was compiled, which was synthezised and biologically analyzed by cooperation partners within the CRU 216. The resulting structure activity relationships can partially be explained on the basis of the corresponding docking poses. However, some of the effects remain unexplained. For the further development of new derivatives a comprehensive experimental characterization of the current compounds is needed. This information can be used as a basis for the refinement of the existing binding models. Hsp70 is a two-domain system, which can visit different allosteric states. To further investigate the effects of the resulting flexibility on the stability of the structure and on inhibitor binding, molecular dynamics simulations were conducted. These simulations show an above-average felxibility of the protein, which is primarily dominated by the movement of the two domains NBD and SBD relatively to each other. However, the basic conformation that is observed in the crystal structure hscaz, which was used in this work, remains stable in all simulations. Furthermore, the trajectories showed no evidence that the mutations, in which hscaz differs from the wild type protein, have a significant effect on the overall protein conformation. Although, the overall conformation of the interface between NDB and SBD remains stable, the exact conformation in this area is signficantly influenced by the domain movement. As this region includes the binding pocket of the tetrahydroisochinolinones, the conformational space of this area was analyzed in detail. The analyses expectedly reveal a high flexibility in the interface area that is dominated by the SBD-NBD movement. Furthermore, it could be shown that the conformation and dynamics can be influenced by a bound ligand (apoptozole), in terms of an induced fit mechanism. It is highly probable that the binding of the tetrahydroisochinolinones trigger similar effects, influencing the binding mechanism of this compound class. Thus, molecular dynamics simulations should play a crucial role in the future development of new compounds. The analyses also show that the dynamics of the interface region have large effects on the overall structure of the protein and vice versa. Especially, the relative orientation of NBD and SBD has a large impact on the binding pocket. This underlines the hypothesis that the interface region constitutes a promising target area for the inhibition of Hsp70.