A cebola comum Allium cepa L. (2n=16), devido à sua excelente condição cromossômica, tem sido largamente utilizada como um sistema de testes para se examinar os efeitos citogenéticos causados por diversos compostos químicos em material biológico. Em estudos de monitoramento de riscos ambientas, observou-se limitação no crescimento das raízes quando as cebolas são expostas a aguas residuárias provenientes de indústrias químicas. Nesse estudo, nós avaliamos este sistema de testes escolhendo alguns compostos de metais pesados, cujos efeitos em outros sistemas de testes já se encontram descritos. Além disso, foram estuados vários fatores que poderiam interferir nos resultados tais como: temperatura; luminosidade; qualidade da água e qualidade das cebolas. As concentrações mais baixas empregadas (1,5 mg/l) nos testes, de cádmio e cobre demostraram alta capacidade inibidora sobre o crescimento das raízes. O zinco apresentou toxicidade moderada a 1,5 mg/l e crescente às concentrações sucessivas mais elevadas. Efluentes industriais, contendo misturas de níquel e sulfatos ou cobre e cianeto, demonstraram-se altamente inibidores às concentrações mais baixas empregadas (0,7%), resultados que demonstram a alta sensibilidade do teste aos sais de metais pesados. Quanto às condições experimentais que levaram a esses resultados, os testes revelaram que não existe influência pronunciada dos fatores luminosidade e temperatura. Quanto à água para controle e diluição, não deve ser de torneira devido ao efeito inibidor do zinco e do cobre. Os resultados foram contraditórios em relação a um possível efeito osmótico da água destilada, sendo conveniente adicionar entre 100 a 250 mg/l de NaCl. A melhor resposta foi obtida com cebolas de origem argentina de 3,5 a 4,0 cm de diâmetro sendo preferível a manutenção de cascas para evitar murchamento. / The common onion Allium cepa. L., due to its excellent chromosome conditions, has been widely used as a test system for examining the citogenetic effects of several chemical compounds on biological material. It has been observerd, in monitoring environmental studies, some growth restriction on Allium roots when they are exposed to wastewater from chemical factories. In this study, we evaluate these test systems by choosing some hard metals which harmful effects on biological materials has been already described. Furthermore, some factors that could interfere on the results, such as: temperature; light; water quality and onion quality were studied. The lowest concentration (1.5 mg/l) for cadmium and cupper were found to have hard capacity to inhibit root growth. The zinc showed moderate toxicity at 1.5 mg/l and this effect was more evident at increased concentrations. The industrial wastewater that contains mixture of nickel and sulphate or cupper and cyanate inhibited root growth at lower concentration (0.7%). These results showed that the test system has high sensitivity for hard metals. There was no direct influence of temperature and light on the experiment conditions. With regard to the type of water, tap water should not be used because of inhibition on the root growth caused by zinc and copper. The results contradicted a potential osmotic effect of distillated water, being convenient to add 100 - 250 mg/l of NaCl. The best response was obtained with onions from Argentina with 3.5 - 4.0 cm of diameter being recommended to keep the onion peel for avoiding dryness.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-28Bitstream added on 2014-06-13T20:44:13Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_e_dr_jabo.pdf: 277356 bytes, checksum: 7f7e43415afd7264c79b023acd4b37ac (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente estudo foi realizado com o intuito de desenvolver o PCR quantitativo para detecção dos níveis de mRNA da toxina botulínica tipo A em palmito. Foram desenhados primers para o gene codificador da toxina botulínica tipo A, os quais apresentaram especificidade e sensibilidade elevadas. Cepas referência de Clostridium botulinum tipo B, C, D, E, F, G e Clostridium butyricum, baratii e argentinense foram utilizadas para verificação da especificidade dos primers sintetizados. Diluições seriadas de cultura da cepa referência de Clostridium botulinum tipo A foram inoculadas em amostras de palmito e separadas em dois grupos: palmito comercial com conservantes e palmito sem conservantes e incubadas a 4°, 25° e 37°C. Alíquotas dessas amostras contaminadas experimentalmente foram submetidas a extração de RNA, para determinação do limiar de detecção da técnica de PCR quantitativo, assim como inoculadas em camundongos para o teste de toxicidade aguda (bioensaio). O bioensaio apresentou sensibilidade característica e detectou a presença da toxina botulínica nas amostras de palmito sem conservantes. No entanto, o PCR quantitativo, apresentou sensibilidade maior que aquela observada no bioensaio, detectando a expressão do gene para BoNT/A (botulinum neurotoxin type A) no tratamento de palmito sem conservantes e no tratamento de palmito comercial incubado a 37°C. Isto evidencia a possível utilização desta técnica no diagnóstico de contaminação de amostras de alimento por C. botulinum tipo A. / The present study was realized in order to develop the quantitative assay for the detention of the levei mRNA of the botulinic toxin type A production in palm heart. Primers were designed for the gene encoding the botulinic toxin type A, which showed high specificity and sensitivity. Reference of strains of C. botulinum type S, c, D, E, F, G, C/ostridium butyricum, baratii and argentinense were used for verification of the specificity of the primers synthesized. Serial dilutions culture of the reference strain of C/ostridium botulinum type A were inoculated in the palm heart samples and separated in two groups: commercial palm heart (with preservatives) and palm heart without preservatives and incubated at 4°, 25° and 37°C. Aliquots these contaminated experimentally samples were subjected to extraction of RNA, for determination of the threshold of detection of the technique of quantitative PCR, well as inoculated into mice to test the acute toxicity (bioassay). The bioassay presented its characteristic sensitivity and detected the presence of the botulinic toxin in samples of palm heart without preservatives. However, the quantitative PCR presented greater sensibility than that observed in the bioassay, detecting the expression of the gene for SoNT/A (botulinic neurotoxin type A) in the treatment of palm heart without preservatives and treatment of commercial palm heart incubated at 37°C. This highlights the possible use of this technique in the diagnosis of contamination of samples the food by C. botulinum type A.

Made available in DSpace on 2016-08-12T19:18:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DanielyFB_TESE.pdf: 1402093 bytes, checksum: 59bc334c392f5b839e6f8198798a7e22 (MD5) Previous issue date: 2014-12-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Knowledge of the factors related to the dynamics of herbicides in the environment is of fundamental importance to predict the behavior of herbicides in different soil types and selection of appropriate doses and to avoid harmful effects to the environment and subsequent crops. Three experiments were conducted in order to analyze the dynamics of sulfentrazone in five soils of sugarcane areas of the Brazilian Northeast: Quartzipsamment (Peter Old-RN), Cambisol (Quixeré-CE); Oxisol (Coastal Plains - Maceió-AL), Red-Yellow Ultisol (Coastal Plains - Maceió-AL) and an Epiaquic Haplustult (floodplain - Maceió-AL). The first experiment aimed to characterize chemically, physically and mineralogically the topsoil of different soil classes. The characterization of soil attributes allowed to observe that areas with cane sugar cultivation vary depending mainly physical attributes, with soils of different textural classes and chemical attributes, highlighted with total Organic Carbon content and P available. Regarding the mineralogy, it was observed that the sugarcane areas are installed from young soils with predominance of 2: 1 clay soils to more developed with the presence of kaolinite, gibbsite and iron oxides. The second experiment aimed to evaluate the sorption and desorption of sulfentrazone in the five soils mentioned above was conducted in laboratory conditions. Freundlich equation was adjusted to obtain the sorption coefficients, Kf (sorption capacity) and 1 / n (intensity sorption). It was observed that the soils have different behavior in relation to sulfentrazone sorption potential. Based on the results of this second study, we concluded that the increasing order of sorption was: Argisol (Kf = 8.74)> Oxisol (Kf = 8.23)> Quartzipsamment (Kf = 7.50)> Inceptisol (Kf = 6 98)> Gleysol (Kf = 6.67); while desorption decreased in the following order: Argisol <Gleysol <Quartzipsamment <Inceptisol <Oxisol. The third study aimed to evaluate the leaching of sulfentrazone in these soils through bioassay and liquid chromatography high resolution. Based on the results, it is concluded that the mobility of sulfentrazone in the soil is influenced by its chemical, physical and mineralogical, presenting the following leaching potential sequence: Quartzipsamment (45 cm)> Oxisol (35 cm)> Argisol (20 cm) = Inceptisol (20 cm) = Gleysol (20 cm). Before making the recommendation of sulfentrazone, we must know the chemical, physical and mineralogical characteristics of soils and their interactions with the herbicide, in order to ensure technical efficiency and environmental sustainability / O conhecimento dos fatores relacionados à dinâmica de herbicidas no ambiente é de fundamental importância para prever o comportamento de herbicidas nas diferentes classes de solo e para seleção de dosagens adequadas, bem como para evitar efeitos prejudiciais ao ambiente e às culturas subsequentes. Foram conduzidos três experimentos, visando a analisar a dinâmica do herbicida sulfentrazone em cinco solos de regiões canavieiras do Nordeste brasileiro: Neossolo Quartzarênico (Pedro Velho-RN), Cambissolo Háplico (Quixeré-CE); Latossolo Vermelho-Amarelo (Tabuleiros Costeiros - Maceió-AL), Argissolo Vermelho-Amarelo (Tabuleiros Costeiros - Maceió-AL) e um Gleissolo Háplico (várzea - Maceió-AL). O primeiro experimento objetivou caracterizar química, física e mineralogicamente a camada arável de diferentes classes de solos. A caracterização dos atributos dos solos permitiu observar que as áreas com cultivo de cana-de-açúcar variam em função principalmente dos atributos físicos, com solos de diferentes classes texturais e atributos químicos, tendo destaque o teor de Carbono Orgânico total e P disponível. Em relação à mineralogia, foi possível observar que as áreas canavieiras são instaladas desde solos jovens com predomínio de argilominerais 2:1 até solos mais desenvolvidos com presença de caulinitas, gibsita e óxidos de ferro. O segundo experimento, com objetivo de avaliar a sorção e a dessorção do sulfentrazone nos cinco solos anteriormente mencionados foi conduzido em condições de laboratório. Foram ajustadas equações de Freundlich para obtenção dos coeficientes de sorção, Kf (capacidade de sorção) e 1/n (intensidade de sorção). Observou-se que os solos estudados apresentam comportamento diferenciado em relação ao potencial de sorção do sulfentrazone. Com base nos resultados deste segundo trabalho, conclui-se que a ordem crescente de sorção foi: Argissolo (Kf = 8,74) > Latossolo (Kf = 8,23) > Neossolo Quartzarênico (Kf = 7,50) > Cambissolo (Kf = 6,98) > Gleissolo (Kf = 6,67); ao passo que a dessorção decresceu na seguinte ordem: Argissolo < Gleissolo < Neossolo Quartzarênico < Cambissolo < Latossolo. O terceiro trabalho propôs avaliar a lixiviação do herbicida sulfentrazone nos referidos solos por meio de bioensaios e cromatografia líquida de alta resolução. Baseado nos resultados, conclui-se que a mobilidade do sulfentrazone nos solos é influenciada pelas suas características químicas, físicas e mineralógicas, apresentando a seguinte sequência de potencial de lixiviação: Neossolo Quartzarênico (45 cm) > Latossolo (35 cm) > Argissolo (20 cm) = Cambissolo (20 cm) = Gleissolo (20 cm). Antes de fazer recomendação do sulfentrazone, é necessário conhecer as características químicas, físicas e mineralógicas dos solos e suas interações com o herbicida, no intuito de garantir eficiência técnica e sustentabilidade ambiental

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcus Alexandre Beltrame parte 1.pdf: 1849307 bytes, checksum: 3070da9250f42557e2a1f278080def13 (MD5) Previous issue date: 2010-05-24 / Introduction. The prevalence of Toxoplasma gondii infection in free-range chickens varies in different regions and we do not know the prevalence of this infection in free-range chickens in the state of Espirito Santo. Objective. To study the prevalence of infection by T. gondii in free-range chickens from different municipalities of the E. Santo, to try the isolation of the parasite from tissues of positive chickens and to search the knowledge on the parasite and the disease it produces among people living in the rural properties from which the samples were collected. Methods. Detection of anti-T. gondii in the serum of 510 chickens from rural areas of eight municipalities of E. Santo, using indirect hemagglutination (IHA) and modified agglutination test (MAT). Bioassay was conducted in mice by intra-peritoneal injection of macerated of thigh muscle, brain and heart from 64 positive chickens. Questionnaires were used to assess environmental conditions related to the protozoan in each farm and the knowledge of people on the parasite. Results. Anti-T. gondii antibodies were detected in 40.4% (95% CI: 36.1 to 44.7) by IHA and 38.8% (95% CI: 34.6 to 43) by MAT. Among the 64 chickens submitted to bioassay, the parasite was isolated from 48 (75%, 95% CI: 85.6 to 64.4), with mortality occurring from 10 through 31days after infection, and in two chickens presented seroconversion. Conclusions. (a) A high prevalence of anti-T. gondii antibodies with high frequency of parasite isolation from positive chickens, was observed in free range chickens in E. Santo;(b) The high mortality observed in mice used in the bioassay may be in relationship with the virulence of isolated strains; (c) There was good concordance (82%) between IHA and MAT, therefore IHA may indicated as a screening test for anti-T. gondii antibodies in chickens; (d) presence of cats in promiscuity with birds and other species occurred in 73% of the properties and (e) The questionnaire revealed ignorance of the people living in the visited farms about the protozoan, the disease it produces and its transmission mechanisms. / Introdução. A prevalência de infecção por Toxoplasma gondii em galinhas caipiras varia nas diferentes regiões e não se conhece a prevalência em galinhas caipiras no Estado do Espírito Santo. Objetivo. Estudar a prevalência da infecção por T. gondii em galinhas caipiras de municípios do E. Santo, tentar o isolamento do parasito nos tecidos de aves positivas e aplicar um questionário entre as pessoas que vivem nas propriedades nas quais as amostras foram tomadas, para verificar o conhecimento sobre o parasita e a doença que ele pode causar. Métodos. Pesquisa de anticorpos anti-T. gondii no soro de 510 galinhas de oito municípios do E. Santo, utilizando testes de hemaglutinação indireta (HAI) e aglutinação modificado (MAT). Em 64 aves soropositivas foi realizado o bioensaio em camundongos a partir de macerados do músculo da coxa, coração e encéfalo. Questionários foram aplicados para avaliar variáveis relacionadas a doença. Resultados. De 510 aves, foram soropositivas 40,4% (IC 95%: 36,1-44,7) no HAI e 38,8% (IC 95%: 34,6-43) no MAT. Das 64 galinhas submetidas ao bioensaio, isolou-se em 48 (75%; IC 95%: 85,6-64,4), com mortalidade ocorrendo entre 10 e 31dias após a infecção, e em duas houve soroconversão. Conclusões. (a) Detectou-se alta prevalência de anticorpos anti-T. gondii em galinhas caipiras no E. Santo, com grande freqüência de isolamento do protozoário; (b) A alta mortalidade dos camundongos utilizados no bioensaio pode estar relacionada com a virulência das cepas isoladas; (c) HAI teve concordância de 82% com o MAT, podendo ser indicado como teste de triagem para pesquisa de anticorpos anti-T. gondii em galinhas; (d) A presença de gatos soltos e em promiscuidade com as aves e demais espécies ocorreu em 73% das propriedades avaliadas; (e) O questionário aplicado revelou desconhecimento dos entrevistados sobre o protozoário, a doença que ele pode causar e seus meios de transmissão.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Marcus Alexandre Vaillant Beltrame.pdf: 2601197 bytes, checksum: 99d4aecebe83edfdd851f8015a17ae7a (MD5) Previous issue date: 2010-05-24 / Introdução. A prevalência de infecção por Toxoplasma gondii em galinhas caipiras varia nas diferentes regiões e não se conhece a prevalência em galinhas caipiras no Estado do Espírito Santo. Objetivo. Estudar a prevalência da infecção por T. gondii em galinhas caipiras de municípios do E. Santo, tentar o isolamento do parasito nos tecidos de aves positivas e aplicar um questionário entre as pessoas que vivem nas propriedades nas quais as amostras foram tomadas, para verificar o conhecimento sobre o parasita e a doença que ele pode causar. Métodos. Pesquisa de anticorpos anti-T. gondii no soro de 510 galinhas de oito municípios do E. Santo, utilizando testes de hemaglutinação indireta (HAI) e aglutinação modificado (MAT). Em 64 aves soropositivas foi realizado o bioensaio em camundongos a partir de macerados do músculo da coxa, coração e encéfalo. Questionários foram aplicados para avaliar variáveis relacionadas a doença. Resultados. De 510 aves, foram soropositivas 40,4% (IC 95%: 36,1-44,7) no HAI e 38,8% (IC 95%: 34,6-43) no MAT. Das 64 galinhas submetidas ao bioensaio, isolou-se em 48 (75%; IC 95%: 85,6-64,4), com mortalidade ocorrendo entre 10 e 31dias após a infecção, e em duas houve soroconversão. Conclusões. (a) Detectou-se alta prevalência de anticorpos anti-T. gondii em galinhas caipiras no E. Santo, com grande freqüência de isolamento do protozoário; (b) A alta mortalidade dos camundongos utilizados no bioensaio pode estar relacionada com a virulência das cepas isoladas; (c) HAI teve concordância de 82% com o MAT, podendo ser indicado como teste de triagem para pesquisa de anticorpos anti-T. gondii em galinhas; (d) A presença de gatos soltos e em promiscuidade com as aves e demais espécies ocorreu em 73% das propriedades avaliadas; (e) O questionário aplicado revelou desconhecimento dos entrevistados sobre o protozoário, a doença que ele pode causar e seus meios de transmissão / Introduction. The prevalence of Toxoplasma gondii infection in free-range chickens varies in different regions and we do not know the prevalence of this infection in free-range chickens in the state of Espirito Santo. Objective. To study the prevalence of infection by T. gondii in free-range chickens from different municipalities of the E. Santo, to try the isolation of the parasite from tissues of positive chickens and to search the knowledge on the parasite and the disease it produces among people living in the rural properties from which the samples were collected. Methods. Detection of anti-T. gondii in the serum of 510 chickens from rural areas of eight municipalities of E. Santo, using indirect hemagglutination (IHA) and modified agglutination test (MAT). Bioassay was conducted in mice by intra-peritoneal injection of macerated of thigh muscle, brain and heart from 64 positive chickens. Questionnaires were used to assess environmental conditions related to the protozoan in each farm and the knowledge of people on the parasite. Results. Anti-T. gondii antibodies were detected in 40.4% (95% CI: 36.1 to 44.7) by IHA and 38.8% (95% CI: 34.6 to 43) by MAT. Among the 64 chickens submitted to bioassay, the parasite was isolated from 48 (75%, 95% CI: 85.6 to 64.4), with mortality occurring from 10 through 31days after infection, and in two chickens presented seroconversion. Conclusions. (a) A high prevalence of anti-T. gondii antibodies with high frequency of parasite isolation from positive chickens, was observed in free range chickens in E. Santo;(b) The high mortality observed in mice used in the bioassay may be in relationship with the virulence of isolated strains; (c) There was good concordance (82%) between IHA and MAT, therefore IHA may indicated as a screening test for anti-T. gondii antibodies in chickens; (d) presence of cats in promiscuity with birds and other species occurred in 73% of the properties and (e) The questionnaire revealed ignorance of the people living in the visited farms about the protozoan, the disease it produces and its transmission mechanisms

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Interleukin 11 (IL-11) is a multifunctional cytokine in the IL-6 type family of long-chain helical cytokines, which modulates the proliferation, differentiation and maturation of various types of hematopoietic cells. Recombinant human interleukin-11 (rhIL-11) produced by DNA technology in Escherichia coli is currently being used worldwide for the prevention of thrombocytopenia and to reduce the need for platelet transfusions after myelosuppressive chemotherapy in patients with nonmyeloid malignancies. A stability-indicating reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was validated for the assessment of recombinant human interleukin-11 (rhIL-11) in biopharmaceutical formulations. The RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 25ºC. The mobile phase A consisted of 0.1% TFA and the mobile phase B was acetonitrile with 0.1% TFA, run as follows: time 0 to 0.1 min 40% of B; from 0.1 to 30 min linear up to 65% of B; from 30.01 to 31 min linear down to 40% of B, maintained up to 40 min. The flow rate was 1 mL/min, and using photodiode array (PDA) detection at 214 nm. Chromatographic separation was obtained with a retention time of 27.6 min, and was linear over the concentration range of 1 200 μg/mL (r2 = 0.9995). The limits of detection and quantitation were 0.34 and 1.12 μg/mL, respectively. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. The accuracy was 100.22% with bias lower than 1.25%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of the degraded products showed non-significant differences (p>0.05). The proposed method was applied to the assessment of rhIL-11 and related proteins in biopharmaceutical dosage forms, and the results were correlated to those of a bioassay, showing a higher mean difference of the estimated content/potencies of 2.60% for the RP-LC method, aiming to establish new alternatives to monitor stability, improve quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biological medicine. / A interleucina 11 (IL-11) é uma citocina multifuncional que pertence a família da interleucina- 6 e estimula a proliferação, diferenciação e maturação de células hematopoiéticas. A interleucina-11 humana recombinante (rhIL-11) é produzida pela tecnologia do DNA em Escherichia coli e é usada clinicamente para a prevenção de trombocitopenia grave e redução da necessidade de transfusão de plaquetas após quimioterapia mielossupressiva em pacientes com neoplasias malignas não mielóides. No presente trabalho foi desenvolvido e validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para a avaliação de rhIL-11 em formulações de produtos farmacêuticos. Utilizou-se coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 25ºC. A fase móvel A foi constituída de TFA 0,1% e a fase móvel B de acetonitrila com 0,1% TFA, eluídas no seguinte gradiente: 0 0,1 min, 40% de B; 0,1 30 min, 40 65% de B; 30,01 a 31 min, 65 40% de B, mantendo-se nesta proporção até 40 min. Utilizou-se vazão de 1 mL/min e detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A eluição cromatográfica foi obtida no tempo de 27,6 min, sendo linear na faixa de concentração de 1 200 μg/mL (r2 = 0,9995). Os limites de detecção e quantificação foram 0,34 e 1,12 μg/mL, respectivamente. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,20%, com bias inferior a 1,25%. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais não apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p>0,05). O método proposto foi aplicado para a avaliação da potência de rhIL-11 e de proteínas relacionadas em formulações farmacêuticas, e os resultados foram comparados com o bioensaio, observando-se diferenças das médias de conteúdo/potência 2,60% superiores para o método por CL-FR. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Human parathyroid hormone (hPTH) is a polypeptide with 84 amino acids and it is the most important peptide regulator for calcium and phosphate ion homeostasis, maintaining bone structure. Recombinant human parathyroid hormone, rhPTH (1-34), produced by DNA technology in Escherichia coli contain the active amino-terminal fragment of the full length hPTH and is currently being used worldwide for the treatment of osteoporosis at high risk of fractures in postmenopausal women and men with osteoporosis primary or hypogonadal. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) and size exclusion liquid chromatography (SE-LC) methods were developed and validated for the assessment of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH 1-34) in biopharmaceutical formulations. A gradient RP-LC method was carried out on a Zorbax 300 SB C18 column (150 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 40 ºC. The mobile phase A consisted of 0.1 M sodium sulphate buffer, pH 2.3, and the mobile phase B was acetonitrile. The SE-LC method was carried out on a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7.8 mm i.d.), maintained at 25 ºC. The mobile phase consisted of 0.1 M phosphoric acid buffer, pH 2.5, run isocratically at a flow rate of 0.7 mL/min. Cromatographic separation was obtained with retention times of 12.2 min, and 13.2 min, and was linear over the concentration range of 1-250 μg/mL (r 2 = 0.9997) and 2-300 μg/mL (r 2 = 0.9993), respectively, for RP-LC and SE-LC, with photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The limits of detection and quantitation were 0.44 and 1.47 μg/mL, respectively, for the RP-LC and 0.79 and 2.63 μg/mL, for the SE-LC. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.49% and 100.22%, with bias lower than 1.12% and than 0.81%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of related proteins and higher molecular weight forms showed significant differences (p< 0.05) compared to intact molecule. The validated methods were applied for the determination of rhPTH and related proteins in biotechnology-derived products, giving lower mean differences of the estimated content/potencies of 0.64% and 1.31% for the RP-LC and SE-LC related to the in vivo bioassay, and of 0.98% and 0.31% higher, compared to the in vitro cell culture assay, respectively. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biotechnology-derived medicine. / O hormônio da paratireóide humano (hPTH) é um polipeptídio constituído de 84 aminoácidos e tem função essencial como regulador da homeostase dos íons cálcio e fosfato, e manutenção da estrutura óssea. O hormônio da paratireóide humano recombinante, rhPTH (1-34), é produzido pela tecnologia do DNA em Escherichia coli, apresenta a sequência de aminoácidos responsável pela porção biologicamente ativa do paratormônio natural e é usado clinicamente para o tratamento da osteoporose de alto risco de fraturas em mulheres pósmenopausa e de homens com osteoporose primária ou hipogonadal. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de rhPTH (1-34) em formulações de produtos biofarmacêuticos. No método por CL-FR, foi utilizada coluna Zorbax 300 SB C18 (150 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 40 ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 0,1 M, pH 2,3, e a fase móvel B por acetonitrila, eluídas em gradiente. No método por CL-EM foi utilizada coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm d.i.), mantida a 25 ºC. A fase móvel foi contituída de tampão ácido fosfórico 0,1 M, pH 2,5, eluída em vazão isocrática de 0,7 mL/min. Para ambos os métodos utilizou-se detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida nos tempos de 12,2 e 13,2 min, sendo linear na faixa de concentração de 1-250 μg/mL (r2 = 0,9997) e 1-300 μg/mL (r2 = 0,9993), respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e quantificação foram 0,44 e 1,47 μg/mL, respectivamente, para o método por CL-FR e 0,79 e 2,63 por CL-EM. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,49 e 100,22, com bias inferior a 1,12 e 0,81, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p<0,05). O métodos propostos foram aplicados para avaliação da potência de rhPTH (1-34) e de proteínas relacionadas em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com os bioensaios, observando-se diferenças das médias de teor/potência 0,64% e 1,31% inferiores para os métodos por CL-FR e CL-EM, em relação ao bioensaio in vivo, e 0,98% e 0,31% superiores, respectivamente, em relação ao in vitro. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) is a cytokine that regulates the proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells and activates mature granulocytes and macrophages. Clinically is used in enhancing hematopoietic recovery after cancer chemotherapy and bone marrow transplantation. A reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was validated for the determination of the non-glycosylated recombinant rhGM-CSF (Molgramostim) in biopharmaceutical formulations. The RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 45 ºC. The mobile phase A consisted of 0.1% TFA and the mobile phase B consisted of 0.1% TFA in acetonitrile, run at a gradient from: 0.01 34 min, 37% 50% of B; 34 35 min linear back to 37% of B and 35 40 min, 37% of B. The flow rate was 1 mL/min, and using photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The chromatographic separation was obtained with the retention time of 29.2 min, and was linear over the concentration range of 2-300 μg/mL (r2 = 0.9992). The procedure was validated evaluating parameters such as the specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, limit of detection and limit of quantitation. The specificity was proven through degradation studies, showing that also there was no interference of the excipients. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of the degraded products showed significant differences (p<0.05). The proposed method was applied for the analysis of molgramostim and their related proteins, and the results were correlated to the bioassay, showing mean differences of the potency 1.02% higher for the RP-LC method, contributing to establish alternatives to characterize and monitoring its instability, improving the quality control and assuring the therapeutic efficacy. / O fator estimulador da colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) é uma citocina que regula a proliferação e diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas e ativa granulócitos e macrófagos maduros. É clinicamente indicado após quimioterapia para o câncer e após transplante de medula óssea. No presente trabalho foi validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para a avaliação da molgramostima, forma recombinante não-glicosilada do GM-CSF, em formulação biofarmacêutica. Utilizou-se coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 45 °C. A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B de ácido trifluoracético 0,1% em acetonitrila, eluídas no gradiente: 0,01 34 min, 37 50% de B; 34 35 min, 50 37% de B, mantendo-se nesta proporção até 40 min. Utilizou-se vazão de 1 mL/min, usando detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 29,2 min, sendo linear na faixa de concentração de 2 300 μg/mL (r2 = 0,9992). O procedimento foi validado, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez, limite de detecção e quantificação. A especificidade foi comprovada através de estudos de degradação, demonstrando também que não houve interferência dos excipientes. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro dos produtos degradados que apresentaram diferença significativa (p<0,05). O método foi aplicado para avaliação de potência de molgramostima e de proteínas relacionadas, e os resultados foram correlacionados com o bioensaio, observando-se diferenças médias de potência 1,02% superiores por CL-FR. Contribuiu-se assim para o estabelecimento de alternativas que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:40:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 725476 bytes, checksum: 9dc70a80eac3e525b33e6bd8c01a137b (MD5) Previous issue date: 2013-07-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In tropical conditions occurs variety of soil and climate. In this region there is little research on the behavior of herbicides in soils. Applications of these products without the knowledge of their interactions with soil properties and climatic conditions can be a cause of inefficiency agronomic observed infrequently, and the high risk of contamination of surface and groundwater. The tebuthiuron is one of the most commonly used herbicides in sugar cane in Brazil and its dynamics in tropical soils is poorly studied. Thus, it was held that this work was to evaluate the sorption, desorption, half-life and leaching of the herbicide tebuthiuron in Red -Yellow humic Latosol ( LVAh ), Typic. For this methods were used high performance liquid chromatography (HPLC ) and the results verified by biological methods . Three experiments were conducted, the first to determine the sorption and desorption of tebuthiuron latosols the second herbicide leaching in the soil profile and the third, the half -life in these soils. Sorption tebuthiuron followed the same trend in different soils, characterized in two phases. Initially, the sorption occurred more quickly, and then displaying a slower phase. The sorption was directly proportional to the amount of organic matter and clay soils. On the other hand, desorption was inversely proportional herbicide sorption. The leaching of tebuthiuron was higher in LV pH 5,0 and pH 6,2 and pH 6,3 LA , being reduced by higher levels of organic matter and clay . The degradation of tebuthiuron in soil followed an exponential model, and its half-life in soil is influenced by soil organic matter content, CEC and clay content. In LVA pH 5,0, the half -life of tebuthiuron was 155 days. On the same soil, with pH changed to 5,9, the half-life of this herbicide was 117 days after its application. It is concluded that the sorption, desorption and leaching half-life tebuthiuron are influenced by the chemical characteristics (CEC and organic matter) and physical (content of clay) soil. Organic matter increased the sorption and desorption and reduced leaching of tebuthiuron. On the other hand, in soils with higher CEC persistence tebuthiuron was reduced. Biological assays can be used to confirm the results of chromatography. / Nas condições tropicais ocorre grande variedade de solos e de clima. Nesta região são escassas as pesquisas sobre o comportamento dos herbicidas nos solos. Aplicações desses produtos sem o conhecimento de suas interações com os atributos dos solos e condições climáticas podem ser uma das causas da ineficiência agronômica, observadas com certa frequência, além dos elevados riscos de contaminação de águas superficiais e subterrâneas. O tebuthiuron é um dos herbicidas mais utilizados em cana-de-açúcar no Brasil e sua dinâmica nos solos tropicais é pouco estudada. Assim, realizou-se este trabalho que teve como objetivo avaliar a sorção, dessorção, meia-vida e lixiviação do herbicida tebuthiuron nos Latossolos Vermelho-Amarelo, Latossolo Vermelho-Amarelo húmico (LVAh), Latossolo Amarelo e Latossolo Vermelho. Para isso foram utilizados métodos de cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) sendo os resultados comprovados por métodos biológicos. Foram realizados três experimentos, sendo o primeiro para determinar a sorção e dessorção do tebuthiuron em latossolos, o segundo a lixiviação desse herbicida no perfil do solo e o terceiro, a sua meia-vida nesses solos. A sorção do tebuthiuron seguiu uma mesma tendência nos diferentes solos, caracterizando-se em duas fases. Numa fase inicial, a sorção ocorreu de forma mais rápida, e em seguida exibindo uma fase mais lenta. A sorção foi diretamente proporcional aos teores de matéria orgânica e argila nos solos. Por outro lado, a dessorção desse herbicida foi inversamente proporcional a sorção. A lixiviação do tebuthiuron foi maior nos LV pH 5,0 e pH 6,2 e LA pH 6,3, sendo reduzida por maiores teores de matéria orgânica e argila. A degradação do tebuthiuron no solo seguiu um modelo exponencial, e a sua meia-vida no solo foi influenciada pelo teor de matéria orgânica, CTC e teor de argila. No LVA pH 5,0, a meia-vida do tebuthiuron foi de 155 dias. No mesmo solo, com o pH alterado para 5,9, a meia-vida desse herbicida foi de 117 dias após sua aplicação. Conclui-se que a sorção, dessorção, meia-vida e lixiviação do tebuthiuron são influenciadas pelas características químicas (matéria orgânica e CTC) e físicas (teor de argila) do solo. A matéria orgânica aumentou a sorção e reduziu a dessorção e a lixiviação do tebuthiuron. Por outro lado em solos com maior CTC a persistência do tebuthiuron foi reduzida. Os ensaios biológicos podem ser utilizados na confirmação dos resultados da cromatografia.

Neste trabalho foi explorado o potencial das actinobactérias como produtoras de agentes antimicrobianos contra bactérias causadoras da mastite bovina. Para este fim, foram otimizados dois diferentes bioensaios um de antagonismo e o outro de antibiose, contra 13 bactérias Gram-positivas e Gram-negativas relacionadas a mastite bovina. Através do bioensaio de antagonismo 120 actinobactérias foram triadas, sendo 55% delas consideradas ativas. Para o ensaio de antibiose foram triados 70 extratos brutos e 60% mostram a formação de halos de inibição. Os extratos brutos Caat 1-54, Caat 2-63 e Caat 8-25 foram considerados os mais promissores dentre todos os extratos estudados. Esses extratos brutos foram submetidos a estudos de desreplicação empregando LC-PAD-MS/MS e isolamento guiado por bioensaio para a identificação de seus metabolitos ativos. Os extratos Caat 1-54 e Caat 2-63 foram ativos principalmente contra as linhagens de bactérias Gram-positivas e a ação antimicrobiana observada foi atribuída a presença da lisolipina I e actinomicina D e V, respectivamente. O extrato Caat 8-25 foi ativo tanto contra bactérias Gram-positivas como para as Gram-negativas, sendo a oxitetraciclina associada a atividade contra as linhagens Gram-positivas e a herbicidina B ativo contra linhagens Gram-negativas. O estudo de desreplicação por LC-MS/MS também possibilitou a identificação de outros metabolitos secundários presentes nos diferentes extratos estudados. Para o extrato Caat 2-63 foi identificada a presença de outros peptídeos provenientes da via biossintética da actinomicina D e, no extrato bruto Caat 8-25 também foi identificado herbicidina F. Um estudo de mudança no metabolismo também foi realizado para a actinobactérias Caat 1-54 produtora de lisolipina. Através da suplementação de íons brometo no meio de cultivo em diferentes períodos da fermentação foi observada a produção de um análogo da lisolipina com bromo e da lisolipina clorada e bromada. Estudos de DESI-TLC-MS associado a bioautografia em TLC também foram aplicados para análise do extrato bruto Caat 2-63 e mostraram a potencialidade desta metodologia para acelerar a identificação de compostos ativos, pois a análise por espectrometria de massas na região da placa cromatográfica correspondente ao halo de inibição revelou a presença de actinomicina D e V, as quais já haviam sido associadas a atividade antimicrobiana deste extrato bruto. Assim os resultados obtidos nesta tese confirmam o grande potencial das actinobactérias como fonte promissoras de compostos bioativos e que a espectrometria de massas empregada nos seus diferentes modos de análise acelera o processo de identificação desses compostos. / In this work were used two different bioassays to evaluate the antimicrobial potential of some actinomycetes against bacteria that cause bovine mastitis. For this propose an antagonism and antibiose assays were optimized against 13 Gram-positive and Gram-negative bacteria related with bovine mastitis. Through antagonism bioassay 120 actinomycetes were screened and 55% were considered active. In disk diffusion bioassay, 70 crude extracts were screened and 60% showed inhibition zones. The crude extracts Caat 1-54, Caat 2-63 and Caat 8-25 were considered the most promising of all the extracts. Dereplication studies and fractionation guided by bioassay were procedure with this extracts to identify the actives metabolites. The extracts Caat 1-54 and Caat 2-63 were active against strains of Gram-positive bacteria and the antimicrobial effect was related to lisolipin I and actinomycin D and V, respectively. The extract Caat 8-25 was active against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Oxytetracycline were associated with activity against Gram-positives strains and a herbicidin B was active against Gram-negative bacteria. Using dereplication strategies by LC-MS/MS others compounds were characterized in different crude extracts. The extract Caat 2-63 was also identified the presence of other peptides from the same biosynthetic pathway of actinomycin D and for crude extract Caat 8-25 were identified herbicidin F. In addition, studies of the shift in secondary metabolism carried out for actinobacteria Caat 1-54 (lysolipin producer). Culture medium supplementation by bromide ions at different stages of fermentation induce the production of bromine lysolipin analog and a chloro-bromine lysolipin. DESI-MS TLC studies associated with TLC bioautography were used to analyze a crude extract Caat 2-63. This study showed how this method could be used to accelerate the identification of active compounds, because mass spectrometry analysis in situ at bioautigraphy inhibition zone showed the presence of actinomycin D and V, which had been associated with antimicrobial activity of this crude extract. Therefore, the results of this thesis confirm the potential of actinobacteria as bioactives compounds source and the importance of mass spectrometry experiments to accelerate the identification of these compounds.