Made available in DSpace on 2016-07-18T17:46:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio Alves dos Santos Neto.pdf: 3927958 bytes, checksum: 7706e6c0650836d76f51febe6d1d862e (MD5) Previous issue date: 2015-04-08 / The p53 gene is considered one of the most intensively studied genes from the genomic point of view and is related to the most common types of skin cancers, which show a trend of increasing incidence in modern human populations. DNA sequences of this gene are available in genomic databases with public access on the Internet and provide useful information for a wide range of applications. This research aimed to employ methods of comparative analysis of nucleotide sequences for evaluating mutations in the p53 gene in different countries, and evaluate the applicability of bioinformatics tools available on the web environment. Investigations were carried out to verify the most frequent mutations in the p53 gene whose sequences are deposited in human genomic databases located in the United States (NCBI), Europe (EBI) and Japan (DDBJ). In the NCBI database we found 194 mutant sequences of the p53 gene, and six of them were described as coming from people with skin cancer. In EBI database 62 mutant sequences of the p53 gene were found, and 50 were from patients with skin cancer. In DDBJ database we found 4075 mutant sequences for the same gene, but not identified as coming from patients with cancer. The original sequence of the p53 gene was compared with the mutant sequences derived from patients with various types of skin cancers, through the CLUSTALW and MAFFT bioinformatics tools. Studies comparing the mutant sequences allowed to establish relationships among the most frequent mutations and that might be related to the disease in different countries. The results showed the feasibility of the proposed approach, and allowed the identification of common characteristics between the analyzed mutants. It was possible to identify the gene regions most sensitive to changes in nucleotide sequences in the p53 gene, which might be related to the origin of the pathology. It was also possible to identify that the mutations commonly occur in very close areas, both for the sequences of the NCBI database as to those collected from EBI database. / O gene p53 é considerado um dos genes mais intensamente estudados do ponto de vista genômico e está relacionado com os tipos mais comuns de cânceres de pele, os quais mostram uma tendência de aumento da incidência em populações humanas modernas. Sequencias de DNA deste gene estão disponíveis em bancos de dados genômicos com acesso público na internet e fornecem informações úteis para uma grande variedade de aplicações. Esta pesquisa teve como objetivo empregar métodos de análise comparativa das sequências de nucleotídeos para a avaliação de mutações no gene p53 em diferentes países, e avaliar a aplicabilidade das ferramentas de bioinformática disponíveis no ambiente web. As investigações foram realizadas a fim de verificar as mutações mais frequentes no gene p53 já depositadas em bancos de dados genômicos humanos localizados nos Estados Unidos (NCBI), Europa (EBI) e Japão (DDBJ). Na base de dados NCBI foram encontradas 194 sequencias mutantes para o referido gene, sendo que seis destas sequências eram descritas como provenientes de pessoas com câncer de pele. Na base de dados EBI foram encontradas 62 sequencias mutantes do gene p53 em humanos, sendo que 50 eram provenientes de pacientes com câncer de pele. Na base de dados DDBJ foram localizadas 4075 sequencias mutantes para o mesmo gene, mas não identificadas como provenientes de pacientes com câncer. A seqüência original do gene p53 foi comparada com as sequências mutantes oriundas de pacientes com diversos tipos de cânceres de pele, por meio das ferramentas de bioinformática CLUSTALW e MAFFT. Estudos comparando as sequências mutantes permitiram estabelecer relações entre as mutações mais freqüentes e que podem estar relacionados com a patologia nos diferentes países. Os resultados mostraram a viabilidade da abordagem proposta, e permitiram a identificação de características comuns entre os mutantes analisados. Foi possível identificar as regiões gênicas mais sensíveis às alterações nas sequências de nucleotídeos no gene p53, e que podem estar relacionados com a origem da patologia. Também foi possível identificar que as mutações comumente ocorrem em regiões bem próximas, tanto para as sequencias oriundas do banco de dados NCBI quanto para aquelas coletadas do banco de dados EBI.

A demanda por abordagens eficientes para o problema de reconhecer a estrutura de cada gene numa sequência genômica motivou a implementação de um grande número de programas preditores de genes. Fizemos uma análise dos programas de sucesso com abordagem probabilística e reconhecemos semelhanças na implementação dos mesmos. A maior parte desses programas utiliza a cadeia oculta generalizada de Markov (GHMM - generalized hiddenMarkov model) como um modelo de gene. Percebemos que muitos preditores têm a arquitetura da GHMM fixada no código-fonte, dificultando a investigação de novas abordagens. Devido a essa dificuldade e pelas semelhanças entre os programas atuais, implementamos o sistema MYOP (Make Your Own Predictor) que tem como objetivo fornecer um ambiente flexível o qual permite avaliar rapidamente cada modelo de gene. Mostramos a utilidade da ferramenta através da implementação e avaliação de 96 modelos de genes em que cada modelo é formado por um conjunto de estados e cada estado tem uma distribuição de duração e um outro modelo probabilístico. Verificamos que nem sempre um modelo probabilísticomais sofisticado fornece um preditor melhor, mostrando a relevância das experimentações e a importância de um sistema como o MYOP. / The demand for efficient approaches for the gene structure prediction has motivated the implementation of different programs. In this work, we have analyzed successful programs that apply the probabilistic approach. We have observed similarities between different implementations, the same mathematical framework called generalized hidden Markov chain (GHMM) is applied. One problem with these implementations is that they maintain fixed GHMM architectures that are hard-coded. Due to this problem and similarities between the programs, we have implemented the MYOP framework (Make Your Own Predictor) with the objective of providing a flexible environment that allows the rapid evaluation of each gene model. We have demonstrated the utility of this tool through the implementation and evaluation of 96 gene models in which each model has a set of states and each state has a duration distribution and a probabilistic model. We have shown that a sophisticated probabilisticmodel is not sufficient to obtain better predictor, showing the experimentation relevance and the importance of a system as MYOP.

Orientador: Robson Francisco Carvalho / Resumo: Adenocarcinoma ductal do pâncreas (PDAC) é extremamente agressivo, possui prognóstico desfavorável e não existem biomarcadores satisfatório para a doença ou identificação de indivíduos com alto risco de morbidade e mortalidade. A complexidade celular e molecular do câncer de pâncreas leva a inconsistências nas validações clínicas de muitas proteínas que foram avaliadas como biomarcadores prognósticos da doença. O secretoma tumoral desempenha um papel crucial na proliferação e metástase de células PDAC, bem como na resistência a tratamentos terapêuticos, que juntos contribuem para um pior resultado clínico. Assim, a enorme quantidade de dados proteômicos do câncer de pâncreas que foram gerados a partir de diferentes tipos de amostras e técnicas de espectrometria de massa pode ser integrada para a seleção de proteínas secretadas compartilhadas relevantes para o diagnóstico e prognóstico da doença. O objetivo do presente estudo foi realizar uma meta-análise combinando dados do proteoma do câncer de pâncreas e secretome publicamente para identificar novos potenciais biomarcadores de doenças. Realizamos uma meta-análise integrando dados de espectrometria de massa obtidos de duas revisões sistemáticas da literatura sobre câncer de pâncreas, que selecionaram independentemente 20 estudos do secretoma e 35 do proteoma. Em seguida, realizamos análises de predição de proteínas secretadas usando sete ferramentas ou bancos de dados “in silico”, que identificaram 39 proteínas compartilhada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is extremely aggressive, has an unfavorable prognosis and there are no satisfactory biomarkers for the disease or identification of individuals at high risk of morbidity and mortality. The cellular and molecular complexity of pancreatic cancer leads to inconsistences in clinical validations of many proteins that have been evaluated as prognostic biomarkers of the disease. Tumor secretome plays a crucial role in PDAC cell proliferation and metastasis, as well as in resistance to therapeutic treatments, which together contribute to a worse clinical outcome. Thus, the massive amount of proteomic data from pancreatic cancer that have been generated from different studies can be integrated into the selection of shared secreted proteins relevant to the prognosis of the disease. The aim of the present study was to perform a metaanalysis combining pancreatic cancer proteome and secretome publicly data to identify new potential disease biomarkers. We performed a meta-analysis integrating mass spectrometry data obtained from two systematic reviews of the pancreatic cancer literature, which independently selected 20 studies of the secretome and 35 of the proteome. Next, we performed prediction analyses of secreted proteins using seven “in silico” tools or databases, which identified 39 proteins shared between the secretome and the proteome data. Notably, the expression of 31 genes of these proteins was upregulated in pancreatic adenocarcinoma samp... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Estudios en distintos ambientes, como el marino o el hipersalino, han demostrado que la combinación de metodologías y la integración de resultados tienen el potencial de aportar nueva información que las técnicas no pueden proveer de manera individual. En esta tesis se han utilizado tres cepas de S. ruber utilizadas para la descripción de la especie para el aislamiento de virus. Un total de 8 virus de aguas de diferentes ambientes hipersalinos se han aislado y seleccionado para realizar una descripción fenotípica, genética y ecogenómica en profundidad. La descripción se ha combinado con un estudio mediante metagenómica vírica dirigida para obtener información acerca de la dinámica poblacional de los virus de S. ruber. Para ahondar en el estudio de la virosfera de Haloquadratum hemos usado diferentes estrategias combinando metodologías dependientes e independientes cultivo. Se realizó un experimento de metagenómica dirigida mediante la incubación de los virus de una muestra de agua hipersalina con dos cepas de Hqr. walsbyi. El metaviroma obtenido se estudió mediante ensamblaje de secuencias y se utilizó para hibridación con un microarray vírico previamente construido. Los genomas halovíricos con señal positiva a la hibridación fueron también analizados y sus secuencias sirvieron como plantilla para la realización de experimentos de phageFISH, en un trabajo independiente a esta tesis, que confirmó su hospedador. Por último se combinó la técnica de single-cell genomics con la hibridación en virochips para detectar células de Haloquadratum infectadas. / Tesis financiada por los proyectos del Plan Nacional CGL2012-39627-C03-01 y CGL2015-66686-C3-3-P, del Ministerio de Economía y Competitividad.

La carne de pollo es la fuente de proteína animal de mayor consumo por el ciudadano peruano. El consumo de pollo, solamente en la provincia de Lima alcanza los 58 kilos per cápita por año, y a nivel nacional, el promedio anual alcanza los 28 kilos per cápita, confirmando la preferencia de este producto. Bajo esta perspectiva, en los últimos años se han desarrollado técnicas biotecnológicas para optimizar los rendimientos y lograr un producto inocuo y con el valor nutricional correspondiente, es así que se han venido aplicando las tecnologías ómicas, en particular para el análisis e interpretación de los genomas y de expresión génica (transcriptómica), considerando factores externos a los que está sometido el animal como suplementos en la dieta o temperatura del ambiente donde crece. El objetivo de la investigación fue evaluar mediante secuenciamiento masivo (RNA-seq) y análisis bioinformático, las variaciones en el transcriptoma de tejido graso en estado fresco de Gallus gallus procedentes de centros de venta de Lima. La muestra CA001 proviene del Centro de Acopio de San Luis y la muestra MB001 del Mercado Modelo de Bellavista. Se secuenciaron las muestras de ARN total obtenidas del tejido adiposo de Gallus gallus con la tecnología Illumina NovaSeq 6000. Posteriormente, se realizó el análisis bioinformático utilizando el flujo de trabajo de una plataforma disponible en web y además con análisis complementarios utilizando herramientas bioinformáticas adaptadas al laboratorio. Para el mapeo de las lecturas se utilizó el software TopHat, luego el ensamblado con el software Cufllinks, y después el análisis por Cuffdiff, que utilizó el estadístico método de dispersión ciega (Blind Dispersion Method) para así obtener la expresión génica diferencial de la muestra CA001 con respecto a la muestra MB001. De un total de 74882 genes expresados por Cufflinks para MB001 y 91993 genes para CA001, se realizó el análisis de expresión diferencial encontrándose 57 genes sub-regulados, 6 sobre-regulados y 71 genes activos en CA001 con respecto a MB001, todos con diferencias significativas (p ajustado < 0.05) principalmente de rutas metabólicas de ácidos grasos, proteínas, resistencia a enfermedades y desarrollo celular. En general, se evidencian diferencias en el transcriptoma de ambas muestras de Gallus gallus, posiblemente asociados a suplementos dietarios u otros factores implicados en la crianza de este recurso avícola de elevado consumo y de gran impacto en la industria alimentaria. / Tesis

Orientador: Guilherme Targino Valente / Resumo: A intensa utilização de combustíveis fósseis gerapreocupações constantes devido aos impactos de sua combustão ao meio ambiente. Os biocombustíveis são uma alternativa viável aos combustíveis fósseis por apresentarem vantagens como serem menos agressivos ao meio ambiente. O bioetanol é um dos biocombustíveis mais utilizados no mundo e sua produção pode ser feita pela fermentação realizada pela levedura Saccharomyces cerevisiae. No entanto, altas concentrações de etanol inibem diversos mecanismos biológicos da levedura, causando a diminuição da produtividade. A partir de resultados prévios, observou-se que o ciclo celular é uma das vias mais afetadas pelo etanol e, além disso, constatou-se a presença de lncRNAs regulando esta via emduas linhagens de S. cerevisiae, a BY4742 e SEY6210. Utilizando operadores Booleanos, um modelo lógico discreto foi desenvolvido para o ciclo celular no qual os nós do sistema assumem até quatro valores discretos que representam a quantidade ou o graude ativaçãodesses nós. O modelo desenvolvido apresentou boa performance preditiva, acertando 87.27% dos 109 fenótipos obtidosda literatura, tornando possível a simulação de novos elementos. Experimentos prévios demonstraram que as leveduras de baixatolerância ao etanol conseguem retomar o crescimento mais rápido do que as de alta tolerância. Nesse trabalho, simulações feitas com dados de expressão diferencial via RNA-Seq permitiu inferir que isso ocorre porque as linhagens de baixa tolerância sofrem arre... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The intense use of fossil fuels raised concern about the future due to their negative environmental impact. Bio-fuels are alternatives to the fossil fuels due to be biodegradable and less environmentally harmful. The bio-ethanol is one of the most popular bio-fuel. It can be produced by fermentation using the yeast Saccharomyces cereviae. However, high ethanol concentration inhibits the yeast decreasing the ethanol yield. Previous data of our groups showed the cell cycle is one of most affected pathways during ethanol stress. Moreover, it was found lncRNAs regulating this pathway in the BY4742 and SEY6210 strains. Using Boolean operators the discrete logical model of the cell cycle was developed. The nodes may get up to four discrete values to represent theirs abundance of activation degree. This model correctly modeled around 87.27% of correct predictions based on 109 phenotypes from the literature, hence, this model is desirable to predict cell cycle behavior after addition of new elements. According to previous data of our group, the lower tolerant strains recover the normal growth faster than higher tolerant strains after stress relief. The simulations here presented by adding RNASeq information into the model, showed a cell cycle arrest at final phase of the cell cycle (M phase) in lower tolerant strains whereas in the higher tolerant ones this arrest occurs at the first phase (G1 phase) during the ethanol treatment. The simulations also indicated that in SEY6210 (low to... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

En las últimas décadas, el surgimiento y resurgimiento de las bacterias infecciosas se han convertido en amenazas de importancia para la salud pública. Este es el caso de la bacteria de la especie Rickettsia asembonensis -identificada en Asembo, Kenia- que, en los últimos años, ha sido detectada en pulgas (Ctenocephalides felis y Ctenocephalides canis), en regiones anteriormente no reportadas y en casos de síndromes febriles agudos inespecíficos. Este patógeno emergente -así como muchos otros- sigue siendo relativamente desconocido. Por lo que, se convierte en una necesidad sustancial no subestimarlo y expandir su estudio no solo epidemiológico, sino también relacionado a su biología molecular. En la actualidad, el esfuerzo científico a fin de incrementar la eficiencia de la obtención de la biología molecular de las especies a nivel global ha generado la aparición de tecnologías de secuenciación de última generación. En ese sentido, la gran cantidad de datos genómicos deben ser manipulados con técnicas bioinformáticas. Estas últimas, han permitido un mejor entendimiento y uso de los datos que generan las tecnologías de secuenciación. Siendo que, recientemente, la aplicación de protocolos y pipelines ha generado resultados favorables. En consecuencia, la aplicación de técnicas bioinformáticas con la finalidad de obtener la información genómica de la bacteria R. asembonensis representa una oportunidad para contribuir al conocimiento científico de este microorganismo. Por lo tanto, el presente trabajo tiene como objetivo principal el ensamblaje y la anotación del genoma de la bacteria R. asembonensis a través de un pipeline bioinformático, que hará uso de datos secuenciados de la pulga de la especie C. felis positivas para R. asembonensis, a partir de unas muestras recolectadas en un estudio llevado a cabo en la ciudad de Iquitos. El presente trabajo generará también un precedente y referente metodológico para otras especies de interés con la misma problemática.

[ES] La resistencia a los antibióticos en la tuberculosis es un grave problema de salud mundial y un obstáculo creciente para el control de la enfermedad. En esta tesis utilizamos la genómica como herramienta para estudiar diferentes aspectos de la biología de la bacteria en relación con el desarrollo de resistencia a los antibióticos y aportar nuevos conocimientos para afrontar el reto de su erradicación. En primer lugar, caracterizamos los nuevos determinantes genómicos de la resistencia a isoniazida utilizando un enfoque basado en genómica funcional y asociación filogenética. El método consiste en la secuenciación de transposones de bacterias expuestas al antibiótico para determinar los genes implicados tanto en sensibilidad como en resistencia, y su filtrado con datos genómicos de una colección global de cepas clínicas. Hemos comprobado la importancia de las rutas metabólicas de síntesis de la pared bacteriana en el mecanismo de acción de los antibióticos, y también hemos descubierto nuevos genes implicados en el equilibrio redox celular que confieren resistencia de bajo nivel. Estos resultados pueden utilizarse para desarrollar nuevas técnicas de diagnóstico o dianas terapéuticas, y el método es aplicable a nuevos antibióticos para predecir futuros determinantes de resistencia. En segundo lugar, exploramos la diversidad bacteriana de la tuberculosis en su sitio natural de infección. Hemos analizado muestras de diferentes partes de la lesión pulmonar de pacientes en Georgia, un país con una alta incidencia de tuberculosis resistente, y hemos detectado un número significativo de infecciones policlonales (causadas por dos o más cepas diferentes). Estas diferentes cepas pueden a su vez ser resistentes a diferentes antibióticos, por lo que es fundamental detectarlas a tiempo. Las muestras quirúrgicas nos dieron una imagen más completa de la diversidad bacteriana que el esputo de rutina, y nos permitieron detectar infecciones policlonales con mayor precisión. Este tipo de infecciones se están subestimando en países con alta carga de TB y pueden afectar negativamente al resultado del tratamiento, por lo que en estos entornos sería recomendable una segunda muestra durante el curso del régimen de antibióticos. Y en tercer lugar, evaluamos el papel del VIH en el desarrollo de resistencias durante las primeras semanas de tratamiento. Para ello, hemos tomado muestras de pacientes de Mozambique con y sin VIH de forma seriada durante el primer mes para analizar cuál es el impacto de la coinfección en las presiones selectivas inmunes y antibióticas. Hemos detectado una mayor diversidad total en los pacientes seronegativos y, en comparación, los pacientes VIH+ presentan dificultades para eliminar esta diversidad durante las etapas tempranas del tratamiento que podrían afectar a su éxito. Gracias a la secuenciación profunda, también hemos podido observar una acumulación de variantes en genes relacionados con resistencia, y hemos asociado algunas de ellas a cambios en las CMI (concentraciones mínimas inhibitorias) de las muestras. Estos pequeños cambios tempranos pueden servir como predictores de una menor capacidad para eliminar la diversidad bacteriana, y podrían indicar un futuro fallo de tratamiento. En resumen, en esta tesis nos hemos centrado en entender mejor los factores bacterianos y del hospedador que impactan el desarrollo de la tuberculosis resistente a antibióticos y como resultado permitirán desarrollar nuevos diagnósticos y modelos epidemiológicos para controlarla. La secuenciación genómica es una gran herramienta para estudiar éste y otros patógenos y ofrece la posibilidad de detectar resistencias rápidamente y con alta precisión en el ámbito clínico. Un correcto diagnóstico asegura un tratamiento adecuado, más corto y exitoso, y además previene la transmisión a nuevos huéspedes. Las técnicas y resultados expuestos aquí contribuyen a lograr estos objetivos y mejorar el control global de la epidemia de TB resistente. / [CA] La resistència als antibiòtics a la tuberculosi és un greu problema de salut mundial i un obstacle creixent per al control de la malaltia. En aquesta tesi utilitzem la genòmica com a eina per estudiar diferents aspectes de la biologia del bacteri en relació amb el desenvolupament de resistència als antibiòtics i aportem nous coneixements per fer front al repte de la seua eradicació. En primer lloc, caracteritzem els nous determinants genòmics de la resistència a isoniazida utilitzant una aproximació basada en genòmica funcional i associació filogenètica. El mètode consisteix en la seqüenciació de transposons de bacteris exposats a l'antibiòtic per determinar els gens implicats tant en sensibilitat com en resistència, i el filtratge amb dades genòmiques d'una col·lecció global de soques clíniques. Hem comprovat la importància de les rutes metabòliques de síntesi de la paret bacteriana en el mecanisme d'acció dels antibiòtics, i també hem descobert nous gens implicats en l'equilibri redox cel·lular que confereixen resistència de baix nivell. Aquests resultats es poden utilitzar per desenvolupar noves tècniques de diagnòstic o dianes terapèutiques, i el mètode és aplicable a nous antibiòtics per predir futurs determinants de resistència. En segon lloc, explorem la diversitat bacteriana de la tuberculosi al seu lloc natural d'infecció. Hem analitzat mostres de diferents parts de la lesió pulmonar de pacients de Geòrgia, un país amb alta incidència de tuberculosi resistent, i hem detectat un nombre significatiu d'infeccions policlonals (causades per dues o més soques diferents). Aquestes soques poden ser resistents a diferents antibiòtics, per la qual cosa és fonamental detectar-les a temps. Les mostres quirúrgiques ens van donar una imatge més completa de la diversitat bacteriana que l'esput de rutina, i ens van permetre detectar infeccions policlonals amb més precisió. Aquest tipus d'infeccions s'estan subestimant en països amb alta càrrega de TB i poden afectar negativament el resultat del tractament, per això en aquests entorns seria recomanable una segona mostra durant el curs del règim d'antibiòtics. I en tercer lloc, avaluem el paper del VIH en el desenvolupament de resistències durant les primeres setmanes de tractament. Per això, hem pres mostres de pacients de Moçambic amb i sense VIH de manera seriada durant el primer mes per analitzar quin és l'impacte de la coinfecció en les pressions selectives immunes i antibiòtiques. Hem detectat una major diversitat total en els pacients seronegatius i, en comparació, els pacients VIH+ presenten dificultats per eliminar aquesta diversitat durant les primeres etapes del tractament que podrien afectar el seu èxit. Gràcies a la seqüenciació profunda, també hem pogut observar una acumulació de variants en gens relacionats amb resistència, i n'hem associat algunes a canvis en les CMI (concentracions mínimes inhibitòries) de les mostres. Aquests petits canvis primerencs poden servir com a predictors d'una capacitat menor per eliminar la diversitat bacteriana, i podrien indicar un futur fracàs del tractament. En resum, en aquesta tesi ens hem centrat a entendre millor els factors bacterians i de l'hoste que impacten el desenvolupament de la tuberculosi resistent a antibiòtics i com a resultat permetran desenvolupar nous diagnòstics i models epidemiològics per controlar-la. La seqüenciació genòmica és una gran eina per estudiar aquest i altres patògens i ofereix la possibilitat de detectar resistències ràpidament i amb alta precisió a l'àmbit clínic. Un diagnòstic correcte assegura un tractament adequat, més curt i exitós, i prevé la transmissió a nous hostes. Les tècniques i els resultats exposats aquí contribueixen a assolir aquests objectius i millorar el control global de l'epidèmia de tuberculosi resistent. / [EN] Antibiotic resistance in tuberculosis is a serious global health problem and a growing obstacle to the control of the disease. In this thesis we use genomics as a tool to study different aspects of the biology of the bacterium in relation to the development of antibiotic resistance and provide new knowledge to meet the challenge of its eradication. First, we characterize new genomic determinants of resistance to isoniazid by using an approach based on functional genomics and phylogenetic association. The method consists of transposon sequencing of bacterial populations exposed to the antibiotic to determine the genes involved in both sensitivity and resistance, and their filtering with genomic data from a global collection of clinical strains. We have verified the importance of the metabolic pathways of bacterial wall synthesis in the mechanism of antibiotic action, and also discovered new genes involved in cellular redox balance that confer low-level resistance to the bacteria. These results can be used to develop new diagnostic techniques or therapeutic targets, and the method is applicable to new antibiotics to predict future resistance determinants. Second, we explored the bacterial diversity of tuberculosis at its natural site of infection and the population dynamics of antibiotic resistance. We have analyzed samples from different parts of the lung lesion from patients in Georgia, a country with a high incidence of resistant tuberculosis, and detected a significant number of polyclonal infections (caused by two or more different strains). These different strains can in turn be resistant to different antibiotics, which makes it essential to detect them in time to offer the patient the most appropriate treatment possible. The surgical specimens gave us a more complete picture of bacterial diversity than sputum, the routine clinical specimen, and allowed us to detect polyclonal infections more accurately. The data show that we are underestimating these types of infections in high TB burden countries and they may adversely affect treatment outcome, so in these settings a second sampling during the course of the antibiotic regimen would be advisable. Third, we evaluated the role of one of the most important comorbidities of tuberculosis, HIV, in the development of resistance during the first weeks of treatment. To this end, we have sampled patients from Mozambique with and without HIV on a serial basis during the first month to analyze the impact of co-infection on both immune and antibiotic selective pressures. We have detected a higher total diversity in seronegative patients and furthermore, in comparison, HIV+ patients present difficulties in eliminating this diversity during the early stages of treatment that could affect their success. Thanks to deep sequencing, we have also been able to observe an accumulation of variants in resistance-related genes, and we have associated some of them with changes in the MICs (minimum inhibitory concentrations) of the samples. These small changes during the first month may serve as predictors of a reduced ability to eliminate bacterial diversity, and could indicate future treatment failure. In summary, in this thesis we have focused on better understanding the bacterial and host factors that have an impact on the development of antibiotic resistant tuberculosis and as a result will allow the development of new diagnostics and epidemiological models to control it. Genomic sequencing is a great tool to study this and other pathogens in real time, and offers the possibility of detecting resistance quickly and with high certainty in the clinical setting. A correct diagnosis ensures adequate, shorter and more successful treatment, and also prevents transmission to new hosts. The techniques and results presented here contribute to achieve these objectives and improve the global control of the resistant tuberculosis epidemic. / Moreno Molina, MÁ. (2023). Functional and evolutionary genomics of antibiotic resistance in tuberculosis: from biology to global DR-TB control [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/199255

La predicción de estructuras de proteínas es uno de los retos más importantes de la biología y la bioinformática (Lopes et al., 2019). Esta última es el campo de investigación que se apoya en la computación para analizar la información relacionada a las macromoléculas biológicas como las proteínas (Xiong, 2006). Las proteínas son moléculas esenciales compuestas por varios cientos o miles de aminoácidos configurados de forma secuencial, lo cual se conoce como estructura primaria (Xiong, 2006). Esta organización se va plegando espontáneamente hasta resultar en una conformación tridimensional diferente una de otra denominada como estructura terciaria, la cual es fundamental para determinar la función de la proteína y realizarla de forma exitosa (Xiong, 2006). Hay muchas razones por las cuales la predicción de estructuras proteicas sigue siendo una problemática vigente. Una de ellas es que, actualmente, es mucho más complicado obtener estructuras tridimensionales que secuencias de proteínas, por lo cual existe una brecha cuantitativa entre ellas, que crece exponencialmente (Deng et al., 2018). Además, la determinación de las estructuras tridimensionales sigue siendo una tarea que requiere muchos recursos económicos, computacionales y algunos no renovables, como el tiempo (Lopes et al., 2019). En adición, se ha evidenciado una significativa ausencia de criterios de usabilidad en el desarrollo de muchas herramientas informáticas relacionadas a la predicción de las proteínas (Paixão-Cortes et al., 2018). Esto conlleva al gasto innecesario de tiempo y esfuerzo de los usuarios que deben interactuar con interfaces difíciles de entender (Bolchini et al., 2009). Esta situación se replica en proteínas específicas como las proteínas repetidas, las cuales son grupos de familias de proteínas que tienen propiedades particulares como la existencia de unidades de repetición en su estructura (Hirsh et al., 2016). Estas proteínas son importantes dado que se sabe que se relacionan con muchas enfermedades humanas en su proceso de diagnóstico y porque dan pie al desarrollo de nueva medicina (Burley et al., 2021; Kajava & Steven, 2006). No obstante, debido a su complejidad, aún se requieren esfuerzos para estudiarlas en temas como la predicción de sus estructuras (MSCA & RISE, 2018). Por todo ello, este proyecto de tesis busca proponer el desarrollo de una herramienta dedicada a la predicción de estructuras terciarias de proteínas repetidas a partir de sus estructuras primarias, la cual deberá cumplir con lineamientos de usabilidad. Se espera responder a la problemática planteando una plataforma web que sea amigable para el usuario, que permita obtener resultados en tiempos aceptables y que utilice un algoritmo de predicción que aplique inteligencia artificial y sea eficaz respecto a la evaluación de alineamientos estructurales. En primera instancia, se evaluarán distintos algoritmos de predicción de proteínas en general, para luego seleccionar uno y adaptarlo a los requerimientos de los especialistas en proteínas repetidas. Con ello, se crearán servicios y rutinas de ejecución que permitirán predecir estructuras terciarias de proteínas a partir de diversos tipos de datos de entrada. Posteriormente, se construirá la interfaz gráfica de la herramienta, partiendo de la definición de estándares y el desarrollo de un prototipo de alta fidelidad. Finalmente, se integrarán ambos componentes para conformar la herramienta completa, la cual será valorada a través de diversas pruebas funcionales y una evaluación de usabilidad. Cabe mencionar que esta última se realizará utilizando una herramienta enfocada a la evaluación de herramientas bioinformáticas.

Bioinformática es la aplicación de tecnologías computacionales y la estadística a la gestión y análisis de datos biológicos como lo son las secuencias de ADN y de proteínas (Can, 2014). En esta área se ha evidenciado una creciente necesidad de usabilidad en las herramientas utilizadas para la investigación, con el fin de conseguir un manejo adecuado de la gran cantidad de información que se utiliza (Bolchini et al., 2009). Además, actualmente es evidente la escasez de investigaciones sobre usabilidad en servicios web bioinformáticos (Bolchini et al., 2009). Es por ello que, en este trabajo de investigación, se busca proponer herramientas que permitan realizar evaluaciones de usabilidad y diseño de interfaces enfocados a las necesidades en servicios web bioinformáticos. Estos servicios presentan características particulares que los diferencian de otros tipos de software. Además, sus usuarios presentan necesidades distintas. Por ejemplo, las barreras de usabilidad pueden inhibir la satisfacción de la experiencia de usuario y forzar a los investigadores a desperdiciar tiempo y energía en realizar tareas cotidianas en sus trabajos (Bolchini et al., 2009). Con la finalidad de atacar esta problemática, en este proyecto de fin de carrera se ha realizado la identificación del instrumento y el método de evaluación de usabilidad idóneos a aplicar en servicios web bioinformáticos, revisando literatura y comparando las principales características de métodos que ya han sido utilizados en este tipo de servicios. Con estos, se realizó una evaluación en el servicio web bioinformático del tipo recurso de datos Pfam (El-Gebali et al., 2019). Se realizó un análisis para enfocar el instrumento elegido a este tipo de servicios y se propusieron ajustes a este. Con el instrumento ajustado propuesto, se realizó nuevamente una evaluación de usabilidad al servicio mencionado anteriormente y se realizó una comparación de los resultados obtenidos. Además, por medio de entrevistas a usuarios de servicios web bioinformáticos y los resultados obtenidos en este trabajo, se propuso una clasificación de usuarios basado en el nivel de experiencia de estos usuarios. Se elaboraron instrumentos de usabilidad como perfiles de usuario y mapas de empatía para cada una de las categorías. Finalmente, se propusieron lineamientos para el diseño de interfaces de servicios web bioinformáticos, los cuales fueron aplicados a una funcionalidad del servicio de información sobre familias de proteínas, Pfam (El-Gebali et al., 2019).