Primera, estudiar los efectos de un extracto de cacahuete rico en polifenoles y de compuestos bioactivos (alfa-tocoferol) en modelos celulares a nivel de inflamación (células monocíticas THP-1) y disfunción endotelial (células endoteliales de aorta humana; HAEC), respectivamente. Segunda, optimizar el volumen sanguíneo caracterizando el perfil de metabolitos acuosos y lipídicos, la composición de ácidos grasos, la detección de subclases de lipoproteínas y de polifenoles en plasma y glóbulos rojos. El extracto de cacahuete ejerce efectos anti-inflamatorios mediante la inhibición de la proteína del TNF-α extracelular, a través de la inhibición de la activación del factor de transcripción c-Jun. El alfa-tocoferol mejora la función endotelial mediante la inhibición de la VCAM-1 y en menor grado sobre la E-selectina e ICAM-1. El plasma y glóbulos rojos aportan información metabolómica complementaria y se elegirá uno u otro en función del objetivo de los estudios en humanos. / The thesis addresses two major issues. Firstly: The study the effects of polyphenol-rich peanut extract and bioactive compounds (alpha-tocopherol) in cellular models of inflammation (monocytic cells; THP-1) and on endothelial dysfunction (human aortic endothelial cells; HAEC), respectively. Secondly: The optimisation of blood sampling for human studies to characterise the profile of aqueous and lipid metabolites, fatty acid composition, lipoprotein subclasses, and polyphenol content of plasma and red blood cells. Peanut extract exerts anti-inflammatory effects by inhibiting extracellular TNF-α protein via the inhibition of c-Jun transcription factor activation. Alpha-tocopherol improves endothelial function by inhibiting VCAM-1 and, to a lesser extent, E-selectin and ICAM-1. Analyses of metabolites in plasma and red blood cells generate complementary information. The measurements may need to be performed in either, or both, matrices, depending on the objectives of the study.

La cabra de mar, Maja brachydactyla, és una espècie de cranc (Decapoda: Brachyura) molt apreciada gastronòmicament i d’interès pesquer en varis països d’Europa, com ara França, el Regne Unit o Irlanda. El consum de cabra de mar a Espanya supera les captures de zones pesquera com Galícia o Astúries, i aproximadament el 75% de les cabres de mar comercialitzades a través dels mercats majoristes són importades d’altres països europeus. A Espanya, la principal zona de captura és Galícia, on la pesca de la cabra de mar té una gran importància econòmica i social. Tanmateix, s’estima que més del 90% del reclutament anual és capturat, amb el risc que això suposa de col•lapse de les poblacions naturals. A més, la cabra de mar presenta unes característiques biològiques molt interessants per al cultiu en captivitat, com ara l’alta fecunditat, un desenvolupament embrionari i larvari curts, un creixement ràpid i l’absència de canibalisme. D’aquesta manera, el cultiu de la cabra de mar podria cobrir les demandes de consum d’aquesta espècie i reduir la pressió sobre les poblacions naturals.. En aquest sentit, la tesi “Estudi de la biologia reproductiva de la cabra de mar, Maja brachydactyla: aparell reproductor i qualitat de les postes en captivitat” desenvolupa estudis bàsics i aplicats de la reproducció d’aquest espècie amb l’objectiu del desenvolupament de la reproducció en captivitat. Els aspectes bàsics estudiats de la reproducció foren 1) la morfologia i ultraestructura de l’aparell reproductor masculí; 2) l’espermatogènesi; 3) la morfologia i ultraestructura de l’espermatozoide i 4) l’ontogènia de l’aparell reproductor durant el desenvolupament larvari i primer cranc juvenil mitjançant l’expressió del gen Mb vasa. Els estudis aplicats a la reproducció en captivitat se centraren en 1) l’efecte de la presència de mascles i 2) l’efecte del fotoperíode en la producció larvària i la composició bioquímica de les larves acabades de sortir de l’ou. Els resultats de la tesis mostren que 1) La morfologia, ultraestructura i funció de l’aparell reproductor masculí de la cabra de mar són similars a la resta de braquiürs; 2) l’espermatogènesi de la cabra de mar és un procés semblant a aquells descrits en altres espècies de braquiürs, amb la particularitat de la presència del complex de Golgi que podria estar involucrat en la formació de l’acrosoma; 3) la morfologia i ultraestructura de l’espermatozoide de la cabra de mar s’ajusta al model general dels braquiürs; 4) l’expressió del Mb vasa al llarg del desenvolupament larvari i primer estadi juvenil s’ajusta a una corba de creixement exponencial; 5) la presència de mascles en els tancs de les femelles deuria ser considerada per a l’optimització de la producció larvària sense comprometre la condició de les femelles i 6) el fotoperíode és una factor ambiental que afecta la reproducció de la cabra de mar, malgrat que la manipulació del fotoperíode és insuficient per a modificar el comportament reproductiu d’aquesta espècie. / The spider crab, Maja brachydactyla, is a brachyuran species (Decapoda: Brachyura) of fishery interest in several countries in Europe. The demand in Spain exceeds the captures of fishing areas such as Asturias and Galicia, which is the main fishing region. However, natural populations might be in risk of collapse in Galicia since over the 90% of the recruitment is estimated to be fished every year. On the other hand, the spider crab has interesting biological features that make this species of interest for aquaculture. Thus, the culture of the spider crab would cover the demands of the market and reduce the pressure over the natural populations. To this respect, the thesis “Estudi de la biologia reproductiva de la cabra de mar, Maja brachydactyla: aparell reproductor i qualitat de les postes en captivitat” is focused on reproductive basic and applied studies aiming to the development of the reproduction in captivity of this species. The basic aspects were 1) the morphology and ultrastructure of the male reproductive system; 2) the spermatogenesis; 3) the morphology and ultrastructure of the spermatozoid and 4) the ontogeny of the reproductive system during the larval development and first juvenile crab using the expression of the Mb vasa gene. The applied aspects were 1) the effect of male presence and 2) the effect of photoperiod in the larval production and biochemical composition of the newly hatched larvae. The results show that 1) the morphology, ultrastructure and function of the male reproductive system are similar to those observed in other crabs; 2) the spermatogenesis is a similar process to that observed in other crab species; 3) the morphology and ultrastructure of the sperm follows the general pattern described for brachyuran; 4) the expression of Mb vasa through the early post-embryonic development increases following an exponential curve, 5) the presence of male within females might be considered in order to optimize the larval production without jeopardizing the condition of females and 6) the photoperiod is an environmental factor that affects the reproduction in the spider crab, although the manipulation of the photoperiod does not modify its reproductive behavior.

En los últimos años se ha producido un gran desarrollo de las técnicas relacionadas con la terapia celular. Así actualmente es posible aislar células progenitoras de numerosos tejidos humanos adultos que pueden dar lugar a múltiples linajes celulares.Además la investigación en biomateriales ha experimentado una importante expansión, generando una gran variedad de soportes de diferente naturaleza físico-química. La combinación del tipo celular y el biomaterial adecuados, junto con factores de crecimiento específicos, podría ser una alternativa a las terapias actuales para lograr la reparación de determinados tejidos de escasa capacidad de autoregeneración, como por ejemplo el tejido óseo. En esta tesis se describe la aplicación de una plataforma basada en la detección de células, que expresan constitutivamente los genes de la proteína verde fluorescente y la luciferasa de Photinus Pyralis, mediante procedimientos de bioluminiscencia no invasiva para la selección de los biomateriales que mejor inducen la proliferación in vivo de las líneas celulares C3H/10T1/2 y C57BL/6 en un modelo ectópico y para la evaluación de la proliferación y diferenciación de células mesenquimales humanas (hMSCs), obtenidas de diferentes tejidos, en un modelo de lesión ósea.Los resultados obtenidos demuestran que las células sembradas en biomateriales implantados en ratones inmunodeprimidos pueden ser detectadas un mínimo de 12 semanas, mostrando una mejor proliferación en los implantes colocados intramuscularmente que en los implantes subcutáneos. Este modelo ectópico permitió seleccionar un biomaterial basado en macrómeros de polietilenglicol (PEG) unidos a péptidos RGD (arg-gly-asp) que potencia la proliferación celular in vivo. Posteriormente este material (PEG-RGD) se sembró con hMSCs y se evaluó en un modelo de lesión ósea, en el hueso de la bóveda craneal de ratones inmunodeprimidos, que mostró una mejor supervivencia de las hMSCs obtenidas de médula ósea frente a las hMSCs obtenidas de tejido adiposo. Se observó además, mediante tomografía axial computerizada, que la densidad de los defectos óseos en los que se colocaron implantes de PEG-RGD aumentó significativamente respecto al grupo control.La plataforma desarrollada podría tener una gran utilidad para analizar cuestiones relacionadas con la utilización de las células troncales en la reparación de tejidos, tales como el tipo celular óptimo, las condiciones de expansión in vitro o la inducción de diferenciación. Además es un procedimiento simple, altamente sensible y permite analizar el mismo animal durante largos períodos de tiempo, mejorando así la consistencia de los resultados obtenidos y reduciendo el número de animales utilizados. / Recent developments in stem cell and biomaterial research have promoted a flourishing of new methods for tissue repair. Nowadays, stem cells isolated from human adult tissues can give rise to multiple cell types. Moreover the research in the biomaterials field has increased dramatically and a huge amount of scaffolds, varying in their structure and chemist properties, has been generated. The right combination of a cell type and a biomaterial, together with the adequate growth factors could be an alternative in the repair of damaged tissues with impaired self-regeneration (such as the bone tissue). However, there is a scarcity of procedures to monitor the performance of scaffold-stem cell combinations implanted in live animals, avoiding the inherent artifacts associated with in vitro assay conditions.In this thesis, a platform based on stem cell detection by non invasive photonic imaging is described. The platform purpose is the selection of the biomaterial that could promote the greatest in vivo proliferation of the C3H/10T1/2 and C57BL/6 cell lines in an ectopic site. These cell lines express constitutively GFP and PLuc.The results proved that the seeded scaffolds, implanted in immunocompromised mice, can be detected up to 12 weeks, showing best results when implanted intramuscularly compared to the subcutaneous site. With this model a biomaterial composed of polyethyleneglycol (PEG) macromers coupled to RGD (arg-gly-asp) peptides was selected. Subsequently, the chosen PEG scaffold was seeded with human mesenchymal stem cells, from bone marrow (hMSCs) or adipose tissue (hASCs), and implanted in a bone defect created in the calvarial bone of immunocompromised mice. In this location the hMSCs survived better than the hASCs. Besides, the density in the bone defects where PEG-RGD constructs had been implanted, measured by TAC, increased (p<0.05) compared to the control group.The developed platform is a simple and extremely photon-sensitive procedure. Furthermore, it allow animal tracking trough long time periods, improving the results consistency and reducing the number of animals used in each experiment. The platform can be also used to analyze and improve cell types, growth and differentiation conditions.

La neuroinmunología estudia la relación entre el sistema inmune y el sistema nervioso. Sus orígenes se remontan a la última década del siglo diecinueve, pero sólo recientemente está en pleno auge. El continuo aumento de la incidencia de las enfermedades neurológicas, especialmente en los países de ingresos altos, ha resaltado la importancia de la clínica de la neuroinflamación. Señales endógenas y/o exógenas anormales pueden determinar el inicio del proceso neuroinflamatorio, el cual representa una respuesta fisiológica pleiotrópica del sistema inmune innato del sistema nervioso central (SNC) que puede ser seguida por la activación del sistema inmune periférico. Los astrocitos y en particular la microglía son las células efectoras del sistema inmune en el SNC. En las últimas décadas se han evidenciado varias funciones de la glía, como la regulación de la trasmisión sináptica o como reservorio celular de la neurogénesis en el cerebro adulto. Aun así, una de las principales funciones de la glía es la de mantener la homeostasis del parénquima del SNC, regulando el microambiente y tamponando eventuales cambios. Cuando la homeostasis del SNC está comprometida más allá de los niveles de tolerancia fisiológica, los astrocitos y la microglía experimentan profundos cambios para restablecer las condiciones necesarias para una óptima actividad neuronal. Este proceso es conocido como activación glial. Esta tesis doctoral se centra en la activación glial, la cual representa un aspecto fundamental de la neuroinflamación. La activación glial es un proceso complejo y altamente relacionado con varios aspectos del sistema inmunológico del SNC y para una mejor comprensión del mismo se introducirán los aspectos fundamentales que lo componen. La activación glial es un cambio importante en la fisiología de la glía, representando profundos cambios del transcriptosoma y de su regulación fina. Hasta ahora han sido descritos diferentes factores de transcripción como reguladores de la transcripción génica durante la activación glial pro- y anti-inflamatoria. Esta tesis estudia la activación glial pro-inflamatoria y en particular el papel de dos miembros de la familia de factores de transcripción de las CCAAT Enhancer Binding Proteins (C/EBPs), los factores C/EBPβ y C/EBPδ. A través de análisis bioinformáticos, bioquímicos y de biología celular, se han caracterizado los promotores de genes dianas de C/EBPβ y C/EBPδ durante la activación glial in vitro. El uso de ratones deficientes en C/EBPβ o C/EBPδ para cultivos primarios de glía mixta y para un modelo de inflamación in vivo han permitido demonstrar la importancia fundamental de estos dos factores en la activación glial. El presente trabajo demuestra claramente cómo C/EBPβ y C/EBPδ interaccionan con los promotores de algunos de los principales genes pro-inflamatorios y cómo la ausencia de uno de los dos determina una reducción de la expresión de los mRNA y de las proteínas de los genes diana. Además, se demuestra que C/EBPβ y C/EBPδ regulan la neurotoxicidad de la microglía in vitro. Finalmente se demuestra que los mismos factores pueden regular la expresión de genes pro-inflamatorios en un modelo in vivo de neuroinflamación. Esta tesis determina el importante papel de los factores de transcripción C/EBPβ y C/EBPδ en la activación glial, evidenciándolos como posibles dianas farmacológicas en el tratamiento terapéutico de la neuroinflamación para prevenir los efectos perjudiciales de la activación glial. / Neuroimmunology studies the relationship between immune and nervous system. It originated in the last decade of the 19th century with Santiago Ramón y Cajal work, but only recently it has exploded as an active research topic. The increase incidence of neurological disorders, especially in high-income countries, has pointed out one of the main clinical aspects of neuroimmunology, the neuroinflammation. Abnormal endogenous and/or exogenous signals can cause neuroinflammation which represents a pleiotropic physiological response initiated by the central nervous system (CNS) innate immunity arm and sometimes mediated by the adaptive peripheral arm. Astrocytes and especially microglia are the immune cell effectors in the CNS. In the last decades many functions of glial cells have been shown, such as adult neurogenesis reservoir or constitutive players in neuronal synaptic transmission. However, one of the main glial roles is to maintain the homeostasis in the adult nervous system by supporting neuronal activity, regulating the microenvironment and buffering any disturbances. When CNS homeostasis is compromised over a physiological threshold, astrocytes and microglia undergo enormous phenotypical changes when attempting to reestablish the original environmental state. This process is known as glial activation. This thesis focuses on glial activation. Since glial activation is highly interconnected with several aspects of immune physiology of CNS, many features of nervous-immune system will be briefly introduced. Glial activation causes a marked change in glial cell physiology, resulting in a profound reorganization of transcriptional machinery and its fine regulation. So far, several transcription factors have been described to control glial activation during pro- and anti-inflammatory response. This thesis focus on the transcriptional regulation of pro-inflammatory glial activation and particularly the role of two members of Ccaat Enhancer Binding Protein family (C/EBPs), the transcription factors C/EBPβ and C/EBPδ. Through bioinformatic, biochemical and cell biology analyses we have characterized transcriptional targets of C/EBPβ and C/EBPδ during glial activation in vitro. In vitro mixed glial cultures and in vivo models of C/EBPs deficient mice have been used to demonstrate the key role of C/EBPβ and C/EBPβ in glial activation, especially in activated microglia. This thesis clearly demonstrates that C/EBPβ and C/EBPδ interact with key pro-inflammatory gene promoters and their absence reduces mRNA and protein levels of target genes in glial activation. In addition, it is shown that C/EBPβ and C/EBPδ control the neurotoxic potential of microglia in vitro. Gene expression analysis of systemically LPS-treated knockout mice has also shown an in vivo C/EBPs transcriptional role in brain cortex neuroinflammation. This work demonstrates for the first time the important role triggered by C/EBPβ and C/EBPδ in glial activation, highlighting these transcription factors as potential therapeutic targets to reduce the detrimental consequences of neuroinflammation.

El càncer d’endometri és la malaltia més freqüent del tracte genital femení en països desenvolupats. L’aparició de símptomes en estadis primerencs [1], contribueix a la detecció de la malaltia en estadis no avançats i amb un alt índex de supervivència. No obstant, en el 20 % dels casos, el diagnòstic es més tardà i els pacients pateixen infiltració miometrial i/o afectació limfàtica. La invasió miometrial, que indica invasió tumoral, és el factor pronòstic més important i determina l’augment de l’índex de recurrència després del tractament quirúrgic i la disminució de l’índex de supervivència als 5 anys. Conseqüentment, el descobriment dels passos inicials associats amb la infiltració miometrial és fonamental per identificar nous agents terapèutics per la prevenció de la disseminació del càncer. Per assolir aquest propòsit, el principal objectiu del nostre grup durant els últims anys ha estat la identificació de mecanismes moleculars involucrats en la invasió i la disseminació del càncer d’endometri. Hem identificat el factor de transcripció ETV5 com el principal agent de la invasió miometrial en les cèl·lules tumorals endometrials. ETV5 està específicament sobreexpressat en el tumor d’endometri invasiu [2] i és capaç d’activar la metaloproteassa MMP2 promovent la migració i la invasió cel·lular in vitro i in vivo [3]. A més, hem demostrat el paper d’ETV5 en la inducció de l’EMT (transició epiteli-mesènquima) que provoca l’adquisició de capacitats invasives i migratòries del tumor. El principal objectiu d’aquesta tesi és la identificació de noves molècules involucrades en la invasió miometrial. En particular, ens hem focalitzat en la identificació de noves dianes d’ETV5 que participen en l’adquisició de propietats migratòries i invasives de les cèl·lules tumorals en el carcinoma endometrial. Per caracteritzar els passos inicials de la invasió miometrial regulada per ETV5, vam analitzar mitjançant l’estudi diferencial d’expressió gènica aquells gens que estaven alterats en cèl·lules de càncer d’endometri Hec1a amb una sobrexpressió estable de la proteïna de fusió GFP-ETV5, comparat amb les cèl·lules Hec1a control. En particular, vam identificar NID1 i NUPR1 com a directes dianes transcripcionals d’ETV5. NID1 és una proteïna que forma part de la matriu extracel·lular juntament amb la laminina [4]. NUPR1 és una proteïna del grup de les HMG i la seva principal funció és unir-se a la cromatina dels promotors per modificar l’accessibilitat de la cromatina durant la regulació gènica [5]. Vam voler examinar el paper de NID1 i NUPR1 coma mediador de les funcions d’ETV5 en les cèl·lules Hec1a de càncer d’endometri in vitro i in vivo utilitzat un model animal [6]. Junts, els nostres resultats suggereixen que la regulació de NID1 mitjançant ETV5 genera la invasió cel·lular i l’adhesió a la matriu extracel·lular, i la regulació de NUPR1 mitjançant ETV5 provoca la migració cel·lular en la línia cel·lular de càncer d’endometri in vitro. D’altra banda, proposem que NID1 i NUPR1 regulen la migració i la invasió, cel·lular en part, mitjançant la regulació indirecte de la N-cadherina. També vam poder observar que els ratolins injectats amb cèl·lules que presentaven NID1 silenciat generaven tumors de mida inferior que els injectats amb cèl·lules control. D’altra banda, els ratolins injectats amb cèl·lules amb NUPR1 o NID1 silenciats generaven menys metàstasis que els injectats en cèl·lules control suggerint que NID1 i NUPR1 mitjançant ETV5 estan involucrats en la progressió i la disseminació tumoral in vivo. Finalment, per tal de confirmar la regulació de NID1 i de NUPR1 per ETV5, vam examinar el paper d’ambdós gens en mostres humanes de càncer d’endometri i la seva associació amb les característiques clíniques i patològiques. En estudis previs, vam descriure la sobreexpressió d’ETV5 en el carcinoma d’endometri, concretament el front d’invasió del tumor [7]. En aquest estudi, hem trobat que l’expressió de NID1 i d’ETV5 està clínicament correlacionada en mostres humanes de càncer d’endometri tan a nivell de mRNA com de proteïna. A més a més, em pogut observar una sobreexpressió de NID1 i de NUPR1 en el front d’invasió del tumor tant a nivell de mRNA con de proteïna. Com conclusió, aquestes dades presentades en aquesta tesi contribueixen al descobriment de mecanismes moleculars involucrats en la disseminació del càncer d’endometri. El descobriment de les bases moleculars de la invasió en el carcinoma endometrial contribuirà en el desenvolupament d’estratègies terapèutiques més específiques i efectives. / Endometrial cancer is the most frequent malignancy of the female genital tract in Western countries. The early appearance of symptoms [1], contributes to the earlier detection of this malignancy and results in better survival rates. However, in 20% of cases the diagnosis is delayed and patients present with myometrial infiltration and/or lymph node affectation. Myometrial invasion, an initial event that signals tumour invasion is one of the most valuable prognostic factors and it determines increased recurrence rates after the first surgical treatment and decreased 5-year survival. Consequently, unravelling the initial steps associated with myometrial infiltration is fundamental to identify new therapeutic agents for the prevention of cancer dissemination. To this end, the major scientific aim of our group during the past few years has been the identification of the molecular mechanisms involved in endometrial cancer invasion and dissemination. We identified ETV5 transcription factor as an important agent of myometrial invasion by endometrial tumour cells. ETV5 is specifically upregulated in invasive endometrial tumours and is able to [2] activate the metalloproteinase MMP2, thus promoting cell migration and invasion in vitro and in vivo [3]. In addition, we demonstrated the role of ETV5 on the induction of EMT, which result in the acquisition of migratory and invasive capabilities. The main objective of this thesis is to identify new molecules involved in the myometrial invasion of endometrial cancer. In particular, we have focused on the identification of new ETV5 downstream targets that mediate the role of ETV5 in the endometrial tumour cells’ acquisition of migratory and invasive properties. To further characterise the initial steps of myometrial invasion regulated by the ETV5 transcription factor, we analysed by gene expression microarray technology those genes whose expression was altered in Hec1A endometrial cancer cells with stable overexpression of a fusion GFP-ETV5 protein, compared with Hec1A control cells. In particular, we have identified NID1 and NUPR1 as direct transcriptional targets of ETV5. NID1 is a ubiquitous protein component of the BM and a partner of laminin [4]. NUPR1 is a HMG protein and its principal role in the cell is to bind to the chromatin promoters to modify the accessibility of chromatin in gene regulation [5]. We wanted to examine the role of NID1 and NUPR1 as a mediator of ETV5 functions in Hec1A endometrial cancer cells in vitro and in vivo using an orthotopic mouse model [6]. Our results suggest that NID1 regulation by ETV5 enhances cell invasion and cell adhesion to the extracellular matrix, and that NUPR1 regulation by ETV5 enhances cell migration in endometrial cancer cells in vitro. We propose that NID1 and NUPR1 regulation of cell migration and invasion may be in part mediated by the regulation of N-cadherin. We also observed that the mice injected with cells with NID1 silenced, generated a small size tumours compared with mice injected with control cells. Moreover, we found that mice injected with cells with NID1 or NUPR1 inhibition produced a decreased number of metastases compared with mice injected with control cells. These results suggest that the regulation of NID1 and NUPR1 by ETV5 contributes to the tumour progression and dissemination in vivo. Finally, in order to confirm the regulation of NID1 or NUPR1 by ETV5, we wanted to examine the role of both NID1 and NUPR1 genes in human endometrial tumour samples and their association with clinical and pathological characteristics In previous studies, ETV5 was upregulated in human endometrial tumour samples compared with control tissue, in particular in the invasion front of endometrial tumours [7]. We found that the expression of NID1 and ETV5 were clinically correlated in human endometrial tumour samples at mRNA level and at the protein level. Moreover, we observed a upregulation of NID1 and NUPR1 in invasion front of the tumour. In conclusion, the data presented in this thesis contributes to the elucidation of the molecular mechanisms involved in endometrial cancer dissemination. Understanding the molecular basis of myometrial invasion in endometrial cancer will contribute to the development of more specific and more effective therapeutic strategies.

Esta investigación aporta evidencias sobre el uso potencial de la luz láser de diodo de 655 nm de emisión continua para modificar la motilidad espermática canina. El modelo experimental usado ha sido el de muestras frescas de semen de perros adultos (5.9  2.1 años) y sanos de raza beagle que han sido sometidas a diferentes dosis y potencias de irradiación láser. Se han analizado los diferentes parámetros de motilidad y las subpoblaciones espermáticas. Los resultados indican claramente que la energía láser modular la motilidad espermática y que este efecto es dosis dependiente y potencias dependiente, mediante un mecanismo de acción no relacionado con los mecanismos de la tirosina ni por las especies reactivas de oxígeno mitocondrial (mROS). / Aquesta recerca aporta evidències sobre l’ús potencial de la llum làser de díode de 655 nm d’emissió contínua per modificar la motilitat espermàtica canina. El model experimental emprat ha estat el de mostres fresques de semen de gossos adults (5.9  2.1 anys) i sans de raça beagel, que han estat sotmeses a diferents dosis i potències d’irradiació làser. S’han analitzat els diferents paràmetres de motilitat i les subpoblacions espermàtiques. Els resultats indiquen clarament que l’energia làser modula la motilitat espermàtica i que aquest efecte és dosi dependent i potència dependent, mitjançant un mecanisme d’acció no relacionat amb els mecanismes de la tirosina ni per les espècies reactives d’oxigen mitocondrial (mROS). / This research provides evidences on the potencial use of the 655 nm continuous wave diode laser irradiation to modify the canine sperm motility. The experimental model used has been fresh samples from adult (5.9  2.1 years old) and healthy beagle dog sperm that have been exposed to different doses an output powers of laser irradiation. The different motility parameters have been analysed as well as the spermatic subpopulations. The results clearly indicate that the laser energy modulates the sperm motility and that this effect is depends on the dose and on the output power. This effect is done by a mechanism of action that is not related to tirosine mechanism nor to mitochondrial reactive oxygen species (mROS).

Tesi realitzada a l'Institut de Bioenginyeria de Catalunya (IBEC) / La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia. Afecta, actualmente, a más de 30 millones de personas en todo el mundo, causando un gran impacto socioeconómico que aumenta año tras año con unos 7,7 millones de nuevos casos por año. La enfermedad de caracteriza por un deterioro cognitivo y cambios conductuales. A nivel patofisiológico se caracteriza por la acumulación del péptido beta-amiloide (Aß), y la proteína tau. La proteína tau es una proteína que se une a tubulina, estabilizando los microtúbulos y ayudando a su polimerización. En la enfermedad, la proteína se hiperfosforila, desestabilizando los microtúbulos por un lado, y auto-agregándose para formar filamentos helicoidales pareados y finalmente los ovillos neurofibrilares. La proteína precursora amiloide (APP), en la enfermedad, es procesada por beta- y gamma-secretasas, resultando en la formación del péptido beta-amiloide, en la vía amiloidogénica. Este péptido agrega dando lugar a las placas amiloides. Se ha descrito que los oligómeros, un estadio de agregación intermedio, son las formas más tóxicas, y que PrPC, que sea demostrado que se une con elevada afinidad a los oligómeros de Aß, podría ser un receptor y mediador de la toxicidad causada por éstos. PrPC es conocida por su participación en las enfermedades espongiformes transmisibles (EETs), en su forma patogénica llamada PrPSc, que se acumula en el cerebro formando agregados, aunque también se han encontrado agregados amiloides en estas enfermedades y una disminución de los niveles de PrPC. Esta proteína participa en procesos como la neuritogénesis o la transmisión sináptica, y hay evidencias de que podría tener una función neuroprotectora en el cerebro. Esta tesis doctoral aborda la participación de PrPC en la EA, des de diferentes puntos de vista, tanto en la acumulación del péptido Aß, como en la fosforilación de tau. Nuestros datos apuntan a una posible función neuroprotectora por parte de PrPC. Por un lado, hemos observado que PrPC podría regular la fosforilación de tau modulando los niveles de expresión de ésta, que se produce debido a los oligómeros de Aß, de forma específica, y no por los agregados insolubles y fibrilares. También hemos visto que, una sobreexpresión de PrPC correlaciona tanto con un aumento de la fosforilación de tau como con un aumento del depósito de Aß, apuntando a una posible pérdida de esta función neuroprotectora. También hemos estudiado la relación entre el péptido Aß y PrPC desde la perspectiva de las enfermedades espongiformes. Hay evidencias de PrPC regula los niveles de Aß en la EA, y debido a la presencia de agregados amiloides, y a una disminución de los niveles de PrPC en las EETs, nos planteamos el papel del depósito de Aß en la infectividad del prión. Nuestros resultados apuntan a que estos depósitos no afectan a la infectividad. Por último, a nivel terapéutico, existen tratamientos paliativos para la EA enfocados en compensar el desequilibrio en diferentes neurotransmisores como la acetilcolina o el glutamato. Estos tratamientos no consiguen frenar el avance de la enfermedad. Aunque muchas alternativas de diferentes clases están ahora en diferentes fases clínicas, algunas de ellas han presentado efectos secundarios como meningoencefalitis, y otras no han conseguido mejorar los síntomas en pacientes respecto a grupos control con placebo. Esta tesis aborda una posible alternativa a los tratamientos anti-amiloides actuales. A partir del screening de una librería de gamma-péptidos derivados de prolina, hemos identificado un candidato con propiedades relacionadas con la neuritogénesis, y una disminución de los niveles de Aß, por la modulación de la beta-secretasa BACE1. / Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia. Nowadays, it affects more than 30 million people worldwide. The disease is characterised by cognitive impairment and behavioural changes. At the pathophysiological level, it is characterised by the accumulation of beta-amyloid peptide (Aß), and tau protein. Tau protein interacts with tubulin, stabilizing the microtubules and taking part in their polymerization. In the disease, the protein becomes hyperphosphorylated destabilizing the microtubules, and self-aggregates to form paired helical filaments (PHF), and later neurofibrillary tangles (NFT). The amyloid precursor protein (APP), in the disease is processed by beta- and gamma-secretases, resulting in the formation of Aß peptide, in the amyloidogenic pathway, that aggregates forming amyloid plaques. It has been described that oligomeric forms, an intermediate aggregation state, are the most toxic species, and PrPC, that has been described of as having high affinity for Aß oligomers, could be a receptor and a mediator of their toxicity. PrPC is known for its participation in transmissible spongiform diseases (TSEs), in its pathogenic form called PrPSc, that accumulates in the brain forming aggregates, although amyloid aggregates and a decrease in PrPC levels have also been found. This protein takes part in processes like neuritogenesis or synaptic transmission, and there are evidences that it could have a neuroprotective role in the brain. We have studied the participation of PrPC in AD, in the accumulation Aß, as well as in tau phosphorylation. Our results point to a possible neuroprotective function of PrPC. On the one hand, we have observed that PrPC would regulate tau phosphorylation, caused by oligomeric forms of Aß specifically, and not by insoluble and fibrillary aggregates, by modulating tau expression levels. We have also seen that an overexpression of PrPC correlates with an increase in tau phosphorylation but also with an increase in Aß deposit, pointing to a possible loss of its neuroprotective function. We have also studied the relation between Aß and PrPC, in TSEs. There are evidences that PrPC regulates Aß levels in AD, and, as there are amyloid aggregates and a decrease in PrPC levels in TSEs, we addressed the role of Aß deposit in prion infectivity. Our results suggest that those deposits do not affect infectivity. Finally, from a therapeutic point of view, there are only palliative treatments for AD, focused on compensating neurotransmitters that are not well regulated in the brain, like acetylcholine or glutamate. Although there are a lot of alternatives in different clinical phases, some of them showed secondary effects like meningoencephalitis, while others did not improve symptoms in patients. In this work, we suggest an alternative from the screening of a library formed by proline-derived gamma-peptides, from which we have identified a candidate with properties related with neuritogenesis, and a decrease in Aß levels by modulating beta-secretasa BACE1.

La presente tesis analiza el efecto de un protocolo de frecuente aplicación clínica (de congelación lenta y descongelación rápida, utilizando 1,2 propanediol y sacarosa como crioprotectores) sobre la supervivencia, la capacidad de maduración in vitro y la estructura del huso meiótico de ovocitos humanos, congelados en estadío de vesícula germinal y de metafase II. Para llevarlo a cabo se plantearon los siguientes objetivos parciales:a) Desarrollar y validar un modelo de estudio a partir de ovocitos madurados in vitro. Este estudio ha permitido demostrar mediante análisis citogénetico y de FISH que la maduración in vitro de ovocitos no induce per se un incremento de la tasa de aneuploidías, por tanto que los ovocitos madurados in vitro constituyen un modelo válido de estudio.b) Determinar la capacidad de maduración in vitro de los ovocitos de cada uno de los grupos experimentales. El cultivo in vitro de ovocitos se realizó en líquido folicular proveniente de folículos estimulados. En este estudio no se observaron diferencias en la tasa de maduración ni diferencias en el tiempo de cultivo requerido para alcanzar el estadío de metafase II en los ovocitos asignados a los distintos grupos experimentales. c) Determinar la tasa de supervivencia de ovocitos humanos congelados en estadío de vesícula germinal y de metafase II al proceso de congelación-descongelación.Este estudio ha demostrado que los ovocitos congelados en estadío de vesícula germinal son desde el punto de vista morfológico más resistentes al daño crioinducido que los ovocitos criopreservados en metafase II. En ambos casos se observan tasas de supervivencia elevadas, comparables a las publicadas en la bibliografía anteriormente. También se ha demostrado que el proceso de criopreservación en estadío de vesícula germinal no afecta la capacidad de los ovocitos para reiniciar la progresión meiótica hasta metafase II, ya que no se han detectado diferencias significativas en el tiempo requerido para la extrusión del primer corpúsculo polar antes y después de la congelación, ni en las respectivas tasas de maduración. d) Determinar la estructura del huso meiótico en ovocitos humanos congelados en estadío de vesícula germinal y de metafase II comparándola con la de ovocitos no criopreservados, para lo que se desarrolló una técnica de tinción inmunocitoquímica del huso meiótico.Este estudio ha permitido determinar que la mayoría de los ovocitos en metafase II madurados in vitro (no sometidos a ningún tratamiento experimental) y analizados mediante microscopía confocal, presenta un huso de morfología normal.En contra de la hipótesis inicial en este estudio se ha determinado que la criopreservación de ovocitos en vesícula germinal no representa una ventaja respecto a la criopreservación de ovocitos en metafase II en lo que se refiere a la preservación de la integridad estructural del huso meiótico. La congelación tiene un efecto deletéreo sobre la estructura del huso meiótico de los ovocitos congelados en vesícula germinal, siendo la tasa de ovocitos con aberraciones estructurales del huso relativamente baja mientras que en un elevado porcentaje de ovocitos no se detectan microtúbulos de tubulina polimerizada. El efecto deletéreo de la congelación en los ovocitos criopreservados en este estadío afecta también a las carácterísticas morfológicas de los cromosomas y su distribución en la placa metafásica. La congelación tiene un efecto deletéreo sobre la estructura del huso meiótico de los ovocitos congelados en metafase II. Las anomalías incluyen un elevado porcentaje de ovocitos en los que no se detectan microtúbulos de tubulina polimerizada, y una tasa de ovocitos con aberraciones estructurales del huso relativamente baja. En los casos en que se observa ausencia del huso, los cromosomas forman un grupo no siempre ordenado y no se observan cromosomas aislados en el citoplasma. / The present work analyses the effect of a cryopreservation protocol (slow freezing-rapid thawing, using 1,2 popanediol and sucrose as cryoprotectant agents) frequently used for clinical purposes on the survival, in vitro maturation potential, and structure of the meiotic spindle of human oocytes, frozen in the germinal vesicle and metaphase II stage. In order to accomplish it the following partial objectives were stated:a) To develop and validate a study model from in vitro matured oocytes. This study demonstrated through cytogenetic and FISH analysis that oocyte in vitro maturation does not induce per se an increase in the aneuploidy rate, therefore in vitro matured oocytes are a valid study model.b) To determine the in vitro maturation potential of the oocytes in each experimental group. In vitro culture was performed in follicular fluid from hormonally stimulated follicles.No differences were observed either in the maturation rate of the oocytes or in the time of culture needed to reach metaphase II stage in each experimental group. c) To determine the survival rate of human oocytes frozen-thawed either in the germinal vesicle or metaphase II stage. The present study demonstrated that oocytes cryopreserved in the germinal vesicle stage are from the morphological point of view more resistant to cryoinduced injury than metaphase II stage oocytes. In both cases high survival rates are observed, similar tothose already published in the literature. It has also been demonstrated that the cryopreservation process does not affect the potential of oocytes frozen in the germinal vesicle stage to reinitiate the meiotic progression to metaphase II, because neither differences in the time of culture required for polar body extrusion before and after cryopreservation, nor in the respective maturation rates were observed.d) To determine the structure of the meiotic spindle of human oocytes frozen either in the germinal vesicle or metaphase II stage, in comparison with that of unfrozen control oocytes.An immunocytochemical staining technique of the meiotic spindle was developed for that purpose. This study determined that the majority of the in vitro matured metaphase II control oocytes analyzed through confocal laser microscopy showed a normal spindle configuration. Against the initial hypothesis, this study showed that the cryopreservation in the germinal vesicle stage does not represent an advantage with respect to the cryopreservation in metaphase II stage in relation to the preservation of the meiotic spindle structure. The cryopreservation process has a deletereous effect on the meiotic spindle structure of oocytes frozen in the germinal vesicle stage, being the rate of structural abnormalities relatively low while there is a high percentage of oocytes that show absence of polimerized tubulin. The aformentioned deletereous effect affects also the appearance of the chromosomes and their distribution in the metaphase plate. The cryopreservation process has a deletereous effect on the meiotic spindle structure of oocytes frozen in metaphase II stage. Abnormalities include a high percentage of oocytes that show absence of polimerized tubulin and a relatively low rate of structural spindle abnormalities. In those cases were there was an absent spindle, chromosomes were found in a group not always organized, but no chromosomes isolated in the cytoplasm were observed.

Per tal d’optimitzar els resultats en el programa de criotransferència embrionària en embrions congelats/descongelats és incloure en el estudi totes les transferències úniques d’embrions congelats/descongelats. L’objectiu principal d’aquest estudi va ser determinar quins paràmetres embrionaris tenien major capacitat per predir el seu potencial d’implantació. Els paràmetres que van influir significativament la taxa d’implantació van ser: taxa de divisió embrionària, simetria de les cèl·lules, supervivència després de la descongelació i desenvolupament posterior al cultiu overnight. El score proposat per embrions congelats en dia 2/3 de desenvolupament és una bona eina per determinar el potencial d’aquests embrions. Els resultats obtinguts amb la congelació lenta d’embrions que han estat prèviament biopsiats han mostrat majoritàriament uns resultats molt pobres pel que respecte a la supervivència i implantació. Aquest fet van esperonar molts grups a introduir la tècnica de vitrificació als seus laboratoris. Inicialment, la vitrificació es va dur a terme amb medis i suports elaborats al laboratori. L’any 2007 es va assolir el primer naixement obtingut a partir de blastocists vitrificats que havien estat prèviament biopsiats per el diagnòstic d’aneuploïdies. Es va poder demostrar com la tècnica de vitrificació pot ser una tècnica adequada en aquests casos sent a més una tècnica simple, segura i de baix cost. Malgrat la millora en els resultats obtinguts en el programa de DGP, i donat el constant desenvolupament de nous sistemes de vitrificació comercials es va voler comparar l’eficàcia dels nous materials i medis comercials amb l’emprat fins al moment. La supervivència obtinguda amb el kit de vitrificació comercial va ser significativament superior en front les preparades en el propi laboratori. També es va observar una taxa de supervivència inferior en els blastocists que estaven eclosionant o eclosionats quan es comparaven amb els blastocists inicials o expandits. Probablement aquestes diferències poden ser degudes a una major susceptibilitat a l’estrés mecànic produït per la manipulació. Per últim, el disseny de l’últim estudi ha permès analitzar l’impacte que té la vitrificació en la viabilitat oocitària. Es va plantejar comparar els resultats obtinguts utilitzant oòcits de donant procedents de la mateixa cohort en receptores que rebien els oòcits en fresc o vitrificats. Aquest fet ens permet avaluar l’efecte de la vitrificació evitant factors extrínsecs relatius a la qualitat de l’oòcit. Es van avaluar els indicadors més habituals en viabilitat oocitària a fi de determinar l’efecte de la vitrificació en l’eficiència dels cicles de donació d’oòcits i així poder plantejar les estratègies més eficaces encaminades a augmentar les taxes de naixement en cicles que inclouen la criopreservació d’oòcits. No es van mostrar diferències en cap dels paràmetres estudiats en comparar la taxa de fecundació, la qualitat embrionària, la taxa d’embaràs evolutiu o la taxa de nen nascut viu a casa entre el grup de receptores d’oòcits en fresc i vitrificats. Aquests resultats permeten plantejar la possibilitat de criopreservar oòcits per altres aplicacions com és la preservació de fertilitat, l’acumulació d’oòcits en el programa de DGP o en pacients amb risc de desenvolupar un Síndrome d’Hiperestimulació Ovàrica. / In order to improve the results in the cryopreservation programme, single frozen embryo transfers have been considered. The main objective of this study was to establish which embryo parameters have the highest prognosis value in the establishment of pregnancy. A score for frozen/thawed embryos has been developed which includes the different embryo parameters that significantly influence the implantation rate: cleavage rate, symmetry of the blastomeres, embryo survival rate and resumption of mitosis. The proposed embryo score for thawed embryos on day2/3 is a useful tool for determining the implantation potential of these embryos. The results achieved with conventional cryopreservation protocols of biopsied embryos at different stages of development have shown low survival and implantation rates. For this reason, many groups encouraged to introduce the vitrification technique into laboratories. At the beginning, the vitrification was carried out with mediums and devices home-made. We have described the first birth after vitrification of embryos biopsied for preimplantation genetic diagnosis (PGD). This report shows that blastocysts obtained from biopsied embryos can be successfully cryopreserved by simple, secure and low-cost vitrification methods using a Hemi-straw device. A wide range of commercial vitrification systems had been developed. In order to improve the new vitrification systems we compare the results obtained warming abnormal donated blastocysts to compare the efficiency of the new materials and commercial mediums with the employed until the moment. Differences in the survival rate were observed with the use of different vitrification media. Decreased results in terms of survival rates were achieved for hatching and much lower for hatched blastocyst compared with initial/expanded blastocists. They can be more susceptible to mechanical damage during manipulation. Finally, the design of the last report included enabled us to analyze the impact of vitrification on the functionality of the oocyte and its capacity to produce an ongoing embryo, the subsequent pregnancy and a healthy live birth in an oocyte donation programme. Comparing results obtained with fresh and vitrified oocytes from the same cohort allowed us to assess the effect of vitrification avoiding extrinsic variables related to oocyte quality. Fertilization, ongoing embryo and good quality embryo rates were compared not finding differences between the two groups. We also compared ongoing pregnancy, implantation and live birth rates to confirm the suitability of the vitrification technique and found no statistically significant differences. Our data demonstrate that vitrification affects neither the functionality of the oocytes nor their capacity to produce and give rise to ongoing embryos, pregnancies and live births. These results encourage the use of this technique for other applications, such as fertility preservation, the accumulation of oocytes for PGD or low responders and in patients at risk of ovarian hiperstimulation syndrome.

This Thesis studies different cellular and cell population processes driven by non-linear and stochastic dynamics. The problems addressed here gravitate around the concepts of transient dynamics and relaxation from a perturbed to a steady state. In this regard, in all processes studied, stochastic fluctuations, either intrinsically present in or externally applied to these systems play an important and constructive role, by either driving the systems out of equilibrium, interfering with the underlying deterministic laws, or establishing suitable levels of heterogeneity. The first part of the Thesis is committed the analysis of genetically regulated transient cellular processes. Here, we analyse, from a theoretical standpoint, three genetic circuits with pulsed excitable dynamics. We show that all circuits can work in two different excitable regimes, in contrast to what was previously speculated. We also study how, in the presence of molecular noise, these excitable circuits can generate periodic polymodal pulses due to the combination of two noise induced phenomena: stabilisation of an unstable spiral point and coherence resonance. We also studied an excitable genetic mechanism for the regulation of the transcriptional fluctuations observed in some pluripotency factors in Embryonic Stem cells. In the embryo, pluripotency is a transient cellular state and the exit of cells from it seems to be associated with transcriptional fluctuations. In regard to pluripotency control, we also propose a novel mechanism based on the post-translational regulation of a small set of four pluripotency factors. We have validated the theoretical model, based on the formation of binary complexes among these factors, with quantitative experimental data at the single-cell level. The model suggests that the pluripotency state does not depend on the cellular levels of a single factor, but rather on the equilibrium of correlations between the different proteins. In addition, the model is able to anticipate the phenotype of several mutant cell types and suggests that the regulatory function of the protein interactions is to buffer the transcriptional activity of Oc4, a key pluripotency factor. In the second part of the Thesis we studied the behaviour of a computational cell signalling network of the human fibroblast in the presence of external fluctuations and signals. The results obtained here indicate that the network responds in a nontrivial manner to background chatter, both intrinsically and in the presence of external periodic signals. We show that these responses are consequence of the rerouting of the signal to different network information-transmission paths that emerge as noise is modulated. Finally, we also study the cell population dynamics during the formation of microbial biofilms, wrinkled pellicles of bacteria glued by an extracellular matrix that are one of the simplest cases of self-organised multicellular structures. In this Thesis we develop a spatiotemporal model of cellular growth and death that accounts for the experimentally observed patterns of massive bacterial death that precede wrinkle formation in biofilms. These localised patterns focus mechanical forces during biofilm expansion and trigger the formation of the characteristic ridges. In this sense, the proposed model suggests that the death patterns emerge from the mobility changes in bacteria due to the production of extracellular matrix and the spatially inhomogeneous cellular growth. An important prediction of the model is that matrix productions is crucial for the appearance of the patterns and, therefore for winkle formation. We have also experimentally validated validated this prediction with matrix deficient bacterial strains, which show neither death patterns nor wrinkles. / En aquesta Tesi s’estudien diferents processos intracel·lulars i de poblacions cel·lulars regits per dinàmica estocàstica i no lineal. El problemes biològics tractats graviten al voltant el concepte de dinàmica transitòria i de relaxació d’un estat dinàmic pertorbat a l’estat estacionari. En aquest sentit, en tots els processos estudiats, les fluctuacions estocàstiques, presents intrínsecament o aplicades de forma externa, hi tenen un paper constructiu, ja sigui empenyent els sistemes fora de l’equilibri, interferint amb les lleis deterministes subjacents, o establint els nivells d’heterogeneïtat necessaris. La primera part de la Tesi es dedica a l’estudi de processos cel·lulars transitoris regulats genèticament. En ella analitzem des d’un punt de vista teòric tres circuits genètics de control de polsos excitables i, contràriament al que s’havia especulat anteriorment, establim que tots ells poden treballar en dos tipus de règim excitable. Analitzem també com, en presència de soroll molecular, aquests circuits excitables poden generar polsos periòdics i multimodals degut a la combinació de dos fenòmens induïts per soroll: l’estabilització estocàstica d’estats inestables i la ressonància de coherència. D’altra banda, estudiem com un mecanisme genètic excitable pot ser el responsable de regular a nivell transcripcional les fluctuacions que s’observen experimentalment en alguns factors de pluripotència en cèl·lules mare embrionàries. En l’embrió, la pluripotència és un estat cel·lular transitori i la sortida de les cèl·lules d’aquest sembla que està associada a fluctuacions transcripcionals. En relació al control de la pluripotència, presentem també un nou mecanisme basat en la regulació post-traduccional d’un petit conjunt de 4 factors de pluripotència. El model teòric proposat, basat en la formació de complexos entre els diferents factors de pluripotència, l’hem validat mitjançant experiments quantitatius en cèl·lules individuals. El model postula que l’estat de pluripotència no depèn dels nivells cel·lulars d’un únic factor, sinó d’un equilibri de correlacions entre diverses proteïnes. A més, prediu el fenotip de cèl·lules mutants i suggereix que la funció reguladora de les interaccions entre les quatre proteïnes és la d’esmorteir l’activitat transcripcional d’Oct4, un dels principals factors de pluripotència. En el segon apartat de la Tesi estudiem el comportament d’una xarxa computacional de senyalització cel·lular de fibroblast humà en presència de senyals externs fluctuants i cíclics. Els resultats obtinguts mostren que la xarxa respon de forma no trivial a les fluctuacions ambientals, fins i tot en presència d’una senyal externa. Diferents nivells de soroll permeten modular la resposta de la xarxa, mitjançant la selecció de rutes alternatives de transmissió de la informació. Finalment, estudiem la dinàmica de poblacions cel·lulars durant la formació de biofilms, pel·lícules arrugades d’aglomerats de bacteris que conformen un dels exemples més simples d’estructures multicel·lulars autoorganitzades. En aquesta Tesi presentem un model espai-temporal de creixement i mort cel·lular motivat per l’evidència experimental sobre l’aparició de patrons de mort massiva de bacteris previs a la formació de les arrugues dels biofilms. Aquests patrons localitzats concentren les forces mecàniques durant l’expansió del biofilm i inicien la formació de les arrugues característiques. En aquest sentit, el model proposat explica com es formen els patrons de mort a partir dels canvis de mobilitat dels bacteris deguts a la producció de matriu extracel·lular combinats amb un creixement espacialment heterogeni. Una important predicció del model és que la producció de matriu és un procés clau per a l’aparició dels patrons i, per tant de les arrugues. En aquest aspecte, els nostres resultats experimentals en bacteris mutants que no produeixen components essencials de la matriu, confirmen les prediccions.