El desarrollo de biomateriales para ingeniería de tejido es un campo muy complejo y prolífico que en el que se combinan la ingeniería de materiales, la química, la biología celular y la medicina. Cada año se publican nuevas y prometedoras ideas que requieren de estudios in vivo e in vitro antes de realizar pruebas clínicas. Por desgracia, las condiciones in vitro son muy diferentes a las de la vida real y muchas de estas prometedoras ideas fracasan cuando son probadas en animales. El número de combinaciones posibles de tipos celulares, factores y biomateriales es inmenso, por lo que sería de gran ayuda establecer plataformas que permitan identificar las combinaciones óptimas para la obtención de características clave, como podría ser la capacidad angiogénica, o la inducción de la diferenciación celular a un determinado linaje. En esta tesis se demuestra el gran potencial de la imagen bioluminescente no invasiva (BLI) para analizar las interacciones célula‐scaffold in vivo. BLI permite monitorizar en tiempo real el número de células y su distribución en el scaffold, así como cambios en la expresión de ciertos genes mediante el uso de promotores inducibles tejido‐específicos. Esto proporciona información muy útil sobre el comportamiento in vivo del scaffold y sobre qué características deberían ser mejoradas para obtener los resultados deseados. Combinando esta información en tiempo real con otras tecnologías de imagen es posible obtener una visión completa sobre el comportamiento del material. Como “prueba de principio” de la aplicación de BLI para la evaluación de scaffolds para reparación tisular se han utilizado dos materiales muy diferentes, desarrollados por nuestros colaboradores. En el primer caso se ha demostrado la capacidad angiogénica de un nuevo material compuesto de ácido poliláctico (PLA) y vidrio de fosfato cálcico (CaP). Los resultados de BLI, que muestran que la inclusión de las partículas de CaP mejora la capacidad angiogénica del material, fueron validados mediante inmunohistoquímica. En el segundo caso se ha evaluado un scaffold de fibrina diseñado para liberar factores de crecimiento (GFs) utilizando un modelo murino de regeneración ósea. Los resultados de BLI mostraron que este scaffold induce la diferenciación osteoblástica, pero no endotelial, en células mesenquimales (MSCs) centinela. Estos resultados fueron corroborados mediante μCT, que mostró que la liberación de GFs da lugar no sólo a la formación de hueso más grueso, sino también a la formación de estructuras vasculares más densas. Mediante la combinación de BLI y μCT se pudo comprobar que las MSCs centinelas no se diferencian a linaje endotelial pero tienen un papel relevante en la inducción de conexiones intravasculares. Entender la respuesta de las células a cambios físicos (fuerzas de cizalla, hipoxia, etc.) dentro de los scaffolds puede ayudar al desarrollo de scaffolds para aplicaciones específicas. Inspirados por estas consideraciones iniciamos un ambicioso proyecto para desarrolla un minibioreactor para el análisis de las interacciones entre scaffolds y las células sin tener que recurrir a animales vivos. Este biorreactor, basado en la misma plataforma de bioluminiscencia, permite el análisis en tiempo real de la supervivencia y la diferenciación celular dentro de los biomateriales bajo flujo dinámico, pudiendo ser utilizado como paso intermedio entre los estudios in vitro e in vivo, agilizando los ciclos de diseño ‐ prueba‐rediseño de los scaffolds. Por otra parte, los biorreactores son cada vez más importantes en la ingeniería de tejidos ya que permiten la producción segura y reproducible de tejidos para aplicaciones clínicas. Este dispositivo, monitorizado por BLI, puede ser una herramienta muy útil para optimizar la siembra de células en los scaffolds, permitiendo la cuantificación de la supervivencia celular y la visualización de su distribución a lo largo del scaffold bajo condiciones de cultivo customizables. Se ha diseñado un prototipo de biorreactor utilizando un scaffold modelo y se ha utilizado para visualizar satisfactoriamente la siembra de MSCs, su distribución y su supervivencia bajo diferentes condiciones, así como su diferenciación en respuesta a agentes inductores. / Biomaterial development for Tissue Engineering is a very complex and prolific research field overlapping material engineering, chemistry, cell biology and medicine fields; every year promising new devises comprising materials, growth factors and cells are reported that require in vitro and in vivo studies previous to clinical evaluation. Unfortunately, in vitro conditions are very far removed from those in real life and many initially promising devices fail when tested in live animals. The number of possible combinations between cell types, factors and biomaterials is so large that testing platforms that can rapidly screen and identify optimal formulas, e.g., that emphasize key characteristics such as angiogenic capacity or promotion of differentiation to specific lineages would facilitate devise development. In this thesis we demonstrated the potential of noninvasive bioluminescence imaging (BLI) to analyze cellscaffold interactions in live animals. BLI allows the real‐time monitoring of cell number and distribution within the scaffolds. Furthermore, by using tissue‐specific inducible promoters, changes in expression of specific genes related to cell differentiation or hypoxic state can also be monitored. This provides very useful information about the scaffold behavior in vivo and about what characteristics should be improved to obtain the desired results. By combining the real‐time data from this bioluminescence platform with other end point imaging technologies, it is possible to obtain a full vision of the biomaterial behavior. We used two very different biomaterials developed by collaborators to illustrate as “proof of principle” the application of in vivo BLI technology in the evaluation of bio‐engineered scaffolds for tissue repair. In the first case we proved the angiogenic capacity of a new composite biomaterial comprising poly(lactic acid) (PLA) and calcium phosphate (CaP) glass. Our BLI results, indicating that inclusion of CaP particles on PLA improved the angiogenic capacity of the material, were also validated using standard immunofluorescent staining and histological procedures for vessel quantification. In the second case, we evaluated a GF‐delivering fibrin scaffold engineered for bone repair using a mice bone regeneration model. Our BLI results indicated that the GF‐delivering material had the capacity to induce osteoblastic, but not endothelial, differentiation in sentinel mesenchymal stem cells. Our BLI results were corroborated by μCT analysis that showed not only that thicker bone, but also denser vascular structures were induced by the delivery of GF. Again, the combination of BLI and μCT analysis indicated that sentinel cells while not differentiating to the endothelial lineage, did have a relevant paracrine role inducing abundant intervascular connections. Understanding the response of cells within biomaterials to changing physical parameters (e.g.: response to shear stress, hypoxia etc.) is valuable information to guide the development of scaffolds for specific applications. Inspired by these considerations we initiated an ambitious approach to develop a minibioreactor system useful for the analysis of cell‐scaffold interactions without having to resort to live animals. This bioreactor system, based in the same bioluminescent platform, allows real‐time analysis of cell survival and differentiation within the biomaterial under dynamic flow conditions and it could be considered as an intermediate step between in vitro and in vivo studies, facilitating the biomaterial design‐test‐redesign cycle. This type of device is important due to additional considerations. Bioreactors are becoming increasingly more important as they allow safe and reproducible production of scaffold‐tissue composites for clinical applications. Thus, BLI monitored system could also be a useful tool for designing and optimizing cell seeding of scaffolds; allowing the quantification of cell survival, and the visualization of cell distribution along the scaffold under customizable culture conditions. We have made progress in this area also, and a small bioreactor prototype comprising a model biomaterial was constructed and successfully used to illustrate cells distribution and survival under dynamic seeding conditions, as well as proliferation and differentiation in response to inducing agents.

Durante el ictus, los niveles elevados de glutamato extracelular, el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central, aumentan y se unen al receptor de NMDA promoviendo la excitotoxicidad. Esta situación genera que un flujo excesivo de Ca2+ pase a través del receptor de NMDA aumentando sus concentraciones intracelulares activando toda una serie de cascadas de señalización que pueden actuar directamente sobre las mitocondrias, promoviendo varios programas de muerte celular. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos que constantemente se fusionan y dividen, cambiando de forma y localización. El equilibrio entre la fisión y la fusión es importante para la función mitocondrial y es un regulador clave de la progresión de la muerte celular. Las proteínas que conforman el proceso de fusión mitocondrial y de fisión están formadas por un grupo de GTPasas. La fusión de la membrana mitocondrial interna está mediada por OPA1. Dos mitofusinas (Mfn1 y 2) median la fusión de la membrana externa mitocondrial. Por otro lado, la fisión mitocondrial está mediada por Drp1, una proteína citoplasmática que es reclutada a la superficie mitocondrial después de ser modificada a nivel post-traduccional. Los problemas relacionados con la dinámica mitocondrial se han descrito en múltiples enfermedades neurodegenrativas así como también en cáncer y sida. En esta Tesis hemos demostrado que Mfn2 juega un papel muy importante en el mantenimiento de la funcionalidad mitocondrial y la supervivencia neuronal. En excitotoxicidad es la única proteína de la maquinaria de fusión/fisión que disminuye su expresión en dos modelos in vitro distintos y también en un modelo in vivo. Hemos identificado dos fases de fragmentación mitocondrial en excitotoxicidad. La primera y que cursa en poco tiempo depende de la activación y reclutamiento de Drp1 mientras que la fase tardana que se inicia 4 horas después del insulto, parece depender de la reducción de los niveles proteicos de Mfn2. Esta fase tardía es irreversible y parece condenar a la neurona. La disminución de Mfn2 genera alteraciones en la homeóstasis del Ca2+, disminuye el potencial de membrana mitocondrial, empeora la comunicación entre las mitocondrias y el retículo endoplasmático, aumenta la traslocación de Bax a las mitocondrias y favorece la liberación del citocromo c. Hemos encontrado que la reducción en la expresión de Mfn2 durante la excitotoxicidad se da a nivel transcripcional y depende del factor de transcripción MEF2 que regula a Mfn2 a nivel basal en neuronas. En excitotoxicidad, MEF2 es degradado y causa la disminución de Mfn2. Este contexto hace pensar que Mfn2 podría ser una diana a tener en cuenta para futuros desarrollos de drogas y poder, de este modo, incrementar la pequeña ventana terapéutica que existe actualmente para el ictus. / Mitochondrial fusion and fission is a dynamic process critical for the maintenance of mitochondrial function and cell viability. During excitotoxicity neuronal mitochondria are fragmented, but the mechanism underlying this process is poorly understood. Here, we show that Mfn2 is the only member of the mitochondrial fusion/fission machinery whose expression is reduced in in vitro and in vivo models of excitotoxicity. Whereas in cortical primary cultures, Drp1 recruitment to mitochondria plays a primordial role in mitochondrial fragmentation in an early phase that can be reversed once the insult has ceased, Mfn2 downregulation intervenes in a delayed mitochondrial fragmentation phase that progresses even when the insult has ceased. Downregulation of Mfn2 causes mitochondrial dysfunction, altered calcium homeo- stasis, and enhanced Bax translocation to mitochondria, resulting in delayed neuronal death. We found that transcription factor MEF2 regulates basal Mfn2 expression in neurons and that excitotoxicity- dependent degradation of MEF2 causes Mfn2 downregulation. Thus, Mfn2 reduction is a late event in excitotoxicity and its targeting may help to reduce excitotoxic damage and increase the currently short therapeutic window in stroke.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Els trastorns mentals com l’esquizofrènia o els trastorns de l’humor i l’ansietat són unes patologies amb un gran impacte i una alta prevalença en la nostra societat. Una de les característiques d’aquestes patologies són els problemes de plasticitat sinàptica, com per exemple, la neurogènesi del gir dentat, que a més s’ha relacionat amb problemes cognitius i també amb patologies psiquiàtriques. En els darrers anys s’ha suggerit que la desregulació de processos del desenvolupament neuronal, ja sigui per alteracions genètiques o factors ambientals, poden ser la clau per explicar l’etiologia d’aquestes malalties. La Reelina és una proteïna de matriu extracel·lular essencial pel desenvolupament neuronal, a més de regular processos de plasticitat sinàptica i transmissió glutamatèrgica, tant en el cervell en desenvolupament com a l’adult, a més d’estar disminuïda en patologies com l’esquizofrènia o els trastorns de l’humor, tot i que el paper que aquesta hi juga encara no està descrit. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat investigar el paper de la Reelina en les malalties psiquiàtriques, tant el possible paper en l’etiologia com en la protecció d’aquestes malalties, a més d’investigar si tenia un paper en la correcta generació de noves neurones. Per tal de portar a terme aquest objectiu, vam utilitzar un ratolí que sobreexpressa Reelina al cervell anterior adult i el vam sotmetre a una bateria de testos de comportament per modelar aspectes de malalties psiquiàtriques com el cap obert, la caixa blanca i negra, el test de natació forçada després d’un tractament crònic de corticosterona, la sensibilització a la cocaïna o dèficits en la inhibició per pre-pols induïda per l’administració d’antagonistes dels receptors N- metil-D-aspartat (NMDAR). Amb aquests testos vam comprovar que la sobreexpressió de Reelina protegia de l’aparició de comportaments esquizofrènics i depressius i que aquesta resiliència es produïa per un una disminució de la transmissió glutamatèrgica a través de la subunitat NR2B dels receptors NMDA. A més de demostrar-ne un paper protector, amb la utilització d’un ratolí transgènic floxed dab1 hem comprovat que una disminució transitòria durant el desenvolupament de l’efector intracel·lular de la via de senyalització de la Reelina, Dab1, provoca alteracions permanents en la laminació del còrtex i hipocamp. A més, la regulació transitòria a la baixa durant el desenvolupament d’aquesta via provoca alteracions de comportament en els ratolins adults com dèficits de memòria, cura maternal, inhibició per pre-pols o sensibilització a la cocaïna, i que alguns d’aquests dèficits ja estaven presents durant l’adolescència. A més, hem pogut rescatar els dèficits cognitius amb un potenciador de la neurotransmissió glutamatèrgica com és la D-cicloserina. Per acabar, vam voler comprovar si un procés de plasticitat alterat en patologies psiquiàtriques com la neurogènesi adulta estava regulat pels nivells de Reelina. Amb la utilització del marcatge específic de les noves neurones mitjançant retrovirus, vam poder veure que la Reelina també controla aquest procés. Hem vist que la via de senyalització és essencial pel correcte desenvolupament, ja que la manca de senyalització d’aquesta via provoca la formació de neurones aberrants, molt menys complexes i amb una gran quantitat de dendrites basals pròpies de processos patològics, i tot i aquesta morfologia alterada, aquestes neurones aconseguien integrar-se en el circuit. A més, hem comprovat que un augment dels nivells de Reelina provoca l’acceleració del procés de maduració. En resum, hem vist que la Reelina té un paper essencial en la protecció envers el desenvolupament de malalties psiquiàtriques, ja que mentre la falta de senyal provoca l’aparició de fenotips, l’augment en provoca la resistència. A més, hem comprovat que un procés alterat en aquestes patologies com és la neurogènesi adulta, també està regulat per la Reelina. / Schizophrenia, mood, and anxiety disorders are devastating diseases with high prevalence and comorbidity rates in our society. Dysregulation of key developmental processes, caused by environmental and/or genetic risk factors, is associated with the pathogenesis of neuropsychiatric diseases. One feature of these diseases are alterations in synaptic plasticity like adult neurogenesis. Reelin is an extracellular matrix protein essential for the neurodevelopment, and has been shown to regulate glutamatergic neurotransmission in both developing and adult neurons. Moreover, Reelin expression is decreased in psychiatric disorders. The aim of this thesis was to rule out the role of Reelin in psychiatric disease, in the aetiology and a possible protection role, and study how Reelin pathway regulates adult neurogenesis. To do that, we used a transgenic mouse that overexpress Reelin in the adult forebrain and we subjected it to a battery of behavioural tests to model some aspects of psychiatric disorders such as schizophrenia, mood, and anxiety disorders. Interestingly, overexpression of Reelin lead to a resistance against behaviours related to psychiatric diseases, thanks to a reduction of NMDA NR2B-mediated synaptic transmission. Next we used a floxed dab1 allele to study whether a transient decreased in Dab1 during development, a key component of the Reelin pathway, is sufficient to induce behavioural deficits related to psychiatric disorders. We found that transient Dab1 downregulation during perinatal stages leads to permanent abnormalities of structural layering and behaviour impairments in the adult mice. Finally, using retroviral reporters in our two model mouse we show that whereas overexpression of Reelin accelerate adult neurogenesis, cell-autonomous inactivation of Dab1 in the new granule cells resulted in aberrant migration, decreased dendrite development, formation of ectopic dendrites in the hilus and the establishment of aberrant circuits. All together these data points an important role of Reelin against the development of neuropsychiatric, overexpression of Reelin protects against this disorders and the disruption of Reelin pathway leads to the development of them. Moreover, Reelin is a key regulator of adult neurogenesis, a process related to the pathogenesis of several neurological and psychiatric disorders.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / Los cuerpos lipídicos (CLs) son los principales orgánulos encargados del almacén de lípidos, siendo el mayor reservorio energético de las células. Están formados por un núcleo de lípidos neutros hidrófobos separados del citoplasma por una monocapa de fosfolípidos en la que se anclan determinadas proteínas. Fueron descritos a finales del siglo XIX por Hanstein, Altmann y Wilson en diferentes publicaciones y originalmente fueron llamados liposomas o microsomas. Desde entonces estos orgánulos han sido denominados de múltiples maneras: cuerpos lipídicos, gotas lipídicas, adiposomas, gránulos, inclusiones lipídicas, triglicéridos intramiocelulares, partículas lipídicas, oleosomas o cuerpos de aceite. Inicialmente fueron considerados como simples orgánulos estáticos únicamente implicados en el almacén lipídico y básicamente importantes en tejidos especializados como el tejido adiposo. No obstante, la presencia de CLs no es exclusiva de tejidos especializados como el adiposo, sino que sucede en todas las células eucariotas y en muchos procariotas. En la última década el número de estudios sobre estos orgánulos ha incrementado exponencialmente especialmente desde el descubrimiento de la perilipina, la primera proteína residente en CLs descrita, en el laboratorio de C. Londos en 1991. Poniendo de manifiesto que se trata de orgánulos complejos, recientemente se ha descrito la implicación de los CLs en múltiples procesos como el metabolismo energético, la síntesis de lípidos y hormonas, la señalización celular, el almacén y la degradación de proteínas, la secreción de lipoproteínas, la respuesta inflamatoria, el ciclo vital de algunos patógenos, el cáncer o la longevidad. Además, la acumulación excesiva de CLs es una característica común en múltiples patologías asociadas con la obesidad como el síndrome metabólico, la esteatosis hepática y la ateroesclerosis, subrayando la relevancia del estudio de la biología de estos orgánulos.

In this thesis we develop a multi-scale model of the evolutionary dynamics of a population of cells, which accounts for the mapping between genotype and phenotype as determined by a model of the gene regulatory network. We study topological properties of genotype-phenotype networks obtained from the multi-scale model. Moreover, we study the problem of evolutionary escape and survival taking into account a genotype-phenotype map. An outstanding feature of populations with genotype-phenotype map is that selective pressures are determined by the phenotype, rather than genotypes. Our multi-scale model generates the evolution of a genotype-phenotype network represented by a pseudo-bipartite graph, that allows formulate a topological definition of the concepts of robustness and evolvability. We further study the problem of evolutionary escape for cell populations with genotype-phenotype map, based on a multi-type branching process. We present a comparative analysis between genotype-phenotype networks obtained from the multi-scale model and networks constructed assuming that the genotype space is a regular hypercube. We compare the effects on the probability of escape and the escape rate associated to the evolutionary dynamics between both classes of graphs. We further the study of evolutionary escape by analysing the long term survival conditioned to escape. Traditional approaches to the study of escape assume that the reproduction number of the escape genotype approaches infinity, and, therefore, survival is a surrogate of escape. Here, we analyse the process of survival upon escape by taking advantage of the fact that the natural setting of the escape problem endows the system with a separation of time scales: an initial, fast-decaying regime where escape actually occurs, is followed by a much slower dynamics within the (neutral network of) the escape phenotype. The probability of survival is analysed in terms of topological features of the neutral network of the escape phenotype. / En aquesta tesi es desenvolupa un model multi-escala de la dinàmica evolutiva d'una població de cèl·lules, tenint en compte la correspondència entre el genotip i el fenotip determinat per un model de la xarxa de regulació genètica. Estudiem les propietats topològiques de les xarxes genotip-fenotip obtingudes a partir del model multi-escala. D'altra banda, s'estudia el problema de la fugida evolutiva i la supervivència, tenint en compte una aplicació entre genotip i fenotip. Una característica destacable de les poblacions amb aplicació genotip-fenotip és que les pressions selectives actuen sobre els fenotips, en lloc dels genotips. El nostre model multi-escala genera l'evolució d'una xarxa genotip-fenotip representada per un graf pseudo-bipartit, el qual permet formular una definició topològica dels conceptes de robustesa y capacitat evolutiva. A més a més, estudiem el problema de fugida evolutiva de poblacions de cèl¿lules amb una aplicació genotip-fenotip, basat en en un procés de ramificació multi-tipus. Presentem un anàlisi comparatiu entre les xarxes de genotip-fenotip obtingudes a partir del model multi-escala i les xarxes construïdes assumint un espai de genotips de tipus hipercub regular. Comparem els efectes de la probabilitat de fugida i la freqüència d'escapament associades a la dinàmica evolutiva entre ambdues classes de grafs. Anem més enllà de l'estudi de fugida evolutiva mitjançant l'anàlisi de la supervivència a llarg plaç condicionat a fugir. Els enfocaments tradicionals per a l'estudi de la fugida o escapament suposen una taxa de reproducció en el genotip de fugida propera a infinit. Per tant, la supervivència és equivalent a la fugida. Aquí analitzem el procés de supervivència suposant fugida aprofitant el fet que l'entorn natural del problema de fugida dota al sistema amb una separació d'escales de temps: un règim inicial, de temps ràpid, on la fugida realment es produeix; seguit d'una dinàmica molt més lenta dins de la (xarxa neutra del) fenotip de fugida. La probabilitat de supervivència s'analitza en termes de les característiques topològiques de la xarxa neutra del fenotip de fugida

L’estudi citogenètic de les neoplàsies hematològiques és de gran importància en la pràctica clínica des del punt de vista diagnòstic, pronòstic i patogenètic. La identificació d’alteracions citogenètiques en les proliferacions limfoides és dificultosa degut al baix índex mitòtic dels limfòcits B madurs, a l’obtenció de metafases normals sovint no corresponents a la clona maligna o amb d’alteracions submicroscòpiques/críptiques impossibles d’identificar en metafase mitjançant les tècniques de bandeig G, i a la mala qualitat cromosòmica de les proliferacions agudes. Mitjançant les tècniques d’estimulació i separació cel·lular i la hibridació in situ fluorescent (FISH) s’han estudiat diferents neoplàsies que es desenvolupen al llarg de la limfopoesi B com la leucèmia limfoblàstica aguda B (LLA-B), la leucèmia limfàtica crònica (LLC), i neoplàsies de cèl·lules plasmàtiques (CP) com la gammapatia monoclonal de significat incert (GMSI) i el mieloma múltiple (MM). En la LLA-B s’han identificat dues translocacions amb implicació del gen IGH no descrites fins al moment. Són la t(2;14)(q14.3;q32) i la t(14;17)(q32;q21) i contribueixen a la formació d’un nou subgrup de pacients en la classificació de la WHO. En la LLC s’ha comparat la FISH interfàsica (I-FISH) en cultius de sang perifèrica estimulats amb phorbol-12-myristate-13-acetate (TPA) i en cèl·lules mononucleades deseparades per gradient de densitat (CMGD) per a la detecció d’alteracions cromosòmiques. La I-FISH-TPA ha incrementat el percentatge de nuclis patològics i ha identificat més alteracions que la I-FISH-CMGD i s’ha observat que la I-FISH-TPA és especialment útil en els pacients amb un recompte de limfòcits baix. A més, s’ha avaluat la supervivència lliure de tractament (SLT) i la supervivència global, i s’ha observat que la I-FISH-TPA prediu millor la SLT que la I-FISH-CMGD, incrementant el valor pronòstic de la I-FISH. També els cultius estimulats amb TPA han permès analitzar la metafase i caracteritzar les delecions 13q14 identificada mitjançant I-FISH-TPA. S’ha observat que les delecions 13q14 monoal·lèlica i submicroscòpica són les més freqüents. Les delecions grans s’observen únicament dins les monoal·lèliques i les submicroscòpiques associades a translocació són més freqüents dins les bial·lèliques i semblen degudes a evolució clonal. S’han identificat quatre translocacions 13q14 no descrites fins al moment amb deleció associada. Aquestes són la der(1)t(1;13)(q21;q14)inv(1)(q42q21), la t(1;5;13)(p36;q31;q14), la t(9;13)(q31;q14-21) i la t(10;13)(p14-15;q12). En les neoplàsies de CP s’ha realitzat la I-FISH en CP (I-FISH-CP) separades amb partícules immunomagnètiques MACS i, en els casos amb delecions 13q, s’ha comparat la detecció de les alteracions respecte la I-FISH en cultius de MO (I-FISH-MO). El percentatge de nuclis patològics observat mitjançant I-FISH-CP és superior que en I-FISH-MO, la qual només detecta el 26% dels casos patològics. Es conclou que la I-FISH-CP és la tècnica d’elecció per a la detecció de les alteracions especialment en casos amb baixa infiltració de CP en MO. / Cytogenetic studies in haematological malignancies are important in clinical practice from the diagnostic, prognosis to pathogenetics point of view. The Identification of chromosomal aberrations in lymphoid proliferations is hampered by the low mitotic index of mature B-cells, the presence of normal metaphases that frequently do not correspond to the malignant clone or hidden submicroscopic/cryptic deletions that escape from G-banding resolution, and poor chromosome quality in acute proliferations. Using cell stimulation and separation techniques and fluorescence in situ hybridisation (FISH) we have studied several lymphoid neoplasms that develop along B-cell lymphopoiesis such as B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia (BCP-ALL), chronic lymphocytic leukaemia (CLL), and plasma cell neoplasms such as monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) and plasma cell myeloma (MM). In BCP-ALL, we have identified two novel translocations involving the IGH gen located at 14q32, namely t(2;14)(q14.3;q32) and t(14;17)(q32;q21), and contribute to the formation of a new group of patients in the WHO classification. In CLL, we have compared interphase FISH (I-FISH) on cultured peripheral blood (PB) stimulated with phorbol-12-miristate-13-acetate (TPA) and on PB mononuclear cells separated by density gradient (PBMC) for the detection of chromosomal aberrations. I-FISH-TPA has increased the percentage of abnormal nuclei and the detection of chromosome abnormalities compared to I-FISH-PBMC. We have observed that I-FISH-TPA is especially useful in patients with low lymphocyte count. Additionally, we have evaluated treatment-free survival (TFS) and overall survival (OS) and we observed that I-FISH-TPA provided a better prediction of TFS and OS than I-FISH-PBMC, improving the prognostic value of I-FISH. Moreover, TPA-stimulated cultures have allowed to analyse metaphases and the characterization of 13q14 deletions identified by I-FISH-TPA. We observed that the most frequent deletions are monoallelic and submicroscopic deletions. Large deletions are only observed within the monoallelic group, and translocation-associated deletions are more frequent in the biallelic group, which seems to be related to clonal evolution. Among these cases we identified four 13q translocations with deletion not previously described such as der(1)t(1;13)(q21;q14)inv(1)(q42q21), t(1;5;13)(p36;q31;q14), t(9;13)(q31;q14-21) and t(10;13)(p14-15;q12). In plasma cell neoplasms, we have performed I-FISH on plasma cells (PC) isolated by MACS immunomagnetic beads, and in cases with 13q deletion, we have analysed with I-FISH bone marrow cultures (BM) for the detection of 13q abnormalities. The percentage of abnormal nuclei observed by I-FISH-PC was higher than I-FISH-BM, which only detects the 26% of abnormal cases. Consequently, I-FISH-PC is the technique of choice for the detection of chromosomal abnormalities especially in those cases with low PC infiltration in BM.

La diabetis tipus 1 (DT1) és una malaltia metabòlica causada per la destrucció selectiva de les cèl·lules β pancreàtiques productores d’insulina per part del sistema immunitari. Actualment no hi ha cura ni prevenció per restaurar la secreció endògena d’insulina als pacients amb DT1. Per tant, un important repte biomèdic és el desenvolupament de noves teràpies per recuperar la tolerància immunològica. Una immunoteràpia ideal hauria d’inhibir la resposta autoimmunitària, sense efectes sistèmics adversos, i permetre la regeneració de les cèl·lules insulars per tal de recuperar la massa β. Hi ha mecanismes fisiològics que contribueixen a mantenir la tolerància immunològica. D’una banda, les cèl·lules apoptòtiques són una important font d’autoantígens que indueixen tolerància després de ser fagocitades per les cèl·lules presentadores d’antigen a través d’un procés anomenat eferocitosi. D’altra banda, les cèl·lules dendrítiques (CDs) són potents presentadores d’antigen amb capacitat de mantenir la tolerància immunològica. Basant-nos en aquestes dues característiques de la resposta immunitària, la hipòtesi del present treball és que les característiques tolerogèniques adquirides per les cèl·lules presentadores d’antigen després de l’eferocitosi poden ajudar a recuperar la tolerància perduda durant l’autoimmunitat. El principal objectiu ha estat generar una immunoteràpia antigen-específica basada en les propietats tolerogèniques inherents a l’apoptosi, per tal de restablir la tolerància a les cèl·lules β en la diabetis autoimmunitària. Amb aquesta finalitat, hem generat una immunoteràpia cel·lular amb CDs que havien capturat cèl·lules β apoptòtiques. Després de l’eferocitosi, les CDs van mostrar un canvi de patró molecular cap a un fenotip tolerogènic i una baixa producció de citocines proinflamatòries, mostrant també una disminució de la seva capacitat d’estimular la proliferació de cèl·lules T autòlogues. Això es va observar fins i tot després d’un estímul proinflamatori, fet que recolza l’estabilitat d’aquestes CDs tolerogèniques. A més, l’eferocitosi va promoure funció supresora en les CDs, un fenomen mediat -al menys en part- per la prostaglandina E2. L’administració d’aquesta immunoteràpia al model més utilitzat de DT1, el ratolí no-obès diabètic (NOD), va aturar la progressió de la insulitis i va prevenir la diabetis. Malgrat això, no va ser possible revertir la malaltia en ratolins diabètics. Degut a la dificultat en obtenir i estandarditzar les cèl·lules β apoptòtiques, vam dissenyar una estratègia sintètica, basada en les micropartícules liposomals. Els liposomes són vesícules formades per una bicapa lipídica amb un nucli hidrofílic. Una característica clau en el reconeixement de les cèl·lules apoptòtiques és l’exposició a la membrana de la molècula fosfatidilserina (FS), que genera el principal senyal de reconeixement per l’eferocitosi. Per tant, vam generar FS-liposomes amb pèptids d’insulina a l’interior -com a autoantígens-, per tal de simular el reconeixement de les cèl·lules apoptòtiques per part de les cèl·lules presentadores d’antigen. Aquests liposomes van ser fagocitats per les CDs, resultant en la inducció de tolerància i disminuint la capacitat d’induir proliferació en els limfòcits T autoreactius, de manera similar a la teràpia cel·lular de CDs. A més, aquesta immunoteràpia sintètica va ser capaç d’aturar l’atac autoimmunitari, reduint la severitat del infiltrat insular i prevenint la DT1 en ratolins NOD. Les característiques tolerogèniques de l’apoptosi ens van portar a dissenyar una teràpia cel·lular i posteriorment, a encapsular autoantígens en liposomes per induir una immunosupressió específica. El mimetisme de l’apoptosi utilitzant liposomes pot oferir una solució a la complexitat de la teràpia cel·lular, amb avantatges en quant a baix cost i la possibilitat de producció a gran escala, estandardització i personalització. Malgrat cal aprofundir molt en aquest camp, l’aportació al camp clínic de les immunoteràpies presentades en aquest treball pot ser molt important, donat el seu potencial translacional en situacions que requereixen el restabliment de la tolerància immunològica, com ara les malalties autoimmunitàries. / Type 1 diabetes (T1D) is a metabolic disease that results from the autoimmune attack against insulin-producing β-cells in the pancreatic islets of Langerhans. Currently, there is no treatment to restore endogenous insulin secretion in patients with T1D, so the development of new therapies to induce long-term tolerance has been an important medical health challenge. An ideal immunotherapy should inhibit the autoimmune attack, avoiding systemic side effects and allowing islet regeneration to improve β-cell function. There are physiological mechanisms that contribute to the maintenance of immune tolerance. On one hand, apoptotic cells are a source of autoantigens that induce tolerance after its removal by antigen presenting cells through a process called efferocytosis. On the other, dendritic cells (DCs) are powerful antigen presenting cells capable of maintaining immunological tolerance. Based on these two traits of the immune system, we hypothesized that tolerogenic features acquired by antigen presenting cells after efferocytosis can help to restore tolerance lost in autoimmunity. The main goal of this study was to generate an antigen-specific immunotherapy based on the inherent tolerogenic properties of apoptosis to reestablish tolerance to β-cells in T1D. To that aim, we generated a cell-based immunotherapy with DCs loaded with apoptotic β-cells. After the uptake of apoptotic β-cells, DCs displayed a molecular switch to a tolerogenic phenotype, low secretion of proinflammatory cytokine and impaired ability to stimulate autologous T cell proliferation even after proinflammatory stimuli, thus demonstrating their stability. Moreover, efferocytosis promoted suppressive ability in DCs, mediated at least in part by prostaglandin E2. The administration of the DC-based immunotherapy to the gold standard animal model for T1D, the non-obese diabetic (NOD) mouse, impaired the progress of insulitis, resulting in the prevention of the disease. However, it was not able to reverse the disease in overtly diabetic in mice. Due to the difficulties in obtaining and standardizing β-cell apoptotic cells, we designed a synthetic strategy, based on liposomal microparticles. Liposomes are vesicles composed of a lipid bilayer with a hydrophilic center. A central event on the surface of apoptotic cells is the exposure of phosphatidylserine (PS), which provide the main signal for efferocytosis. Therefore, PS-liposomes loaded with insulin peptides -as autoantigens- were generated to simulate the PS recognition of apoptotic cells by antigen presenting cells. These liposomes were phagocyted by DCs resulting in tolerance induction and impairing autoreactive T cell proliferation, in a similar way than the DC-based immunotherapy. In addition, this synthetic immunotherapy arrested the autoimmune aggression, reduced the severity of insulitis and prevented T1D in NOD mice. The fact that efferocytosis contributes to the maintenance of self-tolerance led us to design a cell therapy and later, to encapsulate β-cell autoantigens in liposomes to induce specific immunosuppression. Apoptotic mimicry using liposomes can offer a solution to the complexity of cell-therapy with design benefits like low-cost and easy to standardize, large-scale production and customization. Although further research is needed, the clinical relevance of the herein proposed immunotherapies could prove to be very important, as it has translational potential in situations that require the reestablishment of immunological tolerance, such as autoimmune diseases.

Tesi realitzada a l’Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) / El centròmer és l’estructura cromosòmica implicada en la correcta segregació de la informació genètica durant els processos de meiosi i mitosi. La funció centromèrica està determinada epigenèticament per la presència de la variant centromèrica de la histona H3 (CenH3). Aquesta variant substitueix a la histona H3 canònica en els nucleosomes de tots els centròmers funcionals, sent fonamental la seva localització pel correcte assemblatge del cinetocor. En cèl·lules de vertebrats, els nucleosomes de CenH3 actuen com la plataforma necessària pel reclutament de les proteïnes centromèriques que formen el CCAN (Constitutive centromere-associated network). En cada mitosi, les proteïnes del CCAN recluten els components de la xarxa KMN per formar un cinetocor funcional. Mentre que per algunes espècies s’han identificat algunes de les proteïnes homòlogues a les del CCAN, en el cas de D. melanogaster es desconeixen totes, a excepció de CENP-C. En aquest treball per tal d’identificar i caracteritzar noves proteïnes centromèriques a Drosophila s’ha realitzat la purificació i identificació de les proteïnes associades als nucleosomes de CenH3 de Drosophila, CenH3CID. Entre altres, hem identificat la proteïna Barrier-to-autointegration factor (BAF). Aquesta proteïna està conservada i té un paper clau en el reassemblatge de la membrana nuclear un cop finalitzada la mitosi. Hem observat que dBAF es localitza en la heterocromatina de les cèl·lules SL2 en interfase però, un cop iniciada la mitosi aquesta es localitza exclusivament en els centròmers dels cromosomes metafàsics. A més, hem detectat que dBAF intervé en la deposició i/o estabilització de CENP-C en els centròmers, ja que la sobreexpressió del dominant negatiu dBAF-YFP o la depleció de dBAF afecten els nivells centromèrics de CENP-C. CENP-C interacciona amb dBAF, i aquesta interacció depèn de l’estat de fosforilació de dBAF i de RNA. En les nostres purificacions també s’ha identificat la proteïna codificada pel gen CG8289. Els nostres assajos d’immunolocalització a cèl·lules SL2, neuroblastos i a cromosomes politènics confirmen que la proteïna codificada pel gen CG8289 és un nou factor de la heterocromatina pericentromèrica de D. melanogaster. Per altra banda, també hem analitzat la contribució del domini N-terminal de CenH3CID (N-CenH3CID) en l’assemblatge del cinetocor. Concretament, hem observat que el reclutament ectòpic de N-CenH3CID davant d’un gen reporter indueix el silenciament d’aquest gen degut al reclutament de BubR1, una proteïna del cinetocor que està relacionada amb el punt de control de la mitosi. Aquest efecte depèn d’un domini del N-CenH3CID conservat entre les diferents espècies del grup de Drosophila i ric en arginines. Els nostres resultats mostren que aquestes arginines són necessàries per produir el silenciament, ja que la seva deleció o mutació per alanines elimina pràcticament el silenciament del gen reporter. A més, el reclutament dels dominis N-terminals de CenH3s de S. cerevisiae i de humans també indueixen el silenciament del gen reporter, indicant que malgrat el baix grau de conservació d’aquest domini entre espècies, la contribució de CenH3 en el reclutament de proteïnes del cinetocor està evolutivament conservada. Per últim, s’ha confirmat la contribució de la proteïna F-box Ppa en l’estabilitat de CenH3CID. Ppa reconeix específicament el domini CATD de CenH3CID, induint la poliubiquitinació i posterior degradació d’aquesta variant via proteosoma. / Centromere identity and function is regulated epigenetically by the deposition of a centromere-specific histone H3 variant (CenH3). CenH3-nucleosomes act as platform for recruitment of other centromere associated proteins, such as CCAN (Constitutive centromere-associated network) components. These proteins participate in kinetochore assembly during mitosis. In Drosophila, little is known about proteins associated to CenH3-nucleosomes. Here, we have performed purification of CenH3 CID-TAP nucleosomes and subsequent analysis of their associated proteins by mass spectrometry. Among others, we identified Barrier-to-autointegration factor (BAF), a protein related with the reassembly of nuclear envelop at the end of mitosis. Our results show that dBAF binds across heterochromatin in interphase but, at mitosis, is restricted to centromeres. In addition, dBAF mediates CENP-C assembly, since overexpression of a dominant-negative dBAF-YFP form and depletion of dBAF affect centromeric CENP-C. dBAF interacts with CENP-C, as they co-immunoprecipate. In our purification, we also detected the protein encoded by the CG8289 gene. Immunolocalization experiments in SL2 cells, neuroblasts and polytene chromosomes confirm that protein encoded by the CG8289 gene is a new factor of pericentric heterochromatin. In addition, we have analyzed the contribution of the N-terminal domain of CenH3CID (N-CenH3 CID) in kinetochore assembly. Specifically, we have found that ectopic recruitment of N-CenH3CID in front of a reporter gene induces silencing of this due to recruitment of BubR1, a kinetochore protein that is a core component of the spindle attachment checkpoint (SAC). This interaction depends on a short arginine (R)-rich motif conserved within the Drosophila genus. Our results show these arginines are necessary for gene silencing, since silencing induced by N-CenH3CID is strongly impaired when R-residues are replaced by alanine or deleted. In addition, the recruitment of N-CenH3 of S. cerevisiae and humans also induce silencing of the reporter gene, indicating that despite the low degree of conservation of this domain between species, the contribution of the CenH3 recruitment of kinetochore proteins is evolutionarily conserved. Finally, we have shown that the F-box protein Ppa regulates stability of CenH3CID. PPA specifically recognizes the CATD of CenH3CID, inducing polyubiquitination and subsequent proteasome-mediated degradation of this variant.

L'objectiu principal d'aquest treball ha estat la caracterització del procés demort cel·lular en la isquèmia en els cardiomiòcits. En el nostre estudi hem demostratque l'expressió de les principals proteïnes reguladores de la mort cel·lular dependentde caspases es reprimeix durant el desenvolupament cardíac. En correlació ambaquest fet hem observat que la mort cel·lular induïda per isquèmia és dependent decaspases als cardiomiòcits embrionals, mentre que els cardiomiòcits postmitòticsmoren de forma independent de caspases. En el nostre treball també hem demostratque Endonucleasa G (EndoG) és la principal nucleasa responsable de la degradacióde l'ADN, i en particular del senyal positiu de TUNEL, als cardiomiòcits postnatalsdurant la isquèmia, mentre que Apoptosis-inducing Factor (AIF) podria protegir lasupervivència dels cardiomiòcits durant la reoxigenació. La rellevància d'ambduesmolècules correlaciona amb els nostres resultats en què AIF i EndoG augmenten laseva expressió durant el desenvolupament cardíac. Per últim, hem determinat queBNIP3, membre de la família de Bcl2, controla el procés de degradació d'ADNdependent d'EndoG en la isquèmia cardíaca sense impedir l'alliberament d'aquestaproteïna del mitocondriFa més d'una dècada que es va suggerir per primera vegada la rellevància dela mort apoptòtica al cor en contraposició a la mort necròtica. Tot i que s'ha suggeritla implicació de la via apoptòtica dependent de receptors de mort, així com la viamitocondrial i, fins i tot s'ha descartat la implicació de caspases en la mortisquèmica, avui en dia encara es desconeixen molts dels mecanismes involucrats enaquests procés. En aquest context el nostre treball és rellevant perquè: descarta laimplicació de les caspases en la mort cardíaca durant la isquèmia, identifica aEndonucleasa G com a un executor de mort durant la isquèmia cardíaca i identifica aBNIP3 com a proteïna mitocondrial que indueix aquest mecanisme de mort. Lesnostres dades poden ajudar a interpretar la sortida de citocrom c i el senyal positiu deTUNEL, ja que hem determinat que Endonucleasa G origina el senyal de TUNEL enels cardiomiòcits i que la sortida de citocrom c no activa mort dependent de caspasesen els cardiomiòcits postnatals. / El objetivo principal de este trabajo ha sido la caracterización del proceso demuerte celular en cardiomiocitos durante la isquemia. En nuestro estudio hemosdemostrado que la expresión de las principales proteínas reguladoras de muertecelular dependiente de caspasas se reprime durante el desarrollo cardíaco. Encorrelación con este hecho hemos observado que la muerte celular inducida porisquemia es dependiente de caspasas en cardiomiocitos embrionales, mientras que loscardiomiocitos postmitóticos mueren de forma independiente de caspasas. En nuestrotrabajo hemos demostrado también que Endonucleasa G (EndoG) es la principalnucleasa responsable de la degradación de ADN en los cardiomiocitos postnatalesdurante la isquemia, y en particular de la señal positiva de TUNEL, mientras queApoptosis-inducing factor (AIF) podría proteger la supervivencia de loscardiomiocitos durante la reoxigenación. La relevancia de ambas moléculascorrelaciona con nuestros resultados en los que EndoG y AIF aumentan su expresióndurante el desarrollo cardíaco. Por último, hemos determinado que BNIP3, miembrode la familia de Bcl2, induce el proceso de degradación de ADN dependiente deEndoG durante la isquemia cardiaca sin impedir la salida de esta proteína de lamitocondria.Hace más de una década que se sugirió por primera vez la relevancia de lamuerte apoptótica en el corazón en contraposición a la muerte necrótica. A pesar deque se ha sugerido la implicación de la vía apoptótica dependiente de receptores demuerte, así como de la vía mitocondrial, e incluso se ha descartado la implicación decaspasas en la muerte isquémica, hoy en día aún se desconocen muchos de losmecanismos implicados en este proceso. Dentro de este contexto nuestro trabajo esrelevante porque: descarta la implicación de las caspasas en la muerte cardiacadurante la isquemia, identifica a Endonucleasa G como a un ejecutor de muertedurante la isquemia cardiaca e identifica a BNIP3 como a una proteína mitocondrialque puede controlar este mecanismo de muerte. Nuestros datos pueden ayudar ainterpretar la salida de citocromo c y la señal positiva de TUNEL, ya que hemosdeterminado que Endonucleasa G origina la señal de TUNEL en los cardiomiocitos yque la salida de citocromo c no activa muerte dependiente de caspasas encardiomiocitos postnatales. / Our main objective has been the characterization of the cell death mechanismin cardiomyocytes under ischemic conditions. In our research we demonstrated thatthe whole caspase-dependent pathway is silenced during heart development. Incorrelation to these results, we showed that ischemia-induced cell death is caspasedependentin embryonic cardiomyocytes, yet postmitotic cardiomyocytes die in acaspase-independent manner. Our work also disclosed that Endonuclease G (EndoG)is the main nuclease responsible for DNA degradation in postnatal cardiomyocytesand induces the TUNEL-positive labeling, while Apoptosis-Inducing Factor (AIF)plays a prosurvival role in cardiomyocytes during reoxygenation. The relevance ofboth molecules correlates with the observation that AIF and EndoG are upregulatedduring heart development contrary to the genes involved in caspase-dependent celldeath. Finally, our results show that BNIP3, a pro-death Bcl2 family member,induces EndoG-dependent DNA degradation without preventing EndoG release frommitochondria during ischemia.More than one decade ago, the relevance of apoptotic cell death wassuggested in heart in opposition to necrotic cell death. Death receptors and themitochondrial intrinsic pathway have been suggested to be involved in ischemiainducedcell death. Several authors have refused the implication of caspases inischemic cell death. However most of the mechanisms involved in that process arestill unknown. In that context our study is relevant because: it discards theinvolvement of caspases in ischemia-induced cardiac cell death, it identifiesEndonuclease G as a cell death executor during cardiac ischemia, and it identifiesBNIP3 as a mitochondrial protein controlling this cell death mechanism. Our datacontribute to understand cytochrome c release and TUNEL-positive labeling, as wehave determined that Endonuclease G produces TUNEL labeling in cardiomyocytesand that cytochrome c release doesn't activate caspase-dependent cell death inpostmitotic cardiomyocytes.

El disseny i la producció de zimògens de ribonucleases que puguin ser específicament activats per la proteasa d’un patogen, constitueix un enginyós mecanisme per controlar la seva activitat enzimàtica i, conseqüentment, la seva citotoxicitat. En aquest treball es descriu la construcció de 12 variants de zimògens d’Onconasa® (ONC) i de ribonucleasa pancreàtica humana (HP-RNasa), activables per la proteasa del Virus de la Immunodeficiència Humana (HIV-1 PR). Els zimògens d’ONC i HP-RNasa s’activen in vitro amb la proteasa, mantenint una elevada estabilitat sobretot els zimògens d’ONC. L’augment d’activitat ribonucleolítica de la forma activada respecte el precursor, que resulta baix per les variants d’ONC, és d’unes 150 vegades per les d’HP-RNasa. Els zimògens d’ONC presenten una molt bona internalització en limfòcits-T humans, a més de no presentar, en cap dels casos, citotoxicitat en cèl·lules Jurkat en cultiu abans de l’activació. Finalment, s’ha estudiat l’estructura i dinàmica de la forma intacta d’un dels zimògens d’ONC per Ressonància Magnètica Nuclear (NMR), permetent el desenvolupament i optimització futura de nous zimògens més efectius com a agents antivirals. / Design and production of ribonuclease zymogens that could be specifically activated by proteases of pathogens, would provide an ingenious mechanism to control their activity and, consequently, their cytotoxicity. Here we report the construction of 12 variants of Onconase® (ONC) and Human Pancreatic Ribonuclease (HP-RNase) zymogens that are recognized and activated specifically by the Human Immunodeficiency Virus Protease (HIV-1 PR). ONC- and HP-RNase- zymogens are activated by the HIV-1 PR in vitro, and mantain a high conformational stability mainly in ONC variants. The increase of catalytic efficiency of the activated form compared to the precursor has been low in ONC zymogens, but 150-fold for those of HP-RNase. ONC zymogens can internalize in human T-lymphocyte Jurkat cells efficiently, and all of them do not show any cytotoxicity in this type of cells before their activation. Finally, the structure and dynamics of intact form of one of ONC zymogens has been determined by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (NMR). This represents a first step toward the development and optimization of more effective zymogens, as antiviral agents.